Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Behavior

تقييم وظيفة الذاكرة في الفئران الصرع التي يسببها بيلوكاربين

doi: 10.3791/60751 Published: June 4, 2020

Summary

تعرض هذه المقالة إجراءات تجريبية لتقييم ضعف الذاكرة في فئران الصرع الناجمة عن البيلوكاربين. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الآليات الفسيولوجية المرضية للتدهور المعرفي المرتبط بالصرع ، والتي تعد واحدة من أكثر الأمراض المصاحبة شيوعًا في الصرع.

Abstract

الضعف الإدراكي هو واحد من الأمراض المصاحبة الأكثر شيوعا في الصرع الفص الصدغي. وللحد من التدهور المعرفي المرتبط بالصرع في نموذج الحيوان للصرع، قمنا بتوليد فئران الصرع المزمنة التي عولجت بالبيلوكاربين. نحن نقدم بروتوكولا لثلاثة اختبارات سلوكية مختلفة باستخدام هذه الفئران الصرع: موقع الكائن رواية (NL)، التعرف على الكائن رواية (NO)، وفصل نمط (PS) اختبارات لتقييم التعلم والذاكرة للأماكن والكائنات والسياقات، على التوالي. نحن نشرح كيفية تعيين الجهاز السلوكي وتوفير الإجراءات التجريبية لاختبارات NL و NO و PS بعد اختبار ميداني مفتوح يقيس أنشطة الحيوانات الحركية القاعدية. كما أننا نصف المزايا التقنية لاختبارات NL و NO و PS فيما يتعلق بالاختبارات السلوكية الأخرى لتقييم وظيفة الذاكرة في الفئران الصرع. وأخيرا، فإننا نناقش الأسباب والحلول المحتملة للفئران الصرع فشل لجعل 30 ق من اتصال جيد مع الكائنات خلال جلسات التعرّف، وهي خطوة حاسمة لنجاح اختبارات الذاكرة. وبالتالي، يوفر هذا البروتوكول معلومات مفصلة حول كيفية تقييم ضعف الذاكرة المرتبطة بالصرع باستخدام الفئران. NL، NO، وPS الاختبارات هي بسيطة وفعالة الاختبارات التي هي مناسبة لتقييم أنواع مختلفة من الذاكرة في الفئران الصرع.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الصرع هو اضطراب مزمن يتميز بالنوبات المتكررة العفوية1،2،3. لأن النوبات المتكررة يمكن أن تسبب تشوهات هيكلية ووظيفية في الدماغ1,2,3, يمكن أن يساهم نشاط النوبات غير الطبيعي في الخلل المعرفي ، والذي يعد واحدًا من أكثرالأمراضالمصاحبة للصرع 4،5،6. على عكس أحداث النوبات المزمنة ، والتي هي عابرة ولحظة ، يمكن أن تستمر العاهات الإدراكية طوال حياة مرضى الصرع ، مما يؤدي إلى تدهور نوعية حياتهم. لذلك ، من المهم فهم الآليات الفسيولوجية المرضية للتدهور المعرفي المرتبط بالصرع.

وقد استخدمت نماذج الحيوانات التجريبية المختلفة من الصرع لإثبات العجز في التعلم والذاكرة المرتبطة الصرع المزمن7،8،9،10،11،12. على سبيل المثال ، تم استخدام متاهة مياه موريس ، وتكييف الخوف السياقي ، ولوحة الثقب ، وموقع الكائن الجديد (NL) ، واختبارات التعرف على الكائن الجديدة (NO) في كثير من الأحيان لتقييم خلل الذاكرة في صرع الفص الصدغي (TLE). نظرًا لأن قرن آمون هو أحد المناطق الأساسية التي يظهر فيها TLE علم الأمراض ، فإن الاختبارات السلوكية التي يمكنها تقييم وظيفة الذاكرة المعتمدة على قرن آمون غالبًا ما يتم اختيارها بشكل تفضيلي. ومع ذلك، بالنظر إلى أن النوبات يمكن أن تحفز تكوين الأعصاب فرس النهر المنحرف والمساهمة في التدهور المعرفي المرتبطة بالصرع10، النماذج السلوكية لاختبار وظيفة الخلايا العصبية الوليدة (أي فصل النمط المكاني ، PS)8،13 يمكن أن توفر أيضًا معلومات قيمة حول الآليات الخلوية لضعف الذاكرة في الصرع.

في هذه المقالة، ونحن نظهر بطارية من اختبارات الذاكرة، NL، لا، وPS، للفئران الصرع. الاختبارات بسيطة ويمكن الوصول إليها بسهولة ولا تتطلب نظام متطور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ووافقت لجنة الأخلاقيات التابعة للجامعة الكاثوليكية الكورية على جميع الإجراءات التجريبية، ونفذت وفقا للمعاهد الوطنية للدليل الصحي لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (منشورات المعاهد الوطنية للصحة رقم 80-23).

1. اختبار موقع كائن الرواية (NL)

