Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Behavior

Vurdering af hukommelsesfunktionen i pilocarpine-inducerede epileptiske mus

doi: 10.3791/60751 Published: June 4, 2020

Summary

Denne artikel præsenterer eksperimentelle procedurer for vurdering af hukommelsessvækkelser i pilocarpine-inducerede epileptiske mus. Denne protokol kan bruges til at studere de patofysiologiske mekanismer af epilepsi-associeret kognitiv tilbagegang, som er en af de mest almindelige comorbiditeter i epilepsi.

Abstract

Kognitiv svækkelse er en af de mest almindelige comorbiditeter i temporal lap epilepsi. For at opsummere epilepsi-associeret kognitiv tilbagegang i en dyremodel af epilepsi, genererede vi pilocarpine-behandlede kroniske epileptiske mus. Vi præsenterer en protokol for tre forskellige adfærdsmæssige tests ved hjælp af disse epileptiske mus: roman objekt placering (NL), nye objekt anerkendelse (NO), og mønster adskillelse (PS) test til at evaluere læring og hukommelse for steder, objekter og sammenhænge, henholdsvis. Vi forklarer, hvordan man indstiller adfærdsapparatet og leverer eksperimentelle procedurer for NL-, NO- og PS-test efter en åben felttest, der måler dyrenes basale bevægelsesaktiviteter. Vi beskriver også de tekniske fordele ved NL-, NO- og PS-test med hensyn til andre adfærdstest til vurdering af hukommelsesfunktion i epileptiske mus. Endelig diskuterer vi mulige årsager og løsninger til epileptiske mus, der ikke har gjort 30 s god kontakt med objekterne under familiarization sessioner, hvilket er et kritisk skridt for en vellykket hukommelse test. Således giver denne protokol detaljerede oplysninger om, hvordan man vurderer epilepsi-associerede hukommelsessvækkelser ved hjælp af mus. NL-, NO- og PS-testene er enkle og effektive analyser, der er velegnede til evaluering af forskellige typer hukommelse i epileptiske mus.

Introduction

Epilepsi er en kronisk lidelse karakteriseret ved spontane tilbagevendende anfald1,2,3. Fordi gentagne anfald kan forårsage strukturelle og funktionelle abnormiteter i hjernen1,,2,3, unormal beslaglæggelse aktivitet kan bidrage til kognitiv dysfunktion, som er en af de mest almindelige epilepsi-associerede comorbiditeter4,5,6. I modsætning til de kroniske anfaldshændelser, som er forbigående og momentane, kognitive svækkelser kan vare ved hele epileptiske patienters liv, forværrer deres livskvalitet. Derfor er det vigtigt at forstå de patofysiologiske mekanismer af epilepsi-associeret kognitiv tilbagegang.

Forskellige eksperimentelle dyremodeller for epilepsi er blevet anvendt til at påvise indlærings - og hukommelsesunderskud i forbindelse med kronisk epilepsi7,8,9,10,11,12. For eksempel har Morris vand labyrint, kontekstuelle frygt conditioning, hole-board, nye objekt placering (NL), og nye objekt anerkendelse (NO) test er ofte blevet brugt til at vurdere hukommelse dysfunktion i tidsmæssige lap epilepsi (TLE). Fordi hippocampus er en af de primære regioner, hvor TLE viser patologi, adfærdsmæssige tests, der kan evaluere hippocampus-afhængige hukommelsesfunktion er ofte fortrinsvis valgt. Men, i betragtning af, at anfald kan fremkalde afvigende hippocampal neurogenese og bidrage til epilepsi-associeret kognitiv tilbagegang10, adfærdsmæssige paradigmer til test dentate nyfødte neuronal funktion (dvs. rumlig mønster adskillelse, PS)8,13 kan også give værdifulde oplysninger om de cellulære mekanismer hukommelse funktionsnedsættelser i epilepsi.

I denne artikel demonstrerer vi et batteri af hukommelsestest, NL, NO og PS, til epileptiske mus. Testene er enkle og let tilgængelige og kræver ikke et sofistikeret system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer blev godkendt af den etiske komité ved det katolske universitet i Korea og blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for care and use of Laboratory Animals (NIH Publications no. 80-23).

1. Roman objekt placering test (NL)

  1. Forbered epileptisk C57BL/6 eller transgene mus 4-6 uger efter indsprøjtning af pilocarpine.
    BEMÆRK: Akutte anfald blev forårsaget af intraperitoneal (IP) pilocarpin injektion, efter protokollen beskrevet i vores tidligere rapport14.
  2. Overfør de epileptiske mus fra avlsrummet til adfærdsrummet en dag før adfærdstestene begynder. Lad musene vænne sig til i mindst 12 timer natten over.
  3. I adfærdsrummet skal du adskille individuelle mus i nye bure til enkelthus. Skriv oplysningerne for hvert dyr på buret kortet og holde dyrene i de samme bure i hele adfærdsmæssige test. Flere bure kan overføres samtidigt ved hjælp af en vogn.
  4. På den næste dag, begynde 3 dages tilvænning sessioner (H1-H3) i de tidlige morgentimer. Akklimatisere dyrene til svagt lys i deres hjem bure i mindst 30 min.
  5. Forbered en åben feltkasse med udvendige dimensioner på 44 x 44 x 31 cm og indvendige mål på 43 x 43 x 30,5 cm. På dag 1 i tilvænningen (H1), placere et illuminometer i midten af det åbne felt boks og justere illuminance til 60 lux.
  6. Spray gulvet og væggene i det åbne felt boks med 70% ethanol og tørre ned med en ren køkkenrulle til at fjerne mulige olfaktoriske signaler. Vent derefter i mindst 1 min, indtil den resterende alkohol er tørret helt.
  7. Vurder hver mus's bevægelsesaktivitet ved at udføre en åben felttest.
    1. Hvis du vil registrere og spore hver eksperimentel muss funktionsmåde, skal du bruge videosporingssoftware tildyrs adfærd (se Tabel over materialer ).
    2. Når videosporingssoftwaren er åbnet, skal du kalibrere størrelsen på boksen med åbne felter. Angiv derefter zonen til sporing. Sæt 3 s af latenstid og 15 min erhvervelse tid for at undgå at spore en eksperimentator hænder. Indsæt oplysningerne om hver eksperimentel mus (gruppe, køn, alder osv.).
    3. Derefter forsigtigt placere en eksperimentel mus i det åbne felt boks mod væggen. Gør dette ved at placere den på buret låget for at minimere håndtering-associeret stress og angst. Slip derefter musen nær væggen i den åbne feltboks, der er længst væk fra, hvor objekterne vil være under den velkendte session (trin 1.9.3.).
      BEMÆRK: Når musen er i det åbne felt boks, vil musen tracking software automatisk opdage det og begynde at optage. For optimal sporing af udforskningen kan kameraet placeres direkte over boksen med åbent felt.
    4. Efter 15 minutters optagelse, returnere dyret til sit hjem bur ved at placere den på buret låget. Rengør den åbne feltkasse med 70% ethanolspray og tør ned med en ren køkkenrulle mellem forsøg. Gendan det klare lys og måle dyrets samlede afstand flyttet ved hjælp af video tracking software i henhold til producentens anvisninger.
      1. Åbn videosporingssoftwaren og videoklip. Klik derefter på Analyse for at beregne den samlede afstand, der flyttes, baseret på kalibreringen af boksen åben feltstørrelse.
  8. På dag 2 og dag 3 skal du udføre tilvænningssessionerne (H2, H3) ved at gentage trin 1.3 til 1.7.
  9. På dag 4 skal du udføre familiarization session (F1).
    1. I det svage lys skal du placere hver mus i det tomme åbne felt i 3 min. Efter denne korte rehabituation, returnere dyret til sit hjem bur.
    2. Under tilvænningen rengøres objekterne grundigt med 70% ethanol og tørres af med en køkkenrulle. Vent i mindst 1 min, for at restalkoholen tørrer helt.
    3. Placer to identiske objekter (gummi dukker, objekt A) i det åbne felt arena 5 cm væk fra de tilstødende vægge. Fastgør objekterne med dobbeltklæbende tape. Indfør den eksperimentelle mus i den åbne felt boks, vender væggen længst væk fra objekterne.
    4. Tillad gratis udforskning i 20 minutter og manuelt måle den tid, der bruges på at udforske begge objekter ved hjælp af to stopure. Når musen når den mindste efterforskningstid (30 s) for begge objekter, skal du stoppe F1-sessionen og overføre dyret til sit hjem bur. Hvis musen ikke kan udforske objekterne i 30 s inden for 20 minutter, skal du fjerne musen fra boksen med åbne felter og udelukke dem fra yderligere sessioner.
    5. Når dyret er fjernet fra den åbne felt kasse, grundigt rense gulvet og væggene i kassen med 70% ethanol spray og tørre dem ned med en køkkenrulle.
      BEMÆRK: Mål det tidspunkt, hvor musen rører objekterne med sine piskeris, snude eller forpoter. Kvantificer ikke nogen adfærd, hvor dyrets snude ikke peger mod objektet, f.eks.
  10. På dag 5 skal du udføre NL-testsessionen.
    1. Overfør musen fra sit hjem bur til det åbne område for rehabituation i 3 min. Derefter returnere dyret til sit hjem bur.
    2. Under tilvænningen rengøres objekterne grundigt med 70% ethanol og tørres af med en køkkenrulle. Vent i mindst 1 min, for at restalkoholen tørrer helt.
    3. Flyt et objekt (gummidukke, objekt A) til diagonalpositionen, 5 cm væk fra de tilstødende vægge. Fastgør objektet med dobbeltklæbende tape. Overfør den eksperimentelle mus på sit burlåg til det åbne feltområde, og placer den mod væggen i den åbne feltkasse.
      BEMÆRK: Modvægt placeringen af objektet flyttet for at reducere eventuelle medfødte præference for en bestemt retning. Ændre placeringen af det foretrukne objekt fra familiarization session for halvdelen af forsøgsdyrene, og for resten af dyrene skal du flytte det mindre foretrukne objekt fra familiarization sessionen.
    4. Tillad 10 min gratis udforskning og optage med en video tracking system. Mål den tid, der bruges på at udforske hvert objekt, ved hjælp af to stopure, og beregn forskelsbehandlingsforholdet som
      Equation 1
      BEMÆRK: Mål det tidspunkt, hvor musen rører objekterne med sine piskeris, snude eller forpoter. Kvantificer ikke nogen adfærd, hvor dyrets snude ikke peger mod objektet, f.eks.
    5. Grib halen af den eksperimentelle mus og læg den på sit bur låg til overførsel til sit hjem bur. I 3 dage (dag 6-8) skal du lade musen hvile med fri adgang til mad og vand.
    6. Når dyret er fjernet fra det åbne felt boks, grundigt rense gulvet og væggene i kassen med 70% ethanol spray og tørre ned med en køkkenrulle.

2. Roman objekt anerkendelse test (NO)

  1. På dag 9, udføre en 15 min tilvænning session ved at gentage trin 1,2-1,7.
  2. På dag 10 skal du udføre familiarization session (F1).
    1. I svagt lys skal du placere musen i det tomme åbne felt i 3 min. Efter rehabituere musen til det åbne felt område, midlertidigt returnere den til sit hjem bur.
    2. Under tilvænningen rengøres objekterne grundigt med 70% ethanol og tørres af med en køkkenrulle. Vent mindst 1 min, for at restalkoholen tørrer helt.
    3. Anbring to identiske genstande (50 ml plastrør fyldt med 40 ml vand, objekt B) i det åbne felt 5 cm væk fra de tilstødende vægge. Fastgør objekterne med dobbeltklæbende tape. Indfør den eksperimentelle mus i den åbne feltboks mod væggen længst væk fra objekterne.
    4. Da dyret udsættes for de to forskellige genstande (50 ml plastrør fyldt med 40 ml vand, objekt B; glas Coplin krukke, objekt C) i NO-testen, opvejer objektet under F1-sessionen. For eksempel præsentere to identiske objekter (glas Coplin krukker, objekt C) for halvdelen af dyrene i gruppen.
    5. Tillad gratis udforskning i 20 minutter og manuelt måle den tid, der bruges på at udforske begge objekter ved hjælp af to stopure. Når musen når den mindste efterforskningstid (30 s) for begge objekter, skal du stoppe F1-sessionen og overføre dyret til sit hjem bur. Hvis musen ikke kan udforske objekterne i 30 s inden for 20 minutter, skal du fjerne det fra boksen med åbne felter og udelukke dem fra yderligere sessioner.
    6. Når dyret er fjernet fra den åbne felt kasse, grundigt rense gulvet og væggene i kassen med 70% ethanol spray og tørre dem ned med en køkkenrulle.
      BEMÆRK: Mål det tidspunkt, hvor musen rører objekterne med sine piskeris, snude eller forpoter. Kvantificer ikke nogen adfærd, hvor dyrets snude ikke peger mod objektet, f.eks.
  3. På den næste dag (dag 11), udføre NO test session.
    1. Overfør musen fra sit hjem bur til det åbne område for rehabituation i 3 min, og derefter returnere dyret til sit hjem bur.
    2. Under tilvænningen rengøres objekterne grundigt med 70% ethanol og tørres af med en køkkenrulle. Vent i mindst 1 min, for at restalkoholen tørrer helt.
    3. Udskift et objekt (50 ml plastrør fyldt med 40 ml vand, objekt B) med et andet objekt (glas Coplin krukke, objekt C) 5 cm væk fra de tilstødende vægge. Fastgør objekterne med dobbeltklæbende tape. Overfør den eksperimentelle mus på burlåget til det åbne felt, og placer den mod væggen. Modvægt til de objekter, der præsenteres sammen under NO-testen. For eksempel erstatte et glas Coplin krukke (objekt C) med en 50 ml plastrør fyldt med 40 ml vand (objekt B) for mus udsat for de to glas Coplin krukker (objekt C) under familiarization session.
      BEMÆRK: Modvægt placeringen af det erstattede objekt kan også udføres for at reducere den potentielle medfødte præference for en bestemt retning. For hver kohorte af de dyr, der udsættes for sættet af to objekter (objekt B eller objekt C), skal du for eksempel ændre det foretrukne objekt i familiariseringssessionen for halvdelen af forsøgsdyrene, og for resten af dyrene skal objektet erstattes mindre foretrukket i familiariseringssessionen.
    4. Tillad 10 min gratis udforskning og optage det ved hjælp af en video tracking system. Mål den tid, der bruges på at udforske hvert objekt, ved hjælp af to stopure, og beregn forskelsbehandlingsforholdet.
      BEMÆRK: Mål det tidspunkt, hvor musen rører objekterne med sine piskeris, snude eller forpoter. Kvantificer ikke nogen adfærd, hvor dyrets snude ikke peger mod objektet, f.eks.
    5. Grib halen af den eksperimentelle mus og læg den på buret låget til overførsel til sit hjem bur. I 3 dage (dag 12-14) skal du lade musen hvile med fri adgang til mad og vand.
    6. Når dyret er fjernet fra det åbne felt boks, grundigt rense gulv og vægge af det åbne felt boks med 70% ethanol spray og tørre ned med en køkkenrulle.

3. Mønstersepareringstest (PS)

  1. På dag 15 skal du udføre den første fortrolighedssession (F1) til PS-testen.
    1. Overfør musen fra sit hjem bur til det åbne område for rehabituation i 3 min, og derefter returnere den til sit hjem bur.
    2. Under tilvænningen rengøres genstandene og den gitterbelagte gulvplade grundigt med 70% ethanol og tørres af med en køkkenrulle. Vent i mindst 1 min, for at restalkoholen tørrer helt.
    3. Gulvpladen (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) med det brede gitter (5,5 x 5,5 cm) i boksen med åbent felt og læg to identiske genstande (50 ml plast, objekt D) i det åbne felt 5 cm væk fra de tilstødende vægge. Fastgør objekterne med dobbeltklæbende tape. Indfør den eksperimentelle mus i den åbne feltboks mod væggen længst væk fra objekterne.
    4. Da dyret udsættes for to forskellige genstande (T-kolben af plast fyldt med 50 ml vand, objekt D; glasflaske, objekt E) i PS-testen, skal objektet dannes under F1- og F2-sessionerne. For eksempel præsentere to identiske objekter (glasflasker, objekt E) på det brede gitter gulv for halvdelen af dyrene i gruppen.
    5. Tillad gratis udforskning i 20 min, og manuelt måle den tid, der bruges på at udforske begge objekter ved hjælp af to stopure. Når musen når den minimale efterforskningstid i alt (30 s) for begge objekter, skal du stoppe F1-sessionen og overføre dyret til sit hjembur. Hvis musen ikke kan udforske objekterne i 30 s inden for 20 minutter, skal du fjerne det fra boksen med åbne felter og udelukke dem fra yderligere sessioner.
      BEMÆRK: Mål det tidspunkt, hvor musen rører objekterne med sine piskeris, snude eller forpoter. Kvantificer ikke nogen adfærd, hvor dyrets snude ikke peger mod objektet, f.eks.
    6. Efter afslutningen af den første familiarization session (F1), grundigt rense objekter og gulvpladen med 70% ethanol spray og fjerne dem fra det åbne felt boks.
  2. På den næste dag (dag 16), udføre den anden familiarization session (F2) for PS test.
    1. Overfør musen fra sit hjem bur til det åbne område for rehabituation i 3 min, og derefter returnere dyret til sit hjem bur.
    2. Under tilvænningen rengøres genstandene grundigt og gitterbelagt gulvplade med 70% ethanol og tørres af med en køkkenrulle. Vent i mindst 1 min, for at restalkoholen tørrer helt.
    3. Gulvpladen (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) anbringes med det smalle gitter (2,75 x 2,75 cm) i boksen med åbent felt, og to identiske genstande (glasflasker, objekt E) anbringes i det åbne felt 5 cm væk fra de tilstødende vægge. Fastgør objekterne med dobbeltklæbende tape. Indfør den eksperimentelle mus i den åbne feltboks mod væggen længst væk fra objekterne.
    4. Til modvægt findes to identiske genstande (plast-T-kolber fyldt med 50 ml vand, objekt D) på det smalle gittergulv.
    5. Tillad gratis udforskning i 20 minutter og manuelt måle den tid, der bruges på at udforske begge objekter ved hjælp af to stopure. Når musen når den minimale efterforskningstid i alt (30 s) for begge objekter, skal du stoppe F2-sessionen og overføre dyret til sit hjem bur. Hvis musen ikke kan udforske objekterne i 30 s inden for 20 minutter, skal du fjerne det fra boksen med åbne felter og udelukke dem fra yderligere sessioner.
      BEMÆRK: Mål det tidspunkt, hvor musen rører objekterne med sine piskeris, snude eller forpoter. Kvantificer ikke nogen adfærd, hvor dyrets snude ikke peger mod objektet, f.eks.
    6. Efter afslutningen af den anden familiarization session (F2), grundigt rense objekter og gulvplade med 70% ethanol spray og fjerne dem fra det åbne felt boks.
  3. På den næste dag (dag 17), udføre PS test session.
    1. Overfør musen fra sit hjem bur til det åbne område for rehabituation i 3 min, og derefter returnere den til sit hjem bur.
    2. Under tilvænningen rengøres genstandene grundigt og gitterbelagt gulvplade med 70% ethanol og tørres af med en køkkenrulle. Vent i mindst 1 min, for at restalkoholen tørrer helt.
    3. Gulvpladen anbringes med det smalle gitter (2,75 x 2,75 cm) i boksen med åbent felt, og der anbringes to forskellige genstande (plast-T-kolben fyldt med 50 ml vand, objekt D; glasflaske, objekt E) på gulvpladen 5 cm fra de tilstødende vægge. Fastgør objekterne med dobbeltklæbende tape. Overfør den eksperimentelle mus på burlåget til det åbne feltområde, og placer den mod væggen.
    4. Modvægt til de objekter, der præsenteres sammen under PS-testen. Placere hvert objekt (objekt D, objekt E) på det smalle gittergulv for at gøre objektet E til et nyt objekt i denne kontekst. Modvægt placeringen af objekt D eller objekt E (et nyt objekt på det smalle gulvmønster) kan også udføres for at reducere risikoen for en medfødt præference for en bestemt retning. Erstatte det foretrukne objekt fra den anden fortrolighedssession for halvdelen af forsøgsdyrene, og for resten af dyrene skal du erstatte det mindre foretrukne objekt fra den anden fortrolighedssession.
    5. Tillad 10 min gratis udforskning og optage ved hjælp af en video tracking system. Mål den tid, der bruges på at udforske hvert objekt, ved hjælp af to stopure, og beregn forskelsbehandlingsforholdet.
      BEMÆRK: Mål det tidspunkt, hvor musen rører objekterne med sine piskeris, snude eller forpoter. Kvantificer ikke nogen adfærd, hvor dyrets snude ikke peger mod objektet, f.eks.
    6. Grib halen af den eksperimentelle mus og læg den på buret låget til overførsel til sit hjem bur.

4. Cresyl violet farvning

  1. Efter at have afsluttet alle adfærdstest bedøm dyret ved at indsprøjte en cocktail (4:0.5) af ketamin (50 mg/ml) og xylazin (23,3 mg/ml) opløst i saltvand ved en dosis på 110 ml/kg kropsvægt (IP; 1 ml sprøjte; 26 G nål). Kontroller for dybden af anæstesi ved manglen på en reaktion på en tå knivspids.
  2. Når dyret er dybt bedøvelse, udføre transcardial perfusion med 4% paraformaldehyd at fastsætte hjernen15.
  3. Når transcardialperfusionen er færdig, halshugges dyret med en saks15. Derefter fjerne kraniet ved hjælp af et par iris saks til at udsætte hjernen. Efter hjernen er isoleret, postfix det i 4% paraformaldehyd natten over, efterfulgt af kryobeskyttelse i 30% saccharose i 0,01 M fosfat-buffered saltvand.
  4. Gør koronale sektioner (30 μm) fra snap-frosne hjernen ved hjælp af en kryostat.
  5. Monter hjernen væv på dias og udføre en række hydrering skridt fra 100% ethanol til vand fra hanen ved at vaske i 3 min sekventielt i 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol.
  6. Vævsdiasene inkuberes i 0,1% cresyl violet opløsning i 15 min.
  7. Fjern overdreven plet ved at nedsænke vævsdias i 95% ethanol/0.1% iskold eddikesyre, og derefter dehydrere væv med opløsninger af 100% ethanol, 50% ethanol/50% xylen, og 100% xylen.
  8. Coverslip vævsdiasene ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt xylenmonteringsmedium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En generel eksperimentel tidsplan og opsætning til evaluering af kognitiv funktion er vist i figur 1. Seks uger efter indførelsen af pilocarpine-inducerede akutte anfald blev mus underkastet NL-, NO- og PS-testene i den rækkefølge adskilt af 3 dages hvileperioder mellem test (figur 1A). I NL-testen blev der placeret to identiske objekter i det åbne felt under familiarization session (F1), og den næste dag blev det ene objekt flyttet til en ny placering. I NO-testen blev et objekt erstattet med et nyt under testsessionen. Til PS-testen introducerede de to familiarization-sessioner (F1, F2) kombinationer af forskellige gulvgittermønstre og -objekter. Derefter, på testdagen, et objekt fra hver familiarization session blev placeret på den smalle gitter gulv mønster, hvilket gør et objekt roman i forbindelse med den smalle gitter gulv mønster (Figur 1B). Den åbne felt boks kan placeres på et skrivebord direkte under en opladning-koblet enhed kamera og omgivet af en sort gardin for at undgå unødvendige visuelle signaler (Figur 2A). Prøveobjekterne var lette at rengøre materialer af samme størrelse eller lidt større end en mus (Figur 2B). Objektkombinationerne skulle forudscreenes for at bekræfte, at der ikke var nogen signifikant præference mellem de to objekter, der blev præsenteret sammen (Figur 2C). Gulvpladerne med forskellige mønstre blev placeret i boksen med åbne felter for at give yderligere eksperimentelle signaler i PS-testen (Figur 2B). Når en mus blev indført i det åbne felt boks, en video tracking system spores sin bane til at analysere sin samlede bevægelse afstand (Figur 2D). Seks uger efter en pilocarpine-injektion viste de epileptiske mus en signifikant reduktion i forskelsbehandlingsforholdet i NL-testen, hvilket viste rumlig hukommelsessvækkelse (figur 3). I NO-testen, som er en test for objektgenkendelseshukommelse, viste epileptiske mus desuden nedsat hukommelsesfunktion sammenlignet med fingeretkontroller. Da dentate nyfødte neuronal funktion blev evalueret med PS test, epileptiske mus havde svært ved at genkende det nye objekt i en sammenhæng med flere signaler. Som kontrolforsøg blev bevæget aktivitet og ventetid for at nå efterforskningskriterierne under familiariseringssessionen vurderet (figur 3). Målingen af bevægeapparatets aktivitet viste en betydelig stigning i epileptiske dyr (figur 3C) i overensstemmelse med tidligere rapporter16,17, mens motivationen til at udforske objekterne var sammenlignelig mellem skinmanøvrer og epileptiske dyr (figur 3D). Vores frafaldsprocenter, der ikke opfyldte efterforskningskriterierne i fortrolighedssessionen, var henholdsvis 17,4 %, 18,2 %, 0 % for NL-, NO- og PS-testen, hvilket tyder på, at dyrene blev vant til de eksperimentelle miljøer under serien af adfærdsmæssige forsøg. Endelig evaluerede vi hippocampal celledød efter pilocarpin-induceret status epilepticus ved hjælp af cresyl violet farvning for at bekræfte beslaglæggelse-induceret neuronal skade (Figur 4). De pilocarpinebehandlede dyr påviste pyknotiske celler i hilus- og CA3-underfeltet på hippocampus i modsætning til skinkontrollerne (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Skematisk præsentation af adfærdstestbatteriet. (A) En skematisk tegning af adfærdsplanen for den nye objektplacering (NL), romanobjektgenkendelse (NO) og mønsterseparation (PS) for skink og epileptiske mus. (B) Repræsentative billeder af objektet og gulvpladearrangementerne for NL-, NO- og PS-testene. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Adfærdsapparat til evaluering af kognitiv funktion. (A) En generel oversigt over funktionsindstillingen. Et kamera blev placeret direkte over det åbne felt boks, som var omgivet af gardinet for at undgå unødvendige signaler. (B) Prøve objekter for det nye objekt placering (NL), nye objekt anerkendelse (NO), og mønster adskillelse (PS) test. Til PS-testen blev en gulvplade med forskellige mønstre, dvs. (C) Grafer, der viser den tid, hvor hvert objekt, der præsenteres sammen under henholdsvis NO- og PS-testsessionen (n = 7), udforskes. Bemærk, at der ikke var nogen signifikant forskel i præferencen mellem de to objekter, der blev vurderet ved Mann-Whitney U-testen (for NO-test), og Elevens ikke-graden af t-test (til PS-test). (D) Et billede, der viser, at et videosporingssystem registrerede den eksperimentelle mus i boksen med åbne felter. Den røde firkant angiver den forudindstillede zone til sporing af musens bane. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Forringet rumlig hukommelse og mønsteradskillelse i epileptiske mus. (A) En skematisk præsentation af romanobjektets placering (NL), romanobjektgenkendelse (NO) og mønsterseparation (PS). Et nyt objekt er angivet som en rød cirkel. (B) Grafer, der viser forskelsbehandlingsforholdet i NL-, NO- og PS-testene mellem skin (n = 8) og epileptiske mus (n = 10). Bemærk, at de epileptiske mus viste signifikante funktionsnedsættelser i NL-, NO- og PS-testene, som tester hukommelsesfunktionen for henholdsvis steder, objekter og kontekster. * p < 0,05 af Mann-Whitney U test for NL test. * p < 0,05 af Student's ulønnet t-test for NO test. * p < 0,05 af Student's parfornbede t-test med Welch's korrektion for PS test. (C) En graf, der viser skinsmotoriske aktivitet (n = 8) og epileptiske mus (n = 10). Bemærk, at de epileptiske mus viste øget bevægelse i overensstemmelse med tidligere rapporter. * p < 0,05 ved Student's ulønnet t-test. (D) Grafer, der viser ventetid til 30 s kriterier i familiarization session af NL, NO, og PS test. Bemærk, at der ikke var nogen forskelle i motivationen for at udforske objekterne mellem sham (n = 8) og epileptiske mus (n = 10). Dataene præsenteres som gennemsnitlige ± standardfejl ved middelværdi (SEM). SE = status epilepticus. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Neuronal død i hippocampus efter pilocarpine-induceret status epilepticus (SE). Repræsentative billeder fra (A) sham og (B) epileptiske grupper 58 dage efter pilocarpin injektion. Forstørrede billeder viser hilus (a, d),CA1-underfeltet (b, e) og CA3-underfeltet (c, f) i hippocampus, som er angivet som hvide firkanter i billederne med lav forstørrelse. Bemærk de pyknotiske celler i hilus- og CA3-underfeltet på hippocampus. Vægtlinje i billedet længst til venstre = 200 μm, også gyldig for det nederste billede; vægtlinjen i en, b, c = 40 μm, også gyldig for henholdsvis d, e, f. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette arbejde beskriver eksperimentelle procedurer for evaluering af kognitiv funktion hos mus med kronisk epilepsi. Mange forskellige adfærdsmæssige test paradigmer bruges til at vurdere læring og hukommelse funktioner i mus18. Morris vand labyrint, radial arm labyrint, Y-labyrint, kontekstuelle frygt conditioning, og objekt-baserede tests er de hyppigst anvendte adfærdsmæssige tests og give pålidelige resultater. Blandt dem, NL, NO, og PS test er effektive, enkle metoder til evaluering af læring og hukommelse i epileptiske mus8,10. Fordi epileptiske mus kan have uventede spontane anfald under adfærd sessioner, er det bedre at bruge adfærdsmæssige tests baseret på dyrenes naturlige tilbøjelighed til at udforske nyhed uden at tilføje andre positive eller negative forstærkninger, såsom dem, der anvendes i aversive-motiverede opgaver såsom frygt conditioning, mild sult, eller tvunget svømning til at holde sig oven vande, som kan udløse tilbagevendende anfald19,20. Desuden, sammenlignet med andre adfærdsmæssige tests, nyhed-baserede tests er mindre stressende for dyrene, fordi omfattende træningssessioner ikke er påkrævet. Desuden kan nyhedsbaserede adfærdstest nemt ændres for at vurdere forskellige typer hukommelse (dvs. rumlig hukommelse, genkendelseshukommelse eller episodisk hukommelse) ved blot at ændre objektplaceringen, præsentere et nyt objekt eller kombinere yderligere stimuli. Tilsammen har nyhedsbaserede tests som NL-, NO- og PS-testene alsidige fordele ved at evaluere kognitive funktioner i epileptiske mus.

Selvom NL-, NO- og PS-testene er hurtige og nyttige eksperimentelle modeller til undersøgelse af indlærings- og hukommelsesfunktion i epileptiske mus, skal der tages hensyn til flere faktorer, når de bruges. Det er velkendt, at kroniske epileptiske mus viser øget angst fra pilocarpin injektioner7, fører til et markant fald i objekt udforskning under familiarization sessioner. Denne mangel på udforskning kan forårsage fejlfortolkning af testresultaterne. Derfor er det vigtigt at inkludere nok tilvænning til det åbne felt til, at musene kan vænne sig til miljøet før introduktionssessionen. Afhængigt af stammerne kan musene stadig undlade at udforske objekterne i 30 s inden for 20 min af familiarization session, selv efter 3 sessioner af tilvænning. I så fald kan tilføjelse af endnu en tilvænningssession med ekstra par objekter i boksen med åbne felter være med til at reducere musens angst mod objekterne. Gardiner omkring den åbne felt boks kan minimere eksterne rum signaler, så de eksperimentelle mus til at fokusere på objekter i det åbne felt. Desuden bør efterforskningskriterierne være strenge nok til at udelukke adfærd, hvor dyrets snude ikke peger mod objektet, såsom at sidde på objektet, forbi objektet eller hvile med bagenden peger på objektet. Endelig, selv om det kan være meget sjældne, beslaglæggelse begivenheder kan forekomme under adfærdsmæssige opgaver. I dette tilfælde anbefales det, at disse dyr fjernes fra yderligere vurderinger, da dette kan være en mulig kilde til forstyrrende skævhed ved vurdering af hukommelsesfunktionen.

Da NL-, NEJ- og PS-testene er meget følsomme eksperimenter, der er afhængige af dyrenes naturlige nysgerrighed for nye stimuli, kan subtile ændringer påvirke muss sonderende adfærd, hvilket resulterer i inkonklusive diskriminationsforhold21,22. For eksempel kan hård håndtering af musen, et sengetøj ændre lige før adfærdsmæssige opgaver, inkonsekvent timing af testen, og utilstrækkelig akklimatisering til testrummet alle hæve stressniveauer af dyrene, forårsager tvetydige testresultater. Desuden bør ændrede testmiljøer, såsom inkonsekvente præsentationer af asymmetriske objekter ved hver session, placering af hjemmebure i nærheden af forsøgsarenaen eller skift af eksperimentatorens olfaktoriske signatur, overvejes nøje for at undgå yderligere faktorer. På tidspunktet for dataanalyse, vurderinger af flere eksperimentatorer kan bidrage til øget variabilitet i adfærdsmæssige resultater på grund af forskellige kriterier for gnaver sonderende adfærd eller stopur kutyper. Samlet set bør disse aspekter også holdes for øje for en vellykket gennemførelse af NL, NO og PS test.

Hippocampus og parahippocampal regionen er kendt for at spille unikke roller i hukommelse forarbejdning23,24. Der er bred enighed om , at rumlig hukommelse i høj grad afhænger af hippocampus funktion , som let kan vurderes ved NL-testen23,24. På den anden side, objekt anerkendelse hukommelse synes at involvere flere hjerne regioner, herunder perirhinal cortex, ø-cortex, og ventromedial præfrontale cortex, ud over hippocampus25,26,27,28,29,30 ,31,32,,33,34,35,333636,37,38. Pilocarpine-behandlede epileptiske mus har konsekvent påvist adfærdsmæssige svækkelser i rumlig hukommelsestest med omfattende hippocampal neuronal skade39,,40,,41,42, mens objektgenkendelse hukommelsestest har givet kontroversielle resultater, med variabel neuronal degeneration i parahippocampale hjerneregioner10,41,42,43,44. Disse data indebærer, at objektgenkendelse kan kræve avancerede netværksforbindelser mellem flere hjerneregioner, i modsætning til rumlig hukommelse, hvor hippocampus kan spille en central rolle. Når de specifikke hippocampale underfelter vurderes nøje, viser det sig, at CA1- og CA3/dentate gyrus-regionerne behandler forskellige oplysninger. Specifikt, CA1 neuroner menes at være aktiveret ved eksponering for lignende poster, mens CA3 og dentate gyrus er involveret i at diskriminere lignende objekter23,45. I overensstemmelse med denne hypotese tyder nye beviser på , at buler af nyfødte neuroner kan bidrage til mønsterseparationsevnen45,46,47. I betragtning af at afvigende hippocampal neurogenese kan induceres under epileptogenese10,epileptiske mus kan påvise nedsat ydeevne i diskriminerende analoge oplevelser på grund af forstyrret integration af nyfødte neuroner i kronisk epilepsi.

Afslutningsvis beskriver vi, hvordan man evaluerer hukommelsessvækkelser hos epileptiske mus. Konkret leverer vi eksperimentelle protokoller til tre adfærdsmæssige tests, NL, NO og PS test, som tester hukommelse for steder, objekter og sammenhænge, henholdsvis. Blandt de mange kognitive test paradigmer til rådighed for mus, NL, NO, og PS test er ganske enkel, korte analyser, der minimalt stress dyrene, hvilket gør dem optimale til at evaluere hukommelsesfunktion i epileptiske dyr uden at udløse tilbagevendende anfald.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker dr. Jae-Min Lee for hans tekniske støtte. Dette arbejde blev støttet af National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af den koreanske regering (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringe Sung-shim Use with the 26 or 30 gauge needle
70% Ethanol Duksan UN1170 Spray to clean the box and objects
black curtain For avoiding unnecessary visual cues
Cresyl violet Sigma C5042 For Cresyl violet staining
cryotome Leica E21040041 For tissue sectioning
double-sided sticky tape For the firm placement of the objects
DPX mounting medium Sigma 06522
ethanol series Duksan UN1170 Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions
floor plate with narrow grid patterns Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm
floor plate with wide grid patterns Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm
illuminometer TES Electrical Electronic Corp. 1334A For the measurement of the room lighting (60 Lux)
Intensive care unit Thermocare #W-1
ketamine hydrochloride Yuhan 7003 Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
LED lamp Lungo P13A-0422-WW-04 Lighting for the behavioral test room
objects Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle
open field box Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm
paper towel Yuhan-Kimberly 47201 Use to dry open field box and objects
paraformaldehyde Merck Millipore 104005 Make 4% solution
pilocarpine hydrochloride Sigma P6503
ruler Use to locate the objects in the open field box
scopolamine methyl nitrate Sigma S2250 Make 10X stock
Smart system 3.0 Panlab Video tracking system
stopwatch Junso JS-307 For the measurement of explorative activities of mice
sucrose Sigma S9378 For cryoprotection of tissue sections
terbutaline hemisulfate salt Sigma T2528 Make 10X stock
video camera (CCD camera) Vision VCE56HQ-12 Place the camera directly overhead of the open field box
xylazine (Rompun) Bayer korea KR10381 Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
xylene Duksan UN1307 For Cresyl violet staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349, (13), 1257-1266 (2003).
  2. Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7, (4), 348-354 (2007).
  3. Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5, (7), 380-391 (2009).
  4. Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
  5. Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34, (1), 183-204 (2016).
  6. Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
  7. Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207, (2), 329-349 (2007).
  8. Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114, (17), 3536-3545 (2017).
  9. Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
  10. Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606 (2015).
  11. Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55, (4), 3316-3327 (2018).
  12. Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
  13. Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429 (2016).
  14. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  16. Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219, (1), 284-297 (2009).
  17. Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51, (4), 789-804 (2006).
  18. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11, (1), 0147733 (2016).
  19. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718 (2017).
  20. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13, (2), 93-110 (2012).
  21. van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13, (8), 1763-1792 (2018).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8, (12), 2531-2537 (2013).
  23. Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
  24. Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1, (1), 41-50 (2000).
  25. Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2, (1), 51-61 (2001).
  26. Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24, (26), 5901-5908 (2004).
  27. Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25, (1), 52-61 (2005).
  28. Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12, (5), 447-449 (2005).
  29. Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16, (12), 1759-1765 (2006).
  30. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
  31. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23, (17), 1685-1690 (2013).
  32. Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17, (1), 5-11 (2010).
  33. Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
  34. de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405, (1-2), 142-146 (2006).
  35. Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82, (1), 26-34 (2004).
  36. Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20, (23), 8853-8860 (2000).
  37. Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
  38. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9, (2), 49-57 (2002).
  39. Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
  40. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
  41. Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59, (9), 1785-1795 (2018).
  42. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  43. Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46, (4), 499-508 (2005).
  44. Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21, (7), 702-713 (2011).
  45. Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34, (10), 515-525 (2011).
  46. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167, (4), 897-914 (2016).
  47. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472, (7344), 466-539 (2011).
Vurdering af hukommelsesfunktionen i pilocarpine-inducerede epileptiske mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, K. M., Kim, J. E., Choi, I. Y., Cho, K. O. Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice. J. Vis. Exp. (160), e60751, doi:10.3791/60751 (2020).More

Park, K. M., Kim, J. E., Choi, I. Y., Cho, K. O. Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice. J. Vis. Exp. (160), e60751, doi:10.3791/60751 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter