Summary
Denna artikel presenterar experimentella förfaranden för att bedöma minnesförsämringar i pilocarpin-inducerad epileptiska möss. Detta protokoll kan användas för att studera patofysiologiska mekanismer av epilepsi-associerade kognitiv försämring, som är en av de vanligaste samsjuklighet i epilepsi.
Abstract
Kognitiv svikt är en av de vanligaste samsjukligheterna i temporallobepilepsi. För att sammanfatta epilepsi-associerade kognitiv försämring i en djurmodell av epilepsi genererade vi pilocarpin-behandlade kroniska epileptiska möss. Vi presenterar ett protokoll för tre olika beteendetester med hjälp av dessa epileptiska möss: nya objekt plats (NL), nya objekt erkännande (NO) och mönster separation (PS) tester för att utvärdera inlärning och minne för platser, objekt och sammanhang, respektive. Vi förklarar hur du ställer in beteendeapparaten och tillhandahåller experimentella procedurer för NL-, NO- och PS-tester efter ett öppet fälttest som mäter djurens basala rörelseapparat. Vi beskriver också de tekniska fördelarna med NL, NO och PS tester med avseende på andra beteendemässiga tester för bedömning av minnesfunktion i epileptiska möss. Slutligen diskuterar vi möjliga orsaker och lösningar för epileptiska möss som inte gör 30 s god kontakt med objekten under förtrogenhetssessionerna, vilket är ett viktigt steg för framgångsrika minnestester. Således ger detta protokoll detaljerad information om hur man bedömer epilepsi-associerade minnesförsämringar med hjälp av möss. NL- och NO-testerna är enkla, effektiva analyser som är lämpliga för utvärdering av olika typer av minne hos epileptiska möss.
Introduction
Epilepsi är en kronisk sjukdom som kännetecknas av spontana återkommande anfall1,2,3. Eftersom repetitiva anfall kan orsaka strukturella och funktionella avvikelser i hjärnan1,2,3, onormal krampanfall aktivitet kan bidra till kognitiv dysfunktion, som är en av de vanligaste epilepsi-associerade samsjuklighet4,5,6. I motsats till de kroniska anfallshändelserna, som är övergående och tillfälliga, kan kognitiva funktionsnedsättningar kvarstå under epileptiska patienters liv, vilket försämrar deras livskvalitet. Därför är det viktigt att förstå patofysiologiska mekanismerna för epilepsi-associerade kognitiv försämring.
Olika experimentella djurmodeller av epilepsi har använts för att visa inlärnings- och minnesunderskott i samband med kronisk epilepsi7,,8,9,10,11,12. Till exempel, Morris vatten labyrint, kontextuell rädsla konditionering, hål-board, nya objekt plats (NL), och nya objekt erkännande (NO) tester har ofta använts för att bedöma minne dysfunktion i temporalloben epilepsi (TLE). Eftersom hippocampus är en av de primära regioner där TLE visar patologi, beteendetester som kan utvärdera hippocampus-beroende minnesfunktion är ofta företrädesvis utvalda. Men med tanke på att anfall kan inducera avvikande hippocampus neurogenes och bidra till epilepsi-associerade kognitiv försämring10, beteendemässiga paradigm för att testa dentate nyfödda neuronal funktion (dvs. rumsliga mönster separation, PS)8,13 kan också ge värdefull information om cellulära mekanismer för minne nedskrivningar i epilepsi.
I den här artikeln visar vi ett batteri av minnestester, NL, NO och PS, för epileptiska möss. Testerna är enkla och lättillgängliga och kräver inget sofistikerat system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella förfaranden godkändes av den etiska kommittén vid Det katolska universitetet i Korea och genomfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80-23).
1. Test av nya objektplats (NL)
- Förbered epileptiska C57BL/6 eller transgena möss 4–6 veckor efter pilokarpinininjektion.
OBS: Akuta anfall orsakades av intraperitoneal (IP) pilokarpin injektion, enligt protokollet som beskrivs i vår tidigare rapport14. - Överför de epileptiska mössen från avelsrummet till beteenderummet en dag innan beteendetesterna börjar. Låt mössen att vana sig i minst 12 timmar över natten.
- I beteenderummet separerar enskilda möss i nya burar för enstaka bostäder. Skriv informationen för varje djur på burkortet och förvara djuren i samma bur under hela beteendetesterna. Flera burar kan överföras samtidigt med hjälp av en vagn.
- Nästa dag, börja 3 dagar av tillvänjning sessioner (H1-H3) tidigt på morgonen. Acklimatisera djuren till svagt ljus i sina hemburar i minst 30 minuter.
- Förbered en öppen fältlåda med yttermått på 44 x 44 x 31 cm och innermått på 43 x 43 x 30,5 cm. På dag 1 av tillvänjningen (H1), placera en belysningsräknare i mitten av det öppna fältet rutan och justera belysningsstyrkan till 60 lux.
- Spraya golvet och väggarna i det öppna fältet rutan med 70% etanol och torka av med en ren pappershandduk för att ta bort eventuella luktsignaler. Vänta sedan i minst 1 min tills restalkoholen har torkat helt.
- Utvärdera rörelseaktiviteten för varje mus genom att utföra ett öppet fälttest.
- Om du vill registrera och spåra beteendet hos varje experimentell mus använder du videospårningsprogram för djurbeteende (se Tabell över material).
- När videospårningsprogrammet har öppnats kalibrerar du storleken på den öppna fältrutan. Ställ sedan in zonen för spårning. Ställ in 3 s latens och 15 min förvärvstid för att undvika att spåra en försöksmans händer. Infoga information om varje experimentell mus (grupp, kön, ålder, etc.).
- Placera sedan försiktigt en experimentell mus i den öppna fältlådan vänd mot väggen. Gör detta genom att placera den på buren locket för att minimera hantering-associerade stress och ångest. Släpp sedan musen nära väggen i den öppna fältrutan som är längst från där objekten kommer att vara under förtrogenhetssessionen (steg 1.9.3).Then, release the mouse near the wall of the open field box that is the farthest from where the objects will be be during the familiarization session (step 1.9.3.).
När musen är i den öppna fältrutan kommer musspårningsprogrammet automatiskt att upptäcka den och börja spela in. För optimal spårning av utforskningen kan kameran placeras direkt ovanför den öppna fältboxen. - Efter 15 minuters inspelning, återför djuret till sin hembur genom att placera det på burlocket. Rengör den öppna fältlådan med 70% etanolspray och torka av med en ren pappershandduk mellan försöken. Återställ det starka ljuset och mät djurets totala avstånd som flyttas med hjälp av videospårningsprogrammet enligt tillverkarens anvisningar.
- Öppna videospårningsprogramvaran och videoklippen. Klicka sedan på Analys för att beräkna det totala antalet som flyttats baserat på kalibreringen av den öppna fältrutans storlek.
- På dag 2 och dag 3 utför du tillvänjningssessionerna (H2, H3) genom att upprepa steg 1.3 till 1.7.
- På dag 4 utför du förtrogenhetssessionen (F1).
- Placera varje mus i det tomma öppna fältet i 3 min i svagt ljus. Efter den korta rehabitueringen, återför djuret till sin hembur.
- Under tillvänjningen, rengör föremålen noggrant med 70% etanol och torka av dem med en pappershandduk. Vänta i minst 1 min på att restalkoholen torkar helt.
- Placera två identiska objekt (gummidockor, objekt A) i det öppna fältet arena 5 cm från angränsande väggar. Fäst objekten med dubbelhänta tejp. Introducera den experimentella musen i det öppna fältet rutan, vänd mot väggen längst från objekten.
- Tillåt fri utforskning i 20 min och mät manuellt tiden för att utforska båda objekten med hjälp av två stoppur. När musen når den minsta utforskningstiden (30 s) för båda objekten, stoppa F1-sessionen och överföra djuret till sin hembur. Om musen inte utforskar objekten i 30 s inom 20 minuter tar du bort musen från den öppna fältrutan och utesluter den från ytterligare sessioner.
- När djuret tas bort från det öppna fältet rutan, rengör noggrant golvet och väggarna i lådan med 70% etanol spray och torka ner dem med en pappershandduk.
OBS: Mät den tid då musen vidrör objekten med sina morrhår, tryne eller främre tassar. Kvantifiera inte som förberedande tid några beteenden där djurets tryne inte pekar mot objektet, såsom sitter på objektet, passerar objektet, eller vilar med bakdelen pekar på objektet.
- På dag 5 utför du NL-testsessionen.
- Överför musen från sin hembur till det öppna fältet området för rehabituation i 3 min. Sedan tillbaka djuret till sin hembur.
- Under tillvänjningen, rengör föremålen noggrant med 70% etanol och torka av dem med en pappershandduk. Vänta i minst 1 min på att restalkoholen torkar helt.
- Flytta ett objekt (gummidocka, objekt A) till diagonalt läge, 5 cm från de angränsande väggarna. Fäst objektet med dubbelhävt tejp. Överför den experimentella musen på burlocket till det öppna fältet området och placera den mot väggen i det öppna fältet rutan.
OBS: Motvikt platsen för objektet flyttas för att minska eventuella medfödda preferenser för en viss riktning. Ändra till exempel platsen för det önskade objektet från förtrogenhetssessionen för hälften av försöksdjuren och för resten av djuren flytta det mindre önskade objektet från förtrogenhetssessionen. - Tillåt 10 min fri utforskning och spela in med ett videospårningssystem. Mät den tid som ägnas åt att utforska varje objekt med hjälp av två stoppur och beräkna diskrimineringsförhållandet som
OBS: Mät den tid då musen vidrör objekten med sina morrhår, tryne eller främre tassar. Kvantifiera inte som förberedande tid några beteenden där djurets tryne inte pekar mot objektet, såsom sitter på objektet, passerar objektet, eller vilar med bakdelen pekar på objektet. - Ta tag i svansen på den experimentella musen och placera den på sin bur lock för överföring till sin hembur. I 3 dagar (dag 6–8) låter du musen vila med fri tillgång till mat och vatten.
- När djuret tas bort från det öppna fältet rutan, rengör noggrant golvet och väggarna i lådan med 70% etanol spray och torka av med en pappershandduk.
2. Test av nytt objektigenkänning (NO)
- På dag 9, utför en 15 min tillvänjning session genom att upprepa steg 1,2-1,7.
- På dag 10 utför du förtrogenhetssessionen (F1).
- Placera musen i det tomma öppna fältet i 3 min i svagt ljus. Efter att ha rehabituerat musen till det öppna fältet, tillfälligt tillbaka den till sin hembur.
- Under tillvänjningen, rengör föremålen noggrant med 70% etanol och torka av med en pappershandduk. Vänta minst 1 min på att restalkoholen torkar helt.
- Placera två identiska föremål (50 ml plaströr fyllda med 40 ml vatten, objekt B) i det öppna fältet 5 cm från de angränsande väggarna. Fäst objekten med dubbelhänta tejp. Introducera den experimentella musen i det öppna fältet rutan mot väggen längst från objekten.
- Eftersom djuret utsätts för de två olika föremålen (50 ml plaströr fyllt med 40 ml vatten, objekt B; glas Coplin burk, objekt C) i NO-testet, motvikt objektet under F1-sessionen. Till exempel, presentera två identiska objekt (glas Coplin burkar, objekt C) för hälften av djuren i gruppen.
- Tillåt fri utforskning i 20 min och mät manuellt tiden för att utforska båda objekten med hjälp av två stoppur. När musen når den minsta utforskningstiden (30 s) för båda objekten, stoppa F1-sessionen och överföra djuret till sin hembur. Om musen inte utforskar objekten i 30 s inom 20 minuter tar du bort det från den öppna fältrutan och utesluter det från ytterligare sessioner.
- När djuret tas bort från det öppna fältet rutan, rengör noggrant golvet och väggarna i lådan med 70% etanol spray och torka ner dem med en pappershandduk.
OBS: Mät den tid då musen vidrör objekten med sina morrhår, tryne eller främre tassar. Kvantifiera inte som förberedande tid några beteenden där djurets tryne inte pekar mot objektet, såsom sitter på objektet, passerar objektet, eller vilar med bakdelen pekar på objektet.
- Nästa dag (dag 11) utför du NO-testsessionen.
- Överför musen från sin hembur till det öppna fältet för rehabituering i 3 min, och sedan tillbaka djuret till sin hembur.
- Under tillvänjningen, rengör föremålen noggrant med 70% etanol och torka av med en pappershandduk. Vänta i minst 1 min på att restalkoholen torkar helt.
- Byt ut ett objekt (50 ml plaströr fyllt med 40 ml vatten, objekt B) mot ett annat föremål (glas Coplin burk, objekt C) 5 cm från angränsande väggar. Fäst objekten med dubbelhänta tejp. Överför den experimentella musen på burlocket till det öppna fältet och placera den mot väggen. Motvikt till de objekt som presenteras tillsammans under NO-testet. Byt till exempel ut en glaskarlinburk (objekt C) mot ett 50 ml plaströr fyllt med 40 ml vatten (objekt B) för de möss som exponeras för de två coplinburkarna i glas (objekt C) under förtrogenhetssessionen.
OBS: Motvikt plats för objektet ersättas kan också utföras för att minska den potentiella medfödda preferensen för en viss riktning. För varje kohort av de djur som exponeras för uppsättningen med två objekt (objekt B eller objekt C) ändrar du till exempel det önskade objektet i förtrogenhetssessionen för hälften av försöksdjuren och ersätt för resten av djuren det objekt som är mindre önskat i förtrogenhetssessionen. - Tillåt 10 min fri utforskning och spela in den med hjälp av ett videospårningssystem. Mät den tid som ägnas åt att utforska varje objekt med hjälp av två stoppur och beräkna diskrimineringsförhållandet.
OBS: Mät den tid då musen vidrör objekten med sina morrhår, tryne eller främre tassar. Kvantifiera inte som förberedande tid några beteenden där djurets tryne inte pekar mot objektet, såsom sitter på objektet, passerar objektet, eller vilar med bakdelen pekar på objektet. - Ta tag i svansen på den experimentella musen och placera den på buren locket för överföring till sin hembur. I 3 dagar (dag 12–14) låter du musen vila med fri tillgång till mat och vatten.
- När djuret tas bort från det öppna fältet rutan, rengör noggrant golv och väggar i det öppna fältet rutan med 70% etanol spray och torka av med en pappershandduk.
3. Mönsterseparationstest (PS)
- På dag 15 utför du den första förtrogenhetssessionen (F1) för PS-testet.
- Överför musen från sin hembur till det öppna fältet området för rehabituation i 3 min, och sedan tillbaka den till sin hembur.
- Under tillvänjningen, rengör föremålen och den inrutade golvplattan med 70% etanol och torka av med en pappershandduk. Vänta i minst 1 min på att restalkoholen torkar helt.
- Placera golvplattan (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) med det breda gallret (5,5 x 5,5 cm) i den öppna fältlådan och placera två identiska föremål (T-flaskor av plast fyllda med 50 ml vatten, objekt D) i det öppna fältet 5 cm från de angränsande väggarna. Fäst objekten med dubbelhänta tejp. Introducera den experimentella musen i det öppna fältet rutan mot väggen längst från objekten.
- Eftersom djuret utsätts för två olika föremål (T-kolv i plast fylld med 50 ml vatten, föremål D; glasflaska, objekt E) i PS-testet, motvikt mot objektet under F1- och F2-sessionerna. Till exempel, presentera två identiska objekt (glasflaskor, objekt E) på det breda rutnätet golvet för hälften av djuren i gruppen.
- Tillåt fri utforskning i 20 min och mät manuellt tiden för att utforska båda objekten med hjälp av två stoppur. När musen når den minsta utforskningstiden totalt (30 s) för båda objekten, stoppa F1-sessionen och överföra djuret till sin hembur. Om musen inte utforskar objekten i 30 s inom 20 minuter tar du bort det från den öppna fältrutan och utesluter det från ytterligare sessioner.
OBS: Mät den tid då musen vidrör objekten med sina morrhår, tryne eller främre tassar. Kvantifiera inte som förberedande tid några beteenden där djurets tryne inte pekar mot objektet, såsom sitter på objektet, passerar objektet, eller vilar med bakdelen pekar på objektet. - Efter avslutad den första förtrogenhet session (F1), rengör noggrant objekt och golvplattan med 70% etanol spray och ta bort dem från det öppna fältet rutan.
- Nästa dag (dag 16) utför du den andra förtrogenhetssessionen (F2) för PS-testet.
- Överför musen från sin hembur till det öppna fältet området för rehabituation i 3 min, och sedan tillbaka djuret till sin hembur.
- Under tillvänjningen, rengör föremålen noggrant och den inrutade golvplattan med 70% etanol och torka av med en pappershandduk. Vänta i minst 1 min på att restalkoholen torkar helt.
- Placera golvplattan (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) med det smala gallret (2,75 x 2,75 cm) i den öppna fältlådan och placera två identiska föremål (glasflaskor, objekt E) i det öppna fältet 5 cm från de angränsande väggarna. Fäst objekten med dubbelhänta tejp. Introducera den experimentella musen i det öppna fältet rutan mot väggen längst från objekten.
- För motvikt, presentera två identiska objekt (plast T-kolvar fyllda med 50 ml vatten, objekt D) på det smala gallret golvet.
- Tillåt fri utforskning i 20 min och mät manuellt tiden för att utforska båda objekten med hjälp av två stoppur. När musen når den minsta utforskningstiden totalt (30 s) för båda objekten, stoppa F2-sessionen och överföra djuret till sin hembur. Om musen inte utforskar objekten i 30 s inom 20 minuter tar du bort det från den öppna fältrutan och utesluter det från ytterligare sessioner.
OBS: Mät den tid då musen vidrör objekten med sina morrhår, tryne eller främre tassar. Kvantifiera inte som förberedande tid några beteenden där djurets tryne inte pekar mot objektet, såsom sitter på objektet, passerar objektet, eller vilar med bakdelen pekar på objektet. - Efter slutförandet av den andra förtrogenhet session (F2), rengör noggrant objekt och golvplatta med 70% etanol spray och ta bort dem från det öppna fältet rutan.
- Nästa dag (dag 17) utför du PS-testsessionen.
- Överför musen från sin hembur till det öppna fältet området för rehabituation i 3 min, och sedan tillbaka den till sin hembur.
- Under tillvänjningen, rengör föremålen noggrant och den inrutade golvplattan med 70% etanol och torka av med en pappershandduk. Vänta i minst 1 min på att restalkoholen torkar helt.
- Placera golvplattan med det smala gallret (2,75 x 2,75 cm) i den öppna fältlådan och placera två olika föremål (T-kolv i plast fylld med 50 ml vatten, föremål D; glasflaska, föremål E) på golvplattan 5 cm från de angränsande väggarna. Fäst objekten med dubbelhänta tejp. Överför den experimentella musen på burlocket till det öppna fältet området och placera den mot väggen.
- Motvikt de objekt som presenteras tillsammans under PS-testet. Placera till exempel varje objekt (objekt D, objekt E) på det smala rutnätsgolvet för att göra objektet E till ett nytt objekt i den här kontexten. Motvikt platsen för objekt D eller objekt E (ett nytt objekt på det smala golvmönstret) kan också utföras för att minska risken för en medfödd preferens för en viss riktning. Ersätt till exempel det önskade objektet från den andra förtrogenhetssessionen för hälften av försöksdjuren och för resten av djuren ersätter du det mindre önskade objektet från den andra förtrogenhetssessionen.
- Tillåt 10 min fri utforskning och spela in med hjälp av ett videospårningssystem. Mät den tid som ägnas åt att utforska varje objekt med hjälp av två stoppur och beräkna diskrimineringsförhållandet.
OBS: Mät den tid då musen vidrör objekten med sina morrhår, tryne eller främre tassar. Kvantifiera inte som förberedande tid några beteenden där djurets tryne inte pekar mot objektet, såsom sitter på objektet, passerar objektet, eller vilar med bakdelen pekar på objektet. - Ta tag i svansen på den experimentella musen och placera den på buren locket för överföring till sin hembur.
4. Cresyl violett färgning
- Efter att ha avslutat alla beteendetester, bedöva djuret genom att injicera en cocktail (4:0.5) av ketamin (50 mg/ml) och xylazin (23,3 mg/ml) upplöst i saltlösning vid en dos av 110 ml/kg kroppsvikt (IP; 1 mL spruta; 26 G nål). Kontrollera om djupet av anestesi av bristen på ett svar på en tå nypa.
- När djuret är djupt sövd, utföra transcardial perfusion med 4% paraformaldehyd för att fixa hjärnan15.
- Efter transcardial perfusion är klar, halshugga djuret med en sax15. Ta sedan bort skallen med hjälp av en irissax för att exponera hjärnan. Efter att hjärnan är isolerad, postfix det i 4% paraformaldehyd över natten, följt av kryoprotektion i 30% sackaros i 0,01 M fosfat-buffrad saltlösning.
- Gör koronala sektioner (30 μm) från den snapfrusna hjärnan med hjälp av en kryostat.
- Montera hjärnvävnaderna på diabilder och utför en serie vätskesteg från 100% etanol till kranvatten genom att tvätta i 3 min sekventiellt i 100%, 95%, 90%, 80%, 70% etanol.
- Inkubera vävnadsrutschbanorna i 0,1% krassviolettlösning i 15 min.
- Ta bort överdriven fläck genom att doppa vävnadsrutschbanorna i 95% etanol/0,1% glaciär ättiksyra, och torka sedan vävnaderna med lösningar på 100% etanol, 50% etanol/50% xylen och 100% xylen.
- Täck av vävnadsrutschbanorna med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt xylenmonteringsmedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett allmänt experimentellt schema och en allmän inställning för utvärdering av kognitiv funktion visas i figur 1. Sex veckor efter införandet av pilokarpininducerade akuta anfall utsattes möss för NL-, NO- och PS-testerna i den ordningen åtskilda av 3 dagars viloperioder mellan testerna (figur 1A). För NL-testet placerades två identiska objekt i det öppna fältet under förtrogenhetssessionen (F1), och nästa dag flyttades ett objekt till en ny plats. I NO-testet ersattes ett objekt med ett nytt under testsessionen. För PS-testet introducerade de två förtrogenhetssessionerna (F1, F2) kombinationer av olika golvgallermönster och objekt. Sedan, på testdagen, placerades ett objekt från varje förtrogenhetssession på det smala rutnätsgolvet, vilket gjorde ett objekt nytt i samband med det smala rutnätsgolvet (figur 1B). Den öppna fältboxen kan placeras på ett skrivbord direkt under en laddningskopplad enhetskamera och omges av en svart gardin för att undvika onödiga visuella signaler (figur 2A). Provföremålen var lätta att rengöra material av liknande storlek eller något större än en mus (figur 2B). Objektkombinationerna behövde förskärmas för att bekräfta att det inte fanns någon signifikant preferens mellan de två objekt som presenterades tillsammans (figur 2C). Golvplattorna med olika mönster placerades i den öppna fältlådan för att ge ytterligare experimentella signaler i PS-testet (figur 2B). När en mus introducerades i det öppna fältet rutan, spårade en video spårningssystem sin bana för att analysera dess totala förflyttning avstånd (Figur 2D). Sex veckor efter en pilokarpinininjektion visade de epileptiska mössen en signifikant minskning av diskrimineringsförhållandet i NL-testet, vilket visade på försämrat rumsligt minne (figur 3). Dessutom, i NO-testet, som är ett test för objektigenkänningsminne, visade epileptiska möss nedsatt minnesfunktion jämfört med simulerade kontroller. När dentate nyfödda neuronal funktion utvärderades med PS-testet, epileptiska möss hade svårt att känna igen det nya objektet i ett sammanhang med flera ledtrådar. Som kontrollexperiment bedömdes rörelseaktivitet och latens för att nå prospekteringskriterierna under förtrogenhetssessionen (figur 3). Mätningen av rörelseaktivitet visade en betydande ökning av epileptiska djur (figur 3C), i linje med tidigare rapporter16,17, medan motivationen att utforska föremålen var jämförbar mellan bluff och epileptiska djur (figur 3D). Våra avhopp priser inte prospekteringskriterierna i förtrogenhetssessionen var 17,4%, 18,2%, 0% för NL, NO och PS test, respektive, vilket tyder på att djur blev vana vid de experimentella miljöerna under serien av beteendemässiga prövningar. Slutligen utvärderade vi hippocampus cell död efter pilocarpin-inducerad status epilepticus med krasseyl violett färgning för att bekräfta beslag-inducerad neuronal skada (Figur 4). De pilokarpinbehandlade djuren visade pyknotiska celler i underfältet hilus och CA3 i hippocampus, till skillnad från de falska kontrollerna (figur 4).
Bild 1: Schematisk presentation av beteendetestbatteriet. (A)En schematisk ritning av beteendeschemat för det nya objektets plats (NL), nya objektigenkänning (NO) och mönsterseparation (PS) tester för bluff- och epileptiska möss. b)Representativa bilder av föremåls- och golvplåtsarrangemangen för NL-, NO- och PS-testerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Beteendeapparat för utvärdering av kognitiv funktion. (A) En allmän översikt över beteendeinställningen. En kamera placerades direkt ovanför den öppna fältet rutan, som var omgiven av gardinen för att undvika onödiga ledtrådar. (B)Exempel objekt för det nya objektet plats (NL), nya objekt erkännande (NO) och mönster separation (PS) test. För PS-testet sattes en golvplatta med olika mönster, dvs breda och smala galler, in i den öppna fältrutan för att ge ytterligare signaler. (C)Diagram som visar den tid som utforskar varje objekt som presenteras tillsammans under NO- respektive PS-testsessionen (n = 7). Observera att det inte fanns någon signifikant skillnad i preferensen mellan de två objekt som bedömdes av Mann-Whitney U-testet (för NO-test) och Students oparade t-test (för PS-test). (D)En bild som visar att ett videospårningssystem upptäckte den experimentella musen i den öppna fältrutan. Den röda fyrkanten anger den förinställda zonen för att spåra musens bana. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Försämrat rumsligt minne och mönsterseparation hos epileptiska möss. (A)En schematisk presentation av det nya objektets plats (NL), nya objektigenkänning (NO) och mönsterseparationstester (PS). Ett nytt objekt anges som en röd cirkel. B)Diagram som visar diskrimineringsförhållandet i NL-, NO- och PS-testerna mellan bluff -(n = 8) och epileptiska möss (n = 10). Observera att de epileptiska mössen visade signifikanta funktionsnedsättningar i NL-, NO- och PS-testerna, som testar minnesfunktionen för platser, objekt respektive sammanhang. *p < 0.05 av Mann-Whitney U-testet för NL-testet. *p < 0,05 av Students oparade t-test för NO-testerna. * p < 0,05 av Students oparade t-test med Welch korrigering för PS-testet. (C)En graf som visar rörelseaktiviteten hos bluff (n = 8) och epileptiska möss (n = 10). Observera att de epileptiska mössen visade ökad rörelse, i linje med tidigare rapporter. * P < 0,05 av Students oparade t-test. (D)Diagram som visar latens till 30 s kriterier i förtrogenhet session nl, NEJ och PS tester. Observera att det inte fanns några skillnader i motivationen för att utforska objekten mellan bluff (n = 8) och epileptiska möss (n = 10). Uppgifterna presenteras som medelvärdet ± standardfel i medelvärdet (SEM). SE = status epilepticus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Neuronal död i hippocampus efter pilocarpin-inducerad status epilepticus (SE). Representativa bilder från(A)bluff och (B) epileptiska grupper 58 dagar efter pilokarpin injektion. Förstorade bilder visar hilus(a, d),CA1 underfält (b, e), och CA3 delfält (c, f) av hippocampus, som anges som vita rutor i bilderna med låg förstoring. Notera de pyknotiska cellerna i underfältet hilus och CA3 i hippocampus. Skala bar i den vänstra bilden = 200 μm, även giltig för den nedre bilden; skalan i en, b, c = 40 μm, gäller även för d, e, f,respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete beskriver experimentella procedurer för utvärdering av kognitiv funktion hos möss med kronisk epilepsi. Många olika beteendetestparadigmet används för att bedöma inlärnings- och minnesfunktioner hos möss18. Morris vatten labyrint, radiell arm labyrint, Y-labyrint, kontextuell rädsla konditionering, och objekt-baserade tester är de vanligaste beteendetester och ge tillförlitliga resultat. Bland dem, NL, NO, och PS tester är effektiva, enkla metoder för att utvärdera lärande och minne i epileptiska möss8,10. Eftersom epileptiska möss kan ha oväntade spontana anfall under beteendesessioner, är det bättre att använda beteendetester baserade på djurens naturliga lutning för att utforska nyhet utan att lägga till andra positiva eller negativa förstärkningar, såsom de som används i aversive-motiverade uppgifter såsom rädsla konditionering, mild svält, eller tvingas simma för att hålla sig flytande, vilket kan utlösa återkommande anfall19,20. Dessutom, jämfört med andra beteendetester, nyhet-baserade tester är mindre stressande för djuren eftersom omfattande träningspass inte krävs. Vidare kan de nya beteendebaserade beteendetesterna enkelt modifieras för att bedöma olika typer av minne (dvs. rumsligt minne, igenkänningsminne eller episodiskt minne) genom att helt enkelt ändra objektets plats, presentera ett nytt objekt eller kombinera ytterligare stimuli. Sammantaget har nyhetsbaserade tester som NL-, NO- och PS-testerna mångsidiga fördelar med att utvärdera kognitiva funktioner hos epileptiska möss.
Även om NL-, NO- och PS-testerna är snabba och användbara experimentella modeller för att undersöka inlärnings- och minnesfunktion hos epileptiska möss, måste flera faktorer beaktas när du använder dem. Det är välkänt att kroniska epileptiska möss visar ökad ångest från pilokarpin injektioner7, vilket leder till en markant minskning av objektet prospektering under förtrogenhet sessioner. Denna brist på prospektering kan orsaka feltolkning av testresultaten. Därför är det viktigt att inkludera tillräckligt med tillvänjning till det öppna fältet för att mössen ska vänja sig vid miljön före förtrogenhetssessionen. Beroende på stammarna kan mössen fortfarande misslyckas med att utforska objekten i 30 s inom 20 minuter av förtrogenhetssessionen, även efter 3 sessioner av tillvänjning. I så fall kan lägga till en annan tillvänjningssession med extra par av objekten i den öppna fältrutan bidra till att minska musens ångest mot objekten. Gardiner som omger den öppna fältboxen kan minimera externa rumssignaler, vilket gör att de experimentella mössen kan fokusera på objekten i det öppna fältet. Dessutom bör prospekteringskriterierna vara tillräckligt strikta för att utesluta beteenden där djurets tryne inte pekar mot objektet, till exempel att sitta på objektet, passera objektet eller vila med bakdelen pekar mot objektet. Slutligen, även om det kan vara mycket sällsynt, kan anfallshändelser inträffa under beteendeuppgifterna. I detta fall rekommenderas att dessa djur avlägsnas från ytterligare bedömningar, eftersom detta kan vara en möjlig källa till förvirrande partiskhet för utvärdering av minnesfunktionen.
Eftersom NL, NO, och PS tester är mycket känsliga experiment förlitar sig på djurens naturliga nyfikenhet för nya stimuli, subtila förändringar kan påverka utforskande beteende möss, vilket resulterar i ofullständig diskriminering nyckeltal21,22. Till exempel, hård hantering av musen, en sängkläder förändring precis innan beteendemässiga uppgifter, inkonsekvent timing av testet, och otillräcklig acklimatisering till testrummet kan alla höja stressnivåerna hos djuren, orsakar tvetydiga testresultat. Dessutom bör ändrade testmiljöer, såsom inkonsekventa presentationer av asymmetriska föremål vid varje session, placering av hemmaburar nära den experimentella arenan eller byte av experimentörens luktsignatur, noga övervägas för att undvika ytterligare faktorer. I det skede av dataanalys, bedömningar av flera försöksörer kan bidra till ökad variation i beteendemässiga resultat på grund av olika kriterier för gnagare undersökande beteenden eller stoppur användningar. Tillsammans bör dessa aspekter också beaktas för ett framgångsrikt genomförande av NL-, NO- och PS-testerna.
Hippocampus och parahippocampal regionen är kända för att spela unika roller i minnesbearbetning23,24. Det är allmänt accepterat att rumsligt minne till stor del beror på hippocampus funktion, som lätt kan bedömas av NL-testet23,24. Å andra sidan, objekt erkännande minne verkar innebära flera regioner i hjärnan, inklusive perirhinal cortex, öbarken, och ventromedial prefrontala cortex, förutom hippocampus25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38.28 Pilocarpin-behandlade epileptiska möss har konsekvent visat beteendemässiga försämringar i rumsliga minnestester med omfattande hippocampus neuronal skada39,40,,41,42, medan objekt erkännande minnestester har producerat kontroversiella resultat, med variabel neuronal degeneration i parahippocampal hjärnan regioner10,41,42,43,44. Dessa data innebär att objektigenkänning kan kräva sofistikerade nätverksanslutningar mellan flera hjärnregioner, till skillnad från rumsligt minne där hippocampus kan spela en central roll. När de specifika hippocampus delfälten är noggrant utvärderade, ca1 och CA3/dentate gyrus regioner visar sig bearbeta olika information. Specifikt, CA1 nervceller tros aktiveras genom exponering för liknande objekt, medan CA3 och dentate hjärnbarken är inblandade i diskriminerande liknande objekt23,45. Överensstämmer med denna hypotes, nya bevis tyder på att buckla nyfödda nervceller kan bidra till mönster separation prestanda45,46,47. Med tanke på att avvikande hippocampus neurogenes kan induceras under epileptogenesis10, epileptiska möss kan visa nedsatt prestanda i diskriminerande liknande upplevelser på grund av den störda integrationen av nyfödda nervceller i kronisk epilepsi.
Sammanfattningsvis beskriver vi hur man utvärderar minnesförsämringar hos epileptiska möss. Specifikt tillhandahåller vi experimentella protokoll för tre beteendetester, NL-, NO- och PS-testerna, som testar minne för platser, objekt och sammanhang. Bland de många kognitiva testparadigm som finns tillgängliga för möss, NL, NO och PS tester är ganska enkla, korta analyser som minimalt betona djuren, vilket gör dem optimala för att utvärdera minnesfunktion hos epileptiska djur utan att utlösa återkommande anfall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar dr Jae-Min Lee för hans tekniska stöd. Detta arbete stöddes av National Research Foundation of Korea (NRF) bidrag som finansieras av den koreanska regeringen (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Sung-shim | Use with the 26 or 30 gauge needle | |
| 70% Ethanol | Duksan | UN1170 | Spray to clean the box and objects |
| black curtain | For avoiding unnecessary visual cues | ||
| Cresyl violet | Sigma | C5042 | For Cresyl violet staining |
| cryotome | Leica | E21040041 | For tissue sectioning |
| double-sided sticky tape | For the firm placement of the objects | ||
| DPX mounting medium | Sigma | 06522 | |
| ethanol series | Duksan | UN1170 | Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions |
| floor plate with narrow grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm | |
| floor plate with wide grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm | |
| illuminometer | TES Electrical Electronic Corp. | 1334A | For the measurement of the room lighting (60 Lux) |
| Intensive care unit | Thermocare | #W-1 | |
| ketamine hydrochloride | Yuhan | 7003 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| LED lamp | Lungo | P13A-0422-WW-04 | Lighting for the behavioral test room |
| objects | Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle | ||
| open field box | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm | |
| paper towel | Yuhan-Kimberly | 47201 | Use to dry open field box and objects |
| paraformaldehyde | Merck Millipore | 104005 | Make 4% solution |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| ruler | Use to locate the objects in the open field box | ||
| scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Smart system 3.0 | Panlab | Video tracking system | |
| stopwatch | Junso | JS-307 | For the measurement of explorative activities of mice |
| sucrose | Sigma | S9378 | For cryoprotection of tissue sections |
| terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| video camera (CCD camera) | Vision | VCE56HQ-12 | Place the camera directly overhead of the open field box |
| xylazine (Rompun) | Bayer korea | KR10381 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| xylene | Duksan | UN1307 | For Cresyl violet staining |
References
- Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
- Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
- Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5 (7), 380-391 (2009).
- Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
- Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34 (1), 183-204 (2016).
- Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
- Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207 (2), 329-349 (2007).
- Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114 (17), 3536-3545 (2017).
- Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
- Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606 (2015).
- Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3316-3327 (2018).
- Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
- Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429 (2016).
- Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219 (1), 284-297 (2009).
- Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51 (4), 789-804 (2006).
- Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11 (1), 0147733 (2016).
- Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718 (2017).
- Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
- van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13 (8), 1763-1792 (2018).
- Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
- Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
- Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 41-50 (2000).
- Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (1), 51-61 (2001).
- Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
- Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25 (1), 52-61 (2005).
- Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12 (5), 447-449 (2005).
- Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16 (12), 1759-1765 (2006).
- Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
- Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
- Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17 (1), 5-11 (2010).
- Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
- de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405 (1-2), 142-146 (2006).
- Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82 (1), 26-34 (2004).
- Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20 (23), 8853-8860 (2000).
- Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
- Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
- Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
- Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
- Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59 (9), 1785-1795 (2018).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46 (4), 499-508 (2005).
- Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21 (7), 702-713 (2011).
- Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34 (10), 515-525 (2011).
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-539 (2011).
