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Behavior

皮洛卡平诱导癫痫小鼠记忆功能评估

Published: June 4, 2020 doi: 10.3791/60751

Summary

本文介绍了评估皮洛卡平诱导癫痫小鼠记忆损伤的实验程序。该协议可用于研究癫痫相关认知衰退的病理生理学机制,这是癫痫最常见的合并症之一。

Abstract

认知障碍是叶癫痫最常见的合并症之一。为了在癫痫动物模型中重述癫痫相关认知衰退,我们产生了由皮洛卡平治疗的慢性癫痫小鼠。我们使用这些癫痫小鼠为三种不同的行为测试提供了一个协议:新对象位置 (NL)、新对象识别 (NO) 和模式分离 (PS) 测试,分别用于评估地点、对象和上下文的学习和记忆。我们解释了如何在运动场测试后,为NL、NO和PS测试设置行为装置并提供实验程序,该测试测量动物的基底运动活动。我们还描述了NL、NO和PS测试在评估癫痫小鼠记忆功能的其他行为测试方面的技术优势。最后,我们讨论了癫痫小鼠在熟悉会话期间未能与物体进行良好接触的可能原因和解决方案,这是成功进行记忆测试的关键步骤。因此,该协议提供了有关如何使用小鼠评估癫痫相关记忆损伤的详细信息。NL、NO 和 PS 测试简单、高效的检测,适用于评估癫痫小鼠中不同类型的记忆。

Introduction

癫痫是一种慢性疾病,其特征是自发性复发性发作11、2、3。2,3由于重复性癫痫发作可引起大脑11、2、32,3的结构和功能异常,异常发作活动可引起认知功能障碍,这是最常见的癫痫相关合并症4,4、5、6。,6与慢性癫痫发作事件相反,这些发作是短暂的和短暂的,认知障碍会持续到癫痫患者的生活中,从而恶化他们的生活质量。因此,了解癫痫相关认知衰退的病理生理学机制非常重要。

各种癫痫实验动物模型被用来证明与慢性癫痫相关的学习和记忆缺陷787,8,9,10,11,12。,9,10,11,12,例如,莫里斯水迷宫、上下文恐惧调理、孔板、新型物体位置(NL)和新颖的物体识别(NO)测试经常被用来评估叶癫痫(TLE)的记忆功能障碍。由于海马是TLE显示病理学的主要区域之一,因此通常优先选择能够评估海马依赖记忆功能的行为测试。然而,鉴于癫痫发作可以诱发异常海马神经发生,并促成癫痫相关认知衰退10,测试变性新生儿神经元功能的行为范式(即空间模式分离,PS)8,13也可以提供有关癫痫记忆损伤细胞机制8,13的宝贵信息。

在本文中,我们演示了针对癫痫小鼠的一组内存测试 NL、NO 和 PS。测试简单且易于访问,不需要复杂的系统。

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Protocol

所有实验程序均经韩国天主教大学伦理委员会批准,并根据《国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南》(NIH出版物第80-23号)进行。

1. 新颖对象位置测试 (NL)

  1. 在皮洛卡平注射4-6周后准备癫痫C57BL/6或转基因小鼠。
    注:急性癫痫发作是由腹内(IP)皮洛卡平注射引起的,遵循我们上次报告14中详述的协议。
  2. 在行为测试开始前一天,将癫痫小鼠从繁殖室转移到行为室。让老鼠在一夜之间习惯至少12小时。
  3. 在行为室里,将单个小鼠分成新的笼子,用于单壳体。将每个动物的信息写在笼子卡片上,并在行为测试中将动物放在同一个笼子里。多个笼子可以使用推车同时传输。
  4. 第二天,在清晨开始3天的居住课程(H1+H3)。使动物在家庭笼子里的光线不足30分钟。
  5. 准备外尺寸为 44 x 44 x 31 厘米、内部尺寸为 43 x 43 x 30.5 厘米的开放场箱。在习惯(H1)的第 1 天,在开放场框的中心放置一个照明计,并将照度调整到 60 勒克斯。
  6. 用70%乙醇喷洒露天盒子的地板和墙壁,并用干净的纸巾擦拭,以去除可能的嗅觉线索。然后等待至少1分钟,直到残留酒精完全干燥。
  7. 通过执行开放场测试来评估每只鼠标的运动活动。
    1. 要记录和跟踪每个实验鼠标的行为,请使用动物行为视频跟踪软件(参见材料表)。
    2. 打开视频跟踪软件后,校准打开字段框的大小。然后,设置用于跟踪的区域。设置 3 秒的延迟和 15 分钟的采集时间,以避免跟踪实验者的手。插入有关每个实验鼠标的信息(组、性别、年龄等)。
    3. 然后,轻轻地将实验鼠标放在面向墙壁的开放式盒子中。为此,将其放在笼子盖上,以尽量减少处理相关的压力和焦虑。然后,释放鼠标靠近开放字段框的墙,该鼠标距离对象在熟悉会话期间最远的位置(步骤 1.9.3)。
      注:一旦鼠标在开放字段框中,鼠标跟踪软件将自动检测到它并开始录制。为了对探索进行最佳跟踪,摄像机可以放置在开放字段框的正上方。
    4. 录音15分钟后,将动物放在笼子盖上,将动物送回其家庭笼子。用 70% 乙醇喷雾清洁开场盒,并在试验之间用干净的纸巾擦拭。恢复明亮的光线,并根据制造商的说明使用视频跟踪软件测量动物移动的总距离。
      1. 打开视频跟踪软件和视频剪辑。然后,单击"分析"以基于开放字段框大小的校准计算移动的总距离。
  8. 在第 2 天和第 3 天,通过重复步骤 1.3 到 1.7 来执行习惯会话(H2、H3)。
  9. 在第 4 天,执行熟悉会话 (F1)。
    1. 在昏暗的灯光下,将每只鼠标放在空旷的字段中 3 分钟。短暂康复后,将动物送回其家笼。
    2. 在居住过程中,用70%乙醇彻底清洁物体,并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟,让残留的酒精完全干燥。
    3. 将两个相同的物体(橡胶娃娃,物体A)放置在离相邻墙壁 5 厘米的露天竞技场中。使用双面胶带修复对象。将实验鼠标引入开放式盒子,面朝离物体最远的墙。
    4. 允许免费探索 20 分钟,并手动测量使用两个秒表探索两个物体所花费的时间。一旦鼠标达到两个物体的最小探测时间(30秒),停止F1会话,并将动物转移到其家庭笼子。如果鼠标在 20 分钟内无法浏览对象 30 秒,请从打开的字段框中删除鼠标,并将其从其他会话中排除。
    5. 将动物从开放式盒子中取出后,用 70% 乙醇喷雾彻底清洁盒子的地板和墙壁,并用纸巾将其擦拭。
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为(如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止)量化为探索时间。
  10. 第 5 天,执行 NL 测试会话。
    1. 将鼠标从家庭笼子转移到开阔的田间区域进行 3 分钟的康复。然后把动物送回家里的笼子里。
    2. 在居住过程中,用70%乙醇彻底清洁物体,并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟,让残留的酒精完全干燥。
    3. 将一个物体(橡胶娃娃、对象 A)移到对角线位置,距离相邻墙壁 5 厘米。使用双面胶带修复对象。将实验鼠标放在笼盖上,转移到开阔的场区,并朝向开放场箱的墙。
      注: 平衡移动的对象的位置,以减少对特定方向的任何潜在固有偏好。例如,从一半的实验动物的熟悉会话更改首选对象的位置,对于其余动物,从熟悉会话中移动不太首选的对象。
    4. 使用视频跟踪系统免费浏览和录制 10 分钟。使用两个秒表测量每个对象探索每个对象所花费的时间,并将歧视比率计算为
      Equation 1
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为(如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止)量化为探索时间。
    5. 抓住实验鼠的尾巴,放在笼子盖上,转移到笼子里。3天(第6-8天),让鼠标休息,免费获得食物和水。
    6. 一旦动物从开放式的盒子中取出,用70%乙醇喷雾彻底清洁盒子的地板和墙壁,并用纸巾擦拭。

2. 新颖对象识别测试(NO)

  1. 第 9 天,通过重复步骤 1.2_1.7 执行 15 分钟的习惯会话。
  2. 在第 10 天,执行熟悉会话 (F1)。
    1. 在昏暗的灯光下,将鼠标放在空旷区域 3 分钟。将鼠标康复到开阔场地区域后,暂时将其送回其主笼。
    2. 在居住过程中,用70%乙醇彻底清洁物体,并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟,让残留的酒精完全干燥。
    3. 将两个相同的物体(50 mL塑料管装满40 mL的水,物体B)放置在离相邻墙壁5厘米的空地上。使用双面胶带修复对象。将实验鼠标引入离物体最远的墙面的开放式盒子中。
    4. 由于动物暴露在NO测试中的两个不同的物体(50 mL塑料管,装满40mL的水,物体B;玻璃Coplin罐,物体C),在F1会话期间平衡物体。例如,为组中一半的动物呈现两个相同的对象(玻璃 Coplin 罐,对象 C)。
    5. 允许免费探索 20 分钟,并手动测量使用两个秒表探索两个物体所花费的时间。一旦鼠标达到两个物体的最小探测时间(30秒),停止F1会话,并将动物转移到其家庭笼子。如果鼠标在 20 分钟内无法浏览对象 30 秒,请将其从打开的字段框中删除,并将其从其他会话中排除。
    6. 将动物从开放式盒子中取出后,用 70% 乙醇喷雾彻底清洁盒子的地板和墙壁,并用纸巾将其擦拭。
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为(如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止)量化为探索时间。
  3. 第二天(第11天),执行无测试会话。
    1. 将鼠标从家庭笼子转移到露天进行3分钟的康复,然后将老鼠送回其家庭笼子。
    2. 在居住过程中,用70%乙醇彻底清洁物体,并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟,让残留的酒精完全干燥。
    3. 将一个物体(50 mL塑料管装满40 mL的水,物体B)替换为另一个物体(玻璃Coplin罐,物体C)距离相邻墙壁5厘米。使用双面胶带修复对象。将笼子盖上的实验鼠标转移到开阔的田地,然后朝墙放置。平衡 NO 测试期间一起呈现的对象。例如,将一个玻璃 Coplin 罐(对象 C)替换为一个 50 mL 塑料管,该塑料管填充了 40 mL 的水(对象 B),用于在熟悉会话期间接触两个玻璃 Coplin 罐(对象 C)的小鼠。
      注: 也可以对替换的对象的位置进行平衡,以减少特定方向的潜在与生俱来的偏好。例如,对于暴露于两个对象集(对象 B 或对象 C)的每个动物组,更改一半实验动物的熟悉会话中的首选对象,对于其余动物,替换在熟悉会话中不太喜欢的对象。
    4. 允许 10 分钟的免费探索,并使用视频跟踪系统进行录制。使用两个秒表测量每个对象探索每个对象所花费的时间,并计算歧视比率。
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为(如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止)量化为探索时间。
    5. 抓住实验鼠的尾巴,放在笼子盖上,转移到笼子里。3天(第12~14天),让鼠标休息,免费获得食物和水。
    6. 一旦动物从开放现场箱中取出,用70%乙醇喷雾彻底清洁露天盒子的地板和墙壁,并用纸巾擦拭。

3. 模式分离测试(PS)

  1. 第 15 天,为 PS 测试执行第一个熟悉会话 (F1)。
    1. 将鼠标从主笼转移到开阔的田地进行3分钟的康复,然后将其送回其家庭笼子。
    2. 在居住过程中,用70%乙醇彻底清洁物体和网格化地板,并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟,让残留的酒精完全干燥。
    3. 将带有宽网格(5.5 x 5.5 厘米)的底板(42.5 x 42.5 x 0.5 厘米)放在开放场框中,并将两个相同的物体(装满 50 mL 水的塑料 T 瓶,对象 D)放置在离相邻墙壁 5 厘米的露天。使用双面胶带修复对象。将实验鼠标引入离物体最远的墙面的开放式盒子中。
    4. 由于动物在PS测试中暴露于两个不同的物体(塑料T瓶装满50 mL的水,物体D;玻璃瓶,物体E),在F1和F2会话期间平衡物体。例如,在宽网格地板上为组中一半的动物呈现两个相同的对象(玻璃瓶、对象 E)。
    5. 允许免费探索 20 分钟,并使用两个秒表手动测量两个对象探索所花费的时间。一旦鼠标达到两个物体的最小探测时间总计 (30 s),停止 F1 会话并将动物转移到其家庭笼子。如果鼠标在 20 分钟内无法浏览对象 30 秒,请将其从打开的字段框中删除,并将其从其他会话中排除。
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为(如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止)量化为探索时间。
    6. 完成第一次熟悉会话 (F1) 后,使用 70% 乙醇喷雾彻底清洁物体和地板,并将其从开放式现场箱中取出。
  2. 第二天(第 16 天),执行 PS 测试的第二个熟悉会话 (F2)。
    1. 将鼠标从家庭笼子转移到开阔的田地进行3分钟的康复,然后将老鼠送回其家庭笼子。
    2. 在居住过程中,用70%乙醇彻底清洁物体和网格化地板,并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟,让残留的酒精完全干燥。
    3. 将带窄网(2.75 x 2.75 厘米)的底板(42.5 x 42.5 x 0.5 厘米)放在开放场框中,并将两个相同的物体(玻璃瓶、物体 E)放置在离相邻墙壁 5 厘米的开阔字段中。使用双面胶带修复对象。将实验鼠标引入离物体最远的墙面的开放式盒子中。
    4. 对于平衡,在狭窄的网格地板上呈现两个相同的物体(塑料T瓶填充50 mL的水,物体D)。
    5. 允许免费探索 20 分钟,并手动测量使用两个秒表探索两个物体所花费的时间。一旦鼠标达到两个物体的最小探测时间总计 (30 s),停止 F2 会话并将动物转移到其家庭笼子。如果鼠标在 20 分钟内无法浏览对象 30 秒,请将其从打开的字段框中删除,并将其从其他会话中排除。
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为(如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止)量化为探索时间。
    6. 完成第二次熟悉会话 (F2) 后,使用 70% 乙醇喷雾彻底清洁物体和地板,并将其从开放式现场箱中取出。
  3. 第二天(第17天),执行PS测试会话。
    1. 将鼠标从主笼转移到开阔的田地进行3分钟的康复,然后将其送回其家庭笼子。
    2. 在居住过程中,用70%乙醇彻底清洁物体和网格化地板,并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟,让残留的酒精完全干燥。
    3. 将窄网格(2.75 x 2.75 厘米)的地板放在开放式盒子中,并将两个不同的物体(装满 50 mL 的水的塑料 T 瓶、物体 D、玻璃瓶、物体 E)放置在离相邻墙壁 5 厘米远的地板上。使用双面胶带修复对象。将笼盖上的实验鼠标转移到开阔的田间区域,并将其置于墙面上。
    4. 平衡 PS 测试期间一起呈现的对象。例如,将每个对象(对象 D、对象 E)放置在窄网格地板上,以使对象 E 成为此上下文中的新对象。还可以对对象 D 或对象 E 的位置(窄地板图案上的新对象)的位置进行平衡,以减少对特定方向的先天偏好的可能性。例如,替换实验动物第二个熟悉会话中的首选对象,对于其余动物,替换第二个熟悉会话中不太首选的对象。
    5. 使用视频跟踪系统免费浏览和录制 10 分钟。使用两个秒表测量每个对象探索每个对象所花费的时间,并计算歧视比率。
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为(如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止)量化为探索时间。
    6. 抓住实验鼠的尾巴,放在笼子盖上,转移到笼子里。

4. 克里西尔紫色染色

  1. 完成所有行为测试后,通过注射一种鸡尾酒(4:0.5)氯胺酮(50mg/mL)和锡拉辛(23.3毫克/米)在盐水中溶解,以110 mL/kg体重(IP;1 mL注射器;26 G针)为动物麻醉。检查因对脚趾捏缺乏反应而麻醉的深度。
  2. 一旦动物被深度麻醉,进行转体灌注与4%的副甲醛,以修复大脑15。
  3. 转盘灌注完成后,用一把剪刀将动物斩首15。然后,用一把虹膜剪刀取出头骨,露出大脑。分离后,在4%的副甲醛中过夜后修复,随后在0.01M磷酸盐缓冲盐水中冷冻保护30%蔗糖。
  4. 使用冷冻剂从卡扣冷冻的大脑制作日冕部分(30 μm)。
  5. 将脑组织安装在幻灯片上,通过连续洗涤3分钟,依次为100%、95%、90%、80%、70%乙醇,执行从100%乙醇到自来水的一系列水化步骤。
  6. 在0.1%的克里西尔紫罗兰溶液中孵育组织幻灯片15分钟。
  7. 将组织滑片浸入 95% 乙醇/0.1% 的冰醋酸中,然后用 100% 乙醇、50% 乙醇/50% 二甲苯和 100% 二甲苯溶液使组织脱水,从而去除过多的污渍。
  8. 使用市售的二甲苯安装介质盖住组织幻灯片。

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Representative Results

图1显示了评估认知功能的一般实验时间表和设置。在引入皮洛卡平引起的急性癫痫发作六周后,小鼠接受NL、NO和PS测试,按该顺序在测试之间间隔3天休息期(图1A)。对于 NL 测试,在熟悉会话 (F1) 期间,两个相同的对象放置在开放字段中,第二天,一个对象移动到新位置。在 NO 测试中,一个对象在测试会话期间被替换为新对象。对于 PS 测试,两个熟悉会话 (F1, F2) 引入了不同地板网格模式和对象的组合。然后,在测试日,每个熟悉会话中的一个对象被放置在窄网格地板图案上,使一个对象在窄网格地板图案的上下文中新颖(图 1B)。开放场框可以直接放置在电荷耦合设备摄像机下的桌子上,并被黑色窗帘包围,以避免不必要的视觉提示(图2A)。样品对象易于清洁大小相似或略大于鼠标的材料(图2B)。需要对对象组合进行预筛选,以确认一起呈现的两个对象之间没有显著的首选项(图 2C)。不同图案的地板被放置在开放场箱中,在PS测试中提供额外的实验线索(图2B)。一旦鼠标被引入开放字段框,视频跟踪系统跟踪其轨迹以分析其总运动距离(图2D)。在注射皮洛卡平六周后,癫痫小鼠在NL测试中表现出显著降低的鉴别率,显示空间记忆受损(图3)。此外,在NO测试中,癫痫小鼠与假对照相比,其记忆功能受损。当用PS测试评估新生儿神经元功能时,癫痫小鼠很难在具有多个线索的上下文中识别新对象。作为控制实验,评估了在熟悉会话期间达到勘探标准的locomotor活性和延迟(图3)。对运动活动的测量显示,癫痫动物(图3C)明显增加,与先前的报告16、1717一致,16而探索这些物体的动机在假动物和癫痫动物之间是可比的(图3D)。在熟悉会话中,我们的辍学率分别为NL、NO和PS测试的17.4%、18.2%、0%,这表明动物在一系列行为试验中已经习惯了实验环境。最后,我们使用克里西尔紫罗兰染色法评估了皮洛卡平诱导状态癫痫后海马细胞死亡,以确认癫痫发作引起的神经元损伤(图4)。与假对照不同,经过皮洛卡平处理的动物在海马的海马和CA3子场中表现出的结节细胞(图4)。

Figure 1
图 1:行为测试电池的原理图表示。A) 新对象位置 (NL)、新对象识别 (NO) 和假鼠和癫痫小鼠的模式分离 (PS) 测试的行为时间表的原理图图。(B) NL、NO 和 PS 测试的对象和地板配置的代表性图像。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 2
图2:认知功能评价行为装置。A) 行为设置的概述。摄像机被放置在开放场框的正上方,该盒子被窗帘包围,以避免不必要的提示。(B) 新对象位置 (NL)、新对象识别 (NO) 和模式分离 (PS) 测试的样本对象。在 PS 测试中,将具有不同图案(即宽和窄网格)的地板插入开放字段框,以提供其他提示。(C) 显示在 NO 和 PS 测试会话 (n = 7) 期间一起显示的探索每个对象的时间的图形。请注意,曼-惠特尼 U 测试评估的两个对象(对于无测试)和学生未配对的 t 测试(用于 PS 测试)之间的首选项没有显著差异。(D) 显示视频跟踪系统在开放场框中检测到实验鼠标的图像。红色方块表示用于跟踪鼠标轨迹的预设区域。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 3
图3:癫痫小鼠的空间记忆和模式分离受损。A) 新对象位置 (NL)、新对象识别 (NO) 和模式分离 (PS) 测试的原理图表示。新颖的物体被指示为红色圆圈。(B) 显示 NL、NO 和 PS 测试中假(n = 8) 和癫痫小鼠 (n = 10) 之间的歧视比率的图形。请注意,癫痫小鼠在NL、NO和PS测试中表现出明显的损伤,分别测试位置、对象和上下文的内存功能。*p < 0.05 通过曼-惠特尼 U 测试的 NL 测试。*p < 0.05 由学生对 NO 测试的未配对 T 测试。*p < 0.05 由学生未配对 T 测试与韦尔奇的 PS 测试校正。(C) 显示假(n = 8) 和癫痫小鼠 (n = 10) 的运动活动的图表。请注意,与以前的报告一致,癫痫小鼠的运动增加。\p < 0.05 通过学生的未配对 T 测试。(D) 在 NL、NO 和 PS 测试的熟悉会话中显示延迟到 30 s 标准的图形。请注意,探索假(n = 8)和癫痫小鼠(n = 10)之间的物体的动机没有差异。数据以均值 = 均值 (SEM) 的标准误差形式呈现。SE = 状态癫痫。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 4
图4:皮洛卡平引起的状态癫痫症(SE)后海马的神经元死亡。代表性图像从 (A) 假和 (B) 癫痫组 58 天后,皮洛卡平注射.放大的图像显示海马的hilus(a, d),CA1 子场 (b, e) 和 CA3 子场 (c, f), 这些子场在图像中以较低的放大倍率表示为白色方块。注意海马海马和CA3子场中的皮头细胞。最左侧图像中的缩放条 = 200 μm,也适用于下图;刻度柱在abc = 40 μm, 也分别适用于d, ef, 。请点击此处查看此图形的较大版本。

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Discussion

本研究描述了评估慢性癫痫小鼠认知功能的实验程序。许多不同的行为测试范式用于评估小鼠18中的学习和记忆功能。莫里斯水迷宫、径向臂迷宫、Y迷宫、上下文恐惧调节和基于对象的测试是最常用的行为测试,并提供可靠的结果。其中,NL、NO和PS测试是评价癫痫小鼠,8、10学习和记忆的有效、简单的方法。8由于癫痫小鼠在行为过程中可能有意外的自发性癫痫发作,因此最好根据动物的自然倾向进行行为测试,以探索新颖性,而不添加其他阳性或阴性强化物,例如恐惧调节、轻度饥饿或强迫游泳等有活动动机的增强剂,从而引发复发性发作19、20。19,此外,与其他行为测试相比,基于新奇的测试对动物的压力较小,因为不需要进行广泛的训练。此外,通过简单地更改对象位置、呈现新对象或结合其他刺激,可以轻松地修改基于新奇的行为测试,以评估不同类型的内存(即空间记忆、识别记忆或偶发性记忆)。综合起来,基于新奇的测试,如NL、NO和PS测试,在评估癫痫小鼠的认知功能方面具有多功能的优势。

虽然NL、NO和PS测试是快速和有用的实验模型,用于研究癫痫小鼠的学习和记忆功能,但在使用时必须考虑几个因素。众所周知,慢性癫痫小鼠表现出对皮洛卡平注射7的增强焦虑,导致在熟悉过程中物体探索明显减少。这种缺乏探索会导致对测试结果的误解。因此,在熟悉会话之前,必须为小鼠在开放场中加入足够的习惯,以适应环境。根据菌株的不同,小鼠在熟悉会话的20分钟内仍可能无法探索物体,即使在3次习惯之后。在这种情况下,在开放字段框中添加另一个具有额外对象对的填充会话有助于降低鼠标对对象的焦虑。开放场框周围的窗帘可以最大限度地减少外部房间提示,使实验鼠能够专注于开放场中的物体。此外,探索标准应足够严格,以排除动物的鼻圈不指向对象的行为,例如坐在对象上、通过对象或用后端指向对象休息。最后,虽然它可能是非常罕见的,癫痫发作事件可能发生在行为任务期间。在这种情况下,建议将这些动物从进一步评估中删除,因为这可能是记忆函数评估的混淆偏差的来源。

由于NL、NO和PS测试是非常敏感的实验,依靠动物对新颖刺激的自然好奇心,细微的变化可能会影响小鼠的探索行为,导致无结论的歧视比21,22。21,例如,对鼠标的粗暴处理、在行为任务之前更换床上用品、测试时间不一致以及测试室适应不足,都会导致动物的压力水平升高,导致测试结果模棱两可。此外,应仔细考虑改变的测试环境,例如每次会话中不对称物体的不一致表示、在实验场附近放置家庭笼子或切换实验者的嗅觉特征,以避免其他因素。在数据分析阶段,由于啮齿动物探索行为或秒表用法的不同标准,多个实验者的评估可能会增加行为结果的变异性。总之,在成功实施 NL、NO 和 PS 测试时,也应牢记这些方面。

海马和副海马区域已知在记忆处理23、24,24中扮演独特的角色。人们普遍认为,空间记忆很大程度上取决于海马的功能,NL测试23,24,24可以很容易地评估。另一方面,对象识别记忆似乎涉及多个大脑区域,包括内额皮层、内皮层和前额叶皮层,此外还有海马25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38。25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38皮洛卡平治疗癫痫小鼠在空间记忆测试中一直表现出行为障碍,具有广泛的海马神经元损伤39、40、41、42,而物体识别记忆测试产生了有争议的结果,在辅助海波脑区域39,40,41,421010、41、42、43、44中,神经元变性变数。,41,42,43,44这些数据意味着,对象识别可能需要多个大脑区域之间的复杂网络连接,这与海马可以发挥核心作用的空间记忆不同。当仔细评估特定的海马子场时,CA1和CA3/丹特陀螺区域可以处理不同的信息。具体来说,CA1神经元被认为是通过接触类似物体而激活的,而CA3和变性陀螺仪则参与区分类似的物体23,45。23,与这个假设一致,新的证据表明,变性的新生儿神经元可以促进模式分离性能45,46,47。45,46,47鉴于异常海马神经发生可以在癫痫发生10期间诱发,癫痫小鼠可以表现出在歧视类似经历中受损的表现,因为慢性癫痫中新生儿神经元的整合中断。

最后,我们描述了如何评估癫痫小鼠的记忆损伤。具体来说,我们为三个行为测试(NL、NO 和 PS 测试)提供实验协议,分别测试位置、对象和上下文的内存。在小鼠可用的许多认知测试范式中,NL、NO 和 PS 测试非常简单,短小的检测对动物的压力最小,这使得它们最适合评估癫痫动物的记忆功能,而不会引发复发性发作。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢李杰敏博士的技术支持。这项工作得到了韩国政府资助的韩国国家研究基金会(NRF-2019R1A2C1003958,NRF-2019K2A9A2A2A08000167)的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringe Sung-shim Use with the 26 or 30 gauge needle
70% Ethanol Duksan UN1170 Spray to clean the box and objects
black curtain For avoiding unnecessary visual cues
Cresyl violet Sigma C5042 For Cresyl violet staining
cryotome Leica E21040041 For tissue sectioning
double-sided sticky tape For the firm placement of the objects
DPX mounting medium Sigma 06522
ethanol series Duksan UN1170 Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions
floor plate with narrow grid patterns Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm
floor plate with wide grid patterns Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm
illuminometer TES Electrical Electronic Corp. 1334A For the measurement of the room lighting (60 Lux)
Intensive care unit Thermocare #W-1
ketamine hydrochloride Yuhan 7003 Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
LED lamp Lungo P13A-0422-WW-04 Lighting for the behavioral test room
objects Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle
open field box Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm
paper towel Yuhan-Kimberly 47201 Use to dry open field box and objects
paraformaldehyde Merck Millipore 104005 Make 4% solution
pilocarpine hydrochloride Sigma P6503
ruler Use to locate the objects in the open field box
scopolamine methyl nitrate Sigma S2250 Make 10X stock
Smart system 3.0 Panlab Video tracking system
stopwatch Junso JS-307 For the measurement of explorative activities of mice
sucrose Sigma S9378 For cryoprotection of tissue sections
terbutaline hemisulfate salt Sigma T2528 Make 10X stock
video camera (CCD camera) Vision VCE56HQ-12 Place the camera directly overhead of the open field box
xylazine (Rompun) Bayer korea KR10381 Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
xylene Duksan UN1307 For Cresyl violet staining

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References

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皮洛卡平诱导癫痫小鼠记忆功能评估
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Park, K. M., Kim, J. E., Choi, I.More

Park, K. M., Kim, J. E., Choi, I. Y., Cho, K. O. Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice. J. Vis. Exp. (160), e60751, doi:10.3791/60751 (2020).

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