  1. إعداد الصرع C57BL/6 أو الفئران المعدلة وراثيا 4-6 أسابيع بعد حقن البيلوكاربين.
    ملاحظة: تم المضبوطات الحادة الناجمة عن حقن البيلوكاربين داخل البيريتانية (IP) ، بعد البروتوكول المفصل في تقريرنا السابق14.
  2. نقل الفئران الصرع من غرفة التربية إلى غرفة السلوك قبل يوم واحد من بدء الاختبارات السلوكية. السماح للفئران لتعود لمدة 12 ساعة على الأقل بين عشية وضحاها.
  3. في غرفة السلوك، فصل الفئران الفردية في أقفاص جديدة للسكن واحد. اكتب المعلومات لكل الحيوان على بطاقة القفص وإبقاء الحيوانات في نفس الأقفاص طوال الاختبار السلوكي. يمكن نقل أقفاص متعددة في وقت واحد باستخدام عربة.
  4. في اليوم التالي، ابدأ 3 أيام من جلسات الاعتياد (H1-H3) في الصباح الباكر. تكييف الحيوانات إلى الضوء المنخفض في أقفاصمنازلهم لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  5. إعداد مربع حقل مفتوح بأبعاد خارجية 44 × 44 × 31 سم وأبعاد داخلية 43 × 43 × 30.5 سم. في اليوم الأول من الاعتياد (H1)، ضع مقياس الكنومينومتر في وسط مربع الحقل المفتوح وقم بضبط الوضوء إلى 60 لوكس.
  6. رش الكلمة والجدران من مربع حقل مفتوح مع الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية نظيفة لإزالة الإشارات الشمية المحتملة. ثم انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقية تماما.
  7. تقييم النشاط الحركي لكل فأرة من خلال إجراء اختبار حقل مفتوح.
    1. لتسجيل وتتبع سلوك كل ماوس تجريبي، استخدم برنامج تتبع فيديو سلوك الحيوان (انظر جدول المواد).
    2. بمجرد فتح برنامج تتبع الفيديو، قم بمعايرة حجم مربع الحقل المفتوح. ثم قم بتعيين المنطقة للتتبع. تعيين 3 ق من الكمون و 15 دقيقة من وقت الاستحواذ لتجنب تتبع أيدي المجرب. إدراج المعلومات حول كل ماوس تجريبي (المجموعة والجنس والعمر وما إلى ذلك).
    3. ثم ضع ماوسًا تجريبيًا برفق في مربع الحقل المفتوح الذي يواجه الجدار. القيام بذلك عن طريق وضعه على غطاء القفص للحد من التعامل مع الإجهاد والقلق المرتبطة. ثم قم بتحرير الماوس بالقرب من جدار مربع الحقل المفتوح الذي هو الأبعد عن المكان الذي ستكون فيه الكائنات أثناء جلسة تعريف (الخطوة 1.9.3.).
      ملاحظة: بمجرد أن يكون الماوس في مربع الحقل المفتوح، سيقوم برنامج تتبع الماوس باكتشافه تلقائيًا وبدء التسجيل. للتتبع الأمثل للاستكشاف ، يمكن وضع الكاميرا مباشرة فوق مربع الحقل المفتوح.
    4. بعد 15 دقيقة من التسجيل، أعد الحيوان إلى قفصه المنزلي عن طريق وضعه على غطاء القفص. تنظيف مربع حقل مفتوح مع رذاذ الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية نظيفة بين التجارب. استعادة الضوء الساطع وقياس المسافة الإجمالية للالحيوان انتقلت باستخدام برنامج تتبع الفيديو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      1. افتح برنامج تتبع الفيديو ومقاطع الفيديو. ثم انقر فوق تحليل لحساب المسافة الإجمالية التي تم نقلها استنادًا إلى معايرة حجم مربع الحقل المفتوح.
  8. في اليوم الثاني واليوم الثالث، قم بإجراء جلسات الاعتياد (H2، H3) من خلال تكرار الخطوات من 1.3 إلى 1.7.
  9. في اليوم 4، قم بإجراء جلسة تعريف (F1).
    1. في الضوء الخافت، ضع كل فأرة في الحقل المفتوح الفارغ لمدة 3 دقيقة. بعد ذلك إعادة التأهيل القصير، أعد الحيوان إلى قفصه المنزلي.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات بدقة مع الإيثانول 70٪ ومسحها إلى أسفل مع منشفة ورقية. انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. ضع جسمين متطابقين (دمى مطاطية، كائن A) في ساحة الحقل المفتوح على بعد 5 سم من الجدران المجاورة. إصلاح الكائنات مع الشريط على الوجهين. إدخال الماوس التجريبي في مربع الحقل المفتوح، التي تواجه الجدار أبعد من الكائنات.
    4. السماح للاستكشاف مجانا لمدة 20 دقيقة وقياس يدويا الوقت الذي يقضيه استكشاف كلا الكائنين باستخدام ساعتي توقيت. بمجرد أن يصل الماوس إلى الحد الأدنى من وقت الاستكشاف (30 ق) لكلا الكائنين ، أوقف جلسة F1 ونقل الحيوان إلى قفصه المنزلي. إذا فشل الماوس في استكشاف الكائنات لمدة 30 s في غضون 20 دقيقة، قم بإزالة الماوس من مربع الحقل المفتوح واستبعاده من جلسات العمل الأخرى.
    5. بعد إزالة الحيوان من مربع الحقل المفتوح، تنظيف الأرض وجدران الصندوق بدقة مع رذاذ الإيثانول 70٪ ومسحها بمنشفة ورقية.
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
  10. في اليوم 5، قم بإجراء جلسة اختبار NL.
    1. نقل الماوس من قفص المنزل إلى منطقة الحقل المفتوح لإعادة التأهيل لمدة 3 دقيقة. ثم أعد الحيوان إلى قفصه المنزلي.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات بدقة مع الإيثانول 70٪ ومسحها إلى أسفل مع منشفة ورقية. انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. نقل كائن واحد (دمية مطاطية، كائن A) إلى موقف قطري، 5 سم بعيدا عن الجدران المجاورة. إصلاح الكائن مع الشريط على الوجهين. نقل الماوس التجريبي على غطاء قفصها إلى منطقة الحقل المفتوح ووضعه في مواجهة جدار مربع الحقل المفتوح.
      ملاحظة: موازنة موقع الكائن انتقلت لتقليل أي تفضيل فطري محتمل لاتجاه معين. على سبيل المثال، قم بتغيير موقع الكائن المفضل من جلسة تعريف لنصف الحيوانات التجريبية، وبالنسبة لبقية الحيوانات، قم بنقل الكائن الأقل تفضيلًا من جلسة تعريف.
    4. السماح 10 دقيقة من الاستكشاف الحر وتسجيل مع نظام تتبع الفيديو. قياس الوقت المستغرق في استكشاف كل كائن باستخدام ساعتي توقيت وحساب نسبة التمييز كـ
      Equation 1
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
    5. الاستيلاء على ذيل الماوس التجريبي ووضعه على غطاء قفصلنقلها إلى القفص المنزلي. لمدة 3 أيام (أيام 6-8)، والسماح للفأر بقية مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
    6. بمجرد إزالة الحيوان من مربع الحقل المفتوح ، قم بتنظيف الأرض وجدران الصندوق تمامًا مع رذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ ومسحه بمنشفة ورقية.

