Summary
В этой статье представлены экспериментальные процедуры для оценки нарушений памяти у эпилептических мышей, вызванных пилокарпинами. Этот протокол может быть использован для изучения патофизиологических механизмов эпилепсии связанных когнитивных снижение, которое является одним из наиболее распространенных сопутствующих заболеваний при эпилепсии.
Abstract
Когнитивные нарушения является одним из наиболее распространенных сопутствующих больных височной доли эпилепсии. Чтобы резюмировать эпилепсии связанных когнитивных снижение в животных модели эпилепсии, мы создали пилокарпин лечения хронических эпилептических мышей. Мы представляем протокол для трех различных поведенческих тестов с использованием этих эпилептических мышей: местоположение новых объектов (NL), распознавание новых объектов (NO) и тесты разделения шаблонов (PS) для оценки обучения и памяти мест, объектов и контекстов, соответственно. Мы объясняем, как установить поведенческий аппарат и обеспечить экспериментальные процедуры для NL, NO, и PS испытаний после открытого полевого теста, который измеряет животных базальной локомотивной деятельности. Мы также описываем технические преимущества тестов NL, NO и PS в отношении других поведенческих тестов для оценки функции памяти у эпилептических мышей. Наконец, мы обсуждаем возможные причины и решения для эпилептических мышей не в состоянии сделать 30 с хорошим контактом с объектами во время ознакомления сессий, что является критическим шагом для успешных тестов памяти. Таким образом, этот протокол содержит подробную информацию о том, как оценить связанные с эпилепсией нарушения памяти с использованием мышей. Тесты NL, NO и PS являются простыми, эффективными анализами, которые подходят для оценки различных видов памяти у эпилептических мышей.
Introduction
Эпилепсия является хроническим заболеванием, характеризующимся спонтанными рецидивирующими припадками1,,2,,3. Потому что повторяющиеся судороги могут вызвать структурные и функциональные аномалии в головном мозге1,2,3, ненормальная активность захвата может способствовать когнитивной дисфункции, которая является одним из наиболее распространенных эпилепсиисвязанныхсопутствующих 4,5,6.3 Вопреки хроническим припадам событий, которые являются временными и сиюминутными, когнитивные нарушения могут сохраняться на протяжении всей жизни эпилептических пациентов, ухудшая их качество жизни. Поэтому важно понимать патофизиологические механизмы связанного с эпилепсией когнитивного спада.
Различные экспериментальные модели животных эпилепсии были использованы для демонстрации обучения и дефицита памяти, связанные с хронической эпилепсией7,8,,9,,10,11,12. Например, лабиринт воды Морриса, контекстуальные кондиционирования страха, отверстие борту, место расположения новых объектов (NL), и новые объекты распознавания (NO) тесты часто используются для оценки дисфункции памяти в височной доли эпилепсии (TLE). Поскольку гиппокамп является одним из основных областей, в которых TLE показывает патологию, поведенческие тесты, которые могут оценить гиппокампа-зависимой функции памяти часто предпочтительно выбраны. Однако, учитывая, что судороги могут вызвать аномальный гиппокампа нейрогенеза и способствовать эпилепсии связанных когнитивных снижение10, поведенческие парадигмы для тестирования протезирования новорожденных нейронной функции (т.е. пространственное разделение шаблона, PS)8,13 также может предоставить ценную информацию о клеточных механизмов нарушения памяти при эпилепсии.
В этой статье мы демонстрируем батарею тестов памяти, NL, NO и PS, для эпилептических мышей. Тесты просты и легко доступны и не требуют сложной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по этике Католического университета Кореи и проводились в соответствии с Национальным руководством по охране здоровья для ухода и использования лабораторных животных (NIH Publications No 80-23).
1. Новый тест на местоположение объекта (NL)
- Подготовка эпилептических C57BL/6 или трансгенных мышей 4-6 недель после инъекции пилокарпина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Острые судороги были вызваны интраперитонеальной (IP) инъекции пилокарпина, после протокола подробно в нашем предыдущем докладе14. - Перенесите эпилептических мышей из комнаты размножения в комнату поведения за день до начала поведенческих тестов. Разрешить мышей, чтобы привыкнуть, по крайней мере 12 ч в одночасье.
- В комнате поведения, отделять отдельных мышей в новые клетки для одного жилья. Напишите информацию для каждого животного на карте клетки и держите животных в тех же клетках на протяжении всего поведенческого тестирования. Несколько клеток могут быть одновременно переданы с помощью тележки.
- На следующий день, начать 3 дня занятий сессий (H1-H3) рано утром. Акклиматизировать животных к низкой освещенности в их домашних клетках, по крайней мере 30 мин.
- Подготовьте поле открытого поля с внешними размерами 44 x 44 x 31 см и внутренними размерами 43 x 43 x 30,5 см. На 1 день привыкания (H1) поместите иллюминометры в центре открытого поля и отрегулируйте прострижку до 60 люкс.
- Спрей пол и стены открытого поля поле с 70% этанола и протрите вниз с чистым бумажным полотенцем, чтобы удалить возможные обонятельные сигналы. Затем подождите, по крайней мере 1 мин, пока остаточный алкоголь высохнет полностью.
- Оцените активность локомоторной активности каждой мыши, выполнив открытый полевой тест.
- Для записи и отслеживания поведения каждой экспериментальной мыши, используйте программное обеспечение для отслеживания поведения животных (см. Таблицу Материалов).
- Как только программное обеспечение для отслеживания видео будет открыто, откалибруйте размер открытого поля поля. Затем установите зону для отслеживания. Установите 3 с задержки и 15 минут времени приобретения, чтобы избежать отслеживания рук экспериментатора. Вставьте информацию о каждой экспериментальной мыши (группа, пол, возраст и т.д.).
- Затем аккуратно поместите экспериментальную мышь в поле открытого поля, обращенного к стене. Сделайте это, поместив его на крышку клетки, чтобы свести к минимуму обработки связанных стресс и беспокойство. Затем отпустите мышь возле стены открытого поля, которая является самой дальней от того места, где объекты будут находиться во время сеанса ознакомления (шаг 1.9.3.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только мышь находится в поле открытого поля, программное обеспечение отслеживания мыши автоматически обнаружит его и начнет запись. Для оптимального отслеживания исследования, камера может быть помещена непосредственно над открытым полем поля. - После 15 минут записи, вернуть животное в свою домашнюю клетку, поместив его на крышку клетки. Очистите открытую полесную коробку с 70% этанола спрей и протрите вниз с чистым бумажным полотенцем между испытаниями. Восстановить яркий свет и измерить общее расстояние животного перемещается с помощью программного обеспечения для отслеживания видео в соответствии с инструкциями производителя.
- Откройте программное обеспечение для отслеживания видео и видеоклипы. Затем нажмите «Анализ», чтобы вычислить общее расстояние, перемещенное на основе калибровки размера окна открытого поля.
- На второй день и день 3, выполнять привыкание сессий (H2, H3), повторяя шаги от 1,3 до 1,7.
- На 4-й день выполните ознакомление (F1).
- В тусклом свете поместите каждую мышь в пустое открытое поле в течение 3 минут. После этого краткой реабилитации верните животное в родную клетку.
- Во время привыкания тщательно очистите предметы 70% этанола и протрите их бумажным полотенцем. Подождите, по крайней мере 1 мин для остаточного алкоголя, чтобы высохнуть полностью.
- Поместите два одинаковых объекта (резиновые куклы, объект А) на арене открытого поля на 5 см от прилегающих стен. Закрепите объекты двусторонней лентой. Введите экспериментальную мышь в поле открытого поля, обращенное к стене дальше от объектов.
- Разрешить бесплатную разведку в течение 20 минут и вручную измерить время, затрачиваемые на изучение обоих объектов с помощью двух секундомеров. Как только мышь достигает минимального времени исследования (30 с) для обоих объектов, остановите сеанс F1 и перенесите животное в родную клетку. Если мышь не может исследовать объекты в течение 30 с в течение 20 минут, удалите мышь из открытого поля поле и исключить его из дальнейших сессий.
- После того, как животное извлекается из открытого поля поле, тщательно очистить пол и стены коробки с 70% этанола спрей и протрите их с бумажным полотенцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте время, когда мышь касается объектов с его усы, морда, или передние лапы. Не количественно, как исследовательское время любого поведения, в котором морда животного не указывает на объект, например, сидя на объекте, проходя мимо объекта, или отдыхая с его задним концом указывая на объект.
- На 5-й день выполните сеанс тестирования NL.
- Перенесите мышь из домашней клетки в открытую площадку для реабилитации в течение 3 мин. Затем верните животное в родную клетку.
- Во время привыкания тщательно очистите предметы 70% этанола и протрите их бумажным полотенцем. Подождите, по крайней мере 1 мин для остаточного алкоголя, чтобы высохнуть полностью.
- Переместите один объект (резиновая кукла, объект А) в диагональное положение, на 5 см от прилегающих стен. Закрепите объект двусторонней лентой. Перенесите экспериментальную мышь на крышку клетки в открытую область поля и поместите ее лицом к стене открытого поля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контрбалансирование местоположения объекта перемещено, чтобы уменьшить любые потенциальные врожденные предпочтения для определенного направления. Например, изменить местоположение предпочтительного объекта из сеанса ознакомления для половины экспериментальных животных, а для остальных животных, переместить менее предпочтительный объект из сессии ознакомления. - Разрешить 10 минут бесплатного исследования и записи с системой видеонаблюдения. Измерьте время, затрачиваемые на изучение каждого объекта с помощью двух секундомеров, и вычислите коэффициент дискриминации как
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте время, когда мышь касается объектов с его усы, морда, или передние лапы. Не количественно, как исследовательское время любого поведения, в котором морда животного не указывает на объект, например, сидя на объекте, проходя мимо объекта, или отдыхая с его задним концом указывая на объект. - Возьмите хвост экспериментальной мыши и поместите его на крышку клетки для передачи в домашнюю клетку. В течение 3 дней (дней 6-8), пусть мышь отдыха с бесплатным доступом к пище и воде.
- После того, как животное удаляется из открытого поля поле окно, тщательно очистить пол и стены коробки с 70% этанола спрей и протрите вниз с бумажным полотенцем.
2. Новый тест распознавания объектов (NO)
- На 9-й день выполните сеанс привыкания за 15 минут, повторив шаги 1.2-1.7.
- На 10-й день выполните ознакомление (F1).
- При тусклом свете поместите мышь в пустое открытое поле в течение 3 минут. После реабилитации мыши в открытой области, временно вернуть его в свою домашнюю клетку.
- Во время привыкания тщательно очистите предметы 70% этанола и протрите бумажным полотенцем. Подождите, по крайней мере 1 мин для остаточного алкоголя, чтобы высохнуть полностью.
- Поместите два одинаковых объекта (50 мл пластиковых трубок, наполненных 40 мл воды, объект B) в открытом поле на 5 см от прилегающих стен. Закрепите объекты двусторонней лентой. Введите экспериментальную мышь в поле открытого поля, обращенное к стене дальше от объектов.
- Как животное подвергается воздействию двух различных объектов (50 мл пластиковой трубки заполнены 40 мл воды, объект B; стеклянная банка Коплин, объект C) в тесте НЕТ, уравновесить объект во время сессии F1. Например, представить два одинаковых объекта (стеклянные банки Коплин, объект C) для половины животных в группе.
- Разрешить бесплатную разведку в течение 20 минут и вручную измерить время, затрачиваемые на изучение обоих объектов с помощью двух секундомеров. Как только мышь достигает минимального времени исследования (30 с) для обоих объектов, остановите сеанс F1 и перенесите животное в родную клетку. Если мышь не может исследовать объекты в течение 30 с в течение 20 минут, удалите его из открытого поля поле и исключить его из дальнейших сессий.
- После того, как животное извлекается из открытого поля поле, тщательно очистить пол и стены коробки с 70% этанола спрей и протрите их с бумажным полотенцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте время, когда мышь касается объектов с его усы, морда, или передние лапы. Не количественно, как исследовательское время любого поведения, в котором морда животного не указывает на объект, например, сидя на объекте, проходя мимо объекта, или отдыхая с его задним концом указывая на объект.
- На следующий день (день 11) выполните сеанс тестирования NO.
- Перенесите мышь из домашней клетки в открытое поле для реабилитации в течение 3 минут, а затем верните животное в родную клетку.
- Во время привыкания тщательно очистите предметы 70% этанола и протрите бумажным полотенцем. Подождите, по крайней мере 1 мин для остаточного алкоголя, чтобы высохнуть полностью.
- Замените один объект (пластиковая трубка 50 мл, заполненная 40 мл воды, объект B) другим объектом (стеклянная банка Коплин, объект С) на 5 см от прилегающих стен. Закрепите объекты двусторонней лентой. Перенесите экспериментальную мышь на крышку клетки на открытое поле и поместите ее лицом к стене. Противовес объектам, представленным вместе во время теста NO. Например, замените одну стеклянную банку Коплина (объект C) пластиковой трубкой 50 мл, наполненной 40 мл воды (объект B) для мышей, подвергшихся воздействию двух стеклянных банок Коплина (объект C) во время ознакомления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контрбалансировка местоположения заменяемого объекта также может быть выполнена для уменьшения потенциального врожденного предпочтения для определенного направления. Например, для каждой когорты животных, подвергшихся воздействию набора двух объектов (объект B или объект C), измените предпочтительный объект в ознакомлении для половины экспериментальных животных, а для остальных животных замените объект, менее предпочтительный в ознакомительной сессии. - Разрешить 10 минут свободного исследования и записать его с помощью системы отслеживания видео. Измерьте время, затрачиваемые на изучение каждого объекта, с помощью двух секундомеров и вычислите коэффициент дискриминации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте время, когда мышь касается объектов с его усы, морда, или передние лапы. Не количественно, как исследовательское время любого поведения, в котором морда животного не указывает на объект, например, сидя на объекте, проходя мимо объекта, или отдыхая с его задним концом указывая на объект. - Возьмите хвост экспериментальной мыши и поместите его на крышку клетки для передачи в свою домашнюю клетку. В течение 3 дней (дней 12-14), пусть мышь отдыха с бесплатным доступом к пище и воде.
- После того, как животное удаляется из открытого поля поле, тщательно очистить пол и стены открытого поля поле с 70% этанола спрей и протрите вниз с бумажным полотенцем.
3. Тест на разделение шаблонов (PS)
- На 15-й день выполните первую сессию ознакомления (F1) для теста PS.
- Перенесите мышь из домашней клетки в открытую область для реабилитации в течение 3 минут, а затем верните ее в родную клетку.
- Во время привыкания тщательно очистите предметы и сетчатую напольные пластины 70% этанола и протрите бумажным полотенцем. Подождите, по крайней мере 1 мин для остаточного алкоголя, чтобы высохнуть полностью.
- Поместите напольные пластины (42,5 х 42,5 х 0,5 см) с широкой сеткой (5,5 х 5,5 см) в открытой поле поля и поместите два одинаковых объекта (пластиковые Т-фляги заполнены 50 мл воды, объект D) в открытом поле 5 см от прилегающих стен. Закрепите объекты двусторонней лентой. Введите экспериментальную мышь в поле открытого поля, обращенное к стене дальше от объектов.
- Поскольку животное подвергается воздействию двух различных объектов (пластиковая Т-колба, наполненная 50 мл воды, объект D; стеклянная бутылка, объект E) в тесте PS, уравновешивайте объект во время сеансов F1 и F2. Например, представить два одинаковых объекта (стеклянные бутылки, объект Е) на широком полу сетки для половины животных в группе.
- Разрешить бесплатную разведку в течение 20 минут, и вручную измерить время, затрачиваемые на изучение обоих объектов с помощью двух секундомеров. Как только мышь достигает минимального времени исследования (30 с) для обоих объектов, остановите сеанс F1 и перенесите животное в домашнюю клетку. Если мышь не может исследовать объекты в течение 30 с в течение 20 минут, удалите его из открытого поля поле и исключить его из дальнейших сессий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте время, когда мышь касается объектов с его усы, морда, или передние лапы. Не количественно, как исследовательское время любого поведения, в котором морда животного не указывает на объект, например, сидя на объекте, проходя мимо объекта, или отдыхая с его задним концом указывая на объект. - После завершения первого ознакомления (F1), тщательно очистить объекты и напольные пластины с 70% этанола спрей и удалить их из открытого поля поле.
- На следующий день (день 16) выполните вторую сессию ознакомления (F2) для теста PS.
- Перенесите мышь из домашней клетки в открытую область для реабилитации в течение 3 минут, а затем верните животное в родную клетку.
- Во время привыкания тщательно очистите предметы и решетчатую напольные пластины 70% этанола и протрите бумажным полотенцем. Подождите, по крайней мере 1 мин для остаточного алкоголя, чтобы высохнуть полностью.
- Поместите напольные пластины (42,5 х 42,5 х 0,5 см) с узкой сеткой (2,75 х 2,75 см) в открытой поле поля и поместите два одинаковых объекта (стеклянные бутылки, объект E) в открытом поле 5 см от прилегающих стен. Закрепите объекты двусторонней лентой. Введите экспериментальную мышь в поле открытого поля, обращенное к стене дальше от объектов.
- Для уравновешивания на узком полу сетки присутствуют два одинаковых объекта (пластиковые Т-фляги, заполненные 50 мл воды, объект D).
- Разрешить бесплатную разведку в течение 20 минут и вручную измерить время, затрачиваемые на изучение обоих объектов с помощью двух секундомеров. Как только мышь достигает минимального времени исследования (30 с) для обоих объектов, остановите сеанс F2 и перенесите животное в домашнюю клетку. Если мышь не может исследовать объекты в течение 30 с в течение 20 минут, удалите его из открытого поля поле и исключить его из дальнейших сессий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте время, когда мышь касается объектов с его усы, морда, или передние лапы. Не количественно, как исследовательское время любого поведения, в котором морда животного не указывает на объект, например, сидя на объекте, проходя мимо объекта, или отдыхая с его задним концом указывая на объект. - После завершения второй ознакомительной сессии (F2), тщательно очистить объекты и напольные пластины с 70% этанола спрей и удалить их из открытого поля поле.
- На следующий день (день 17) выполните сеанс тестирования PS.
- Перенесите мышь из домашней клетки в открытую область для реабилитации в течение 3 минут, а затем верните ее в родную клетку.
- Во время привыкания тщательно очистите предметы и решетчатую напольные пластины 70% этанола и протрите бумажным полотенцем. Подождите, по крайней мере 1 мин для остаточного алкоголя, чтобы высохнуть полностью.
- Поместите напольные пластины с узкой сеткой (2,75 х 2,75 см) в открытой поле поля и поместите два различных объекта (пластиковая Т-колба заполнена 50 мл воды, объект D; стеклянная бутылка, объект E) на напольной пластине 5 см от прилегающих стен. Закрепите объекты двусторонней лентой. Перенесите экспериментальную мышь на крышку клетки в открытую область поля и поместите ее лицом к стене.
- Противовес объектам, представленным вместе во время теста PS. Например, поместите каждый объект (объект D, объект E) на узком полу сетки, чтобы сделать объект E новым объектом в этом контексте. Противовес расположению объекта D или объекта E (новый объект на узком этаже) также может быть выполнен для уменьшения потенциала врожденного предпочтения для определенного направления. Например, заменить предпочтительный объект из второй сессии ознакомления для половины экспериментальных животных, а для остальных животных, заменить менее предпочтительный объект из второй сессии ознакомления.
- Разрешить 10 минут свободного исследования и записи с помощью системы отслеживания видео. Измерьте время, затрачиваемые на изучение каждого объекта, с помощью двух секундомеров и вычислите коэффициент дискриминации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте время, когда мышь касается объектов с его усы, морда, или передние лапы. Не количественно, как исследовательское время любого поведения, в котором морда животного не указывает на объект, например, сидя на объекте, проходя мимо объекта, или отдыхая с его задним концом указывая на объект. - Возьмите хвост экспериментальной мыши и поместите его на крышку клетки для передачи в свою домашнюю клетку.
4. Кресилфийное фиолетовое окрашивание
- После завершения всех поведенческих тестов, анестезируя животное путем введения коктейля (4:0,5) кетамина (50 мг/мл) и ксилазина (23,3 мг/мл) растворяется в солин в дозе 110 мл/кг массы тела (IP; 1 мл шприца; 26 Г шприц; 26 Г шприц). Проверьте глубину анестезии из-за отсутствия реакции на щепотку ног.
- После того, как животное глубоко обезболили, выполнить транскардиальный перфузии с 4% параформальдегида, чтобы исправить мозг15.
- После транскардиальной перфузии закончена, обезглавить животное ножницами15. Затем удалите череп, используя ножницы радужной оболочки глаза, чтобы разоблачить мозг. После того, как мозг изолирован, postfix его в 4% параформальдегида в одночасье, а затем криопротекции в 30% сахарозы в 0,01 М фосфат-буфера солей.
- Сделать корональные секции (30 мкм) из оснастки замороженных мозга с помощью криостата.
- Смонтировать ткани мозга на слайдах и выполнить ряд шагов гидратации от 100% этанола до водопроводной воды путем мытья в течение 3 минут последовательно в 100%, 95%, 90%, 80%, 70% этанола.
- Инкубировать ткань слайды в 0,1% кресил фиолетовый раствор в течение 15 мин.
- Удалите чрезмерное пятно, погрузив ткани слайды в 95% этанола / 0,1% ледниковой уксусной кислоты, а затем обезвоживать ткани растворами 100% этанола, 50% этанола / 50% ксилена, и 100% ксилена.
- Coverslip ткани слайды с помощью коммерчески доступных ксилена монтажа среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общий экспериментальный график и настройка для оценки когнитивных функций показаны на рисунке 1. Через шесть недель после введения пилокарпинов индуцированных острых припадков, мышей были подвергнуты NL, NO, и PS испытаний в этом порядке разделены на 3 дневных периодов отдыха между тестами(Рисунок 1A). Для теста NL два одинаковых объекта были помещены в открытое поле во время сеанса ознакомления (F1), а на следующий день один объект был перемещен в новое место. В тесте NO один объект был заменен на новый во время сеанса тестирования. Для теста PS, два сеанса ознакомления (F1, F2) представили комбинации различных моделей сетки пола и объектов. Затем, в день тестирования, один объект из каждой сессии ознакомления был помещен на узкую схему пола сетки, что делает один объект роман в контексте узкой сетки пол шаблона (Рисунок 1B). Открытое поле поля может быть помещено на стол непосредственно под зарядной камерой устройства и окружено черным занавесом, чтобы избежать ненужных визуальных сигналов(рисунок 2A). Образец объектов были легко чистить материалы аналогичного размера или немного больше, чем мышь(рисунок 2B). Комбинации объектов необходимо было предварительно проверить, чтобы подтвердить, что между двумя объектами, представленными вместе (рисунок 2C,нет значительных предпочтений. Напольные пластины с различными узорами были помещены в открытое поле поля, чтобы обеспечить дополнительные экспериментальные сигналы в тесте PS(рисунок 2B). После того, как мышь была введена в поле открытого поля, система видеослекинга отслеживала ее траекторию, чтобы проанализировать ее общее расстояние передвижения(рисунок 2D). Через шесть недель после инъекции пилокарпина эпилептические мыши показали значительное снижение коэффициента дискриминации в тесте NL, демонстрируя нарушение пространственной памяти(рисунок 3). Кроме того, в тесте NO, который является тестом на память распознавания объектов, эпилептические мыши показали нарушение функции памяти по сравнению с фиктивным управлением. Когда протез ирования-нейронной функции был оценен с тестом PS, эпилептические мыши с трудом распознавать новый объект в контексте с несколькими сигналами. В качестве контрольных экспериментов были оценены локомоторная активность и задержка для достижения критериев исследования во время ознакомления(рисунок 3). Измерение активности локомотивов показало значительное увеличение эпилептических животных(рисунок 3C), в соответствии с предыдущими докладами16,17, в то время как мотивация для изучения объектов была сопоставима между фиктивным и эпилептических животных (Рисунок 3D). Наши показатели отсева не смогли изучить критерии в сессии ознакомления были 17,4%, 18,2%, 0% для NL, NO, и PS тест, соответственно, предполагая, что животные привыкли к экспериментальной среде во время серии поведенческих испытаний. Наконец, мы оценили гиппокампа смерти клеток после пилокарпина индуцированного статуса эпилептис с помощью кресилфийного фиолетового окрашивания для подтверждения захвата индуцированных нейронных повреждений (Рисунок 4). Пилокарпин лечения животных продемонстрировали пикнотические клетки в хилус и CA3 подполе гиппокампа, в отличие от фиктивных контроля (Рисунок 4).
Рисунок 1: Схематическая презентация поведенческой тестовой батареи. (A) Схематический рисунок поведенческого графика для расположения нового объекта (NL), распознавание новых объектов (NO) и тесты на разделение шаблонов (PS) для фиктивных и эпилептических мышей. (B) Репрезентативные изображения объекта и напольных плит для тестов NL, NO и PS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Поведенческий аппарат для оценки когнитивных функций. (A) Общий обзор поведенческих параметров. Камера была помещена прямо над открытым полем поля, который был окружен занавесом, чтобы избежать ненужных сигналов. (B) Пример объектов для расположения нового объекта (NL), распознавания новых объектов (NO) и разделения шаблонов (PS). Для теста PS, напольная пластина с различными узорами, т.е. широкими и узкими сетками, была вставлена в открытое поле поля для обеспечения дополнительных сигналов. (C) Графики, показывающие время изучения каждого объекта, представленного вместе во время сеанса тестирования NO и PS (n no 7), соответственно. Обратите внимание, что не было существенной разницы в предпочтениях между двумя объектами, оцененными тестом Mann-Whitney U (для NO test) и неспаренным t-тестом студента (для теста PS). (D) Изображение, показывающее, что система слежения за видео обнаружила экспериментальную мышь в поле открытого поля. Красный квадрат указывает на заданные зоны для отслеживания траектории мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Нарушение пространственной памяти и разделения узоров у эпилептических мышей. (A) Схематическая презентация расположения объекта романа (NL), распознавание новых объектов (NO) и тесты разделения шаблонов (PS). Новый объект обозначен как красный круг. (B) Графики, показывающие коэффициент дискриминации в NL, NO и PS-тестах между фиктивными (n No 8) и эпилептическими мышами (n no 10). Обратите внимание, что эпилептические мыши продемонстрировали значительные нарушения в тестах NL, NO и PS, которые проверяют функцию памяти для мест, объектов и контекстов, соответственно. Злт; 0,05 Манн-Уитни U тест для теста NL. Злт; 0,05 по непарной t-тест студента для NO испытаний. Злт; 0,05 по непарной t-тест студента с коррекцией Уэлча для теста PS. (C) График, показывающий локомотивную активность обмана (n No 8) и эпилептических мышей (n No 10). Отметим, что эпилептические мыши продемонстрировали повышенное передвижение, в соответствии с предыдущими сообщениями. Злт; 0,05 по непарной t-тест студента. (D) Графики, показывающие задержку до 30 с критериями в сессии ознакомления с тестами NL, NO и PS. Обратите внимание, что не было никаких различий в мотивации для изучения объектов между фиктивными (n No 8) и эпилептическими мышами (n No 10). Данные представлены как средняя погрешность средней (SEM). SE и статус эпилептик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Нейрональная смерть в гиппокампе после пилокарпина индуцированного эпилептического статуса (SE). Представитель изображения из (A) обман и (B) эпилептические группы 58 дней после инъекции пилокарпина. Увеличенные изображения показывают hilus(a, d),подполе CA1(b, e),и подполе CA3(c, f) гиппокампа, которые показаны как белые квадраты в изображениях с низким увеличением. Обратите внимание на пикнотические клетки в подполе хилуса и CA3 гиппокампа. Шкала бар в крайне левом изображении 200 мкм, также действительна для нижнего изображения; шкала бар в, b, c 40 мкм, также действителен для d, e, f, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта работа описывает экспериментальные процедуры для оценки когнитивных функций у мышей с хронической эпилепсией. Много различных поведенческих парадигм испытания использованы для того чтобы оценить учя и функции памяти в мышах18. Лабиринт воды Морриса, радиальный лабиринт руки, Y-лабиринт, контекстуальные кондиционирования страха, и объектные тесты являются наиболее часто используемыми поведенческими тестами и обеспечивают надежные результаты. Среди них, NL, NO, и PS тесты являются эффективными, простые методы для оценки обучения и памяти у эпилептических мышей8,10. Потому что эпилептические мыши могут иметь неожиданные спонтанные судороги во время поведения сессий, лучше использовать поведенческие тесты, основанные на естественной склонности животных для изучения новизны без добавления других положительных или отрицательных подкреплений, таких как те, которые используются в аверсивно-мотивированных задач, таких как страх кондиционирования, легкое голодание, или принудительное плавание, чтобы остаться на плаву, которые могут вызвать периодические припадки19,20. Кроме того, по сравнению с другими поведенческими тестами, тесты на основе новизны менее стрессовые для животных, потому что обширные учебные занятия не требуются. Кроме того, поведенческие тесты на основе новизны могут быть легко изменены для оценки различных типов памяти (нат., пространственная память, память распознавания или эпизодическая память), просто изменив местоположение объекта, представив новый объект или объединив дополнительные стимулы. Взятые вместе, новизна на основе тестов, таких как NL, NO, и PS тесты имеют универсальные преимущества для оценки когнитивных функций у эпилептических мышей.
Хотя тесты NL, NO и PS являются быстрыми и полезными экспериментальными моделями для исследования функции обучения и памяти у эпилептических мышей, при их использовании необходимо учитывать несколько факторов. Хорошо известно, что хронические эпилептические мыши показывают повышенную тревогу от инъекций пилокарпина7,что приводит к заметному снижению исследования объектов во время ознакомительных сессий. Такое отсутствие исследований может привести к неправильному толкованию результатов испытаний. Поэтому важно включить достаточное привыкание к открытому полю для мышей, чтобы привыкнуть к окружающей среде до ознакомления сессии. В зависимости от штаммов, мыши все еще могут не исследовать объекты в течение 30 с в течение 20 минут от ознакомления сессии, даже после 3 сессий привыкания. В этом случае добавление еще одного сеанса привыкания с дополнительными парами объектов в поле открытого поля может помочь уменьшить беспокойство мыши по отношению к объектам. Занавески, окружающие поле открытого поля, могут свести к минимуму внешние сигналы комнаты, позволяя экспериментальным мышам сосредоточиться на объектах в открытом поле. Кроме того, критерии исследования должны быть достаточно строгими, чтобы исключить поведение, при котором морда животного не указывает на объект, например, сидя на объекте, проходя мимо объекта или отдыхая с его задним концом, указывающим на объект. Наконец, хотя это может быть очень редко, захват события могут произойти во время поведенческих задач. В этом случае рекомендуется удалить этих животных из дальнейших оценок, поскольку это может быть возможным источником путаницы при оценке функции памяти.
Как NL, НЕТ, и PS тесты очень чувствительные эксперименты, опираясь на естественное любопытство животных для новых стимулов, тонкие изменения могут повлиять на исследовательское поведение мышей, в результате чего неубедительные коэффициенты дискриминации21,22. Например, жесткое обращение с мышью, изменение постельных принадлежностей прямо перед поведенческими задачами, несогласованное время проведения теста и недостаточное акклиматизацию в испытательном зале могут повысить уровень стресса животных, вызывая двусмысленные результаты тестов. Кроме того, следует тщательно рассмотреть измененные условия тестирования, такие как несовместимые презентации асимметричных объектов на каждой сессии, размещение домашних клеток вблизи экспериментальной арены или переключение обонятельной подписи экспериментатора, чтобы избежать дополнительных факторов. На этапе анализа данных, оценки нескольких экспериментаторов может способствовать увеличению изменчивости в поведенческих исходов из-за различных критериев поведения грызунов исследования или стоп-часы использования. В совокупности эти аспекты следует также иметь в виду для успешного осуществления тестов NL, NO и PS.
Гиппокамп и парагиппокампальной области, как известно, играют уникальную роль в обработке памяти23,24. Широко признано, что пространственная память во многом зависит от функции гиппокампа, который может быть легко оценен тестом NL23,24. С другой стороны, память распознавания объектов, как представляется, связаны с несколькими областями мозга, в том числе периринальной коры, островной коры, и вентромедиальной префронтальной коры, в дополнение к гиппокампа25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37.38 Пилокарпин лечения эпилептических мышей последовательно продемонстрировали поведенческие нарушения в пространственной памяти тестирования с обширными гиппокампа нейронов,повреждения39,40,41,42, в то время как объект распознавания памяти тесты дали спорные результаты, с переменной нейрональной дегенерации в парагиппокампальных областях мозга10,42,4343,44. Эти данные подразумевают, что распознавание объектов может потребовать сложных сетевых связей между несколькими областями мозга, в отличие от пространственной памяти, в которой гиппокамп может играть центральную роль. При тщательной оценке конкретных подполев бегемотов, в областях извилины CA1 и CA3/dentate обнаруживаются процессы различной информации. В частности, CA1 нейроны, как полагают, активируются при воздействии аналогичных элементов, в то время как CA3 и зубной извилины участвуют в дискриминации аналогичных объектов23,45. В соответствии с этой гипотезой, новые данные свидетельствуют о том, что зубчатые новорожденные нейроны могут способствовать модели разделения производительности45,46,47. Учитывая, что аномальный гиппокампа нейрогенеза может быть вызвана во время эпилептогенеза10, эпилептические мыши могут продемонстрировать нарушения производительности в дискриминационных аналогичных опытом из-за нарушенной интеграции новорожденных нейронов в хронической эпилепсии.
В заключение, мы описываем, как оценить нарушения памяти у эпилептических мышей. В частности, мы предоставляем экспериментальные протоколы для трех поведенческих тестов, NL, NO и PS-тестов, которые проверяют память на места, объекты и контексты, соответственно. Среди многих когнитивных парадигм испытаний, доступных для мышей, NL, NO, и PS тесты довольно просты, короткие анализы, что минимально подчеркнуть животных, что делает их оптимальными для оценки функции памяти у эпилептических животных без запуска периодических припадков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Чжэ Мина Ли за его техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемыми корейским правительством (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Sung-shim | Use with the 26 or 30 gauge needle | |
| 70% Ethanol | Duksan | UN1170 | Spray to clean the box and objects |
| black curtain | For avoiding unnecessary visual cues | ||
| Cresyl violet | Sigma | C5042 | For Cresyl violet staining |
| cryotome | Leica | E21040041 | For tissue sectioning |
| double-sided sticky tape | For the firm placement of the objects | ||
| DPX mounting medium | Sigma | 06522 | |
| ethanol series | Duksan | UN1170 | Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions |
| floor plate with narrow grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm | |
| floor plate with wide grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm | |
| illuminometer | TES Electrical Electronic Corp. | 1334A | For the measurement of the room lighting (60 Lux) |
| Intensive care unit | Thermocare | #W-1 | |
| ketamine hydrochloride | Yuhan | 7003 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| LED lamp | Lungo | P13A-0422-WW-04 | Lighting for the behavioral test room |
| objects | Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle | ||
| open field box | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm | |
| paper towel | Yuhan-Kimberly | 47201 | Use to dry open field box and objects |
| paraformaldehyde | Merck Millipore | 104005 | Make 4% solution |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| ruler | Use to locate the objects in the open field box | ||
| scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Smart system 3.0 | Panlab | Video tracking system | |
| stopwatch | Junso | JS-307 | For the measurement of explorative activities of mice |
| sucrose | Sigma | S9378 | For cryoprotection of tissue sections |
| terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| video camera (CCD camera) | Vision | VCE56HQ-12 | Place the camera directly overhead of the open field box |
| xylazine (Rompun) | Bayer korea | KR10381 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| xylene | Duksan | UN1307 | For Cresyl violet staining |
References
- Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
- Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
- Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5 (7), 380-391 (2009).
- Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
- Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34 (1), 183-204 (2016).
- Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
- Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207 (2), 329-349 (2007).
- Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114 (17), 3536-3545 (2017).
- Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
- Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606 (2015).
- Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3316-3327 (2018).
- Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
- Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429 (2016).
- Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219 (1), 284-297 (2009).
- Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51 (4), 789-804 (2006).
- Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11 (1), 0147733 (2016).
- Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718 (2017).
- Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
- van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13 (8), 1763-1792 (2018).
- Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
- Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
- Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 41-50 (2000).
- Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (1), 51-61 (2001).
- Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
- Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25 (1), 52-61 (2005).
- Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12 (5), 447-449 (2005).
- Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16 (12), 1759-1765 (2006).
- Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
- Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
- Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17 (1), 5-11 (2010).
- Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
- de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405 (1-2), 142-146 (2006).
- Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82 (1), 26-34 (2004).
- Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20 (23), 8853-8860 (2000).
- Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
- Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
- Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
- Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
- Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59 (9), 1785-1795 (2018).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46 (4), 499-508 (2005).
- Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21 (7), 702-713 (2011).
- Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34 (10), 515-525 (2011).
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-539 (2011).
