Summary
यहां हम एक कीमोटैक्टिक पूरक C5a ढाल में छवि माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज के लिए समय-चूक, चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
कीमोटैक्सिस रासायनिक ढाल के साथ कोशिकाओं का रिसेप्टर-मध्यस्थता मार्गदर्शन है, जबकि रसायन रसायन द्वारा यादृच्छिक कोशिका गतिशीलता की उत्तेजना है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं के जुड़ाव और तैनाती के लिए केमोकिनेसिस और कीमोटैक्सिस मौलिक हैं। उदाहरण के लिए, केमोकिन्स (कीमोटैक्टिक साइटोकिन्स) सूजन की असाधारण साइटों में तेजी से परिसंचारी न्यूट्रोफिल और मोनोसाइट्स की भर्ती कर सकते हैं। कीमोआकर्षितेंट रिसेप्टर्स जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के बड़े परिवार से संबंधित हैं। कैसे कीमोआकर्षितेंट (यानी, लिगामेंट) ग्रेडिएंट्स जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर सिग्नलिंग के माध्यम से प्रत्यक्ष सेल माइग्रेशन अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आता है। इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में, न्यूट्रोफिल विट्रो में कीमोटैक्सिस का अध्ययन करने के लिए लोकप्रिय मॉडल कोशिकाएं हैं। यहां हम माउस निवासी मैक्रोफेज के लिए सिलवाया एक वास्तविक समय दो आयामी (2डी) कीमोटैक्सिस परख का वर्णन करते हैं, जो पारंपरिक रूप से अध्ययन करने में अधिक कठिन रहा है। मैक्रोफेज 2 डी सतह पर ~ 1 μm/मिन की धीमी गति से चलते हैं और बिंदु-स्रोत प्रवासन परखों (जैसे, कीमोप्रोवेंट से भरे माइक्रोपाइप्ट की नोक की ओर प्रवास) न्यूट्रोफिल या डिक्टिओस्टेलियम डिस्कोइडियमकी तुलना में कम अच्छी तरह से अनुकूल होते हैं, जो परिमाण के क्रम को तेजी से आगे बढ़ाते हैं । व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले ट्रांसवेल रूप विभिन्न पदार्थों की कीमोटैक्टिक गतिविधि का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं, लेकिन सेल आकृति विज्ञान, वेग या कीमोटैक्टिक नेविगेशन के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं। यहां हम एक समय-चूक माइक्रोस्कोपी आधारित मैक्रोफेज कीमोटैक्सिस परख का वर्णन करते हैं जो सेल वेग और कीमोटैक्टिक दक्षता के मात्राकरण की अनुमति देता है और ट्रांसड्यूसर, सिग्नल पाथवे और कीमोटैक्सिस के प्रभावकों को रेखांकित करने के लिए एक मंच प्रदान करता है।
Introduction
प्रतिरक्षा कोशिकाएं आमतौर पर एक अमीबोइड फैशन1,,2में 2डी सतह पर समान रूप से माइग्रेट करती हैं, जिसमें सामने के फलाव, पूर्णांक-मध्यस्थता कोशिका आसंजन और पीछे की वापसी के बार-बार चक्र शामिल होते हैं। एक शर्त कदम सेल ध्रुवीकरण है, जिसमें कोशिकाओं के सामने और पीछे फार्म3समाप्त होता है । कीमोटैक्सिस जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स द्वारा कीमोआकर्षितेंट का पता लगाने और झिल्ली द्वारा लंगर डाले गए विषममेट्रिमेरिक जी प्रोटीन और छोटे मोनोमेरिक जी प्रोटीन, साथ ही फॉस्फोलिपिड-बाउंड ग्वानाइन न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज फैक्टर्स (जीईएफ)4,,5द्वारा मध्यस्थता करने वाले एक जटिल सिग्नलिंग नेटवर्क के साथ शुरू होता है । Cdc42 और आरएसी उपपरिवारों के Rho GTPases की सक्रियता सामने6 और Rho उपपरिवार के सदस्यों, विशेष रूप से RhoA के सदस्यों पर फैलाना प्रेरित, पीछे5,,7के संकुचन को सक्रिय । एक त्रि-आयामी (3 डी) वातावरण में, ल्यूकोसाइट माइग्रेशन के लिए पूर्णांक काफी हद तक बेमानी हैं और रोडा संकीर्ण मार्ग8के माध्यम से कोशिकाओं को फैलाएंगे के लिए अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है, जबकि Cdc42- या आरएसी-प्रेरित Arp2/3 सक्रियण कीमोटैक्टिक स्टीयरिंग9,,10के लिए महत्वपूर्ण रहता है।
प्रतिरक्षा कोशिकाओं को विशेष रूप से ऊतक चोट, रोगजनक आक्रमण और सूजन की सेटिंग्स में विभिन्न कीमोआकर्षितेंट का सामना करना पड़ सकता है। फैगोसाइट्स पूरक C3a और C5a पर व्यक्त किए गए एंडोजेनस कीमोआकर्षितेंट तेजी से पूरक झरना की सक्रियता से उत्पन्न होते हैं, और पूरक C3a और C5a रिसेप्टर्स द्वारा पहचाने जाते हैं। इसी तरह, परिगल कोशिकाएं फोरिल पेप्टाइड रिसेप्टर्स के माध्यम से फागोसाइट्स की भर्ती करती हैं, जो माइटोकॉन्ड्रिया-व्युत्पन्न के साथ-साथ बैक्टीरिया-व्युत्पन्न फोरिल पेप्टाइड्स11को पहचानती हैं। प्रतिरक्षा कोशिकाएं भी केमोकिन्स के लिए जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स को व्यक्त करती हैं, जो होमोस्टेसिस और सूजन दोनों के दौरान प्रतिरक्षा सेल तस्करी के नियमन में शामिल कीमोआकर्षितेंट पेप्टाइड्स का एक बड़ा परिवार है। चेमोकिनको पहले दो साइस्टीन (सी) अवशेषों की रिक्ति के आधार पर चार समूहों में वर्गीकृत किया जाता है: सी, सीसी, सीएक्ससी और सीएक्स3सी साइटोकिन्स, जहां एक्स एक अमीनो एसिड है। इस प्रकार, वीवो प्रतिरक्षा कोशिकाओं में अत्यधिक जटिल स्थानिक और लौकिक संकेतों का उचित जवाब देने की आवश्यकता होती है, जिससे कीमोटैक्सियों का अध्ययन एक चुनौतीपूर्ण कार्य होता है। नीचे हम कीमोटैक्सिस का एक संक्षिप्त इतिहास प्रदान करते हैं, जो इंट्रावेटल इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ शुरू हुआ।
ल्यूकोसाइट कीमोटैक्सिस का अध्ययन 188812में वापस आता है, जब नेत्र रोग विशेषज्ञ थियोडोर कार्ल गुस्ताव लेबर ने स्पष्ट रूप से ल्यूकोसाइट्स के निर्देशित प्रवास का वर्णन किया, और माइकोटिक (फंगल) केराटिटिस के मॉडल में सूजन की साइटों पर संचय किया। लेबर ने जोर देकर कहा कि रोगजनक-व्युत्पन्न पदार्थों द्वारा अतिरिक्त ल्यूकोसाइट्स का आकर्षण phagocytosis के माध्यम से हानिकारक सूक्ष्मजीवों के उन्मूलन के लिए महत्वपूर्ण है, जिसे मेचनिकॉफ (जिसे मेट्श्निकॉफ के नाम से भी जाना जाता है) ने इसी दशकमें 13में वर्णित किया था । 1 9 20 के दशक में क्लार्क और क्लार्क14,,15द्वारा वीवो प्रयोगों का भी प्रदर्शन किया गया था, जिन्होंने टैडपोल की पारदर्शिता का लाभ उठाया और दिखाया कि क्रॉटन तेल14 या अन्य परेशानियों से प्रेरित बाँझ सूजन15 ने रक्त वाहिकाओं का पालन करने के लिए ल्यूकोसाइट्स का कारण बना, जिसके बाद डायपेडेसिस (ट्रांसेंडोथेलियाल माइग्रेशन) और परेशानी की ओर ऊतक रिक्त ियों के माध्यम से तेजी से प्रवास हुआ। जीन कोमंडन16 द्वारा विकसित माइक्रोसिनेटोग्राफी विधि का उपयोग करके इन विट्रो प्रयोगों से पता चला कि ल्यूकोसाइट्स बैक्टीरिया17जैसे पार्टिकुलेट कीमोआकर्षितेंट स्रोत की ओर चले गए । उस समय, कीमोटैक्टिक कारकों की आणविक पहचान अज्ञात थी। 1960 के दशक में, स्टीफन Boyden18 मांयता प्राप्त है कि तकनीक घुलनशील पदार्थों की कीमोटैक्टिक गतिविधि का अध्ययन करने के लिए कमी थी । उन्होंने एक कक्ष तैयार किया, जिसे बाद में बॉयडन चैंबर के नाम से जाना जाता है, जिसमें फिल्टर पेपर झिल्ली से अलग दो डिब्बे थे। ऊपरी डिब्बे में एक सेल निलंबन जोड़ा जाता है और परीक्षण पदार्थ को या तो दोनों डिब्बों या केवल निचले डिब्बे में जोड़ा जाता है। एक ऊष्मायन अवधि के बाद, फिल्टर झिल्ली को हटा दिया जाता है, और कोशिकाओं को स्थिर और दाग दिया जाता है। तुलना करके कि कितनी कोशिकाएं फिल्टर झिल्ली को दोनों डिब्बों में परीक्षण पदार्थ के साथ निचले कुएं की ओर स्थानांतरित करती हैं, न तो डिब्बे में, या केवल निचले डिब्बे में, कीमोटैक्टिक गतिविधि निर्धारित की जा सकती है। ट्रांसवेल रूप आज भी लोकप्रिय हैं और विभिन्न तरीकों से संशोधित किए गए हैं, जिनमें परिभाषित ताकना आकार और घनत्व19,,20के साथ विभिन्न पॉलीकार्बोनेट झिल्ली का उपयोग शामिल है। ट्रांसवेल रूपों की एक प्रमुख खामी यह है कि माइग्रेट होने वाली कोशिकाओं की सीधे कल्पना करना अव्यावहारिक है और झिल्ली के पार माइग्रेशन पथ आमतौर पर प्रतिरक्षा कोशिका के व्यास से अधिक नहीं होता है।
सैली एच Zigmond एक कीमोटैक्सिस चैंबर21 है कि फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कर ढाल गठन और सेल आकृति विज्ञान दोनों के दृश्य सक्षम विकसित की है । कक्ष में दो समानांतर रैखिक कुओं के साथ एक प्लेक्सीग्लास (ऐक्रेलिक) स्लाइड शामिल है, प्रत्येक में ~ 100 माइक्रोन की मात्रा होती है, जो स्लाइड के ऊपरी विमान के नीचे 1 मिमी चौड़े पुल 3-10 माइक्रोन से अलग होती है। कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त एक कवरस्लिप को उलटा किया जाता है और स्लाइड पर रखा जाता है जैसे कि यह दो कुओं तक फैला होता है। कुओं में से एक के लिए एक कीमोआकर्षितेंट के अलावा, पुल के पार एक खड़ी कीमोआकर्षितेंट ढाल रूपों, आम तौर पर 30-90 मिनट के भीतर । Zigmond कक्ष में मानव बहुरूपपरमाणु ल्यूकोसाइट्स (ग्रैनुलोसाइट्स) खुद को कीमोआकर्षितेंट की ओर उन्मुख देखा जाता है । Zigmond चैंबर के रूपों की सूचना दी गई है, डन22 और Insall23 कक्षों सहित, दोनों जिनमें से एक 1 मिमी चौड़ा पुल से अलग दो कुओं में रखा कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त एक कवरस्लिप का उपयोग करें । डन चैंबर में एक गोलाकार पुल से अलग गाढ़ा कुएं होते हैं, जबकि इंसऑल चैंबर अधिक बारीकी से जिगमंड चैंबर से संबंधित है, लेकिन दो अलग-अलग चौड़ाई, 0.5 मिमी और 1 मिमी के पुल प्रदान करता है। एक उपन्यास कीमोटैक्सिस चैंबर, जिसका नाम माइक्रो-स्लाइड कीमोटैक्सिस और प्लास्टिक इंजेक्शन मोल्डिंग द्वारा निर्मित, जेमगेल एट अल24द्वारा वर्णित किया गया था। कीमोटैक्सिस चैंबर में 2 मिमी की लंबाई और 70 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ 1 मिमी चौड़े चैनल द्वारा अलग किए गए दो 40 माइक्रोनल जलाशय होते हैं। कक्ष के नीचे एक गैस परगम्य, पतली प्लास्टिक शीट के साथ एक ही मोटाई और एक नंबर 1.5 ग्लास कवरस्लिप24के ऑप्टिकल गुणों से बनता है। यहां हम एक कीमोटैक्टिक (पूरक C5a) ढाल में 14 घंटे तक के लिए माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज के प्रवास की कल्पना करने के लिए μ-स्लाइड कीमोटैक्सिस चैंबर का उपयोग करके कीमोटैक्सिस परख का वर्णन करते हैं।
Protocol
प्रोटोकॉल हमारी स्थानीय अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशा निर्देशों का पालन करते हैं, साथ ही पशु देखभाल दिशानिर्देश भी ।
नोट: चित्रा 1 कीमोटैक्सिस परख के एक कार्यप्रवाह से पता चलता है ।
1. प्रीफिलिंग कीमोटैक्सिस स्लाइड्स
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संशोधित आरपीएमआई 1640 एचपीईएस माध्यम का उपयोग करके एक या दो कीमोटैक्सिस स्लाइड के 1 मिमी चौड़े और 2 मिमी लंबे कनेक्टिंग चैनलों को प्रीफिल करें, जिसमें बाइकार्बोनेट-फ्री आरपीएमआई 1640 मीडियम शामिल है जिसमें 20 एमएम 4-(2-हाइड्रोक्सेथेथिल) - 1-पाइपाज़ीनेथेनसल्फोनिक एसिड (HEPES), 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और ऐसे पेनिसिलिन (१०० U/mL) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०० μg/mL), 100x पेनिसिलिन/streptomycin कमजोर द्वारा तैयार के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं, और 1 μg/mL लिपोपोलिसाक्जारिडी (ई. कोलाईसे), और एक टोल की तरह रिसेप्टर 4 ligand इस्तेमाल किया कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए।
- एक दौर (10 सेमी व्यास) सेल संस्कृति पकवान में एक कीमोटैक्सिस स्लाइड(चित्रा 2A)रखें, दोनों पहले से गरम 37 डिग्री सेल्सियस तक, और एक गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) एल्यूमीनियम ब्लॉक पर पकवान सेट करें। पोर्ट 1 और 4(चित्रा 2B)में प्लग डालें ।
नोट: एक एल्यूमीनियम ब्लॉक 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा और लैमिनार प्रवाह हुड के अंदर रखा केमोटैक्सिस कक्षों को तैयार करने के लिए उपयोगी है। आदर्श रूप से, गर्म ब्लॉक को विभिन्न ट्यूबों के लिए एक फ्लैट कार्य क्षेत्र और कुओं प्रदान करना चाहिए, जैसे 50 मिलील ट्यूब और 2 मिलीआर माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब। - एक बेवल्ड टिप के साथ 10-200 माइक्रोन पिपेट टिप का उपयोग करके, संशोधित आरपीएमआई 1640 HEPES माध्यम के 15 माइक्रोन को पोर्ट 3(चित्रा 2 B)भरने में जमा करें। इसके बाद, वॉल्यूम अभी भी 15 माइक्रोन पर सेट है और (2-20 माइक्रोन वॉल्यूम) पिपेट के कंट्रोल बटन को उदास कर दिया गया है, पोर्ट 2 में पिपेट टिप डालें और मामूली तेज दर पर 15 माइक्रोन करें(चित्रा 2B)। यह चैनल (अवलोकन क्षेत्र) को जोड़ने वाले 1 मिमी x 2 मिमी के साथ-साथ दो फ्लैंकिंग आपूर्ति चैनलों (केंद्रीय अवलोकन क्षेत्र और बंदरगाहों 2 और 3 के बीच क्रमशः) को प्रीफिल करेगा। कवर भरने बंदरगाहों 2 और 3 टोपियां के साथ ।
- प्रीफिलिंग के बाद, कीमोटैक्सिस स्लाइड को एक बंद आर्द्रता कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर अन्यथा शुष्क और सीओ2-मुक्तइनक्यूबेटर के भीतर रखे गए रैक पर रखें।
नोट: कीमोटैक्सिस स्लाइड भरने के लिए सही पिपेट टिप का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। भरने बंदरगाह के शीर्ष में एक beveled पिपेट टिप वेजेज, जबकि आमतौर पर इस्तेमाल किया नुकीले पिपेट युक्तियों को भरने बंदरगाह में और अधिक गहराई से डाला जा सकता है और तरल पदार्थ के प्रवाह के लिए प्रतिरोध में काफी वृद्धि हो सकती है ।
- एक दौर (10 सेमी व्यास) सेल संस्कृति पकवान में एक कीमोटैक्सिस स्लाइड(चित्रा 2A)रखें, दोनों पहले से गरम 37 डिग्री सेल्सियस तक, और एक गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) एल्यूमीनियम ब्लॉक पर पकवान सेट करें। पोर्ट 1 और 4(चित्रा 2B)में प्लग डालें ।
2. माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज का अलगाव
- अस्थिर एनेस्थेटिक आइसोफ्लोरीन (और 5% हवा में) या कार्बन डाइऑक्साइड25की उच्च एकाग्रता का उपयोग करके 3-4 महीने पुराने माउस का त्याग करें, इसके बाद सर्वाइकल अव्यवस्था। कृंतकों में दक्षिणपंथी पलटा का नुकसान मनुष्यों में चेतना की हानि के साथसंबंधित है । माउस के पेट को पानी में 80% इथेनॉल से साफ करें और फिर कुंद युक्तियों के साथ सर्जिकल कैंची का उपयोग करके 1-2 सेमी मिडलाइन त्वचा चीरा बनाएं। अंतर्निहित पेट की दीवार को बेनकाब करने के लिए त्वचा को वापस छील ें।
- पेरिटोनियल गुहा में 24 ग्राम प्लास्टिक कैथेटर डालें। 5 मिलीग्राम प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग करके, सीए2 + और एमजी2 +के बिना 2 x 4.5 मिलीग्राम बर्फ-ठंडा हैंक के बफर्ड नमक समाधान (एचबीएस) का उपयोग करके गुहा को लावेज करें। सिरिंज में अवशिष्ट एचबीएसके 0.5 मिलीग्राम के आसपास छोड़ दें ताकि ऊतक अनजाने में कैथेटर की नोक पर चूसा जा सके।
- लैवएज माध्यम, आमतौर पर कुल 8-8.5 मिलील को 14 मिलीआर पॉलीप्रोपाइलीन राउंड बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 6.5 न्यूनतम के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित करें।
नोट: गोल नीचे ट्यूब सुपरनेट को पूरी तरह से डिलैंट करने की अनुमति देती है और सेल झुरमुट को कम करती है। - संशोधित आरपीएमआई 1640 हेप्स मीडियम के 200 माइक्रोन में पेरानेंट को त्यागें और पेरिटोनियल कोशिकाओं (आमतौर पर ~ 4 x 106 कोशिकाओं प्रति माउस) को फिर से निलंबित करें। सेल निलंबन 1:20 का एक नमूना पतला करें और कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक न्यूबॉयर बेहतर गिनती कक्ष जैसे मतगणना उपकरण का उपयोग करें। इसके बाद, सेल निलंबन को 10 x 106 कोशिकाओं/mL की अंतिम एकाग्रता में पतला करें और एक गर्म एल्यूमीनियम ब्लॉक का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गोल बॉटम 2 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब में कोशिकाओं को बनाए रखें (चरण 1.1.1 में नोट देखें)।
3. कीमोटैक्सिस स्लाइड्स में पेरिटोनियल सेल को सीडिंग
- 100 माइक्रोन (या आधे निलंबन की मात्रा पर) पर सेट पिपेट वॉल्यूम के साथ 5x के ऊपर और नीचे सेल निलंबन को पाइप करने के बाद, धीरे-धीरे सेल निलंबन के 10 माइक्रोन को एक कीमोटैक्सिस चैंबर(चित्रा 2 C)के पोर्ट 3 में जमा करें। पिपेट टिप को पोर्ट 2 में रखें और धीरे-धीरे सेल निलंबन को कनेक्टिंग चैनल(चित्रा 2 C)में खींचें। जैसे ही सेल निलंबन शुरू किया गया है, बंदरगाहों 1 और 4 पर प्लग हटा दें, जो सेल निलंबन के प्रवाह को गिरफ्तार करने में मदद करेगा। सभी चार भरने बंदरगाहों पर टोपियां रखें।
- सभी कीमोटैक्सिस कक्षों के लिए चरण 3.1 दोहराएं। एक छोटे से उल्टे माइक्रोस्कोप और एक 10x चरण-विपरीत उद्देश्य लेंस का उपयोग करना, अवांछित हवा बुलबुले के लिए कीमोटैक्सिस स्लाइड का निरीक्षण करें।
- 2-3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रता कक्ष में पेरिटोनियल कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त कीमोटैक्सिस स्लाइड रखें।
4. जलाशयों को भरना और कीमोआकर्षितेंट जोड़ना
- एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अवलोकन क्षेत्र (दो 40 μL जलाशयों को जोड़ने चैनल) का निरीक्षण करें।
नोट: इस स्तर पर, जलाशयों को भरने के बाद कोशिका घनत्व अधिक होगा, क्योंकि कमजोर अनुयायी कोशिकाएं, मुख्य रूप से CD19+ कोशिकाएं (बी 1 कोशिकाएं), भरने की प्रक्रिया(चित्रा 2सी-ई)के दौरान अवलोकन क्षेत्र से बाहर धोई जाएंगी। - पोर्ट 1 और 2(चित्रा 2D)भरने में प्लग प्लेस । सुनिश्चित करें कि पोर्ट 3 भरना मध्यम और हवा के बुलबुले से मुक्त के साथ शीर्ष पर भरा हुआ है। यदि आवश्यक हो तो अवांछित हवा के बुलबुले को उखाड़ फेंकने के लिए बाँझ 27 जी सिरिंज सुई का उपयोग करें।
- 10-100 माइक्रोन वॉल्यूम मैकेनिकल पिपेट का उपयोग करना, संशोधित आरपीएमआई 1640 हेप्स मीडियम के एस्पिरेट ~ 60 माइक्रोन का उपयोग करके और पिपेट टिप को पोर्ट 3 भरने में रखें। जलाशय में धीरे-धीरे और तेजी से मध्यम इंजेक्ट करने के लिए पिपेट की वॉल्यूम सेटिंग रिंग का उपयोग करें ताकि मध्यम 1-2 मिन(चित्रा 2D)के बाद पोर्ट 4 भरने के शीर्ष तक पहुंच जाए।
- दूसरा जलाशय भरें। पोर्ट 1 से प्लग ले जाएँ और धीरे-धीरे इसे पोर्ट 3(चित्रा 2डी)में डालें। इसके बाद, संशोधित आरपीएमआई 1640 हेप्स मीडियम के एस्पिरेट ~ 50 माइक्रोन और पिपेट टिप को पोर्ट 4 भरने में रखें। दूसरे जलाशय में मध्यम इंजेक्ट करने के लिए 10-100 माइक्रोन वॉल्यूम पिपेट की वॉल्यूम सेटिंग रिंग का उपयोग करें ताकि मध्यम 1-2 मिन(चित्रा 2D)के बाद पोर्ट 1 भरने के शीर्ष पर पहुंच जाए।
- संशोधित आरपीएमआई 1640 हेप्स मीडियम के 495 माइक्रोन को एक (राउंड बॉटम) 2 एमएल माइक्रोसेन्ड्रिफ्यूज ट्यूब में रखें और पेटेंट ब्लू वी (स्टॉक सॉल्यूशन: फास्फेट-बफर्ड लवलाइन [पीबीएस]), में 10 मिलीग्राम/एमएल के 5 माइक्रोन जोड़ें, जो एकाग्रता ढाल गठन के दृश्य संकेतक के रूप में उपयोग की जाने वाली नीली रंग है। संक्षिप्त भंवर द्वारा मिलाएं। रिकॉम्बिनेंट माउस के 5.4 माइक्रोन जोड़ें C5a पूरक (स्टॉक समाधान: 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन के साथ पीबीएस में 50 μg/mL) और संक्षिप्त भंवर द्वारा मिश्रण करें।
- नीले रंग के 15 μL जमा, पोर्ट 1(चित्रा 3A)भरने में C5a युक्त माध्यम पूरक, सुनिश्चित करें कि बंदरगाह के शीर्ष पर उथले अवसाद मध्यम मुक्त है बनाने के बाद (अंयथा ड्रॉप spillover हो सकता है) ।
- पोर्ट 4 भरने में एक 10-200 μL पिपेट टिप डालें और धीरे-धीरे और तेजी से नीले रंग की बूंद आकर्षित करने के लिए 10-100 माइक्रोन वॉल्यूम पिपेट की वॉल्यूम सेटिंग रिंग को घुमाएं, विपरीत जलाशय में C5a-युक्त माध्यम का पूरक(चित्रा 3B)। एयर पोर्ट 1 भरने के छोटे ऊर्ध्वाधर कॉलम में प्रवेश करना शुरू कर देगा। हवा में ड्रा जब तक तरल पदार्थ हवा इंटरफेस ऊर्ध्वाधर स्तंभ में मिडवे है, और फिर धीरे से बंदरगाह में एक प्लग डालें ।
- धीरे-धीरे पोर्ट 4 से पिपेट उठाएं, दूसरे हाथ का उपयोग करके यह सुनिश्चित करें कि स्लाइड जगह में तय रहती है। अंत में, धीरे-धीरे पोर्ट 4(चित्रा 3B)प्लग करें।
- उल्टे माइक्रोस्कोप पर कीमोटैक्सिस स्लाइड का निरीक्षण।
नोट: अवलोकन क्षेत्र में शेष अनुयायी कोशिकाएं मुख्य रूप से मैक्रोफेज होनी चाहिए। यह फ्लोरोसेंटी टैग एंटी-F4/80 एंटीबॉडी का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है (F4/80 माउस मैक्रोफेज के लिए एक विशिष्ट मार्कर है) । बी कोशिकाओं फ्लोरोसेंटी टैग विरोधी CD19 एंटीबॉडी और F4/80-/CD19 का उपयोग कर की पहचान की जा सकतीहै-कोशिकाओं को एक नीले फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग(चित्रा 4)का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है ।-
5. समय-चूक, चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग मैक्रोफेज माइग्रेशन
- स्टेज इनक्यूबेटर लगे उल्टे माइक्रोस्कोप के स्टेज पर कीमोटैक्सिस स्लाइड रखें। तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
- इमेज 10x फेज-कंट्रास्ट ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करके 1 मिमी x 2 मिमी अवलोकन क्षेत्र और मैक्रोफेज लैमेलीपोडिया पर ध्यान केंद्रित करें: पतली, शीट जैसी झिल्ली फलाव। हर 2 मिन में 1 फ्रेम की दर से 14 घंटे के लिए छवियों पर कब्जा करें।
6. समय चूक छवियों का विश्लेषण
- इमेजजे के लिए फैब्रिक पी कॉर्डेलेरेस द्वारा उत्पादित स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर या मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन का उपयोग करके समय-चूक, चरण-विपरीत छवियों का विश्लेषण करें।
नोट: स्वचालित ट्रैकिंग कार्यक्रमों का उपयोग या तो समय-चूक, चरण-विपरीत, या फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेज्ड कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कॉर्डेलेरेस एट अल द्वारा उत्पादित जावा-आधारित सॉफ्टवेयर iTrack4Uका उपयोग समय-चूक, चरण-विपरीत, या फ्लोरेसेंस छवियों को इनपुट के रूप में स्वचालित सेल ट्रैकिंग और विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। मैनुअल ट्रैकिंग अधिक समय लगता है, लेकिन इमेजजे प्लगइन मैनुअल ट्रैकिंग द्वारा उत्पन्न पटरियों को सीधे आयात किया जा सकता है और इमेजजे प्लगइन कीमोटैक्सिस और माइग्रेशन टूल28,,29द्वारा स्वचालित रूप से विश्लेषण किया जा सकता है।
Representative Results
कीमोटैक्टिक ग्रेडिएंट में माइग्रेट होने वाले माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज की टाइम-लैप्स वीडियो माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग की जाने वाली कीमोटैक्सिस स्लाइड का एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 2एमें दिखाया गया है। स्लाइड में तीन कीमोटैक्सिस चैंबर हैं, जिनमें से प्रत्येक में चार फिलिंग पोर्ट हैं । स्लाइड के ऊपर दिखाए गए प्लग का उपयोग करके बंदरगाहों को व्यक्तिगत रूप से बंद किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, बंध्यता बनाए रखने के लिए एक अनप्लग्ड बंदरगाह पर एक गैर-सीलिंग कैप रखी जा सकती है। पोर्ट 1 और 4 प्लग करने के बाद, पोर्ट 2 और 3 के बीच अवलोकन क्षेत्र (दो जलाशयों को जोड़ने वाला 1 मिमी चौड़ा x 2 मिमी लंबा x 70 माइक्रोन उच्च चैनल) पोर्ट 3 में 15 माइक्रोन ड्रॉप रखकर और पोर्ट 2(चित्रा 2 बी)में 2-20 माइक्रोन वॉल्यूम पिपेट के साथ एस्पिरेटिंग करके मध्यम से भरा जा सकता है। माउस निवासी पेरिटोनियल कोशिकाओं (10 x 106 कोशिकाओं/mL) के निलंबन को बंदरगाह 3 में निलंबन की 10 माइक्रोन ड्रॉप रखकर अवलोकन क्षेत्र में वरीयता दी गई थी और धीरे-धीरे पोर्ट 2(चित्रा 2 C)पर कोसिटिंग की गई थी। 10x ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करके चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा ली गई अवलोकन क्षेत्र में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की एक विशिष्ट छवि चित्रा 2 सीमें दिखाई गई है। 2-3 घंटे के लिए इनक्यूबेटिंग के बाद, कीमोटैक्सिस स्लाइड धीरे-धीरे मध्यम(चित्रा 2डी)से भरी हुई थी। बंदरगाहों 1 और 2 प्लगिंग के बाद, मध्यम धीरे से बंदरगाह 3 के माध्यम से इंजेक्शन था जब तक यह 4 बंदरगाह से उभरा । इसके बाद, प्लग बंदरगाह 1 से बंदरगाह 3 के लिए बंद कर दिया गया था, और फिर दूसरा जलाशय धीरे से बंदरगाह 4 के माध्यम से मध्यम इंजेक्शन से भर गया था जब तक यह बंदरगाह 1 पर उभरा । इस स्तर पर, अवलोकन क्षेत्र में कोशिकाओं को उल्टे माइक्रोस्कोप(चित्रा 2E)का उपयोग करके पुनर्निरीक्षण किया गया था। शीघ्र ही छवियों की तुलना करके(चित्रा 2C)और बाद(चित्रा 2E)जलाशयों के भरने, कोशिकाओं के दो तिहाई तक अवलोकन क्षेत्र से बाहर धोया गया था । आम तौर पर, कमजोर अनुयायी CD19+ कोशिकाओं (B1 कोशिकाओं) को धोया गया था और शेष कोशिकाएं मुख्य रूप से F4/80+ कोशिकाओं (मैक्रोफेज) थीं। यह फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्येक सेल प्रकार को फ्लोरोसेंटी लेबल विशिष्ट एंटीबॉडी(चित्र 4)के साथ लेबल करने के बाद प्रदर्शित किया गया था। चित्रा 4Aमें, हौसले से अलग माउस निवासी पेरिटोनियल कोशिकाओं को हरे फ्लोरोसेंट फ्लोरोफोर-कॉन्जुरेट एंटी-एफ 4/80 एंटीबॉडी और लाल फ्लोरोसेंट फ्लोरोफोर-कॉन्जुगाइज्ड एंटी-सीडी19 एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया था, और कोशिकाओं के नाभिक को नीले फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ लेबल किया गया था। F4/80 माउस मैक्रोफेज30के लिए एक विशिष्ट मार्कर है, जबकि सीडी19 एक बी सेल मार्कर है । चित्रा 4B एक कीमोटैक्सिस चैंबर के अवलोकन क्षेत्र में डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी कताई द्वारा छवि F4/80+ कोशिकाओं से पता चलता है । कोशिकाओं को एक रात कीमोटैक्सिस परख के बाद लेबल किया गया समय चूक, चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा दर्ज की गई ।
पूरक C5a (chemoattractant) ०.५४ μg/mL (recombinant माउस) पूरक C5a और 10 μg/mL पेटेंट ब्लू वी भरने में पोर्ट 1(चित्रा 3A)से युक्त मध्यम की एक 15 μL ड्रॉप रखकर दो जलाशयों में से एक को पेश किया गया था बंदरगाह 2 और 3 प्लगिंग के बाद । कीमोआकर्षितेंट माध्यम धीरे-धीरे बंदरगाह 4 के माध्यम से एक पिपेट के साथ धीमी आकांक्षा द्वारा जलाशय में खींचा गया था। चित्रा 3B एक जलाशय में 15 μL ड्रॉप ड्राइंग के बाद नीले रंग के प्रसार से पता चलता है । पेटेंट ब्लू वी का उपयोग कीमोआकर्षितेंट प्रसार के अप्रत्यक्ष दृश्य संकेतक के रूप में किया गया था। पूरक C5a अणु पेटेंट ब्लू वी (9.0 केडीए बनाम 0.57 केडीए) की तुलना में काफी बड़े हैं और धीरे-धीरे फैलाना करते हैं। जलाशय में पूरक C5a के प्रसार के बाद, इसकी एकाग्रता ~0.2 μg/mL (15 μL/40 μL [जलाशय मात्रा] x 0.54 μg/mL = 0.2 μg/mL), ~ 22.5 एनएम के बराबर थी। 3 घंटे के बाद अवलोकन क्षेत्र में एक विनय खड़ी ढाल का गठन किया गया और वृद्धि जारी रही, जो लगभग 12 घंटे31पर अधिकतम तक पहुंच गया। चित्रा 3C कीमोआकर्षितेंट जोड़ने के बाद 6-12 घंटे के बीच, एक पूरक C5a ढाल में पलायन मैक्रोफेज के प्रवास पटरियों से पता चलता है । सेल वेग और कीमोटैक्टिक दक्षता, वाई-एफएमआई (वाई-फॉरवर्ड माइग्रेशन इंडेक्स; रेंज: -1 से +1) और एक्स-एफएमआई, व्यक्तिगत मैक्रोफेज के रूप में अनुक्रमित माइग्रेशन प्लॉट्स(चित्रा 3 डी)से गणना की गई थी। चित्रा 3डी बॉक्स भूखंडों के नीचे एक्स = 0 और वाई = 0 के लिए प्रत्येक माइग्रेशन ट्रैक के स्टार्ट पॉइंट को सामान्य करने के बाद उत्पादित एक माइग्रेशन प्लॉट भी दिखाता है। माइग्रेशन प्लॉट में इनसेट से पता चलता है कि प्रत्येक माइग्रेशन ट्रैक के लिए वाई-एफएमआई की गणना कैसे की गई थी ।
चित्रा 1: कीमोटैक्सिस परख का कार्यप्रवाह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: कीमोटैक्सिस स्लाइड की हैंडलिंग। (A)चार प्लग और चार कैप के साथ कीमोटैक्सिस स्लाइड का 3डी दृश्य। स्लाइड में तीन कीमोटैक्सिस चैम्बर्स हैं, जिनमें से प्रत्येक में 1 मिमी x 2 मिमी चैनल से जुड़े दो 40 माइक्रोन जलाशय होते हैं, जो 70 माइक्रोन उच्च है, जिसे अवलोकन क्षेत्र कहा जाता है। (ख)कनेक्टिंग चैनल बंदरगाहों को भरने के लिए दोनों सिरों पर फैला हुआ है 2 और 3 । पोर्ट 1 और 4 भरने में प्लग डालने के बाद, अवलोकन क्षेत्र को 10-200 माइक्रोन पाइपेट टिप के साथ पोर्ट 2 पर मध्यम की एक बूंद डालकर मध्यम (लाल) से भरा गया था। बाद में, 37 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड इनक्यूबेटिंग और सेल निलंबन की तैयारी करने से पहले पोर्ट 2 और 3 बंदरगाहों पर टोपियां लागू की गईं। (ग)अवलोकन क्षेत्र, जहां कीमोआकर्षितेंट ढाल का गठन किया गया था, बंदरगाह 3 पर माउस निवासी पेरिटोनियल कोशिकाओं की 10 माइक्रोन ड्रॉप लागू करके मैक्रोफेज के साथ वरीयता प्राप्त की गई थी और धीरे-धीरे पोर्ट 2 पर एस्पिरेटिंग की गई थी। इसके बाद स्लाइड को आर्द्रता कक्ष में 2-3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया। 10x ऑब्जेक्टल लेंस के माध्यम से प्राप्त दाईं ओर दिखाए गए चरण-विपरीत छवि, 2 घंटे स्केल बार = 500 माइक्रोन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सीडिंग और ऊष्मायन के बाद पेरिटोनियल कोशिकाओं को दिखाती है।(डी)कीमोटैक्सिस कक्षों को बंदरगाहों 1 और 2 को प्लग करके मध्यम से भर दिया गया था और फिर धीरे-धीरे पोर्ट 3 के माध्यम से मध्यम इंजेक्शन जब तक यह बंदरगाह 4 पर उभरा नहीं था। धीमी गति से और स्थिर भरने के एक 20-100 μL मात्रा पिपेट की मात्रा सेटिंग अंगूठी मोड़ द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । पहले जलाशय को भरने के बाद, दूसरे जलाशय को बंदरगाहों 2 और 3 को प्लग करके भरा जा सकता है और फिर धीरे-धीरे पोर्ट 4 पर मध्यम इंजेक्शन जब तक यह पोर्ट 1 पर उभर नहीं जाता। (ई)दोनों जलाशयों को भरने के बाद ऊपर दिखाए गए एक ही अवलोकन क्षेत्र(सी)की चरण-विपरीत छवि। स्केल बार = 500 माइक्रोन एलियास हॉर्न द्वारा प्रदान किए गए ग्राफिक तत्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: कीमोटैक्सिस परख । (A)कीमोटैक्सिस चैंबर के दो जलाशयों में से एक को 0.54 μg/mL पूरक C5a और 10 μg/mL पेटेंट ब्लू वी से युक्त माध्यम की 15 माइक्रोन ड्रॉप लागू करके पोर्ट 1 पर धीमी आकांक्षा के बाद कीमोटैक्सिस चैंबर के दो जलाशयों में से एक को पेश किया गया था । (ख)शुरू में जलाशय में तैयार होने के बाद नीले, कीमोआकर्षितेंट युक्त माध्यम में मोटे तौर पर उल्टे बूंद आकार था, और फिर धीरे से जलाशय भर में फैलाहुआ । (ग)एक जलाशय में कीमोआकर्षितेंट शुरू करने के बाद 6-12 घंटे के बीच कीमोप्रोवेंट (पूरक C5a) ढाल में पलायन मैक्रोफेज के प्रवास ट्रैक । ढाल की दिशा दाईं ओर इंगित की जाती है। प्रत्येक माइग्रेशन ट्रैक का अंत एक भरे हुए सर्कल द्वारा इंगित किया जाता है। (घ)वेग के ब्लोक्स भूखंड, एक्स-एफएमआई (एक्स-फॉरवर्ड माइग्रेशन इंडेक्स) और वाई-एफएमआई (वाई-फॉरवर्ड माइग्रेशन इंडेक्स), कीमोटैक्टिक दक्षता का एक सूचकांक जो -1 से +1 तक होता है। 25 मैक्रोफेज माइग्रेशन ट्रैक के विश्लेषण से डेटा प्राप्त किया गया था । अवलोकन क्षेत्र के निचले आधे हिस्से में मैक्रोफेज और 6 घंटे से अधिक कम से कम एक सेल चौड़ाई का विस्थापन दिखाना बेतरतीब ढंग से विश्लेषण के लिए चुना गया था। नीचे एक्स = 0 और वाई = 0 के लिए स्टार्ट पॉइंट को सामान्य करने के बाद माइग्रेशन ट्रैक का एक प्लॉट है। कीमोटैक्सिस सूचकांक (वाई-एफएमआई) की गणना माइग्रेशन पथ की संचित लंबाई (एल) द्वारा वाई-एक्सिस (डी) के साथ शुद्ध विस्थापन को विभाजित करके की गई थी, जैसा कि स्कीमेट रूप से दिखाया गया है। एलियास हॉर्न द्वारा प्रदान किए गए पैनलए और बी में ग्राफिक तत्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र4: डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी कताई द्वारा प्राप्त जीवित माउस निवासी पेरिटोनियल कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियां। (A)विस्तारित फोकस छवि (सभी जेड-विमानों का प्रतिभाशाली बिंदु विलय) हरे फ्लोरोसेंट एंटी-एफ 4/80 (मैक्रोफेज मार्कर) एंटीबॉडी, लाल फ्लोरोसेंट एंटी-सीडी19 (बी सेल मार्कर) एंटीबॉडी, और एक नीले फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ लेबल ताजा अलग माउस पेरिटोनियल कोशिकाओं के। स्केल बार = 10 μm.(बी)स्नैपशॉट (एकल जेड-विमान) F4/80+ कोशिकाओं (मैक्रोफेज) के एक रात कीमोटैक्सिस परख के बाद लिया एक कीमोटैक्सिस चैंबर के अवलोकन क्षेत्र में । कोशिकाओं को हरे फ्लोरोसेंट एंटी-एफ4/80 एंटीबॉडी और ब्लू फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ लेबल किया गया था । पूरक C5a और पेटेंट ब्लू वी ढाल सेल लेबलिंग प्रक्रिया है, जो बताते है क्यों कीमोटैक्सिस चैंबर के योजनाबद्ध आरेख में ऊपरी जलाशय नीला नहीं है द्वारा धोया गया । स्केल बार = 10 माइक्रोन एलियास हॉर्न द्वारा प्रदान किया गया ग्राफिक तत्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
इंट्राग्लाइज्ड इमेजिंग 1 9वीं शताब्दी की तारीखें हैं और अपने प्राकृतिक वातावरण में जीवित प्रतिरक्षा कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन करने का साधन प्रदान करती हैं। हालांकि, आज की उन्नत माइक्रोस्कोपी और आनुवंशिक तकनीकों के साथ भी वीवो में विशिष्ट कीमोआकर्षितेंट के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का अध्ययन करना मुश्किल है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, Boyden18 1960 के दशक में ट्रांसवेल रूप विकसित की है, लेकिन इन अंत बिंदु परख कैसे कोशिकाओं को वास्तव में कीमोआकर्षितेंट की ओर चले गए, यह मुश्किल केमोकिनेसिस भेद करने के लिए, एक रासायनिक क्यू३२द्वारा यादृच्छिक प्रवास उत्तेजित, और कीमोटैक्सिस, एक दूसरे से रासायनिक उत्तेजनाओं की उच्च सांद्रता की ओर प्रवास३३ । इस समस्या को एक पुल के साथ विभिन्न खुले कक्षों को डिजाइन करके हल किया गया था, आमतौर पर 1 मिमी चौड़ा, दो जलाशयों के बीच स्थित है और एक उद्देश्य लेंस21,,22,,23द्वारा सुलभ है। एक उल्टे कवर स्लिप लागू करना, जो अनुयायी कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त है, कक्षों को बंद कर देता है और कीमोआकर्षितेंट को पुल के पार जलाशयों में से एक में जोड़ा जाता है, जिससे एकाग्रता ढाल बन जाती है। यहां हम एक ही सिद्धांत का उपयोग कर केमोटैक्सीपर का वर्णन करते हैं, लेकिन चार भरने वाले बंदरगाहों की विशेषता वाले बंद कक्ष का उपयोग करते हैं। इस प्रणाली और समय-चूक, चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, हमने छवि माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज को कीमोटैक्टिक पूरक C5a ढाल31,,34,,35,,36में माइग्रेट करने के लिए एक परख विकसित की। नॉकआउट माउस मॉडल के साथ संयुक्त यह परख, मैक्रोफेज आकृति विज्ञान, गतिशीलता, और कीमोटैक्सिस,31,34,,35,36,,37में विभिन्न Rho GTPases और मोटर प्रोटीन की भूमिकाओं की जांच में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई साबित हुई।, हमने 2 डी सतह पर या 3डी कोलेजन प्रकार आई मैट्रिक्स38में माइग्रेट होने वाले मानव परिधीय रक्त मोनोसाइट्स की छवि के लिए इस दृष्टिकोण का भी उपयोग किया है। इसके अलावा, परख माउस बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज या मैक्रोफेज के लिए उपयुक्त है जो सशर्त अमर माइलॉयड अग्रदूत कोशिकाओं39,,40से प्राप्त होता है। हमने पहले पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) बैग का उपयोग किया है, जिसमें संस्कृति अस्थि मज्जा कोशिकाओं के लिए ल्यूयर एडाप्टर हैं और मैक्रोफेज34प्राप्त करते हैं। पीटीएफई बैग का लाभ यह है कि कोशिकाओं को 20-30 मिन के लिए बर्फ पर बैग रखने के बाद आसानी से फिर से निलंबित किया जा सकता है और उपयोग के लिए तैयार किया जा सकता है ध्यान दें कि हम कोशिकाओं को शुरू करने से पहले कीमोटैक्सिस स्लाइड अवलोकन क्षेत्र को प्रीफिल करते हैं। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि अवांछित हवा के बुलबुले को बाद में (चर सफलता के साथ) निकाला जा सकता है और पूर्वबद्ध अवलोकन क्षेत्र पाइपिंग द्वारा सेल निलंबन की धीमी शुरुआत को सक्षम बनाता है। प्रीफिलिंग, हालांकि, संभावना बढ़ जाती है कि माध्यम आंशिक रूप से एक या दोनों फ्लैंकिंग जलाशयों में प्रवाहित होगा, जो अवलोकन क्षेत्र से परे कोशिकाओं के सीडिंग को बढ़ावा देगा। वैकल्पिक रूप से, सेल निलंबन सीधे एक शुष्क अवलोकन क्षेत्र में पाइप किया जा सकता है, लेकिन अवांछित हवा बुलबुले बाद में निष्कासित नहीं किया जा सकता है।
माउस की पेरिटोनियल गुहा में कोशिकाओं की दो मुख्य आबादी होती है: F4/80+ मैक्रोफेज और (छोटे) CD19+ बी कोशिकाएं, लगभग 1:2(चित्रा 4A)के अनुपात में। ये दो सेल आबादी पेरिटोनियल गुहा कोशिकाओं के ९५% से अधिक के लिए खाते हैं, जबकि शेष F4/80-/CD19-कोशिकाओं को आमतौर पर CD11c+ कोशिकाओं (dendritic कोशिकाओं) या CD3+ कोशिकाओं (टी कोशिकाओं) के रूप में पहचाना जा सकता है ।-- कमजोर अनुयायी बी कोशिकाओं को मध्यम(चित्रा 2)के साथ जलाशयों को भरने के दौरान अवलोकन क्षेत्र से धोया जाता है। दो जलाशयों में से एक में कीमोआकर्षितेंट जोड़ने के बाद, समय-चूक, चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक विकसित कीमोआकर्षितेंट ढाल में पलायन करने वाली शेष कोशिकाओं (मैक्रोफेज) को छवि देने के लिए किया जा सकता है। अवलोकन क्षेत्र में पूरक C5a ढाल के गठन, एक जलाशय से दूसरे जलाशय में प्रसार के माध्यम से, इसी तरह के आणविक वजन के साथ एक फ्लोरोसेंट रंग का उपयोग कर नकली किया जा सकता है । Recombinant माउस के पूरक C5a के लिए एक अच्छा विकल्प (अनुमानित आणविक वजन, 9.0 केडीए) फ्लोरोसेंटली लेबल dextran (10 केडीए)31है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, कीमोटैक्सिस स्लाइड के दो जलाशयों को जोड़ने वाले संकीर्ण चैनल (अवलोकन क्षेत्र) में फ्लोरेसेंस ग्रेडिएंट को निश्चित अंतराल पर मापा जा सकता है और विभिन्न समय बिंदुओं पर एकाग्रता प्रोफाइलको 24,,31प्लॉट किया जा सकता है। हम नियमित रूप से प्रसार और ढाल गठन का एक सुविधाजनक दृश्य संकेतक प्रदान करने के लिए कीमोआकर्षितेंट माध्यम में एक नॉनफ्लोरोसेंट, ब्लू डाये (पेटेंट ब्लू वी) जोड़ते हैं। एक जलाशय में नीले, कीमोआकर्षितेंट युक्त माध्यम के 15 μL शुरू करने के 1 घंटे के भीतर, जलाशय समान रूप से नीला दिखाई देता है और, प्रसार के Fick के कानूनों के अनुसार, जलाशयों को जोड़ने के संकीर्ण अवलोकन क्षेत्र में एक ढाल बनेगी(चित्रा 3B)। समान रूप से वितरित होने के लिए सॉल्यूट (नीली रंग या कीमोआकर्षितेंट) के लिए कई दिनों की आवश्यकता होती है।
फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जो स्वचालित सेल ट्रैकिंग के लिए लाभ प्रदान करता है, क्योंकि फ्लोरोसेंटी लेबल वाली कोशिकाओं को पृष्ठभूमि से आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। एक और लाभ यह है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी को फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ सतह मार्कर लेबलिंग के बाद चुनिंदा रूप से ट्रैक किया जा सकता है। हमने छवि मानव परिधीय रक्त CD14+ कोशिकाओं (मोनोसाइट्स) में माइग्रेट करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग किया जो कीमोटैक्टिक एफएमएलपी (एन-फॉरिलमेथथिओनी-ल्यूसिल-फिनाइललिन) ढाल38में माइग्रेट करते हैं। इसी तरह, फ्लोरोसेंट एंटी-F4/80 एंटीबॉडी का उपयोग कीमोटैक्टिक पूरक C5a ढाल में माइग्रेट माउस मैक्रोफेज छवि के लिए किया जा सकता है। फोटोटॉक्सिकिटी फ्लोरेसेंस इमेजिंग41का उपयोग करने का एक संभावित नुकसान है। इसे विभिन्नसाधनों 42द्वारा कम किया जा सकता है, जिसमें लंबे समय तक तरंगदैर्ध्य के साथ उत्साहित फ्लोरोफोरस का उपयोग करना और माध्यम में एंटीऑक्सीडेंट जोड़ना शामिल है। वैकल्पिक रूप से, लेबल कोशिकाओं को शुरू में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जा सकता है और बाद में समय-चूक, चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजकिया जा सकता है। हालांकि, व्यवहार में, मामूली कम वेग पर चलती कोशिकाओं, जैसे ~1 μm/min (मैक्रोफेज) या ~ 4 μm/मिन (मोनोसाइट्स), रुक-रुक कर मिनटों के अंतराल पर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया जा सकता है, जो अच्छी तरह से३८सहन किया जाता है । हमने पहले फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और कीमोटैक्सिस स्लाइड का उपयोग 3डी कीमोटैक्सिस परख38,43के लिए किया था। इस मामले में, दोनों जलाशयों को मध्यम और 15 μL कीमोआकर्षितेंट युक्त माध्यम से भरा गया था, जो धीरे-धीरे कोलेजन प्रकार I को अवलोकन क्षेत्र में निलंबित करने वाले माध्यम में निलंबित फ्लोरोसेंटी लेबल वाली कोशिकाओं को पाइप करने से तुरंत पहले जलाशयों में से एक में तैयार किया गया था। इस प्रक्रिया का कठिन हिस्सा कोलेजन प्रकार I की हैंडलिंग है, जो अम्लीय समाधान में केंद्रित है। कोलेजन समाधान के पीएच को सेल निलंबन के साथ बर्फ-ठंडे कोलेजन समाधान को मिलाने से पहले क्षारीय समाधान के अलावा निष्प्रभावी करने की आवश्यकता है। कोलेजन-सेल मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करने से कोलेजन बहुलककरण शुरू हो जाएगा। ऊष्मायन के दौरान, स्लाइड को धीरे-धीरे अपनी लंबी धुरी के चारों ओर घुमाया जाना चाहिए ताकि कोशिकाएं एक्स-, वाई-और जेड-एक्सिस दिशाओं में समान रूप से वितरित रहें, जबकि कोलेजन जेल में बहुलक हो जाए। एक संबंधित बंद कीमोटैक्सिस स्लाइड 3 डी कीमोटैक्सिस के लिए उपयुक्त है, जिसमें चार प्लग के बजाय छह प्लग हैं, हाल ही में29वर्णित किए गए हैं । यह प्रणाली कोलेजन-सेल मिश्रण को स्वतंत्र रूप से प्रत्येक फ्लैंकिंग जलाशयों को भरने से पहले अवलोकन क्षेत्र में पेश करने की अनुमति देती है, क्योंकि प्रत्येक जलाशय में एक ही बंदरगाह के बजाय दो भरने वाले बंदरगाह होते हैं।
संक्षेप में, हम एक वास्तविक समय कीमोटैक्सिस परख का वर्णन करते हैं जो 6 या उससे अधिक घंटे की अवधि में कीमोटैक्टिक ढाल में नेविगेट करने वाली कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देता है। इसके साथ हम मैक्रोफेज पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो भड़काऊ रोगों में प्रमुख भूमिकानिभाते हैं, लेकिन न्यूट्रोफिल और डिक्टिओस्टेलियम अमीबी जैसी तेजी से चलती कोशिकाओं की तुलना में वास्तविक समय कीमोटैक्सिस परख में कम प्रतिनिधित्व किया गया है ।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को डीएफजी (ड्यूश फोर्स्चुंग्सजेमिन्स्चफ्ट) से अनुदान (एचए 3271/3-2) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |
References
- Lammermann, T., Germain, R. N. The multiple faces of leukocyte interstitial migration. Seminars in Immunopathology. 36, 227-251 (2014).
- Lammermann, T., Sixt, M. Mechanical modes of 'amoeboid' cell migration. Current Opinion in Cell Biology. 21, 636-644 (2009).
- Woodham, E. F., Machesky, L. M. Polarised cell migration: intrinsic and extrinsic drivers. Current Opinion in Cell Biology. 30, 25-32 (2014).
- Devreotes, P. N., et al. Excitable Signal Transduction Networks in Directed Cell Migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 103-125 (2017).
- Kamp, M. E., Liu, Y., Kortholt, A. Function and Regulation of Heterotrimeric G Proteins during Chemotaxis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 90 (2016).
- Miao, Y., et al. Wave patterns organize cellular protrusions and control cortical dynamics. Molecular Systems Biology. 15, 8585 (2019).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, 51-55 (2008).
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6181-6186 (1998).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature Cell Biology. 18, 1253-1259 (2016).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Leber, T. Ueber die Entstehung der Entzündung und die Wirkung der entzündungserregenden Schädlichkeiten. Fortschritte der Medizin. 6, 460-464 (1888).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4, 897-901 (2003).
- Clark, E. R., Linton Clark, E. Reactions of cells in the tail of amphibian larvae to injected croton oil (aseptic inflammation). American Journal of Anatomy. 27, 221-254 (1920).
- Clark, E. R., Linton Clark, E. The reaction of living cells in the tadpole's tail toward starch, agar-agar, gelatin, and gum arabic. The Anatomical Record. 24, (1922).
- Comandon, J. Phagocytose in vitro des Hématozoaires du Calfat (enregistrement cinématographique). Comptes Rendus Hebdomadaires des Séances et Mémoires de la Société de Biologie. 69, 314-316 (1917).
- McCutcheon, M. Chemotaxis in leukocytes. Physiological Reviews. 26, 319-336 (1946).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Horwitz, D. A., Garrett, M. A. Use of leukocyte chemotaxis in vitro to assay mediators generated by immune reactions. I. Quantitation of mononuclear and polymorphonuclear leukocyte chemotaxis with polycarbonate (nuclepore) filters. Journal of Immunology. 106, 649-655 (1971).
- Bignold, L. P. A novel polycarbonate (Nuclepore) membrane demonstrates chemotaxis, unaffected by chemokinesis, of polymorphonuclear leukocytes in the Boyden chamber. Journal of Immunological Methods. 105, 275-280 (1987).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, Pt 4 769-775 (1991).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5, 15309 (2010).
- Zengel, P., et al. mu-Slide Chemotaxis: a new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. 12, 21 (2011).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Lab Animal. 50, 241-253 (2016).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 370-386 (2008).
- Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, 81266 (2013).
- Zantl, R., Horn, E. Chemotaxis of slow migrating mammalian cells analysed by video microscopy. Methods in Molecular Biology. 769, 191-203 (2011).
- Biswenger, V., et al. Characterization of EGF-guided MDA-MB-231 cell chemotaxis in vitro using a physiological and highly sensitive assay system. PLoS One. 13, 0203040 (2018).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. European Journal of Immunology. 11, 805-815 (1981).
- Hanley, P. J., et al. Motorized RhoGAP myosin IXb (Myo9b) controls cell shape and motility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12145-12150 (2010).
- Wilkinson, P. C. Cell Locomotion and Chemotaxis: Basic Concepts and Methodological Approaches. Methods. 10, 74-81 (1996).
- Pfeffer, W. Locomotorische Richtungsbewegungen durch chemische Reize. Untersuchungen aus dem Botanischen Institut zu Tübingen. 1, 363 (1884).
- Konigs, V., et al. Mouse macrophages completely lacking Rho subfamily GTPases (RhoA, RhoB, and RhoC) have severe lamellipodial retraction defects, but robust chemotactic navigation and altered motility. The Journal of Biological Chemistry. 289, 30772-30784 (2014).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of Biological Chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bachg, A. C., et al. Phenotypic analysis of Myo10 knockout (Myo10(tm2/tm2)) mice lacking full-length (motorized) but not brain-specific headless myosin X. Scientific Reports. 9, 597 (2019).
- Horsthemke, M., et al. A novel isoform of myosin 18A (Myo18Agamma) is an essential sarcomeric protein in mouse heart. The Journal of Biological Chemistry. 294, 7202-7218 (2019).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: roles of Rho. Scientific Reports. 6, 25016 (2016).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nature Methods. 3, 287-293 (2006).
- Gran, S., et al. Imaging, myeloid precursor immortalization, and genome editing for defining mechanisms of leukocyte recruitment in vivo. Theranostics. 8, 2407-2423 (2018).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 39 (8), 1700003 (2017).
- Isfort, K., et al. Real-time imaging reveals that P2Y2 and P2Y12 receptor agonists are not chemoattractants and macrophage chemotaxis to complement C5a is phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)- and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)-independent. The Journal of Biological Chemistry. 286, 44776-44787 (2011).