Summary
Hier beschrijven we methoden met behulp van time-lapse, fase-contrast microscopie om de muis ingezetene peritoneale macrofagen beeld in een chemotactische aanvulling C5a gradiënt. De protocollen kunnen worden uitgebreid naar andere immuuncellen.
Abstract
Chemotaxis is receptor-gemedieerde begeleiding van cellen langs een chemische gradiënt, terwijl chemokinese is de stimulatie van willekeurige cel beweeglijkheid door een chemische stof. Chemokinese en chemotaxis zijn van fundamenteel belang voor de mobilisatie en inzet van immuuncellen. Chemokines (chemotactische cytokines) kunnen bijvoorbeeld snel circulerende neutrofielen en monocyten rekruteren naar extravasculaire ontstekingslocaties. Chemoattractant receptoren behoren tot de grote familie van G eiwit-gekoppelde receptoren. Hoe chemoattractant (d.w.z., ligand) gradiënten directe celmigratie via G eiwit-gekoppelde receptor signalering is nog niet volledig begrepen. Op het gebied van immunologie zijn neutrofielen populaire modelcellen voor het bestuderen van chemotaxis in vitro. Hier beschrijven we een real-time tweedimensionale (2D) chemotaxis test op maat voor muis resident macrofagen, die traditioneel moeilijker te bestuderen. Macrofagen bewegen in een langzaam tempo van ~ 1 μm/min op een 2D-oppervlak en zijn minder geschikt voor point-source migratietesten (bijvoorbeeld migratie naar het puntje van een micropipet gevuld met chemoattractant) dan neutrofielen of Dictyostelium discoideum, die een orde van grootte sneller bewegen. Op grote schaal gebruikt Transwell testen zijn nuttig voor het bestuderen van de chemotactische activiteit van verschillende stoffen, maar bieden geen informatie over cel morfologie, snelheid, of chemotactische navigatie. Hier beschrijven we een time-lapse microscopie-gebaseerde macrofaag chemotaxis test die kwantificering van de celsnelheid en chemotactische efficiëntie mogelijk maakt en biedt een platform om de transducers, signaaltrajecten en effectoren van chemotaxis af te definiëren.
Introduction
Immuuncellen migreren meestal afzonderlijk op een 2D-oppervlak op een amoebe manier1,2, wat gepaard gaat met herhaalde cycli van uitsteeksel van de voorkant, integrin-gemedieerde celhechting, en intrekking van de achterzijde. Een vereiste stap is celpolarisatie, waarbij cellen voor- en achtereinden vormen3. Chemotaxis begint met de detectie van chemoattractants door G-eiwitgekoppelde receptoren en een complex signaleringsnetwerk dat wordt gebemiddeld door membraanverankerde hetero-trimmeric G-eiwitten en kleine monomeric G-eiwitten, evenals fosfolipidengebonden guanine nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEFs)4,5. Activering van Rho GTPases van de Cdc42 en Rac subfamilies induceren uitsteeksels aan de voorzijde6 en leden van de Rho subfamilie, met name RhoA, activeren contractie van de achterzijde5,7. In een driedimensionale (3D) omgeving, integrins zijn grotendeels overbodig voor leukocyten migratie en RhoA wordt belangrijker voor het knijpen van cellen door smalle passages8, terwijl Cdc42- of Rac-geïnduceerde Arp2 / 3 activering blijft belangrijk voor chemotactische besturing9,10.
Immuuncellen kunnen worden geconfronteerd met verschillende chemoattractants, vooral in de instellingen van weefselletsel, pathogene invasie, en ontsteking. De endogene chemoattractanten uitgedrukt op fagocyten vullen C3a en C5a aan, worden snel gegenereerd door activering van de complementcascade en worden herkend door complementc3a- en C5a-receptoren. Op dezelfde manier rekruteren necrotische cellen fagocyten via formylpeptidereceptoren, die mitochondriën-afgeleide en bacteriën-afgeleide formyl peptiden11herkennen. Immuuncellen drukken ook G-eiwit-gekoppelde receptoren voor chemokines uit, een grote familie van chemoattractant peptiden die betrokken zijn bij de regulatie van immuuncelhandel tijdens zowel homeostase als ontsteking. Chemokines worden ingedeeld in vier groepen, afhankelijk van de afstand van de eerste twee cysteïne (C) residuen: C, CC, CXC, en CX3C cytokines, waar X is een aminozuur. Zo moeten in vivo immuuncellen adequaat reageren op zeer complexe ruimtelijke en temporele signalen, waardoor de studie van chemotaxis een ontmoedigende taak is. Hieronder geven we een korte geschiedenis van chemotaxis, die begon met intravital imaging benaderingen.
De studie van leukocyten chemotaxis dateert uit 188812, toen de oogarts Theodor Karl Gustav Leber duidelijk de gerichte migratie van leukocyten naar, en de accumulatie op, plaatsen van ontsteking in een model van mycotische (schimmel) keratitis beschreef. Leber benadrukte dat de aantrekkingskracht van overtollige leukocyten door pathogene stoffen belangrijk is voor de eliminatie van schadelijke micro-organismen via phagocytose, die eerder in hetzelfde decennium13was beschreven door Metchnikoff (ook bekend als Metschnikoff). In vivo experimenten werden ook uitgevoerd in de jaren 1920 door Clark en Clark14,15, die gebruik maakten van de transparantie van kikkervisjes en toonde dat steriele ontsteking veroorzaakt door croton olie14 of andere irriterende stoffen15 veroorzaakt leukocyten aan bloedvaten, gevolgd door diapedesis (transendotheel migratie) en snelle migratie door de weefselruimten naar de irriterende. In vitro experimenten met behulp van de microcinematografie methode ontwikkeld door Jean Comandon16 bleek dat leukocyten gemigreerd naar een deeltjes chemoattractant bron zoals bacteriën17. Op dat moment waren de moleculaire identiteiten van chemotactische factoren onbekend. In de jaren 1960, Stephen Boyden18 erkend dat technieken om de chemotactische activiteit van oplosbare stoffen te bestuderen ontbraken. Hij bedacht een kamer, later bekend als de Boyden kamer, met twee compartimenten gescheiden door een filter papier membraan. Aan het bovenste compartiment wordt een celvering toegevoegd en de teststof wordt aan beide compartimenten of alleen aan het onderste compartiment toegevoegd. Na een incubatietijd wordt het filtermembraan verwijderd en worden de cellen bevestigd en gekleurd. Door te vergelijken hoeveel cellen migreren over het filtermembraan naar de onderste put met de teststof in beide compartimenten, in geen van beide compartimenten, of alleen in het onderste compartiment, chemotactische activiteit kan worden bepaald. Transwell assays zijn nog steeds populair vandaag en zijn gewijzigd op verschillende manieren, met inbegrip van het gebruik van verschillende polycarbonaat membranen met gedefinieerde porie maten en dichtheden19,20. Een groot nadeel van Transwell-testen is dat het onpraktisch is om cellen die migreren direct te visualiseren en dat het migratiepad over het membraan doorgaans niet hoger is dan de diameter van een immuuncel.
Sally H. Zigmond ontwikkelde een chemotaxis kamer21 die visualisatie van zowel gradiëntvorming als celmorfologie mogelijk maakte met fluorescerende kleurstoffen. De kamer bestaat uit een plexiglas (acryl) dia met twee parallelle lineaire putten, elk met een volume van ~ 100 μL, gescheiden door een 1 mm brede brug 3-10 μm onder het bovenste vlak van de dia. Een coverslip gezaaid met cellen wordt omgekeerd en geplaatst op de dia zodanig dat het de twee putten omspant. Na toevoeging van een chemoattractant aan een van de putten, vormt zich een steile chemoattractante gradiënt over de brug, meestal binnen 30-90 min. Menselijke polymorfnucleaire leukocyten (granulocyten) in de Zigmond-kamer worden waargenomen zich te oriënteren op de chemoattractant. Variaties van de Zigmond kamer zijn gemeld, met inbegrip van de Dunn22 en Insall23 kamers, die beide gebruik maken van een coverslip gezaaid met cellen geplaatst over twee putten gescheiden door een 1 mm brede brug. De Dunn kamer bestaat uit concentrische putten gescheiden door een ronde brug, terwijl de Insall kamer is nauwer verwant aan de Zigmond kamer, maar biedt bruggen van twee verschillende breedtes, 0,5 mm en 1 mm. Een nieuwe chemotaxis kamer, genoemd μ-Slide Chemotaxis en vervaardigd door plastic spuitgieten, werd beschreven door Zemgel et al.24. De chemotaxis kamer bestaat uit twee 40 μL reservoirs gescheiden door een 1 mm breed kanaal met een lengte van 2 mm en een hoogte van 70 μm. De onderkant van de kamer wordt gevormd door een gasdoorlatende, dunne kunststof plaat met dezelfde dikte en optische eigenschappen van een nr. 1,5 glazen afdekking24. Hier beschrijven we een chemotaxis test met behulp van de μ-Slide Chemotaxis kamer om de migratie van muis ingezetene peritoneale macrofagen te visualiseren voor maximaal 14 uur in een chemotactische (complement C5a) gradiënt.
Protocol
De protocollen volgen de richtlijnen van onze lokale onderzoeksethische commissie, evenals de richtlijnen voor dierverzorging.
LET OP: Figuur 1 toont een workflow van de chemotaxis test.
1. Voorvullen Chemotaxis Slides
-
Vul de 1 mm brede en 2 mm lange verbindingskanalen van een of twee chemotaxis-glijbanen voor met aangepaste RPMI 1640 HEPES-medium, bestaande uit bicarbonaatvrij RPMI 1640-medium met 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethelsulfo 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en antibiotica zoals penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 μg/mL), bereid door het verdunnen van 100x penicilline/streptomycine, en 1 μg/mL lipopolysaccharide (van E. coli),en een Toll-achtige receptor 4 ligand gebruikt om de cellen te activeren.
- Plaats een chemotaxis schuif (figuur 2A) in een ronde (10 cm diameter) cel cultuur schotel, zowel voorverwarmd tot 37 °C, en zet de schotel op een verwarmde (37 °C) aluminium blok. Sluit stekkers in poorten 1 en 4(figuur 2B).
LET OP: Een aluminium blok onderhouden op 37 °C en geplaatst in de laminaire stroomkap is nuttig voor de voorbereiding van chemotaxis kamers. Idealiter moet het verwarmde blok zorgen voor een vlakke werkruimte en putten voor verschillende buizen, zoals 50 mL buizen en 2 mL microcentrifuge buizen. - Met behulp van een 10-200 μL pipettip met een afgeschuinde punt, deponeert u 15 μL gewijzigd RPMI 1640 HEPES medium in vulpoort 3 (Figuur 2B). Voeg vervolgens, met het volume dat nog steeds op 15 μL is ingesteld en de bedieningsknop van de (2-20 μL volume) pipet ingedrukt, de pipetpunt in poort 2 en voeg 15 μL aan bij een matig snel tempo (figuur 2B). Hiermee wordt het verbindingskanaal van 1 mm x 2 mm (observatiegebied) en de twee flankerende aanvoerkanalen (respectievelijk tussen het centrale observatiegebied en de havens 2 en 3) voorgevuld. Bedek vulpoorten 2 en 3 met doppen.
- Plaats na het voorvullen de chemotaxisglijbanen op een rek dat in een gesloten vochtigheidskamer wordt bewaard in een anders droge en CO2-vrijecouveuse bij 37 °C.
LET OP: Het is belangrijk om de juiste pipettip te gebruiken voor het vullen van de chemotaxis glijbaan. Een afgeschuinde pipetpunt wiggen in de bovenkant van de vulpoort, terwijl veelgebruikte puntige pipet tips kunnen dieper worden ingevoegd in de vulpoort en kan sterk verhogen weerstand tegen vloeistofstroom.
- Plaats een chemotaxis schuif (figuur 2A) in een ronde (10 cm diameter) cel cultuur schotel, zowel voorverwarmd tot 37 °C, en zet de schotel op een verwarmde (37 °C) aluminium blok. Sluit stekkers in poorten 1 en 4(figuur 2B).
2. Isolatie van muis ingezetene peritoneale macrofagen
- Offer een 3-4 maanden oude muis op met behulp van een hoge concentratie van de vluchtige verdovingsmiddel (>5% in lucht) of kooldioxide25, gevolgd door cervicale dislocatie. Verlies van de righting reflex bij knaagdieren correleert met verlies van bewustzijn bij de mens26. Reinig de buik van de muis met 80% ethanol in water en maak vervolgens een 1-2 cm midline huidincisie met behulp van chirurgische schaar met stompe tips. Pel de huid terug om de onderliggende buikwand bloot te leggen.
- Steek een 24 G plastic katheter in de peritoneale holte. Met behulp van een 5 mL plastic spuit, lavage de holte met behulp van 2 x 4,5 mL ijskoude Hank's gebufferde zout oplossing (HBSS), zonder Ca2 + en Mg2 +. Laat ongeveer 0,5 mL restHBSS in de spuit, zodat weefsel per ongeluk op de punt van de katheter kan worden afgevoerd.
- Breng het lavaged medium, meestal 8-8,5 mL in totaal, over in een 14 mL polypropyleen ronde bodembuis. Centrifugeer de buis op 300 x g voor 6,5 min bij kamertemperatuur.
LET OP: De ronde onderbuis maakt het mogelijk de supernatant volledig te decanteren en vermindert het klonteren van cellen. - Gooi de supernatant en resuspend de peritoneale cellen (meestal ~ 4 x 106 cellen per muis) in 200 μL van gemodificeerde RPMI 1640 HEPES medium. Verdun een monster van de celsuspensie 1:20 en gebruik een telinrichting, zoals een Neubauer verbeterde telkamer, om de cellen te tellen. Verdun vervolgens de celsuspensie tot een eindconcentratie van 10 x 106 cellen/mL en houd de cellen in een ronde bodem 2 mL polypropyleen microcentrifugebuis bij 37 °C met behulp van een verwarmd aluminiumblok (zie NOOT in stap 1.1.1).
3. Zaaien Peritoneale cellen in Chemotaxis Dia's
- Na het pipetteren van de celsuspensie 5x op en neer 5x met het pipetvolume ingesteld op 100 μL (of op de helft van het ophangvolume) om het samenklonteren te verminderen, deponeren voorzichtig 10 μL van de celsuspensie in poort 3 van een chemotaxiskamer (Figuur 2C). Plaats de pipettip in poort 2 en trek de celsuspensie langzaam in het verbindingskanaal(figuur 2C). Zodra de celvering is geïntroduceerd, verwijder de stekkers in de poorten 1 en 4, die zal helpen om de stroom van de cel ophanging te stoppen. Plaats doppen op alle vier de vulpoorten.
- Herhaal stap 3.1 voor alle chemotaxis kamers. Met behulp van een kleine omgekeerde microscoop en een 10x fase-contrast objectieve lens, inspecteer de chemotaxis dia's voor ongewenste luchtbellen.
- Plaats de chemotaxis glijbanen gezaaid met peritoneale cellen in een vochtigheidskamer bij 37 °C gedurende 2-3 uur.
4. Het vullen van de reservoirs en het toevoegen van Chemoattractant
- Inspecteer het observatiegebied (kanaal dat de twee reservoirs van 40 μL verbindt) met behulp van een omgekeerde microscoop.
LET OP: In dit stadium zal de celdichtheid hoger zijn dan na het vullen van de reservoirs, omdat zwak aanhangende cellen, voornamelijk CD19+ cellen (B1-cellen), tijdens de vulprocedure uit het observatiegebied worden gewassen (Figuur 2C–E). - Plaats stekkers in vulpoorten 1 en 2(figuur 2D). Zorg ervoor dat vulpoort 3 naar boven wordt gevuld met medium en vrij van luchtbellen. Gebruik een steriele 27 G spuitnaald om ongewenste luchtbellen los te maken, indien nodig.
- Met behulp van een 10-100 μL volume mechanische pipet, aanzuigen ~ 60 μL van gemodificeerde RPMI 1640 HEPES medium en plaats de pipet tip in vulpoort 3. Gebruik de volume-instellingsring van de pipet om langzaam en gestaag medium in het reservoir te injecteren, zodat het medium de bovenkant van vulpoort 4 bereikt na 1-2 min (figuur 2D).
- Vul het tweede reservoir. Verplaats de stekker van poort 1 en plaats deze langzaam in poort 3(figuur 2D). Vervolgens , aanzuigen ~ 50 μL van gewijzigde RPMI 1640 HEPES medium en plaats de pipet tip in vulpoort 4. Gebruik de volumeinstellingsring van de 10-100 μL volumepipet om langzaam en gestaag medium in het tweede reservoir te injecteren, zodat het medium de bovenkant van vulpoort 1 bereikt na 1-2 min (figuur 2D).
- Plaats 495 μL gemodificeerde RPMI 1640 HEPES medium in een (ronde bodem) 2 mL microcentrifuge buis en voeg 5 μL Patent Blue V (voorraadoplossing: 10 mg/mL in fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS]), een blauwe kleurstof gebruikt als een visuele indicator van concentratiegradiëntvorming. Meng door korte vortexing. Voeg 5,4 μL recombinante muiscomplement C5a toe (voorraadoplossing: 50 μg/mL in PBS met 0,1% runderserumalbumine) en meng door korte vortexing.
- Deponeer 15 μL blauw, vul C5a-bevattend medium aan in vulpoort 1 (Figuur 3A), nadat u ervoor hebt gezorgd dat de ondiepe depressie aan de bovenkant van de poort middelvrij is (anders kan de druppel overlopen).
- Plaats een pipettip van 10-200 μL in vulpoort 4 en draai langzaam en gestaag de volume-instellingsring van de 10-100 μL volumepipet om de druppel blauw te trekken, vul c5a-bevattend medium aan in het tegenovergestelde reservoir (figuur 3B). Lucht begint de korte verticale kolom van vulpoort 1 binnen te gaan. Trek lucht in totdat de vloeistof-lucht interface is halverwege in de verticale kolom, en dan langzaam een stekker in de poort.
- Til de pipet voorzichtig op van poort 4, met behulp van de andere hand om ervoor te zorgen dat de schuif op zijn plaats blijft staan. Ten slotte, langzaam stekker poort 4 (Figuur 3B).
- Inspecteer de chemotaxis schuif op een omgekeerde microscoop.
LET OP: De resterende aanhangende cellen in het observatiegebied moeten voornamelijk macrofagen zijn. Dit kan worden bevestigd met behulp van fluorescerende gelabelde anti-F4/80 antilichamen (F4/80 is een specifieke marker voor muismacrofagen). B-cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van fluorescerende anti-CD19 antilichamen en F4/80-/CD19- cellen kunnen worden gedetecteerd met behulp van een blauwe fluorescerende nucleïnezuurvlek(figuur 4).
5. Imaging Macrofaagmigratie door time-lapse, fasecontrastmicroscopie
- Plaats een chemotaxis glijbaan op het podium van een omgekeerde microscoop uitgerust met een podium incubator. Houd de temperatuur op 37 °C.
- Beeld het observatiegebied van 1 mm x 2 mm met behulp van een 10x fasecontrastobjectieve lens en focus op de macrofaag lamellipodia: dunne, bladachtige membraanuitsteeksels. Leg beelden vast voor 14 uur met een snelheid van 1 frame per 2 min.
6. Analyse van time-lapse beelden
- Analyseer de time-lapse, fasecontrastbeelden met behulp van geautomatiseerde beeldanalysesoftware of de Manual Tracking-plug-in, geproduceerd door Fabrice P. Cordelières, voor ImageJ.
LET OP: Geautomatiseerde trackingprogramma's kunnen worden gebruikt om cellen te analyseren die zijn weergegeven door time-lapse, fasecontrast of fluorescentiemicroscopie. De Java-gebaseerde software iTrack4U, geproduceerd door Cordelières et al.27, kan bijvoorbeeld worden gebruikt voor geautomatiseerde celtracking en -analyse met behulp van time-lapse, fasecontrast of fluorescentiebeelden als invoer. Handmatig bijhouden is tijdrovender, maar de tracks gegenereerd door de ImageJ plugin Manual Tracking kan direct worden geïmporteerd en automatisch worden geanalyseerd door de ImageJ plugin Chemotaxis en Migration Tool28,29.
Representative Results
Een schematisch diagram van de chemotaxis dia gebruikt voor time-lapse video microscopie van muis peritoneale macrofagen migreren in een chemotactische gradiënt wordt weergegeven in figuur 2A. De glijbaan bevat drie chemotaxis kamers, die elk vier vulpoorten hebben. Poorten kunnen individueel worden gesloten met behulp van de stekkers boven de dia. Als alternatief kan een niet-afdichtingsdop over een niet-afgesloten poort worden geplaatst om de steriliteit te behouden. Na het aansluiten van poorten 1 en 4 kan het observatiegebied (1 mm breed x 2 mm lang x 70 μm hoog kanaal dat de twee reservoirs verbindt) tussen poorten 2 en 3 worden voorgevuld met medium door een val van 15 μL in poort 3 te plaatsen en te aspirating met een 2-20 μL volumepipet in poort 2 (Figuur 2B). Een suspensie van muis ingezetene peritoneale cellen (10 x 106 cellen/mL) werd gezaaid in het observatiegebied door het plaatsen van een 10 μL daling van de suspensie in poort 3 en langzaam aspirating in poort 2 (Figuur 2C). Een typisch beeld van cellen die in het observatiegebied worden gezaaid dat door fase-contrastmicroscopie wordt genomen gebruikend een 10x objectieve lens wordt getoond in Figuur 2C. Na 2-3 uur uitte broeden, werd de chemotaxis-glijbaan langzaam gevuld met medium (Figuur 2D). Na het aansluiten van poorten 1 en 2 werd medium langzaam geïnjecteerd via poort 3 totdat het uit poort 4 kwam. Vervolgens werd de stekker overgeschakeld van poort 1 naar poort 3, en vervolgens werd het tweede reservoir gevuld door langzaam injecterend medium via poort 4 totdat het in poort 1 tevoorschijn kwam. In dit stadium werden de cellen in het observatiegebied opnieuw geïnspecteerd met behulp van een omgekeerde microscoop (figuur 2E). Door het vergelijken van beelden kort voor (Figuur 2C) en na (Figuur 2E) vulling van de reservoirs, tot twee derde van de cellen was gewassen uit het observatiegebied. Over het algemeen werden zwak aanhangende CD19+ cellen (B1-cellen) weggespoeld en waren de resterende cellen voornamelijk F4/80+ cellen (macrofagen). Dit werd aangetoond door fluorescentiemicroscopie na het labelen van elk celtype met fluorescerende gelabelde specifieke antilichamen (Figuur 4). In figuur 4A, vers geïsoleerde muis ingezetene peritoneale cellen werden gelabeld met groene fluorescerende fluorophore-geconjugeerde anti-F4/80 antilichamen en rood fluorescerende fluorophore-geconjugeerde anti-CD19 antilichamen, en de kernen van cellen werden gelabeld met een blauwe fluorescerende nucleïnezuurvlek. F4/80 is een specifieke markering voor muismacrofagen30,terwijl CD19 een B-celmarkering is. Figuur 4B toont F4/80+ cellen afgebeeld door draaiende schijfconfocale microscopie in het observatiegebied van een chemotaxis kamer. De cellen werden gelabeld na een nachtelijke chemotaxis test geregistreerd door time-lapse, fase-contrast microscopie.
Complement C5a (chemoattractant) werd geïntroduceerd in een van de twee reservoirs door het plaatsen van een 15 μL daling van medium met 0,54 μg/mL (recombinant muis) aanvulling C5a en 10 μg/mL Patent Blue V in vulpoort 1 (Figuur 3A) na het aansluiten van poorten 2 en 3. Het chemoattractant medium werd langzaam in het reservoir getrokken door langzame aspiratie met een pipet via poort 4. Figuur 3B toont de diffusie van de blauwe kleurstof na het tekenen van de 15 μL druppel in een reservoir. Patent Blue V werd gebruikt als een indirecte visuele indicator van chemoattractant diffusie. Complement C5a moleculen zijn aanzienlijk groter dan die van Patent Blue V (9,0 kDa versus 0,57 kDa) en diffuus langzamer. Na diffusie van complement C5a in het reservoir was de concentratie ~0,2 μg/mL (15 μL/40 μL [reservoirvolume] x 0,54 μg/mL = 0,2 μg/mL), gelijk aan ~22,5 nM. Een bescheiden steile helling gevormd over het observatiegebied na 3 uur en bleef toenemen, het bereiken van een maximum rond 12 uur31. Figuur 3C toont de migratiesporen van macrofagen die migreren in een complementC5a-gradiënt, tussen 6-12 uur na het toevoegen van de chemoattractant. Celsnelheid en chemotactische efficiëntie, geïndexeerd als y-FMI (y-forward migratie-index; bereik: -1 tot +1) en x-FMI, van individuele macrofagen werd berekend op basis van de migratieplots (Figuur 3D). Figuur 3D toont ook een migratieplot die is geproduceerd na het normaliseren van het beginpunt van elke migratietrack naar X = 0 en Y = 0 onder de vakpercelen. De begintijd in het migratieplot laat zien hoe de y-FMI voor elke migratietrack is berekend.
Figuur 1: De workflow van de chemotaxis test. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Behandeling van chemotaxis glijbanen. (A) Een 3D-weergave van een chemotaxis glijbaan met vier stekkers en vier caps. De glijbaan bevat drie chemotaxis kamers, die elk bestaan uit twee 40 μL reservoirs verbonden door een 1 mm x 2 mm kanaal, dat is 70 μm hoog, genoemd het observatiegebied. (B) Het verbindingskanaal strekt zich aan beide uiteinden uit tot vulpoorten 2 en 3. Na het inbrengen van stekkers in vulpoorten 1 en 4 werd het observatiegebied voorgevuld met medium (rood) door een druppel medium op poort 3 toe te passen en in poort 2 te aspirating met een pipetpunt van 10-200 μL. Vervolgens werden de doppen aangebracht op de havens 2 en 3 voordat de dia bij 37 °C werd uitgebroed en de celsuspensie werd voorbereid. (C) Het observatiegebied, waar de chemoattractant gradiënt gevormd, werd gezaaid met macrofagen door het toepassen van een 10 μL daling van de muis ingezetene peritoneale cellen in poort 3 en langzaam aspirating in poort 2. De glijbaan werd vervolgens geïncubeerd in een vochtigheidskamer bij 37 °C gedurende 2-3 uur. Het fasecontrastbeeld aan de rechterkant, verkregen via een 10x objectieve lens, vertoont peritoneale cellen na zaaien en incubatie bij 37 °C gedurende 2 uur. Schaalbalk = 500 μm. (D) Chemotaxis kamers werden gevuld met medium door het aansluiten van poorten 1 en 2 en vervolgens langzaam injecteren medium via poort 3 totdat het naar voren kwam in poort 4. Langzame en constante vulling kan worden bereikt door de volumeinstellingsring van een volumepipet van 20-100 μL te draaien. Na het vullen van het eerste reservoir kan het tweede reservoir worden gevuld door poorten 2 en 3 aan te pluggen en vervolgens langzaam medium injecteren in poort 4 totdat het in poort 1 uitkomt. ( E) Fasecontrastvan het bovenstaande observatiegebied (C) na het vullen van de twee reservoirs. Schaalbalk = 500 μm. Grafische elementen van Elias Horn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Chemotaxis test. (A) Chemoattractant werd geïntroduceerd in een van de twee reservoirs van een chemotaxis kamer door het toepassen van een 15 μL daling van medium met 0,54 μg/mL complement C5a en 10 μg/mL Patent Blue V aan vulpoort 1, gevolgd door langzame aspiratie in poort 4. (B) Aanvankelijk na te zijn getrokken in het reservoir de blauwe, chemoattractant-bevattende medium had een ruwweg omgekeerde druppel vorm, en vervolgens langzaam verspreid door het reservoir. (C) Migratiesporen van macrofagen die migreren in een chemoattractant (complement C5a) gradiënt tussen 6-12 uur na de introductie van chemoattractant in een van de reservoirs. De richting van het verloop wordt aan de rechterkant aangegeven. Het einde van elk migratiespoor wordt aangegeven door een gevulde cirkel. dD) Blox-plots van snelheid, x-FMI (x-forward migration index) en y-FMI (y-forward migration index), een index van chemotactische efficiëntie die varieert van -1 tot +1. De gegevens werden verkregen door analyse van 25 macrofaagmigratiesporen. Macrofagen in de onderste helft van het observatiegebied en met verplaatsing van ten minste één celbreedte van meer dan 6 uur werden willekeurig geselecteerd voor analyse. Hieronder vindt u een plot van migratiesporen na het normaliseren van het beginpunt naar X = 0 en Y = 0. De chemotaxis-index (y-FMI) werd berekend door de nettoverplaatsing langs de Y-as (d) te delen door de geaccumuleerde lengte (l) van het migratiepad, zoals schematisch weergegeven. Grafische elementen in panelen A en B van Elias Horn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Fluorescerende beelden van levende muis ingezetene peritoneale cellen verkregen door spinnen schijf confocale microscopie. (A) Extended focus image (helderste punt samenvoeging van alle Z-vlakken) van vers geïsoleerde muis peritoneale cellen gelabeld met groene fluorescerende anti-F4/80 (macrofaag marker) antilichamen, rode fluorescerende anti-CD19 (B-cel marker) antilichamen, en een blauwe fluorescerende nucleïnezuurvlek. Schaalbalk = 10 μm. (B) Momentopname (enkel Z-vlak) van F4/80+ cellen (macrofagen) in het observatiegebied van een chemotaxiskamer die is ingenomen na een nachtelijke chemotaxis-test. Cellen werden gelabeld met groene fluorescerende anti-F4/80 antilichamen en een blauwe fluorescerende nucleïnezuurvlek. De complement C5a en Patent Blue V gradiënten werden weggespoeld door de cel etikettering procedure, wat verklaart waarom het bovenste reservoir in het schema diagram van de chemotaxis kamer is niet blauw. Schaalbalk = 10 μm. Grafisch element van Elias Horn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Intravital imaging dateert uit de 19e eeuw en biedt een middel om het gedrag van levende immuuncellen in hun natuurlijke omgeving te bestuderen. Echter, zelfs met de geavanceerde microscopie van vandaag en genetische technieken is het moeilijk om de reactie van cellen op specifieke chemoattractants in vivo te bestuderen. Om dit probleem te omzeilen, boyden18 ontwikkeld Transwell testen in de jaren 1960, maar deze eindpunt testen niet visualisatie van hoe cellen daadwerkelijk gemigreerd naar chemoattractants, waardoor het moeilijk is om chemokinese te onderscheiden, gestimuleerd willekeurige migratie door een chemische cue32, en chemotaxis, migratie naar hogere concentraties van chemische stimuli van elkaar33. Dit probleem werd opgelost door het ontwerpen van verschillende open kamers met een brug, meestal 1 mm breed, gelegen tussen twee reservoirs en toegankelijk door een objectieve lens21,22,23. Het aanbrengen van een omgekeerde afdekking slip, gezaaid met aanhangende cellen, sluit de kamers en chemoattractant toegevoegd aan een van de reservoirs verspreidt zich over de brug naar de tegengestelde reservoir, het creëren van een concentratie gradiënt. Hier beschrijven we een chemotaxis test met behulp van hetzelfde principe, maar met behulp van een gesloten kamer met vier vulpoorten. Met behulp van dit systeem en time-lapse, fase-contrast microscopie, ontwikkelden we een test om muis ingezetene peritoneale macrofagen migreren in een chemotactische aanvulling C5a gradiënt31,34,35,36. Deze test, gecombineerd met knock-out muis modellen, bleek instrumenteel in het onderzoek naar de rollen van verschillende Rho GTPases en motoreiwitten in macrofaag morfologie, beweeglijkheid, en chemotaxis31,34,35,36,37. We hebben ook gebruik gemaakt van deze benadering van beeld menselijke perifere bloed monocyten migreren op een 2D-oppervlak of in een 3D collageen type I matrix38. Bovendien is de test geschikt voor muisbeenmerg-afgeleide macrofagen of macrofagen afgeleid van voorwaardelijk vereeuwigde myeloïde voorlopercellen39,40. We hebben eerder polytetrafluorethyleen (PTFE) zakken met luer adapters gebruikt om beenmergcellen te kweken en macrofagen te verkrijgen34. Het voordeel van PTFE zakken is dat de cellen gemakkelijk kunnen worden opgehangen en klaar voor gebruik na het plaatsen van de zak op ijs voor 20-30 min. Merk op dat we prefill de chemotaxis dia observatiegebied voor de invoering van de cellen. Deze aanpak heeft als voordeel dat ongewenste luchtbellen vervolgens kunnen worden weggespoeld (met wisselend succes) en het voorgeweekte observatiegebied maakt de langzame introductie van een celvering mogelijk door te pipetteren. Voorvulling, hoewel, verhoogt de kans dat het medium gedeeltelijk zal stromen in een of beide van de flankerende reservoirs, die het zaaien van cellen buiten het observatiegebied zal bevorderen. Als alternatief kan de celsuspensie direct in een droog observatiegebied worden gepipeterd, maar ongewenste luchtbellen kunnen vervolgens niet worden uitgezet.
De peritoneale holte van de muis bevat twee hoofdpopulaties van cellen: F4/80+ macrofagen en (kleinere) CD19+ B-cellen, met een verhouding van ongeveer 1:2 (figuur 4A). Deze twee celpopulaties zijn goed voor meer dan 95% van de peritoneale holtecellen, terwijl de resterende F4/80-/CD19- cellen meestal kunnen worden geïdentificeerd als CD11c+ cellen (dendritische cellen) of CD3+ cellen (T-cellen). Zwak aanhangende B-cellen worden tijdens het vullen van de reservoirs met het medium(figuur 2)uit het observatiegebied gewassen. Na het toevoegen van chemoattractant aan een van de twee reservoirs, time-lapse, fase-contrast microscopie kan worden gebruikt om het beeld van de resterende cellen (macrofagen) migreren in een evoluerende chemoattractant gradiënt. De vorming van de complementC5a gradiënt in het observatiegebied, via diffusie van het ene reservoir naar het andere, kan worden gesimuleerd met behulp van een fluorescerende kleurstof met een vergelijkbaar moleculair gewicht. Een goede vervanger voor recombinante muis complement C5a (voorspeld moleculair gewicht, 9,0 kDa) is fluorescerend gelabeld dextran (10 kDa)31. Met behulp van confocale microscopie kan het fluorescentieverloop in het smalle kanaal (observatiegebied) dat de twee reservoirs van de chemotaxis-glijbaan met elkaar verbindt, met vaste intervallen worden gemeten en kunnen concentratieprofielen op de verschillende tijdstippen24,31worden uitgezet . We voegen routinematig een niet-fluorescerende, blauwe kleurstof (Patent Blue V) toe aan het chemoattractant medium om een handige visuele indicator van diffusie en gradiëntvorming te bieden. Binnen 1 uur na de introductie van 15 μL blauw, chemoattractant-bevattend medium in een reservoir, lijkt het reservoir gelijkmatig blauw en, volgens fick's diffusiewetten, vormt zich een gradiënt over het smalle observatiegebied dat de reservoirs met elkaar verbindt (figuur 3B). Er zijn meerdere dagen nodig om de oplosmiddel (blauwe kleurstof of chemoattractant) gelijkmatig te verdelen.
Fluorescentiemicroscopie kan worden vervangen door fasecontrastmicroscopie, wat voordelen biedt voor geautomatiseerde celtracking, omdat fluorescerende gelabelde cellen gemakkelijk van de achtergrond kunnen worden onderscheiden. Een ander voordeel is dat specifieke populaties immuuncellen selectief kunnen worden gevolgd na het labelen van oppervlaktemarkers met fluorescerende antilichamen. We gebruikten deze benadering van beeld menselijk perifere bloed CD14+ cellen (monocyten) migreren in een chemotactische fMLP (N-formylmethionine-leucyl-fenylalanine) gradiënt38. Op dezelfde manier kunnen fluorescerende anti-F4/80-antilichamen worden gebruikt om muismacrofagen te afbeelding die migreren in een chemotactische complement C5a-gradiënt. Fototoxiciteit is een potentieel nadeel van het gebruik van fluorescentiebeeldvorming41. Dit kan worden verminderd met verschillende middelen42, met inbegrip van het gebruik van fluorophores opgewonden met langere golflengten en het toevoegen van antioxidanten aan het medium. Als alternatief konden gelabelde cellen in eerste instantie worden geïdentificeerd door fluorescentiemicroscopie en vervolgens in beeld worden gebracht door time-lapse, fasecontrastmicroscopie. In de praktijk kunnen cellen die bewegen bij matig lage snelheden, zoals ~1 μm/min (macrofagen) of ~4 μm/min (monocyten), echter met tussenpozen worden afgebeeld door fluorescentiemicroscopie met intervallen van minuten, wat goed wordt verdragen38. We gebruikten eerder fluorescentie microscopie en de chemotaxis dia hier beschreven voor 3D chemotaxis testen38,43. In dit geval werden beide reservoirs voorgevuld met medium en 15 μL chemoattractant-bevattende medium werd getrokken in een van de reservoirs onmiddellijk voordat langzaam pipetteren fluorescerend gelabelde cellen opgehangen in medium met collageen type I in het observatiegebied. Het moeilijke deel van deze procedure is de behandeling van collageen type I, dat is geconcentreerd in zure oplossing. De pH van de collageenoplossing moet worden geneutraliseerd door toevoeging van alkalische oplossing voordat u de ijskoude collageenoplossing mengt met de celsuspensie. De overdracht van het collageencelmengsel naar een couveuse bij 37 °C zal de polymerisatie van collageen in gang zetten. Tijdens de incubatietijd moet de dia langzaam rond zijn lange as worden gedraaid, zodat de cellen gelijkmatig verdeeld blijven in de X-, Y- en Z-as richtingen, terwijl het collageen polymeriseert in een gel. Een verwante gesloten chemotaxis dia geschikt voor 3D chemotaxis testen, met zes stekkers in plaats van vier stekkers, is onlangs beschreven29. Dit systeem maakt het mogelijk het collageen-celmengsel in het observatiegebied te brengen voordat het elk van de flankerende reservoirs onafhankelijk vult, omdat elk reservoir twee vulpoorten heeft, in plaats van één enkele poort.
Samengevat beschrijven we een real-time chemotaxis-test die het mogelijk maakt om cellen te visualiseren die in een chemotactische gradiënt navigeren gedurende een periode van 6 of meer uur. Hierin richten we ons op macrofagen, die een grote rol spelen bij ontstekingsziekten, maar zijn ondervertegenwoordigd in real-time chemotaxis testen in vergelijking met sneller bewegende cellen zoals neutrofielen en Dictyostelium amoebe.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie (HA 3271/3-2) van de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
| 10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| 405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
| C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
| ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
| Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |
References
- Lammermann, T., Germain, R. N. The multiple faces of leukocyte interstitial migration. Seminars in Immunopathology. 36, 227-251 (2014).
- Lammermann, T., Sixt, M. Mechanical modes of 'amoeboid' cell migration. Current Opinion in Cell Biology. 21, 636-644 (2009).
- Woodham, E. F., Machesky, L. M. Polarised cell migration: intrinsic and extrinsic drivers. Current Opinion in Cell Biology. 30, 25-32 (2014).
- Devreotes, P. N., et al. Excitable Signal Transduction Networks in Directed Cell Migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 103-125 (2017).
- Kamp, M. E., Liu, Y., Kortholt, A. Function and Regulation of Heterotrimeric G Proteins during Chemotaxis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 90 (2016).
- Miao, Y., et al. Wave patterns organize cellular protrusions and control cortical dynamics. Molecular Systems Biology. 15, 8585 (2019).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, 51-55 (2008).
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6181-6186 (1998).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature Cell Biology. 18, 1253-1259 (2016).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Leber, T. Ueber die Entstehung der Entzündung und die Wirkung der entzündungserregenden Schädlichkeiten. Fortschritte der Medizin. 6, 460-464 (1888).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4, 897-901 (2003).
- Clark, E. R., Linton Clark, E. Reactions of cells in the tail of amphibian larvae to injected croton oil (aseptic inflammation). American Journal of Anatomy. 27, 221-254 (1920).
- Clark, E. R., Linton Clark, E. The reaction of living cells in the tadpole's tail toward starch, agar-agar, gelatin, and gum arabic. The Anatomical Record. 24, (1922).
- Comandon, J. Phagocytose in vitro des Hématozoaires du Calfat (enregistrement cinématographique). Comptes Rendus Hebdomadaires des Séances et Mémoires de la Société de Biologie. 69, 314-316 (1917).
- McCutcheon, M. Chemotaxis in leukocytes. Physiological Reviews. 26, 319-336 (1946).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Horwitz, D. A., Garrett, M. A. Use of leukocyte chemotaxis in vitro to assay mediators generated by immune reactions. I. Quantitation of mononuclear and polymorphonuclear leukocyte chemotaxis with polycarbonate (nuclepore) filters. Journal of Immunology. 106, 649-655 (1971).
- Bignold, L. P. A novel polycarbonate (Nuclepore) membrane demonstrates chemotaxis, unaffected by chemokinesis, of polymorphonuclear leukocytes in the Boyden chamber. Journal of Immunological Methods. 105, 275-280 (1987).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, Pt 4 769-775 (1991).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5, 15309 (2010).
- Zengel, P., et al. mu-Slide Chemotaxis: a new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. 12, 21 (2011).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Lab Animal. 50, 241-253 (2016).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 370-386 (2008).
- Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, 81266 (2013).
- Zantl, R., Horn, E. Chemotaxis of slow migrating mammalian cells analysed by video microscopy. Methods in Molecular Biology. 769, 191-203 (2011).
- Biswenger, V., et al. Characterization of EGF-guided MDA-MB-231 cell chemotaxis in vitro using a physiological and highly sensitive assay system. PLoS One. 13, 0203040 (2018).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. European Journal of Immunology. 11, 805-815 (1981).
- Hanley, P. J., et al. Motorized RhoGAP myosin IXb (Myo9b) controls cell shape and motility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12145-12150 (2010).
- Wilkinson, P. C. Cell Locomotion and Chemotaxis: Basic Concepts and Methodological Approaches. Methods. 10, 74-81 (1996).
- Pfeffer, W. Locomotorische Richtungsbewegungen durch chemische Reize. Untersuchungen aus dem Botanischen Institut zu Tübingen. 1, 363 (1884).
- Konigs, V., et al. Mouse macrophages completely lacking Rho subfamily GTPases (RhoA, RhoB, and RhoC) have severe lamellipodial retraction defects, but robust chemotactic navigation and altered motility. The Journal of Biological Chemistry. 289, 30772-30784 (2014).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of Biological Chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bachg, A. C., et al. Phenotypic analysis of Myo10 knockout (Myo10(tm2/tm2)) mice lacking full-length (motorized) but not brain-specific headless myosin X. Scientific Reports. 9, 597 (2019).
- Horsthemke, M., et al. A novel isoform of myosin 18A (Myo18Agamma) is an essential sarcomeric protein in mouse heart. The Journal of Biological Chemistry. 294, 7202-7218 (2019).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: roles of Rho. Scientific Reports. 6, 25016 (2016).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nature Methods. 3, 287-293 (2006).
- Gran, S., et al. Imaging, myeloid precursor immortalization, and genome editing for defining mechanisms of leukocyte recruitment in vivo. Theranostics. 8, 2407-2423 (2018).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 39 (8), 1700003 (2017).
- Isfort, K., et al. Real-time imaging reveals that P2Y2 and P2Y12 receptor agonists are not chemoattractants and macrophage chemotaxis to complement C5a is phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)- and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)-independent. The Journal of Biological Chemistry. 286, 44776-44787 (2011).