2. اختبار التعرف على الكائن رواية (NO)

  1. في اليوم 9، قم بإجراء جلسة اعتياد لمدة 15 دقيقة من خلال تكرار الخطوات 1.2-1.7.
  2. في اليوم 10، قم بإجراء جلسة تعريف (F1).
    1. في ضوء خافت، ضع الماوس في الحقل المفتوح الفارغ لمدة 3 دقيقة. بعد إعادة تأهيل الماوس إلى منطقة الحقل المفتوح ، إعادته مؤقتًا إلى قفصه الأصلي.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات بدقة مع الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية. انتظر دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. ضع جسمين متطابقين (أنابيب بلاستيكية سعة 50 مل مملوءة بـ 40 مل من الماء، الكائن B) في الحقل المفتوح على بعد 5 سم من الجدران المجاورة. إصلاح الكائنات مع الشريط على الوجهين. إدخال الماوس التجريبي في مربع الحقل المفتوح الذي يواجه الجدار أبعد من الكائنات.
    4. كما يتعرض الحيوان إلى اثنين من الكائنات المختلفة (50 مل أنبوب بلاستيكي مليئة 40 مل من الماء، الكائن B؛ جرة كوبلين الزجاج، الكائن C) في اختبار NO، موازنة الكائن خلال جلسة F1. على سبيل المثال، تقديم كائنين متطابقة (الجرار كوبلين الزجاج، الكائن C) لنصف الحيوانات في المجموعة.
    5. السماح للاستكشاف مجانا لمدة 20 دقيقة وقياس يدويا الوقت الذي يقضيه استكشاف كلا الكائنين باستخدام ساعتي توقيت. بمجرد أن يصل الماوس إلى الحد الأدنى من وقت الاستكشاف (30 ق) لكلا الكائنين ، أوقف جلسة F1 ونقل الحيوان إلى قفصه المنزلي. إذا فشل الماوس في استكشاف الكائنات لمدة 30 s في غضون 20 دقيقة، قم بإزالته من مربع الحقل المفتوح واستبعاده من جلسات العمل الأخرى.
    6. بعد إزالة الحيوان من مربع الحقل المفتوح، تنظيف الأرض وجدران الصندوق بدقة مع رذاذ الإيثانول 70٪ ومسحها بمنشفة ورقية.
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
  3. في اليوم التالي (اليوم 11)، قم بإجراء جلسة الاختبار NO.
    1. نقل الماوس من قفصالمنزل إلى الحقل المفتوح لإعادة التأهيل لمدة 3 دقيقة، ومن ثم إعادة الحيوان إلى قفصالمنزل.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات بدقة مع الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية. انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. استبدال كائن واحد (50 مل أنبوب بلاستيكي مليئة 40 مل من الماء، الكائن B) مع كائن آخر (جرة كوبلين الزجاج، كائن C) 5 سم بعيدا عن الجدران المجاورة. إصلاح الكائنات مع الشريط على الوجهين. نقل الماوس التجريبي على غطاء القفص إلى الحقل المفتوح، ووضعه في مواجهة الجدار. موازنة الكائنات المقدمة معًا أثناء اختبار NO. على سبيل المثال، استبدل جرة كوبلين زجاجية واحدة (الكائن C) بأنبوب بلاستيكي سعة 50 مل مملوء ًا بـ 40 مل من الماء (الكائن B) للفئران المعرضة لجرار كوبلين الزجاجية (الكائن C) أثناء جلسة التعرف.
      ملاحظة: يمكن أيضاً إجراء موازنة موقع الكائن استبدال لتقليل تفضيل الفطرية المحتملة لاتجاه معين. على سبيل المثال، لكل مجموعة من الحيوانات المعرضة لمجموعة من كائنين (الكائن B أو الكائن C)، قم بتغيير الكائن المفضل في جلسة التعرف لنصف الحيوانات التجريبية، وبالنسبة لبقية الحيوانات، استبدل الكائن الأقل تفضيلًا في جلسة التعرف.
    4. السماح 10 دقيقة من الاستكشاف المجاني وتسجيله باستخدام نظام تتبع الفيديو. قياس الوقت المستغرق في استكشاف كل كائن باستخدام ساعتي توقيت وحساب نسبة التمييز.
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
    5. الاستيلاء على ذيل الماوس التجريبي ووضعه على غطاء قفص لنقلها إلى القفص المنزلي. لمدة 3 أيام (أيام 12-14)، والسماح للفأر بقية مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
    6. بمجرد إزالة الحيوان من مربع الحقل المفتوح ، قم بتنظيف الأرض وجدران مربع الحقل المفتوح تمامًا مع رذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ ومسحه بمنشفة ورقية.

3. اختبار فصل النمط (PS)

  1. في اليوم 15، قم بإجراء جلسة تعريف الأول (F1) لاختبار PS.
    1. نقل الماوس من قفصالمنزل إلى منطقة الحقل المفتوح لإعادة التأهيل لمدة 3 دقيقة، ومن ثم إعادته إلى قفص المنزل.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات تماما ولوحة الكلمة متشابكة مع الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية. انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. ضع لوحة الأرضية (42.5 × 42.5 × 0.5 سم) مع الشبكة العريضة (5.5 × 5.5 سم) في مربع الحقل المفتوح ووضع جسمين متطابقين (قوارير بلاستيكية مليئة بـ 50 مل من الماء، الكائن D) في الحقل المفتوح على بعد 5 سم من الجدران المجاورة. إصلاح الكائنات مع الشريط على الوجهين. إدخال الماوس التجريبي في مربع الحقل المفتوح الذي يواجه الجدار أبعد من الكائنات.
    4. كما يتعرض الحيوان إلى اثنين من الكائنات المختلفة (البلاستيك تي قارورة مليئة 50 مل من الماء، الكائن D؛ زجاجة زجاجة، كائن E) في اختبار PS، موازنة الكائن خلال جلسات F1 و F2. على سبيل المثال، تقديم كائنين متطابقين (زجاجات، كائن E) على أرضية الشبكة الواسعة لنصف الحيوانات في المجموعة.
    5. السماح بالاستكشاف المجاني لمدة 20 دقيقة، وقياس الوقت المستغرق يدويًا في استكشاف كلا الكائنين باستخدام ساعتي توقيت. بمجرد أن يصل الماوس إلى الحد الأدنى من وقت الاستكشاف الإجمالي (30 s) لكلا الكائنين ، أوقف جلسة F1 ونقل الحيوان إلى قفصه المنزلي. إذا فشل الماوس في استكشاف الكائنات لمدة 30 s في غضون 20 دقيقة، قم بإزالته من مربع الحقل المفتوح واستبعاده من جلسات العمل الأخرى.
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
    6. بعد الانتهاء من جلسة التعرف الأولى (F1) ، قم بتنظيف الكائنات ولوحة الأرضية تمامًا مع رذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ وإزالتها من مربع الحقل المفتوح.
  2. في اليوم التالي (اليوم 16)، قم بإجراء جلسة تعريف الثانية (F2) لاختبار PS.
    1. نقل الماوس من قفصالمنزل إلى منطقة الحقل المفتوح لإعادة التأهيل لمدة 3 دقيقة، ومن ثم إعادة الحيوان إلى قفصالمنزل.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات تماما ولوحة أرضية متشابكة مع الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية. انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. ضع لوحة الأرضية (42.5 × 42.5 × 0.5 سم) مع الشبكة الضيقة (2.75 × 2.75 سم) في مربع الحقل المفتوح ووضع جسمين متطابقين (زجاجات، كائن E) في الحقل المفتوح على بعد 5 سم من الجدران المجاورة. إصلاح الكائنات مع الشريط على الوجهين. إدخال الماوس التجريبي في مربع الحقل المفتوح الذي يواجه الجدار أبعد من الكائنات.
    4. لموازنة، الحاضر اثنين من الكائنات متطابقة (البلاستيك تي قارورة مليئة 50 مل من الماء، الكائن D) على أرضية الشبكة الضيقة.
    5. السماح للاستكشاف مجانا لمدة 20 دقيقة وقياس يدويا الوقت الذي يقضيه استكشاف كلا الكائنين باستخدام ساعتي توقيت. بمجرد أن يصل الماوس إلى الحد الأدنى من وقت الاستكشاف الإجمالي (30 s) لكلا الكائنين ، أوقف جلسة F2 ونقل الحيوان إلى قفصه المنزلي. إذا فشل الماوس في استكشاف الكائنات لمدة 30 s في غضون 20 دقيقة، قم بإزالته من مربع الحقل المفتوح واستبعاده من جلسات العمل الأخرى.
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
    6. بعد الانتهاء من جلسة التعرف الثانية (F2) ، قم بتنظيف الكائنات ولوحة الأرضية تمامًا مع رذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ وإزالتها من مربع الحقل المفتوح.
  3. في اليوم التالي (اليوم 17)، قم بإجراء جلسة اختبار PS.
    1. نقل الماوس من قفصالمنزل إلى منطقة الحقل المفتوح لإعادة التأهيل لمدة 3 دقيقة، ومن ثم إعادته إلى قفص المنزل.
    2. أثناء التعود، تنظيف الكائنات تماما ولوحة أرضية متشابكة مع الإيثانول 70٪ ومسح أسفل مع منشفة ورقية. انتظر لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يجف الكحول المتبقي تمامًا.
    3. ضع لوحة الأرضية مع الشبكة الضيقة (2.75 × 2.75 سم) في مربع الحقل المفتوح ووضع جسمين مختلفين (قارورة T بلاستيكية مليئة بـ 50 مل من الماء ، الكائن D ؛ زجاجة ، كائن E) على لوحة الأرضية على بعد 5 سم من الجدران المجاورة. إصلاح الكائنات مع الشريط على الوجهين. نقل الماوس التجريبي على غطاء القفص إلى منطقة الحقل المفتوح ووضعه في مواجهة الجدار.
    4. موازنة الكائنات التي تم تقديمها معًا أثناء اختبار PS. على سبيل المثال، ضع كل كائن (الكائن D، الكائن E) على أرضية الشبكة الضيقة لجعل الكائن E كائن ًا جديدًا في هذا السياق. ويمكن أيضا موازنة موقع الكائن دال أو الكائن E (كائن جديد على نمط الكلمة الضيقة) أيضا للحد من احتمال تفضيل فطري لاتجاه معين. على سبيل المثال، استبدال الكائن المفضل من جلسة التعرف الثانية لنصف الحيوانات التجريبية، وبالنسبة لبقية الحيوانات، استبدال الكائن الأقل تفضيلاً من جلسة التعرّف الثانية.
    5. السماح 10 دقيقة من الاستكشاف المجاني وتسجيل باستخدام نظام تتبع الفيديو. قياس الوقت المستغرق في استكشاف كل كائن باستخدام ساعتي توقيت وحساب نسبة التمييز.
      ملاحظة: قياس الوقت عندما يلمس الماوس الكائنات مع شعيرات، خطم، أو الكفوف الأمامية. لا تحدد كوقت استكشافي أي سلوكيات لا يشير فيها أنفة الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن ، أو المرور بجانب الكائن ، أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن.
    6. الاستيلاء على ذيل الماوس التجريبي ووضعه على غطاء قفص لنقلها إلى القفص المنزلي.

4. كريسيل تلطيخ البنفسجي

  1. بعد الانتهاء من جميع الاختبارات السلوكية، قم بحقن الحيوان عن طريق حقن كوكتيل (4:0.5) من الكيتامين (50 ملغ/مل) وxylazine (23.3 ملغم/مل) المذابة في المالحة بجرعة 110 مل/كغ من وزن الجسم (IP؛ 1 مل حقنة؛ 26 جم إبرة). تحقق من عمق التخدير من خلال عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم.
  2. مرة واحدة هو عميق في المخدرات الحيوان، وأداء التروية عبر التوربيد مع 4٪ بارافورمالديهايد لإصلاح الدماغ15.
  3. بعد الانتهاء من التطفل عبر القيراط ، قطع رأس الحيوان بزوج من المقص15. ثم، إزالة الجمجمة باستخدام زوج من مقص القزحية لفضح الدماغ. بعد عزل الدماغ, بعد إصلاحه في 4% مظليديهايد بين عشية وضحاها, تليها الحماية من البرد في 30% السكروز في 0.01 M الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة.
  4. جعل المقاطع التاجية (30 ميكرون) من الدماغ المفاجئة المجمدة باستخدام cryostat.
  5. قم بتركيب أنسجة الدماغ على الشرائح وتنفيذ سلسلة من خطوات الترطيب من الإيثانول 100٪ إلى مياه الصنبور عن طريق الغسيل لمدة 3 دقيقة بالتتابع في 100٪، 95٪، 90٪، 80٪، 70٪ الإيثانول.
  6. احتضان شرائح الأنسجة في محلول البنفسج كريسيلي 0.1٪ لمدة 15 دقيقة.
  7. إزالة وصمة عار مفرطة عن طريق غمر شرائح الأنسجة في 95٪ الإيثانول/0.1٪ حمض الخليك الجليدي، ومن ثم تجفيف الأنسجة مع حلول الإيثانول 100٪، 50٪ الإيثانول/50٪ xylene، و 100٪ xylene.
  8. coverslip شرائح الأنسجة باستخدام المتاحة تجاريا xylene تصاعد المتوسطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويرد جدول زمني عام للتجارب والإعداد لتقييم الوظيفة المعرفية في الشكل 1. بعد ستة أسابيع من إدخال المضبوطات الحادة الناجمة عن البيلوكاربين ، تعرضت الفئران لاختبارات NL و NO و PS في هذا الترتيب مفصولة بفترات راحة لمدة 3 أيام بين الاختبارات(الشكل 1A). بالنسبة لاختبار NL، تم وضع كائنين متماثلين في الحقل المفتوح أثناء جلسة تعريف (F1)، وفي اليوم التالي، تم نقل كائن واحد إلى موقع جديد. في الاختبار NO، تم استبدال كائن واحد بكائن جديد أثناء جلسة الاختبار. لاختبار PS، قدمت جلستي تعريف (F1، F2) مجموعات من أنماط الشبكة الأرضية المختلفة والكائنات. ثم، في يوم الاختبار، تم وضع كائن واحد من كل جلسة تعريف على نمط أرضية الشبكة الضيقة، مما يجعل كائن واحد جديد في سياق نمط أرضية الشبكة الضيقة(الشكل 1B). يمكن وضع مربع الحقل المفتوح على مكتب مباشرة تحت كاميرا جهاز مقرونة بالشحن ومحاطة بستارة سوداء لتجنب الإشارات البصرية غير الضرورية(الشكل 2A). كانت الكائنات عينة سهلة لتنظيف المواد من حجم مماثل أو أكبر قليلا من الماوس(الشكل 2B). تركيبات الكائن تحتاج إلى أن تكون مسبقا للتأكد من أنه لم يكن هناك تفضيل كبير بين الكائنين قدمت معا(الشكل 2C). تم وضع لوحات الكلمة ذات الأنماط المختلفة في مربع الحقل المفتوح لتوفير إشارات تجريبية إضافية في اختبار PS(الشكل 2B). بمجرد إدخال الماوس في مربع الحقل المفتوح ، تتبع نظام تتبع الفيديو مساره لتحليل المسافة الإجمالية للحركة(الشكل 2D). بعد ستة أسابيع من حقن البيلوكاربين ، أظهرت الفئران الصرع انخفاضًا كبيرًا في نسبة التمييز في اختبار NL ، مما يدل على ضعف الذاكرة المكانية(الشكل 3). وعلاوة على ذلك، في اختبار NO، وهو اختبار لذاكرة التعرف على الكائن، أظهرت الفئران الصرع ضعف وظيفة الذاكرة مقارنة بعناصر التحكم صورية. عندما تم تقييم وظيفة الخلايا العصبية الوليدة dentate مع اختبار PS، الفئران الصرع كان صعوبة في التعرف على الكائن رواية في سياق مع إشارات متعددة. كما تجارب التحكم، تم تقييم النشاط الحركي والكمون للوصول إلى معايير الاستكشاف خلال جلسة التعرف(الشكل 3). أظهر قياس النشاط الحركي زيادة كبيرة في الحيوانات الصرعية(الشكل 3C)، بما يتماشى مع التقارير السابقة16،17، في حين كان الدافع لاستكشاف الأشياء قابلًا للمقارنة بين الحيوانات الصورية والصرع(الشكل 3D). كانت معدلات التسرب لدينا التي فشلت في معايير الاستكشاف في جلسة التعرّف 17.4٪ و 18.2٪ و 0٪ لاختبار NL و NO و PS ، على التوالي ، مما يشير إلى أن الحيوانات اعتادت على البيئات التجريبية خلال سلسلة التجارب السلوكية. وأخيرا، قمنا بتقييم موت خلية فرس النهر بعد حالة الصرع الناجمعن البيلوكاربين باستخدام تلطيخ البنفسج كريسيلي لتأكيد تلف الخلايا العصبية الناجم عن النوبات(الشكل 4). أظهرت الحيوانات المعالجة بالبيلوكاربين الخلايا البكونية في هيلوس وحقل CA3 الفرعي من قرن آمون ، على عكس الضوابط الصورية(الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: العرض التخطيطي لبطارية الاختبار السلوكي. (أ)رسم تخطيطي للجدول السلوكي لموقع الكائن الجديد (NL) ، والتعرف على الكائن الجديد (NO) ، واختبارات فصل النمط (PS) للفئران الصورية والصرع. (ب)صور تمثيلية للكائن وترتيبات لوحة الأرضية لاختبارات NL و NO و PS. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الجهاز السلوكي لتقييم الوظيفة المعرفية. (أ)نظرة عامة على الإعداد السلوكي. تم وضع كاميرا مباشرة فوق مربع الحقل المفتوح ، الذي كان محاطًا بالستار لتجنب الإشارات غير الضرورية. (ب)عينات الكائنات لموقع الكائن الجديد (NL) والتعرف على الكائن الجديد (NO) واختبار فصل النمط (PS). بالنسبة لاختبار PS، تم إدخال لوحة أرضية ذات أنماط مختلفة، أي شبكات واسعة وضيقة، في مربع الحقل المفتوح لتوفير إشارات إضافية. (C)الرسوم البيانية التي تبين الوقت استكشاف كل كائن المقدمة معا خلال جلسة اختبار NO و PS (ن = 7)، على التوالي. لاحظ أنه لم يكن هناك فرق كبير في التفضيل بين الكائنين الذي تم تقييمه بواسطة اختبار مان ويتني U (بدون اختبار) واختبار t غير المقترن للطالب (لاختبار PS). (D)صورة تظهر أن نظام تتبع الفيديو اكتشف الماوس التجريبي في مربع الحقل المفتوح. يشير المربع الأحمر إلى المنطقة المحددة مسبقًا لتتبع مسار الماوس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: ضعف الذاكرة المكانية وفصل النمط في الفئران الصرع. (أ)عرض تخطيطي لموقع الكائن الجديد (NL) ، والتعرف على الكائن الجديد (NO) ، واختبارات فصل النمط (PS). يشار إلى كائن الرواية كدائرة حمراء. (ب)الرسوم البيانية التي تبين نسبة التمييز في NL، NO، واختبارات PS بين الصور (ن = 8) والفئران الصرع (ن = 10). لاحظ أن الفئران الصرع أظهرت ضعف كبير في NL، NO، وPS الاختبارات، والتي اختبار وظيفة الذاكرة للأماكن والكائنات والسياقات، على التوالي. * ع < 0.05 من قبل مان ويتني يو اختبار لاختبار NL. *p < 0.05 بواسطة اختبار t غير المقترن للطالب لاختبارات NO. * ع < 0.05 من قبل الطالب غير يقترن تي اختبار مع تصحيح ويلش لاختبار PS. (ج)رسم بياني يبين النشاط الحركي للشام (ن = 8) وفئران الصرع (ن = 10). لاحظ أن الفئران الصرع أظهرت زيادة الحركة، تمشيا مع التقارير السابقة. *p < 0.05 بواسطة اختبار t غير المقترن للطالب. (D)الرسوم البيانية التي تبين زمن الوصول إلى 30 s المعايير في جلسة تعريف NL، NO، واختبارات PS. لاحظ أنه لم تكن هناك اختلافات في الدافع لاستكشاف الأشياء بين الشام (ن = 8) والفئران الصرع (ن = 10). يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± خطأ قياسي للمتوسط (SEM). SE = حالة الصرع. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: موت الخلايا العصبية في قرن آمون بعد حالة الصرع الناجم عن البيلوكاربين (SE). صور تمثيلية من (A) صور و (ب)مجموعات الصرع بعد 58 يوما من حقن البيلوكاربين. تُظهر الصور المكبرة الهيلوس(أ، د)،حقل CA1 الفرعي(ب، ه)،وحقل CA3 الفرعي(ج، و)من قرن آمون، والتي يشار إليها كمربعات بيضاء في الصور ذات التكبير المنخفض. لاحظ الخلايا pyknotic في حقل هيلوس وCA3 الفرعي ة من قرن آمون. شريط مقياس في الصورة أقصى اليسار = 200 ميكرومتر، صالحة أيضا للصورة السفلية؛ شريط مقياس في ، ب، ج = 40 ميكرومتر ، صالحة أيضًا لـ d، e، f، على التوالي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يصف هذا العمل الإجراءات التجريبية لتقييم الوظيفة المعرفية لدى الفئران المصابة بالصرع المزمن. يتم استخدام العديد من نماذج الاختبار السلوكي المختلفة لتقييم وظائف التعلم والذاكرة في الفئران18. متاهة المياه موريس، متاهة الذراع شعاعي، Y-متاهة، تكييف الخوف السياقي، والاختبارات القائمة على الكائن هي الاختبارات السلوكية الأكثر استخداما وتوفير نتائج موثوقبها. من بينها، NL، NO، واختبارات PS فعالة، وطرق بسيطة لتقييم التعلم والذاكرة في الفئران الصرع8،10. لأن الفئران الصرع يمكن أن يكون لها نوبات عفوية غير متوقعة خلال جلسات السلوك، فمن الأفضل استخدام الاختبارات السلوكية على أساس ميل الحيوانات الطبيعية لاستكشاف الجدة دون إضافة تعزيزات إيجابية أو سلبية أخرى، مثل تلك المستخدمة في المهام المنفعلة دوافع مثل تكييف الخوف، والتجويع خفيفة، أو السباحة القسرية على البقاء واقفا على قدميه، والتي يمكن أن تؤدي إلى المضبوطات المتكررة19،20. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع الاختبارات السلوكية الأخرى، فإن الاختبارات القائمة على الجدة أقل إرهاقاً للحيوانات لأن جلسات التدريب المكثفة غير مطلوبة. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل الاختبارات السلوكية القائمة على الجدة بسهولة لتقييم أنواع مختلفة من الذاكرة (أي الذاكرة المكانية أو ذاكرة التعرف أو الذاكرة العرضية) ببساطة عن طريق تغيير موقع الكائن أو تقديم كائن جديد أو الجمع بين محفزات إضافية. إذا أخذت معا، فإن الاختبارات القائمة على الجدة مثل اختبارات NL و NO و PS لها مزايا متعددة الاستخدامات لتقييم الوظائف المعرفية في الفئران الصرع.

على الرغم من أن NL، NO، واختبارات PS هي نماذج تجريبية سريعة ومفيدة للتحقيق في التعلم وظيفة الذاكرة في الفئران الصرع، يجب النظر في عدة عوامل عند استخدامها. ومن المعروف أن الفئران الصرع المزمن تظهر زيادة القلق من حقن البيلوكاربين7, مما أدى إلى انخفاض ملحوظ في استكشاف الكائن خلال جلسات التعرّف. هذا النقص في الاستكشاف يمكن أن يسبب سوء تفسير نتائج الاختبار. لذلك ، من المهم تضمين ما يكفي من التعود إلى الحقل المفتوح للفئران لتعتاد على البيئة قبل جلسة التعرّف. اعتمادا على سلالات، الفئران قد لا تزال تفشل في استكشاف الكائنات لمدة 30 s ضمن 20 دقيقة من جلسة التعرّف، حتى بعد 3 جلسات من التعود. في هذه الحالة، إضافة جلسة اعتياد أخرى مع أزواج إضافية من الكائنات في مربع الحقل المفتوح يمكن أن تساعد على تقليل قلق الماوس تجاه الكائنات. يمكن للستائر المحيطة بمربع الحقل المفتوح تقليل إشارات الغرفة الخارجية ، مما يسمح للفئران التجريبية بالتركيز على الكائنات الموجودة في الحقل المفتوح. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون معايير الاستكشاف صارمة بما يكفي لاستبعاد السلوكيات التي لا يشير فيها أنخطي الحيوان نحو الكائن ، مثل الجلوس على الكائن أو المرور بجانب الكائن أو الراحة مع نهايته الخلفية التي تشير إلى الكائن. وأخيراً، على الرغم من أنه قد يكون نادراً جداً، يمكن أن تحدث أحداث النوبة أثناء المهام السلوكية. في هذه الحالة ، يوصى بإزالة تلك الحيوانات من مزيد من التقييمات لأن هذا يمكن أن يكون مصدرًا محتملًا للتحيز المربك لتقييم وظيفة الذاكرة.

كما NL, NO, وPS الاختبارات هي تجارب حساسة جدا تعتمد على فضول الحيوانات الطبيعية لمحفزات الرواية, تغييرات خفية قد تؤثر على السلوك الاستكشافي للفئران, مما أدى إلى نسب التمييز غير حاسمة21,,22. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي التعامل القاسي مع الماوس ، وتغيير الفراش مباشرة قبل المهام السلوكية ، وعدم اتساق توقيت الاختبار ، وعدم كفاية التأقلم إلى غرفة الاختبار إلى رفع مستويات الإجهاد للحيوانات ، مما يسبب نتائج اختبار ملتبسة. وعلاوة على ذلك، ينبغي النظر بعناية في بيئات الاختبار المتغيرة، مثل العروض غير المتسقة للأجسام غير المتماثلة في كل جلسة، أو وضع أقفاص منزلية بالقرب من الساحة التجريبية، أو تبديل التوقيع الشمي للمجرب، لتجنب عوامل إضافية. في مرحلة تحليل البيانات، قد تساهم التقييمات التي يقوم بها تجارب متعددة في زيادة التقلبات في النتائج السلوكية بسبب معايير مختلفة من السلوكيات الاستكشافية القوارض أو استخدام ساعة التوقيت. وبشكل جماعي، يجب أن توضع هذه الجوانب في الاعتبار أيضًا للتنفيذ الناجح لاختبارات NL و NO و PS.

ومن المعروف أن منطقة قرن آمون وparahippocampal للعب أدوار فريدة من نوعها في معالجة الذاكرة23,24. ومن المسلم به على نطاق واسع أن الذاكرة المكانية يعتمد إلى حد كبير على وظيفة قرن آمون، والتي يمكن تقييمها بسهولة من قبل اختبار NL23،24. من ناحية أخرى ، يبدو أن ذاكرة التعرف على الكائن تنطوي على مناطق متعددة في الدماغ ، بما في ذلك قشرة المحيط ، وقشرة الانعزال ، وقشرة الفص الجبهي البطيني ، بالإضافة إلى قرن آمون25،26،27,،28،29،30،31،32،33،34،35،36،37،38. وقد أظهرت الفئران الصرع Pilocarpine المعالجة باستمرار العاهات السلوكية في اختبار الذاكرة المكانية مع الضرر العصبي واسع النطاق فرس النهر39,40,41,42, في حين أن اختبارات الذاكرة التعرف على الكائن قد أسفرت عن نتائج مثيرة للجدل, مع انحطاط الخلايا العصبية المتغيرة في مناطق الدماغ parahippocampal10,,41,,42,,43,,44. تعني هذه البيانات أن التعرف على الكائن قد يتطلب اتصالات شبكة متطورة بين مناطق الدماغ المتعددة، على عكس الذاكرة المكانية التي يمكن أن يلعب فيها قرن آمون دورًا مركزيًا. عندما يتم تقييم الحقول الفرعية لفرس النهر عن كثب ، تم العثور على مناطق الدوران CA1 و CA3 /dentate لمعالجة معلومات مختلفة. على وجه التحديد، ويعتقد أن الخلايا العصبية CA1 ليتم تنشيطها عن طريق التعرض لعناصر مماثلة، في حين تشارك CA3 وجيروس الدنات في التمييز الأجسام المماثلة23،45. بما يتفق مع هذه الفرضية, الأدلة الناشئة تشير إلى أن الخلايا العصبية حديثي الولادة التدنة يمكن أن تسهم في نمط أداء الفصل45,46,47. وبالنظر إلى أن التهاب النهر الشاذ يمكن أن يكون مستحثا ً خلال تكوين الصرع10، يمكن أن تظهر الفئران الصرعضعف في الأداء في التجارب المماثلة التمييزية بسبب الاندماج المعطلة للخلايا العصبية الوليدة في الصرع المزمن.

في الختام، نحن نصف كيفية تقييم ضعف الذاكرة في الفئران الصرع. على وجه التحديد، نحن نقدم بروتوكولات تجريبية لثلاثة اختبارات سلوكية، NL، NO، واختبارات PS، والتي تختبر الذاكرة للأماكن والكائنات والسياقات، على التوالي. من بين العديد من نماذج الاختبار المعرفي المتاحة للفئران ، والاختبارات NL ، NO ، وPS بسيطة جدا ، والاختبارات القصيرة التي تشدد الحد الأدنى من الحيوانات ، مما يجعلها الأمثل لتقييم وظيفة الذاكرة في الحيوانات الصرع دون اثارة النوبات المتكررة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ونشكر الدكتور جاي مين لي على دعمه التقني. تم دعم هذا العمل من خلال منح المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (NRF-2019R1A2C1003958، NRF-2019K2A9A2A08000167).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringe Sung-shim Use with the 26 or 30 gauge needle
70% Ethanol Duksan UN1170 Spray to clean the box and objects
black curtain For avoiding unnecessary visual cues
Cresyl violet Sigma C5042 For Cresyl violet staining
cryotome Leica E21040041 For tissue sectioning
double-sided sticky tape For the firm placement of the objects
DPX mounting medium Sigma 06522
ethanol series Duksan UN1170 Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions
floor plate with narrow grid patterns Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm
floor plate with wide grid patterns Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm
illuminometer TES Electrical Electronic Corp. 1334A For the measurement of the room lighting (60 Lux)
Intensive care unit Thermocare #W-1
ketamine hydrochloride Yuhan 7003 Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
LED lamp Lungo P13A-0422-WW-04 Lighting for the behavioral test room
objects Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle
open field box Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm
paper towel Yuhan-Kimberly 47201 Use to dry open field box and objects
paraformaldehyde Merck Millipore 104005 Make 4% solution
pilocarpine hydrochloride Sigma P6503
ruler Use to locate the objects in the open field box
scopolamine methyl nitrate Sigma S2250 Make 10X stock
Smart system 3.0 Panlab Video tracking system
stopwatch Junso JS-307 For the measurement of explorative activities of mice
sucrose Sigma S9378 For cryoprotection of tissue sections
terbutaline hemisulfate salt Sigma T2528 Make 10X stock
video camera (CCD camera) Vision VCE56HQ-12 Place the camera directly overhead of the open field box
xylazine (Rompun) Bayer korea KR10381 Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
xylene Duksan UN1307 For Cresyl violet staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349, (13), 1257-1266 (2003).
  2. Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7, (4), 348-354 (2007).
  3. Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5, (7), 380-391 (2009).
  4. Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
  5. Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34, (1), 183-204 (2016).
  6. Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
  7. Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207, (2), 329-349 (2007).
  8. Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114, (17), 3536-3545 (2017).
  9. Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
  10. Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606 (2015).
  11. Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55, (4), 3316-3327 (2018).
  12. Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
  13. Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429 (2016).
  14. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  16. Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219, (1), 284-297 (2009).
  17. Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51, (4), 789-804 (2006).
  18. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11, (1), 0147733 (2016).
  19. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718 (2017).
  20. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13, (2), 93-110 (2012).
  21. van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13, (8), 1763-1792 (2018).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8, (12), 2531-2537 (2013).
  23. Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
  24. Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1, (1), 41-50 (2000).
  25. Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2, (1), 51-61 (2001).
  26. Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24, (26), 5901-5908 (2004).
  27. Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25, (1), 52-61 (2005).
  28. Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12, (5), 447-449 (2005).
  29. Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16, (12), 1759-1765 (2006).
  30. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
  31. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23, (17), 1685-1690 (2013).
  32. Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17, (1), 5-11 (2010).
  33. Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
  34. de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405, (1-2), 142-146 (2006).
  35. Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82, (1), 26-34 (2004).
  36. Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20, (23), 8853-8860 (2000).
  37. Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
  38. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9, (2), 49-57 (2002).
  39. Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
  40. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
  41. Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59, (9), 1785-1795 (2018).
  42. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  43. Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46, (4), 499-508 (2005).
  44. Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21, (7), 702-713 (2011).
  45. Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34, (10), 515-525 (2011).
  46. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167, (4), 897-914 (2016).
  47. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472, (7344), 466-539 (2011).
تقييم وظيفة الذاكرة في الفئران الصرع التي يسببها بيلوكاربين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, K. M., Kim, J. E., Choi, I. Y., Cho, K. O. Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice. J. Vis. Exp. (160), e60751, doi:10.3791/60751 (2020).More

Park, K. M., Kim, J. E., Choi, I. Y., Cho, K. O. Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice. J. Vis. Exp. (160), e60751, doi:10.3791/60751 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter