Summary
Cet article présente des procédures expérimentales pour évaluer des affaiblissements de mémoire dans les souris épileptiques pilocarpine-induites. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les mécanismes pathophysiologic du déclin cognitif associé à l’épilepsie, qui est l’une des comorbidités les plus courantes dans l’épilepsie.
Abstract
L’affaiblissement cognitif est l’une des comorbidités les plus communes dans l’épilepsie de lobe temporel. Pour récapituler le déclin cognitif associé à l’épilepsie dans un modèle animal d’épilepsie, nous avons généré des souris épileptiques chroniques traitées par pilocarpine. Nous présentons un protocole pour trois tests comportementaux différents à l’aide de ces souris épileptiques : l’emplacement des objets nouveaux (NL), la reconnaissance d’objets nouveaux (NO), et les tests de séparation des motifs (PS) pour évaluer l’apprentissage et la mémoire des lieux, des objets et des contextes, respectivement. Nous expliquons comment définir l’appareil comportemental et fournir des procédures expérimentales pour les tests NL, NO et PS à la suite d’un essai en terrain ouvert qui mesure les activités locomotrices basales des animaux. Nous décrivons également les avantages techniques des essais de NL, de NO, et de PS en ce qui concerne d’autres essais comportementaux pour évaluer la fonction de mémoire chez les souris épileptiques. Enfin, nous discutons des causes et des solutions possibles pour les souris épileptiques ne parviennent pas à faire 30 s de bon contact avec les objets au cours des séances de familiarisation, qui est une étape critique pour les tests de mémoire réussies. Ainsi, ce protocole fournit des informations détaillées sur la façon d’évaluer les troubles de la mémoire associés à l’épilepsie à l’aide de souris. Les tests NL, NO et PS sont des essais simples et efficaces qui sont appropriés pour l’évaluation de différents types de mémoire chez les souris épileptiques.
Introduction
L’épilepsie est un trouble chronique caractérisé par des crises récurrentes spontanées1,2,3. Parce que les crises répétitives peuvent causer des anomalies structurelles et fonctionnelles dans le cerveau1,2,3, l’activité de crise anormale peut contribuer au dysfonctionnement cognitif, qui est l’une des comorbidités les plus communes associées à l’épilepsie4,5,6. Contrairement aux événements chroniques de saisie, qui sont transitoires et momentanés, les affaiblissements cognitifs peuvent persister tout au long de la vie des patients épileptiques, détériorant leur qualité de vie. Par conséquent, il est important de comprendre les mécanismes pathophysiologic du déclin cognitif associé à l’épilepsie.
Divers modèles animaux expérimentaux de l’épilepsie ont été utilisés pour démontrer les déficits d’apprentissage et de mémoire associés à l’épilepsie chronique7,8,9,10,11,12. Par exemple, le labyrinthe d’eau de Morris, le conditionnement contextuel de la peur, le tableau de trou, l’emplacement d’un objet nouveau (NL) et les tests de reconnaissance d’objets nouveaux (NO) ont souvent été utilisés pour évaluer le dysfonctionnement de la mémoire dans l’épilepsie du lobe temporel (TLE). Parce que l’hippocampe est l’une des régions primaires dans lesquelles TLE montre la pathologie, les tests comportementaux qui peuvent évaluer la fonction de mémoire dépendante de l’hippocampe sont souvent sélectionnés de préférence. Cependant, étant donné que les saisies peuvent induire la neurogenèse hippocampique aberrante et contribuer au déclin cognitif associé à l’épilepsie10, paradigmes comportementaux pour tester la fonction neuronale néonatale dentate (c.-à-d., séparation de modèle spatial, PS)8,13 peuvent également fournir des informations valables sur les mécanismes cellulaires des affaiblissements de mémoire dans l’épilepsie.
Dans cet article, nous démontrons une batterie de tests de mémoire, NL, NO, et PS, pour les souris épileptiques. Les tests sont simples et facilement accessibles et ne nécessitent pas un système sophistiqué.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université catholique de Corée et ont été effectuées conformément au Guide national des instituts de santé pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (publications des NIH no 80-23).
1. Test de localisation d’objets nouveaux (NL)
- Préparer les souris épileptiques C57BL/6 ou transgéniques 4 à 6 semaines après l’injection de pilocarpine.
REMARQUE : Des saisies aigues ont été induites par l’injection intraperitoneal (IP) de pilocarpine, suivant le protocole détaillé dans notre rapport précédent14. - Transférer les souris épileptiques de la salle de reproduction à la salle de comportement un jour avant le début des tests comportementaux. Laissez les souris s’habituer pendant au moins 12 h pendant la nuit.
- Dans la salle de comportement, séparer les souris individuelles dans de nouvelles cages pour un logement simple. Écrivez les informations pour chaque animal sur la carte de cage et gardez les animaux dans les mêmes cages tout au long des tests comportementaux. Plusieurs cages peuvent être transférées simultanément à l’aide d’un chariot.
- Le lendemain, commencez 3 jours de séances d’accoutumination (H1-H3) tôt le matin. Acclimatez les animaux à la faible lumière dans leurs cages domestiques pendant au moins 30 min.
- Préparer une boîte à champ ouvert avec des dimensions extérieures de 44 x 44 x 31 cm et des dimensions intérieures de 43 x 43 x 30,5 cm. Le jour 1 de l’accoutumance (H1), placez un illuminomètre au centre de la boîte à champ ouvert et ajustez l’éclairage à 60 lux.
- Vaporiser le sol et les murs de la boîte à champ ouvert avec 70% d’éthanol et essuyer avec un essuie-tout propre pour enlever les indices olfactifs possibles. Attendez ensuite au moins 1 min jusqu’à ce que l’alcool résiduel ait complètement séché.
- Évaluez l’activité locomotrice de chaque souris en effectuant un essai sur le terrain ouvert.
- Pour enregistrer et suivre le comportement de chaque souris expérimentale, utilisez un logiciel de suivi vidéo de comportement animal (voir Tableau des matériaux).
- Une fois le logiciel de suivi vidéo ouvert, étalonner la taille de la boîte à champ ouvert. Ensuite, définissez la zone de suivi. Définissez 3 s de latence et 15 min de temps d’acquisition pour éviter de suivre les mains d’un expérimentateur. Insérez les informations sur chaque souris expérimentale (groupe, sexe, âge, etc.).
- Ensuite, placez doucement une souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert face au mur. Faites-le en le plaçant sur le couvercle de la cage pour minimiser le stress et l’anxiété associés à la manipulation. Ensuite, relâchez la souris près du mur de la boîte à champ ouvert qui est la plus éloignée de l’endroit où les objets seront pendant la session de familiarisation (étape 1.9.3.).
REMARQUE : Une fois que la souris est dans la boîte ouverte, le logiciel de suivi de la souris la détectera automatiquement et commencera à enregistrer. Pour un suivi optimal de l’exploration, la caméra peut être placée directement au-dessus de la boîte à champ ouvert. - Après 15 minutes d’enregistrement, remettre l’animal dans sa cage intérieure en le plaçant sur le couvercle de la cage. Nettoyez la boîte à champ ouvert avec un spray à 70 % d’éthanol et essuyez-le avec un essuie-tout propre entre les essais. Restaurer la lumière vive et mesurer la distance totale parcourue par l’animal à l’aide du logiciel de suivi vidéo selon les instructions du fabricant.
- Ouvrez le logiciel de suivi vidéo et les clips vidéo. Ensuite, cliquez sur Analyse pour calculer la distance totale parcourue en fonction de l’étalonnage de la taille de la boîte à champ ouvert.
- Le jour 2 et le jour 3, effectuez les séances d’accoutumétation (H2, H3) en répétant les étapes 1,3 à 1,7.
- Le jour 4, effectuer la séance de familiarisation (F1).
- Dans la pénombre, placez chaque souris dans le champ ouvert vide pendant 3 min. Après cette brève réadaptation, retournez l’animal dans sa cage.
- Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets avec 70% d’éthanol et essuyez-les avec un essuie-tout. Attendez qu’au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
- Placez deux objets identiques (poupées en caoutchouc, objet A) dans l’arène de champ ouvert à 5 cm des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif recto-verso. Introduisez la souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert, face au mur le plus éloigné des objets.
- Autoriser l’exploration gratuite pendant 20 min et mesurer manuellement le temps passé à explorer les deux objets à l’aide de deux chronomètres. Une fois que la souris atteint le temps d’exploration minimum (30 s) pour les deux objets, arrêtez la session de F1 et transférez l’animal dans sa cage d’attache. Si la souris ne parvient pas à explorer les objets pendant 30 s dans les 20 minutes, retirez la souris de la boîte à champ ouvert et excluez-la des sessions supplémentaires.
- Une fois que l’animal est retiré de la boîte à champ ouvert, nettoyez soigneusement le sol et les murs de la boîte avec 70% de pulvérisation d’éthanol et essuyez-les avec un essuie-tout.
REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet.
- Le jour 5, effectuez la séance d’essai de NL.
- Transférer la souris de sa cage à domicile à la zone ouverte pour la réadaptation pendant 3 min. Puis retournez l’animal dans sa cage.
- Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets avec 70% d’éthanol et essuyez-les avec un essuie-tout. Attendez qu’au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
- Déplacez un objet (poupée en caoutchouc, objet A) à la position diagonale, à 5 cm des murs adjacents. Fixez l’objet avec du ruban adhésif recto-verso. Transférer la souris expérimentale sur son couvercle de cage à la zone de champ ouvert et la placer face au mur de la boîte à champ ouvert.
REMARQUE : Contrebalancer l’emplacement de l’objet déplacé pour réduire toute préférence innée potentielle pour une certaine direction. Par exemple, modifiez l’emplacement de l’objet préféré de la séance de familiarisation pour la moitié des animaux expérimentaux, et pour le reste des animaux, déplacez l’objet moins préféré de la séance de familiarisation. - Autoriser 10 min d’exploration et d’enregistrement gratuits avec un système de suivi vidéo. Mesurer le temps passé à explorer chaque objet à l’aide de deux chronomètres et calculer le ratio de discrimination
REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet. - Attrapez la queue de la souris expérimentale et placez-la sur son couvercle de cage pour le transférer à sa cage à la maison. Pendant 3 jours (jours 6 à 8), laissez la souris se reposer avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.
- Une fois que l’animal est retiré de la boîte à champ ouvert, nettoyez soigneusement le sol et les murs de la boîte avec 70% de pulvérisation d’éthanol et essuyez-les avec un essuie-tout.
2. Nouveau test de reconnaissance d’objets (NO)
- Le jour 9, effectuez une séance d’accoutumé 15 min en répétant les étapes 1.2-1.7.
- Le jour 10, effectuer la séance de familiarisation (F1).
- Dans la faible lumière, placer la souris dans le champ ouvert vide pendant 3 min. Après avoir réhabilité la souris à la zone de champ ouvert, retournez-la temporairement dans sa cage d’origine.
- Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets avec 70% d’éthanol et essuyez-le avec un essuie-tout. Attendez au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
- Placez deux objets identiques (tubes en plastique de 50 ml remplis de 40 ml d’eau, objet B) dans le champ ouvert à 5 cm des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif recto-verso. Introduisez la souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert face au mur le plus éloigné des objets.
- Comme l’animal est exposé aux deux objets différents (tube en plastique de 50 ml rempli de 40 ml d’eau, objet B; bocal Coplin en verre, objet C) dans le test NO, contrebalancer l’objet pendant la session de F1. Par exemple, présenter deux objets identiques (pots coplin en verre, objet C) pour la moitié des animaux du groupe.
- Autoriser l’exploration gratuite pendant 20 min et mesurer manuellement le temps passé à explorer les deux objets à l’aide de deux chronomètres. Une fois que la souris atteint le temps d’exploration minimum (30 s) pour les deux objets, arrêtez la session de F1 et transférez l’animal dans sa cage d’attache. Si la souris ne parvient pas à explorer les objets pendant 30 s dans les 20 minutes, retirez-la de la boîte à champ ouvert et excluez-la des sessions supplémentaires.
- Une fois que l’animal est retiré de la boîte à champ ouvert, nettoyez soigneusement le sol et les murs de la boîte avec 70% de pulvérisation d’éthanol et essuyez-les avec un essuie-tout.
REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet.
- Le lendemain (jour 11), effectuer la séance d’essai NO.
- Transférer la souris de sa cage à la maison au champ ouvert pour la réadaptation pendant 3 minutes, puis remettre l’animal dans sa cage d’origine.
- Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets avec 70% d’éthanol et essuyez-le avec un essuie-tout. Attendez qu’au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
- Remplacer un objet (tube en plastique de 50 ml rempli de 40 ml d’eau, objet B) par un autre objet (jar de coplin en verre, objet C) à 5 cm des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif recto-verso. Transférer la souris expérimentale sur le couvercle de la cage au champ ouvert, et la placer face au mur. Contrebalancer les objets présentés ensemble lors du test NO. Remplacer, par exemple, un bocal Coplin en verre (objet C) par un tube en plastique de 50 ml rempli de 40 ml d’eau (objet B) pour les souris exposées aux deux pots Coplin en verre (objet C) pendant la séance de familiarisation.
REMARQUE : Contrebalancier l’emplacement de l’objet remplacé peut également être effectué pour réduire la préférence innée potentielle pour une certaine direction. Par exemple, pour chaque cohorte d’animaux exposés à l’ensemble de deux objets (objet B ou objet C), modifiez l’objet préféré dans la séance de familiarisation pour la moitié des animaux expérimentaux et remplacez l’objet moins préféré dans la séance de familiarisation. - Autoriser 10 min d’exploration gratuite et enregistrer à l’aide d’un système de suivi vidéo. Mesurez le temps passé à explorer chaque objet à l’aide de deux chronomètres et calculez le ratio de discrimination.
REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet. - Prenez la queue de la souris expérimentale et placez-la sur le couvercle de la cage pour le transférer à sa cage à la maison. Pendant 3 jours (jours 12-14), laissez la souris se reposer avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.
- Une fois que l’animal est retiré de la boîte à champ ouvert, nettoyez soigneusement le sol et les murs de la boîte à champ ouvert avec un spray à 70 % d’éthanol et essuyez-les avec un essuie-tout.
3. Test de séparation de modèle (PS)
- Le 15e jour, effectuer la première séance de familiarisation (F1) pour le test PS.
- Transférer la souris de sa cage à domicile à la zone de champ ouvert pour la réadaptation pendant 3 minutes, puis le retourner à sa cage à domicile.
- Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets et la plaque de plancher quadrillée avec 70% d’éthanol et essuyez-le avec un essuie-tout. Attendez qu’au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
- Placez la plaque de plancher (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) avec la grille large (5,5 x 5,5 cm) dans la boîte à champ ouvert et placez deux objets identiques (T-flacons en plastique remplis de 50 ml d’eau, objet D) dans le champ ouvert à 5 cm des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif recto-verso. Introduisez la souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert face au mur le plus éloigné des objets.
- Comme l’animal est exposé à deux objets différents (T-flask en plastique rempli de 50 ml d’eau, objet D; bouteille en verre, objet E) dans le test PS, contrebalancer l’objet pendant les sessions de F1 et F2. Par exemple, présenter deux objets identiques (bouteilles en verre, objet E) sur le plancher de la grille large pour la moitié des animaux du groupe.
- Autoriser l’exploration gratuite pendant 20 min, et mesurer manuellement le temps passé à explorer les deux objets à l’aide de deux chronomètres. Une fois que la souris atteint le minimum de temps d’exploration total (30 s) pour les deux objets, arrêtez la session de F1 et transférez l’animal dans sa cage d’origine. Si la souris ne parvient pas à explorer les objets pendant 30 s dans les 20 minutes, retirez-la de la boîte à champ ouvert et excluez-la des sessions supplémentaires.
REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet. - Après la fin de la première séance de familiarisation (F1), nettoyez soigneusement les objets et la plaque de plancher avec un spray à 70% d’éthanol et retirez-les de la boîte ouverte.
- Le lendemain (jour 16), effectuer la deuxième séance de familiarisation (F2) pour le test PS.
- Transférer la souris de sa cage à la maison à la zone ouverte pour la réadaptation pendant 3 minutes, puis retourner l’animal à sa cage à la maison.
- Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets et la plaque de plancher quadrillée avec 70% d’éthanol et essuyez-le avec un essuie-tout. Attendez qu’au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
- Placez la plaque de plancher (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) avec la grille étroite (2,75 x 2,75 cm) dans la boîte à champ ouvert et placez deux objets identiques (bouteilles en verre, objet E) dans le champ ouvert à 5 cm des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif recto-verso. Introduisez la souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert face au mur le plus éloigné des objets.
- Pour le contrepoids, présenter deux objets identiques (T-flacons en plastique remplis de 50 ml d’eau, objet D) sur le plancher étroit de la grille.
- Autoriser l’exploration gratuite pendant 20 min et mesurer manuellement le temps passé à explorer les deux objets à l’aide de deux chronomètres. Une fois que la souris atteint le minimum de temps d’exploration total (30 s) pour les deux objets, arrêtez la session F2 et transférez l’animal dans sa cage d’origine. Si la souris ne parvient pas à explorer les objets pendant 30 s dans les 20 minutes, retirez-la de la boîte à champ ouvert et excluez-la des sessions supplémentaires.
REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet. - Après la fin de la deuxième séance de familiarisation (F2), nettoyez soigneusement les objets et la plaque de plancher avec un spray à 70 % d’éthanol et retirez-les de la boîte ouverte.
- Le lendemain (jour 17), effectuer la séance d’essai PS.
- Transférer la souris de sa cage à domicile à la zone de champ ouvert pour la réadaptation pendant 3 minutes, puis le retourner à sa cage à domicile.
- Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets et la plaque de plancher quadrillée avec 70% d’éthanol et essuyez-le avec un essuie-tout. Attendez qu’au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
- Placez la plaque de plancher avec la grille étroite (2,75 x 2,75 cm) dans la boîte à champ ouvert et placez deux objets différents (T-flacon en plastique rempli de 50 ml d’eau, objet D; bouteille en verre, objet E) sur la plaque de plancher à 5 cm des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif recto-verso. Transférer la souris expérimentale sur le couvercle de la cage à la zone ouverte du champ et la placer face au mur.
- Contrebalancer les objets présentés ensemble lors du test PS. Par exemple, placez chaque objet (objet D, objet E) sur le plancher étroit de grille pour faire de l’objet E un objet nouveau dans ce contexte. Contrebalancer l’emplacement de l’objet D ou de l’objet E (un objet nouveau sur le motif de plancher étroit) peut également être effectuée pour réduire le potentiel d’une préférence innée pour une certaine direction. Par exemple, remplacez l’objet préféré de la deuxième séance de familiarisation pour la moitié des animaux expérimentaux, et pour le reste des animaux, remplacez l’objet moins préféré de la deuxième séance de familiarisation.
- Autoriser 10 min d’exploration et d’enregistrement gratuits à l’aide d’un système de suivi vidéo. Mesurez le temps passé à explorer chaque objet à l’aide de deux chronomètres et calculez le ratio de discrimination.
REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet. - Prenez la queue de la souris expérimentale et placez-la sur le couvercle de la cage pour le transférer à sa cage à la maison.
4. Coloration violette cresyl
- Après avoir effectué tous les tests comportementaux, anesthésiez l’animal en injectant un cocktail (4:0.5) de kétamine (50 mg/mL) et de xylazine (23,3 mg/mL) dissous en saline à une dose de poids corporel de 110 ml/kg (IP; seringue de 1 ml; 26 G d’aiguille). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par l’absence d’une réponse à une pincée d’ateil.
- Une fois que l’animal est profondément anesthésié, effectuer la perfusion transcardiale avec 4% de paraformaldéhyde pour fixer le cerveau15.
- Une fois la perfusion transcardiale terminée, décapiter l’animal avec une paire de ciseaux15. Ensuite, retirez le crâne à l’aide d’une paire de ciseaux d’iris pour exposer le cerveau. Après que le cerveau soit isolé, le postfixe dans 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit, suivi de la cryoprotection dans 30% de saccharose dans 0,01 M phosphate-tamponné saline.
- Faire des sections coronales (30 m) à partir du cerveau surgelé à l’aide d’un cryostat.
- Montez les tissus cérébraux sur des toboggans et effectuez une série d’étapes d’hydratation de l’éthanol à l’eau du robinet à 100 % en lisant 3 min séquentiellement dans 100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 % d’éthanol.
- Incuber les diapositives tissulaires dans 0,1% de solution violette cresyl pour 15 min.
- Enlever la tache excessive en immergeant les diapositives de tissu dans 95% d’éthanol/0,1% d’acide acétique glaciaire, puis déshydrater les tissus avec des solutions de 100% d’éthanol, 50% d’éthanol/50% de xylène, et 100% de xylène.
- Couvre les diapositives de tissu à l’aide d’un milieu de montage de xylène disponible dans le commerce.
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Representative Results
Un calendrier expérimental général et la configuration pour évaluer la fonction cognitive sont indiqués dans la figure 1. Six semaines après l’introduction de crises aigues induites par la pilocarpine, les souris ont été soumises aux tests NL, NO et PS dans cet ordre séparé par des périodes de repos de 3 jours entre les tests(figure 1A). Pour le test de NL, deux objets identiques ont été placés dans le champ ouvert pendant la session de familiarisation (F1), et le lendemain, un objet a été déplacé vers un nouvel emplacement. Dans le test NO, un objet a été remplacé par un nouvel objet au cours de la session d’essai. Pour le test PS, les deux sessions de familiarisation (F1, F2) ont introduit des combinaisons de différents modèles et objets de grille de plancher. Puis, le jour du test, un objet de chaque séance de familiarisation a été placé sur le motif étroit du plancher de grille, faisant un roman d’objet dans le contexte du modèle étroit de plancher de grille (figure 1B). La boîte à champ ouvert peut être placée sur un bureau directement sous une caméra d’appareil couplée à la charge et entourée d’un rideau noir pour éviter les repères visuels inutiles(figure 2A). Les objets de l’échantillon étaient faciles à nettoyer des matériaux d’une taille similaire ou légèrement plus grands qu’une souris(figure 2B). Les combinaisons d’objets devaient être présélectionnées pour confirmer qu’il n’y avait pas de préférence significative entre les deux objets présentés ensemble(figure 2C). Les plaques de plancher avec différents modèles ont été placées dans la boîte de champ ouvert pour fournir des indices expérimentaux supplémentaires dans le test PS(figure 2B). Une fois qu’une souris a été introduite dans la boîte à champ ouvert, un système de suivi vidéo a suivi sa trajectoire pour analyser sa distance totale de locomotion(figure 2D). Six semaines après une injection de pilocarpine, les souris épileptiques ont montré une réduction significative du rapport de discrimination dans le test de NL, démontrant une altération de la mémoire spatiale(figure 3). En outre, dans le test NO, qui est un test pour la mémoire de reconnaissance d’objet, les souris épileptiques ont montré la fonction altérée de mémoire comparée aux contrôles faux. Quand la fonction neuronale dentate nouveau-né a été évaluée avec le test de PS, les souris épileptiques ont eu la difficulté à reconnaître l’objet nouveau dans un contexte avec des indices multiples. Au fur et à mesure que les expériences de lutte, l’activité locomotrice et la latence pour atteindre les critères d’exploration au cours de la séance de familiarisation ont été évalués(figure 3). La mesure de l’activité locomotrice a montré une augmentation significative des animaux épileptiques(figure 3C), en ligne avec les rapports précédents16,17, tandis que la motivation d’explorer les objets était comparable entre les animaux de faux et d’épilepsie(figure 3D). Nos taux d’abandon du décrochage qui n’ont pas les critères d’exploration au cours de la séance de familiarisation étaient de 17,4 %, 18,2 %, 0 % pour le test NL, NO et PS, respectivement, ce qui suggère que les animaux se sont habitués aux environnements expérimentaux au cours de la série d’essais comportementaux. Enfin, nous avons évalué la mort de cellules hippocampales après l’épilepticus induit par la pilocarpine à l’aide de taches violets cresyl pour confirmer les dommages neuronaux induits par la saisie(figure 4). Les animaux traités par pilocarpine ont démontré des cellules pyknotiques dans le hilus et le sous-champ CA3 de l’hippocampe, contrairement aux contrôles fictifs(figure 4).
Figure 1 : Présentation schématique de la batterie de test comportementale. (A) Un dessin schématique du calendrier comportemental pour le lieu de l’objet roman (NL), la reconnaissance d’objet roman (NO), et la séparation de modèle (PS) tests pour les souris simulées et épileptiques. (B) Images représentatives des arrangements de l’objet et de la plaque de plancher pour les tests NL, NO et PS. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Appareil comportemental pour l’évaluation de la fonction cognitive. (A) Un aperçu général du réglage comportemental. Une caméra a été placée directement au-dessus de la boîte à champ ouvert, qui était entourée par le rideau pour éviter les indices inutiles. (B) Exemple d’objets pour le nouvel emplacement de l’objet (NL), de la reconnaissance d’objets nouveaux (NO) et du test de séparation des motifs (PS). Pour le test PS, une plaque de plancher avec des motifs différents, c’est-à-dire des grilles larges et étroites, a été insérée dans la boîte à champ ouvert pour fournir des indices supplémentaires. (C) Graphiques montrant le temps d’exploration de chaque objet présenté ensemble au cours de la session de test NO et PS (n - 7), respectivement. Notez qu’il n’y avait pas de différence significative dans la préférence entre les deux objets évalués par le test Mann-Whitney U (pour aucun test) et le t-test non apprau de l’étudiant (pour le test PS). (D) Une image montrant qu’un système de suivi vidéo a détecté la souris expérimentale dans la boîte ouverte de champ. Le carré rouge indique la zone prédéfinie pour suivre la trajectoire de la souris. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Altération de la mémoire spatiale et de la séparation des motifs chez les souris épileptiques. (A) Une présentation schématique de l’emplacement de l’objet roman (NL), la reconnaissance d’objets nouveaux (NO), et la séparation de modèle (PS) essais. Un objet nouveau est indiqué comme un cercle rouge. (B) Graphiques montrant le rapport de discrimination dans les tests de discrimination dans les tests de NL, NO et PS entre les faux (n - 8) et les souris épileptiques (n - 10). Notez que les souris épileptiques ont démontré des affaiblissements significatifs dans les essais de NL, de NO, et de PS, qui testent la fonction de mémoire pour des endroits, des objets, et des contextes, respectivement. Test de l’université mann-Whitney U pour le test de NL. 0,05 par le t-test non appréré de l’étudiant pour les tests NO. 0,05 par le t-test non appréré de l’étudiant avec la correction de Welch pour le test PS. (C) Un graphique montrant l’activité locomotrice des souris simulées (n - 8) et épileptiques (n - 10). Notez que les souris épileptiques ont démontré l’augmentation de la locomotion, en ligne avec les rapports précédents. 0,05 par le t-test non appréré de l’étudiant. (D) Graphiques montrant la latence à 30 s critères dans la session de familiarisation des tests NL, NO, et PS. Notez qu’il n’y avait aucune différence dans la motivation pour explorer les objets entre les souris simulées (n - 8) et épileptiques (n - 10). Les données sont présentées comme une erreur moyenne et standard de moyenne (SEM). EPIlepticus statut SE. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Mort neuronale dans l’hippocampe après l’épilepticus induit par les pilocarpines (SE). Images représentatives des groupes d’épilepsie (A) etB) 58 jours après injection de pilocarpine. Les images magnifiées montrent le hilus (a, d), ca1 subfield (b, e), et CA3 subfield (c, f) de l’hippocampe, qui sont indiqués comme carrés blancs dans les images avec un faible grossissement. Notez les cellules pyknotiques dans le champ d’hilus et CA3 de l’hippocampe. Barre d’échelle dans l’image d’extrême gauche 200 m, également valable pour l’image inférieure; barre à l’échelledans un , b, c ' 40 'm, également valable pour d, e, f, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce travail décrit des procédures expérimentales pour évaluer la fonction cognitive chez les souris atteintes d’épilepsie chronique. Beaucoup de paradigmes différents de test comportemental sont employés pour évaluer l’apprentissage et les fonctions de mémoire chez les souris18. Le labyrinthe d’eau Morris, le labyrinthe de bras radial, le labyrinthe Y, le conditionnement contextuel de la peur et les essais basés sur des objets sont les tests comportementaux les plus fréquemment utilisés et fournissent des résultats fiables. Parmi eux, les tests NL, NO et PS sont des méthodes efficaces et simples pour évaluer l’apprentissage et la mémoire chez les souris épileptiques8,10. Parce que les souris épileptiques peuvent avoir des crises spontanées inattendues pendant les séances de comportement, il est préférable d’utiliser des tests comportementaux basés sur l’inclination naturelle des animaux pour explorer la nouveauté sans ajouter d’autres renforts positifs ou négatifs, tels que ceux utilisés dans des tâches aversives motivées telles que le conditionnement de la peur, la famine légère, ou la natation forcée de rester à flot, ce qui peut déclencher des crises récurrentes19,20. En outre, par rapport à d’autres tests comportementaux, les tests basés sur la nouveauté sont moins stressants pour les animaux parce que des séances d’entraînement approfondies ne sont pas nécessaires. En outre, les tests comportementaux basés sur la nouveauté peuvent être facilement modifiés pour évaluer différents types de mémoire (c.-à-d., mémoire spatiale, mémoire de reconnaissance ou mémoire épisodique) en changeant simplement l’emplacement de l’objet, en présentant un objet nouveau ou en combinant des stimuli supplémentaires. Pris ensemble, les tests basés sur la nouveauté tels que les tests NL, NO et PS ont des avantages polyvalents pour évaluer les fonctions cognitives chez les souris épileptiques.
Bien que les tests de NL, NO et PS soient des modèles expérimentaux rapides et utiles pour étudier l’apprentissage et la fonction de la mémoire chez les souris épileptiques, plusieurs facteurs doivent être pris en considération lors de leur utilisation. Il est bien connu que les souris épileptiques chroniques montrent une anxiété accrue des injections de pilocarpine7, conduisant à une diminution marquée de l’exploration des objets au cours des séances de familiarisation. Ce manque d’exploration peut entraîner une mauvaise interprétation des résultats des tests. Par conséquent, il est important d’inclure suffisamment d’accoutumation dans le champ ouvert pour que les souris s’habituent à l’environnement avant la séance de familiarisation. Selon les souches, les souris peuvent encore ne pas explorer les objets pendant 30 s dans les 20 minutes de la session de familiarisation, même après 3 sessions d’accoutumation. Dans ce cas, l’ajout d’une autre séance d’accoutumée avec des paires supplémentaires d’objets dans la boîte à champ ouvert pourrait aider à réduire l’anxiété de la souris envers les objets. Les rideaux entourant la boîte à champ ouvert peuvent minimiser les repères extérieurs de pièce, permettant aux souris expérimentales de se concentrer sur les objets dans le champ ouvert. En outre, les critères d’exploration devraient être suffisamment stricts pour exclure les comportements dans lesquels le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité arrière pointant vers l’objet. Enfin, bien qu’il puisse être très rare, les événements de saisie peuvent se produire pendant les tâches comportementales. Dans ce cas, il est recommandé que ces animaux soient retirés d’autres évaluations, car cela peut être une source possible de biais confondant pour l’évaluation de la fonction de mémoire.
Comme les tests NL, NO et PS sont des expériences très sensibles s’appuyant sur la curiosité naturelle des animaux pour de nouveaux stimuli, des changements subtils peuvent affecter le comportement exploratoire des souris, résultant en des ratios de discrimination non concluante21,22. Par exemple, une manipulation sévère de la souris, un changement de literie juste avant les tâches comportementales, le moment incohérent du test et l’accumulation insuffisante de la salle d’essai peuvent tous élever les niveaux de stress des animaux, causant des résultats équivoques des tests. En outre, des environnements d’essai modifiés, tels que des présentations incohérentes d’objets asymétriques à chaque session, le placement de cages à domicile près de l’arène expérimentale, ou le changement de la signature olfactive de l’expérimentateur devraient être soigneusement considérés pour éviter d’autres facteurs. Au stade de l’analyse des données, les évaluations par plusieurs expérimentateurs peuvent contribuer à l’augmentation des écarts dans les résultats comportementaux en raison de différents critères de comportements exploratoires rongeurs ou d’utilisations de chronomètres. Collectivement, ces aspects doivent également être gardés à l’esprit pour la mise en œuvre réussie des tests NL, NO et PS.
L’hippocampe et la région parahippocampal sont connus pour jouer des rôles uniques dans le traitement de la mémoire23,24. Il est largement admis que la mémoire spatiale dépend en grande partie de la fonction de l’hippocampe, qui peut être facilement évaluée par le test de NL23,24. D’autre part, la mémoire de reconnaissance d’objets semble impliquer de multiples régions du cerveau, y compris le cortex perirhinal, cortex insulaire, et le cortex préfrontal ventromedial, en plus de l’hippocampe25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Les souris épileptiques traitées par pilocarpine ont constamment démontré des affaiblissements comportementaux dans les tests de mémoire spatiale avec des dommages neuronaux hippocampiques étendus39,40,41,42,tandis que les essais de mémoire de reconnaissance d’objet ont produit des résultats controversés, avec la dégénérescence neuronale variable dans les régions du cerveau parahippocampal10,41,42,43,44. Ces données impliquent que la reconnaissance d’objets pourrait nécessiter des connexions réseau sophistiquées entre plusieurs régions du cerveau, contrairement à la mémoire spatiale dans laquelle l’hippocampe peut jouer un rôle central. Lorsque les sous-champs hippocampiques spécifiques sont évalués de près, les régions de gyrus CA1 et CA3/dentate traitent différentes informations. Plus précisément, les neurones CA1 sont pensés pour être activés par l’exposition à des éléments similaires, tandis que LE CA3 et le gyrus denté sont impliqués dans la discrimination des objets similaires23,45. Conformément à cette hypothèse, les preuves émergentes suggèrent que les neurones nouveau-nés dentate peuvent contribuer à la performance de séparation de modèle45,46,47. Étant donné que la neurogenèse hippocampique aberrante peut être induite pendant l’épileptogénèse10, les souris épileptiques peuvent démontrer la performance altérée dans des expériences analogues discriminantes dues à l’intégration perturbée des neurones nouveau-nés dans l’épilepsie chronique.
En conclusion, nous décrivons comment évaluer des affaiblissements de mémoire chez les souris épileptiques. Plus précisément, nous fournissons des protocoles expérimentaux pour trois tests comportementaux, les tests NL, NO et PS, qui testent la mémoire pour les lieux, les objets et les contextes, respectivement. Parmi les nombreux paradigmes de test cognitif disponibles pour les souris, les tests NL, NO et PS sont assez simples, essais courts qui soulignent au minimum les animaux, ce qui les rend optimaux pour évaluer la fonction de la mémoire chez les animaux épileptiques sans déclencher des crises récurrentes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Jae-Min Lee pour son soutien technique. Ces travaux ont été soutenus par les subventions de la National Research Foundation of Korea (NRF) financées par le gouvernement coréen (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Sung-shim | Use with the 26 or 30 gauge needle | |
| 70% Ethanol | Duksan | UN1170 | Spray to clean the box and objects |
| black curtain | For avoiding unnecessary visual cues | ||
| Cresyl violet | Sigma | C5042 | For Cresyl violet staining |
| cryotome | Leica | E21040041 | For tissue sectioning |
| double-sided sticky tape | For the firm placement of the objects | ||
| DPX mounting medium | Sigma | 06522 | |
| ethanol series | Duksan | UN1170 | Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions |
| floor plate with narrow grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm | |
| floor plate with wide grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm | |
| illuminometer | TES Electrical Electronic Corp. | 1334A | For the measurement of the room lighting (60 Lux) |
| Intensive care unit | Thermocare | #W-1 | |
| ketamine hydrochloride | Yuhan | 7003 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| LED lamp | Lungo | P13A-0422-WW-04 | Lighting for the behavioral test room |
| objects | Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle | ||
| open field box | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm | |
| paper towel | Yuhan-Kimberly | 47201 | Use to dry open field box and objects |
| paraformaldehyde | Merck Millipore | 104005 | Make 4% solution |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| ruler | Use to locate the objects in the open field box | ||
| scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Smart system 3.0 | Panlab | Video tracking system | |
| stopwatch | Junso | JS-307 | For the measurement of explorative activities of mice |
| sucrose | Sigma | S9378 | For cryoprotection of tissue sections |
| terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| video camera (CCD camera) | Vision | VCE56HQ-12 | Place the camera directly overhead of the open field box |
| xylazine (Rompun) | Bayer korea | KR10381 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| xylene | Duksan | UN1307 | For Cresyl violet staining |
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