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Behavior

Avaliação da função de memória em camundongos epilépticos induzidos por pilocarpina

Published: June 4, 2020 doi: 10.3791/60751
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmacology, Department of Biomedicine & Health Sciences, Catholic Neuroscience Institute, Institute of Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea

Summary

Este artigo apresenta procedimentos experimentais para avaliação de prejuízos de memória em camundongos epilépticos induzidos por pilocarpina. Este protocolo pode ser usado para estudar os mecanismos fisiosiológicos do declínio cognitivo associado à epilepsia, que é uma das comorbidades mais comuns na epilepsia.

Abstract

O comprometimento cognitivo é uma das comorbidades mais comuns na epilepsia do lobo temporal. Para recapitular o declínio cognitivo associado à epilepsia em um modelo animal de epilepsia, geramos camundongos epilépticos crônicos tratados com pilocarpina. Apresentamos um protocolo para três diferentes testes comportamentais usando esses camundongos epilépticos: localização de objetos novos (NL), reconhecimento de objetos novos (NO) e testes de separação de padrões (PS) para avaliar o aprendizado e a memória de lugares, objetos e contextos, respectivamente. Explicamos como definir o aparelho comportamental e fornecer procedimentos experimentais para os testes de NL, NO e PS após um teste de campo aberto que mede as atividades basais locomotor dos animais. Descrevemos também as vantagens técnicas dos testes de NL, NO e PS em relação a outros testes comportamentais para avaliação da função de memória em camundongos epilépticos. Finalmente, discutimos possíveis causas e soluções para ratos epilépticos que não conseguem fazer 30 s de bom contato com os objetos durante as sessões de familiarização, o que é um passo fundamental para testes de memória bem sucedidos. Assim, este protocolo fornece informações detalhadas sobre como avaliar os prejuízos de memória associados à epilepsia usando camundongos. Os testes DE NL, NO e PS são ensaios simples e eficientes que são apropriados para a avaliação de diferentes tipos de memória em camundongos epilépticos.

Introduction

Epilepsia é uma doença crônica caracterizada por convulsões espontâneas recorrentes1,,2,3. Como convulsões repetitivas podem causar anormalidades estruturais e funcionais no cérebro1,,2,3, a atividade convulsiva anormal pode contribuir para a disfunção cognitiva, que é uma das comorbidades associadas à epilepsia mais comuns4,,5,6. Ao contrário dos eventos de convulsão crônica, que são transitórios e momentâneos, os prejuízos cognitivos podem persistir ao longo da vida dos pacientes epilépticos, deteriorando sua qualidade de vida. Por isso, é importante compreender os mecanismos fisiofiológicos do declínio cognitivo associado à epilepsia.

Vários modelos experimentais de epilepsia têm sido utilizados para demonstrar os déficits de aprendizagem e memória associados à epilepsia crônica7,,8,,9,,10,,11,12. Por exemplo, o labirinto de água morris, condicionamento de medo contextual, quadro de buracos, localização de objetos novos (NL) e novos testes de reconhecimento de objeto (NO) têm sido frequentemente usados para avaliar a disfunção da memória na epilepsia do lobo temporal (TLE). Como o hipocampo é uma das principais regiões em que a TLE mostra patologia, testes comportamentais que podem avaliar a função de memória dependente do hipocampo são muitas vezes selecionados preferencialmente. No entanto, dado que as convulsões podem induzir neurogênese hipocampal aberrante e contribuir para o declínio cognitivo associado à epilepsia10, paradigmas comportamentais para testar a função neuronal recém-nascida dento (ou seja, separação de padrão espacial, PS)8,13 também podem fornecer informações valiosas sobre os mecanismos celulares de prejuízos de memória na epilepsia.

Neste artigo, demonstramos uma bateria de testes de memória, NL, NO e PS, para ratos epilépticos. Os testes são simples e de fácil acesso e não exigem um sistema sofisticado.

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Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Católica da Coreia e foram realizados de acordo com o Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NNI Publicações nº 80-23).

1. Novo teste de localização de objeto (NL)

  1. Prepare o epiléptico C57BL/6 ou camundongos transgênicos 4-6 semanas após a injeção de pilocarpina.
    NOTA: As convulsões agudas foram induzidas pela injeção de pilocarpina intraperitoneal (IP), seguindo o protocolo detalhado em nosso relatório anterior14.
  2. Transfira os camundongos epilépticos da sala de reprodução para a sala de comportamento um dia antes do início dos testes comportamentais. Deixe os ratos habituarem pelo menos 12h durante a noite.
  3. Na sala de comportamento, separe ratos individuais em novas gaiolas para uma única carcaça. Escreva as informações para cada animal no cartão da gaiola e mantenha os animais nas mesmas gaiolas durante os testes comportamentais. Várias gaiolas podem ser transferidas simultaneamente usando um carrinho.
  4. No dia seguinte, começam 3 dias de sessões de habituação (H1-H3) no início da manhã. Aclimate os animais à luz baixa em suas gaiolas por pelo menos 30 minutos.
  5. Prepare uma caixa de campo aberto com dimensões externas de 44 x 44 x 31 cm e dimensões internas de 43 x 43 x 30,5 cm. No primeiro dia da habituação (H1), coloque um illuminômetro no centro da caixa de campo aberto e ajuste a iluminação para 60 lux.
  6. Pulverize o chão e as paredes da caixa de campo aberto com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel limpa para remover possíveis pistas olfativas. Em seguida, espere pelo menos 1 min até que o álcool residual tenha secado completamente.
  7. Avalie a atividade locomotor de cada mouse realizando um teste de campo aberto.
    1. Para registrar e acompanhar o comportamento de cada mouse experimental, use o software de rastreamento de vídeo de comportamento animal (ver Tabela de Materiais).
    2. Uma vez aberto o software de rastreamento de vídeo, calibrar o tamanho da caixa de campo aberto. Em seguida, defina a zona para rastreamento. Ajuste 3 s de latência e 15 minutos de tempo de aquisição para evitar rastrear as mãos de um experimentador. Insira as informações sobre cada mouse experimental (grupo, sexo, idade, etc.).
    3. Em seguida, coloque suavemente um mouse experimental na caixa de campo aberto de frente para a parede. Faça isso colocando-o na tampa da gaiola para minimizar o estresse e a ansiedade associados ao manuseio. Em seguida, solte o mouse perto da parede da caixa de campo aberto que é o mais distante de onde os objetos estarão durante a sessão de familiarização (passo 1.9.3.).
      NOTA: Uma vez que o mouse esteja na caixa de campo aberto, o software de rastreamento do mouse irá detectá-lo automaticamente e começar a gravar. Para um acompanhamento ideal da exploração, a câmera pode ser colocada diretamente acima da caixa de campo aberto.
    4. Após 15 minutos de gravação, devolva o animal à gaiola, colocando-o na tampa da gaiola. Limpe a caixa de campo aberto com 70% de spray de etanol e limpe com uma toalha de papel limpa entre os ensaios. Restaure a luz brilhante e meça a distância total do animal movida usando o software de rastreamento de vídeo de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Abra o software de rastreamento de vídeo e clipes de vídeo. Em seguida, clique em Análise para calcular a distância total movida com base na calibração do tamanho da caixa de campo aberto.
  8. No dia 2 e dia 3, realize as sessões de habituação (H2, H3) repetindo as etapas 1.3 a 1.7.
  9. No dia 4, realize a sessão de familiarização (F1).
    1. Na luz fraca, coloque cada rato no campo aberto vazio por 3 minutos. Depois dessa breve reabilitação, devolva o animal para sua gaiola.
    2. Durante a habituação, limpe completamente os objetos com 70% de etanol e limpe-os com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Coloque dois objetos idênticos (bonecas de borracha, objeto A) na arena de campo aberto a 5 cm de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Introduza o mouse experimental na caixa de campo aberto, de frente para a parede mais distante dos objetos.
    4. Permita a exploração gratuita por 20 minutos e meça manualmente o tempo gasto explorando ambos os objetos usando dois cronômetros. Uma vez que o mouse atinja o tempo mínimo de exploração (30 s) para ambos os objetos, pare a sessão de F1 e transfira o animal para sua gaiola doméstica. Se o mouse não explorar os objetos por 30 s dentro de 20 minutos, remova o mouse da caixa de campo aberto e exclua-o de outras sessões.
    5. Depois que o animal for removido da caixa de campo aberto, limpe completamente o chão e as paredes da caixa com 70% de spray de etanol e limpe-os com uma toalha de papel.
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
  10. No dia 5, realize a sessão de testes da NL.
    1. Transfira o rato de sua gaiola para a área de campo aberto para reabilitação por 3 minutos. Então devolva o animal para sua gaiola.
    2. Durante a habituação, limpe completamente os objetos com 70% de etanol e limpe-os com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Mova um objeto (boneca de borracha, objeto A) para a posição diagonal, 5 cm de distância das paredes adjacentes. Corrija o objeto com fita dupla face. Transfira o mouse experimental em sua tampa da gaiola para a área de campo aberto e coloque-o de frente para a parede da caixa de campo aberto.
      NOTA: Contrabalancear a localização do objeto movido para reduzir qualquer preferência potencial inata por uma determinada direção. Por exemplo, altere a localização do objeto preferido da sessão de familiarização para metade dos animais experimentais e, para o resto dos animais, mova o objeto menos preferido da sessão de familiarização.
    4. Permita 10 minutos de exploração gratuita e registro com um sistema de rastreamento de vídeo. Meça o tempo gasto explorando cada objeto usando dois cronômetros e calcule a razão de discriminação como
      Equation 1
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
    5. Pegue a cauda do rato experimental e coloque-o em sua tampa da gaiola para transferência para sua gaiola. Durante 3 dias (dias 6 a 8), deixe o mouse descansar com acesso gratuito a comida e água.
    6. Uma vez que o animal seja removido da caixa de campo aberto, limpe completamente o chão e as paredes da caixa com 70% de spray de etanol e limpe com uma toalha de papel.

2. Novo teste de reconhecimento de objeto (NÃO)

  1. No dia 9, realize uma sessão de habituação de 15 minutos repetindo as etapas 1.2-1.7.
  2. No dia 10, realize a sessão de familiarização (F1).
    1. Em luz fraca, coloque o mouse no campo aberto vazio por 3 minutos. Depois de reabilitar o rato para a área de campo aberto, devolvê-lo temporariamente para sua gaiola doméstica.
    2. Durante a habituação, limpe completamente os objetos com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Coloque dois objetos idênticos (tubos plásticos de 50 mL cheios com 40 mL de água, objeto B) no campo aberto a 5 cm de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Introduza o mouse experimental na caixa de campo aberto de frente para a parede mais distante dos objetos.
    4. À medida que o animal é exposto aos dois objetos diferentes (tubo plástico de 50 mL cheio com 40 mL de água, objeto B; jarra de vidro Coplin, objeto C) no teste NO, contrabalancear o objeto durante a sessão de F1. Por exemplo, apresentar dois objetos idênticos (frascos de vidro Coplin, objeto C) para metade dos animais do grupo.
    5. Permita a exploração gratuita por 20 minutos e meça manualmente o tempo gasto explorando ambos os objetos usando dois cronômetros. Uma vez que o mouse atinja o tempo mínimo de exploração (30 s) para ambos os objetos, pare a sessão de F1 e transfira o animal para sua gaiola doméstica. Se o mouse não explorar os objetos por 30 s dentro de 20 minutos, remova-o da caixa de campo aberto e exclua-o de outras sessões.
    6. Depois que o animal for removido da caixa de campo aberto, limpe completamente o chão e as paredes da caixa com 70% de spray de etanol e limpe-os com uma toalha de papel.
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
  3. No dia seguinte (dia 11), realize a sessão de testes NO.
    1. Transfira o rato de sua gaiola para o campo aberto para reabilitação por 3 minutos, e depois devolva o animal para sua gaiola.
    2. Durante a habituação, limpe completamente os objetos com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Substitua um objeto (tubo plástico de 50 mL cheio com 40 mL de água, objeto B) por outro objeto (frasco de vidro Coplin, objeto C) 5 cm de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Transfira o mouse experimental na tampa da gaiola para o campo aberto, e coloque-o de frente para a parede. Contrabalancear os objetos apresentados juntos durante o teste NO. Por exemplo, substitua um frasco de vidro Coplin (objeto C) por um tubo plástico de 50 mL preenchido com 40 mL de água (objeto B) para os ratos expostos aos dois frascos de vidro Coplin (objeto C) durante a sessão de familiarização.
      NOTA: O contrabalamento da localização do objeto substituído também pode ser realizado para reduzir a preferência potencial inata por uma determinada direção. Por exemplo, para cada coorte dos animais expostos ao conjunto de dois objetos (objeto B ou objeto C), altere o objeto preferido na sessão de familiarização para metade dos animais experimentais e, para o resto dos animais, substitua o objeto menos preferido na sessão de familiarização.
    4. Permita 10 minutos de exploração gratuita e grave-o usando um sistema de rastreamento de vídeo. Meça o tempo gasto explorando cada objeto usando dois cronômetros e calcule a razão de discriminação.
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
    5. Pegue a cauda do rato experimental e coloque-o na tampa da gaiola para transferência para sua gaiola. Durante 3 dias (dias 12 a 14), deixe o rato descansar com acesso gratuito a comida e água.
    6. Uma vez que o animal seja removido da caixa de campo aberto, limpe completamente o chão e as paredes da caixa de campo aberto com 70% de spray de etanol e limpe com uma toalha de papel.

3. Teste de separação de padrões (PS)

  1. No dia 15, realize a primeira sessão de familiarização (F1) para o teste de PS.
    1. Transfira o rato de sua gaiola para a área de campo aberto para reabilitação por 3 minutos, e depois devolva-o para sua gaiola.
    2. Durante a habituação, limpe completamente os objetos e a placa de piso gridded com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Coloque a placa do piso (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) com a grade larga (5,5 x 5,5 cm) na caixa de campo aberto e coloque dois objetos idênticos (frascos T de plástico preenchidos com 50 mL de água, objeto D) no campo aberto a 5 cm de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Introduza o mouse experimental na caixa de campo aberto de frente para a parede mais distante dos objetos.
    4. Como o animal é exposto a dois objetos diferentes (plástico T-flask preenchido com 50 mL de água, objeto D; garrafa de vidro, objeto E) no teste PS, contrabalancear o objeto durante as sessões de F1 e F2. Por exemplo, apresente dois objetos idênticos (garrafas de vidro, objeto E) no piso da grade larga para metade dos animais do grupo.
    5. Permita a exploração gratuita por 20 minutos e meça manualmente o tempo gasto explorando ambos os objetos usando dois cronômetros. Uma vez que o mouse atinja o tempo mínimo de exploração total (30 s) para ambos os objetos, pare a sessão de F1 e transfira o animal para sua gaiola doméstica. Se o mouse não explorar os objetos por 30 s dentro de 20 minutos, remova-o da caixa de campo aberto e exclua-o de outras sessões.
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
    6. Após a conclusão da primeira sessão de familiarização (F1), limpe completamente os objetos e a placa do chão com 70% de spray de etanol e remova-os da caixa de campo aberto.
  2. No dia seguinte (dia 16), realize a segunda sessão de familiarização (F2) para o teste PS.
    1. Transfira o rato de sua gaiola para a área de campo aberto para reabilitação por 3 minutos, e depois devolva o animal para sua gaiola.
    2. Durante a habituação, limpe minuciosamente os objetos e a placa de piso gridded com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Coloque a placa do piso (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) com a grade estreita (2,75 x 2,75 cm) na caixa de campo aberto e coloque dois objetos idênticos (garrafas de vidro, objeto E) no campo aberto a 5 cm de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Introduza o mouse experimental na caixa de campo aberto de frente para a parede mais distante dos objetos.
    4. Para contrabalançar, apresente dois objetos idênticos (frascos T de plástico preenchidos com 50 mL de água, objeto D) no piso estreito da grade.
    5. Permita a exploração gratuita por 20 minutos e meça manualmente o tempo gasto explorando ambos os objetos usando dois cronômetros. Uma vez que o mouse atinja o tempo mínimo de exploração total (30 s) para ambos os objetos, pare a sessão F2 e transfira o animal para sua gaiola doméstica. Se o mouse não explorar os objetos por 30 s dentro de 20 minutos, remova-o da caixa de campo aberto e exclua-o de outras sessões.
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
    6. Após a conclusão da segunda sessão de familiarização (F2), limpe completamente os objetos e a placa do piso com 70% de spray de etanol e remova-os da caixa de campo aberto.
  3. No dia seguinte (dia 17), realize a sessão de testes ps.
    1. Transfira o rato de sua gaiola para a área de campo aberto para reabilitação por 3 minutos, e depois devolva-o para sua gaiola.
    2. Durante a habituação, limpe minuciosamente os objetos e a placa de piso gridded com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel. Espere pelo menos 1 min para que o álcool residual seque completamente.
    3. Coloque a placa do piso com a grade estreita (2,75 x 2,75 cm) na caixa de campo aberto e coloque dois objetos diferentes (plástico T-flask cheio com 50 mL de água, objeto D; garrafa de vidro, objeto E) na placa de piso a 5 cm de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Transfira o mouse experimental na tampa da gaiola para a área de campo aberto e coloque-o de frente para a parede.
    4. Contrabalancear os objetos apresentados juntos durante o teste PS. Por exemplo, coloque cada objeto (objeto D, objeto E) no piso de grade estreita para fazer do objeto E um novo objeto neste contexto. Contrabalaçar a localização do objeto D ou objeto E (um novo objeto no padrão de piso estreito) também pode ser realizado para reduzir o potencial de uma preferência inata por uma determinada direção. Por exemplo, substitua o objeto preferido da segunda sessão de familiarização por metade dos animais experimentais e, para o resto dos animais, substitua o objeto menos preferido da segunda sessão de familiarização.
    5. Permita 10 minutos de exploração gratuita e registro usando um sistema de rastreamento de vídeo. Meça o tempo gasto explorando cada objeto usando dois cronômetros e calcule a razão de discriminação.
      NOTA: Meça o tempo em que o mouse toca os objetos com seus bigodes, focinho ou patas dianteiras. Não quantifique como tempo exploratório quaisquer comportamentos em que o focinho do animal não aponte para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto.
    6. Pegue a cauda do rato experimental e coloque-o na tampa da gaiola para transferência para sua gaiola.

4. Mancha violeta cresyl

  1. Após completar todos os testes comportamentais, anestesia o animal injetando um coquetel (4:0.5) de cetamina (50 mg/mL) e xilazina (23,3 mg/mL) dissolvido em soro fisiológico a uma dose de 110 mL/kg de peso corporal (IP; 1 mL de seringa; agulha de 26 G). Verifique a profundidade da anestesia pela falta de uma resposta a uma pitada de dedo do dedo do sol.
  2. Uma vez que o animal esteja profundamente anestesiado, realize a perfusão transcárlica com 4% de paraformaldeído para corrigir o cérebro15.
  3. Após o término da perfusão transcárdia, decapite o animal com uma tesoura15. Então, remova o crânio usando uma tesoura de íris para expor o cérebro. Depois que o cérebro é isolado, pós-fixá-lo em 4% de paraformaldeído durante a noite, seguido de crioproteção em 30% de sacarose em 0,01 M salina tamponada com fosfato.
  4. Faça seções coronais (30 μm) do cérebro congelado por estalo usando um criostat.
  5. Monte os tecidos cerebrais em lâminas e realize uma série de passos de hidratação de 100% de etanol para água da torneira lavando por 3 min sequencialmente em 100%, 95%, 90%, 80%, 70% etanol.
  6. Incubar as lâminas de tecido em solução violeta de 0,1% por 15 min.
  7. Remova a mancha excessiva imergindo as lâminas teciduais em 95% de etanol/0,1% ácido acético glacial e, em seguida, desidratar os tecidos com soluções de 100% etanol, 50% etanol/50% xileno e 100% xileno.
  8. Cubra as lâminas de tecido usando um meio de montagem de xileno disponível comercialmente.

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Representative Results

Um cronograma experimental geral e uma configuração para avaliação da função cognitiva são mostrados na Figura 1. Seis semanas após a introdução de convulsões agudas induzidas por pilocarpina, os camundongos foram submetidos aos testes de NL, NO e PS nessa ordem separados por períodos de descanso de 3 dias entre os testes(Figura 1A). Para o teste NL, dois objetos idênticos foram colocados no campo aberto durante a sessão de familiarização (F1), e no dia seguinte, um objeto foi movido para um novo local. No teste NO, um objeto foi substituído por um novo durante a sessão de teste. Para o teste de PS, as duas sessões de familiarização (F1, F2) introduziram combinações de diferentes padrões e objetos da grade do piso. Em seguida, no dia do teste, um objeto de cada sessão de familiarização foi colocado no padrão estreito do piso da grade, tornando um objeto novo no contexto do padrão de piso de grade estreita(Figura 1B). A caixa de campo aberto pode ser colocada em uma mesa diretamente sob uma câmera de dispositivo acoplada a carga e cercada por uma cortina preta para evitar pistas visuais desnecessárias(Figura 2A). Os objetos de amostra eram materiais fáceis de limpar de tamanho semelhante ou ligeiramente maiores que um rato(Figura 2B). As combinações de objetos precisavam ser pré-tela para confirmar que não havia preferência significativa entre os dois objetos apresentados juntos(Figura 2C). As placas de piso com padrões diferentes foram colocadas na caixa de campo aberto para fornecer pistas experimentais adicionais no teste PS (Figura 2B). Uma vez que um mouse foi introduzido na caixa de campo aberto, um sistema de rastreamento de vídeo rastreou sua trajetória para analisar sua distância total de locomoção(Figura 2D). Seis semanas após uma injeção de pilocarpina, os camundongos epilépticos apresentaram uma redução significativa na razão de discriminação no teste NL, demonstrando prejuízo de memória espacial(Figura 3). Além disso, no teste NO, que é um teste para memória de reconhecimento de objetos, camundongos epilépticos mostraram função de memória prejudicada em comparação com controles falsos. Quando a função neuronal recém-nascida dento foi avaliada com o teste PS, os camundongos epilépticos tiveram dificuldade em reconhecer o objeto novo em um contexto com múltiplas pistas. Como experimentos de controle, foram avaliadas atividades locomotores e latência para atingir os critérios de exploração durante a sessão de familiarização (Figura 3). A medição da atividade locomotor mostrou um aumento significativo dos animais epilépticos(Figura 3C),em linha com os relatórios anteriores16,17, enquanto a motivação para explorar os objetos foi comparável entre animais falsos e epilépticos(Figura 3D). Nossas taxas de abandono que falharam nos critérios de exploração na sessão de familiarização foram de 17,4%, 18,2%, 0% para o teste de NL, NÃO e PS, respectivamente, sugerindo que os animais se acostumaram com os ambientes experimentais durante a série de ensaios comportamentais. Finalmente, avaliamos a morte das células hipocampais após o estado epiléptico induzido por pilocarpina usando coloração violeta de creslito para confirmar danos neuronais induzidos pela convulsão(Figura 4). Os animais tratados com pilocarpina demonstraram células pitnóticas no hilus e no subcampo CA3 do hipocampo, ao contrário dos controles falsos(Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Apresentação esquemática da bateria de teste comportamental. (A) Um desenho esquemático do cronograma comportamental para a localização do objeto novo (NL), reconhecimento de objetos novos (NO) e testes de separação de padrões (PS) para ratos falsos e epilépticos. (B) Imagens representativas dos arranjos de placas de objeto e piso para os testes DE NL, NO e PS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Aparelho comportamental para avaliação da função cognitiva. (A) Uma visão geral do ambiente comportamental. Uma câmera foi colocada diretamente acima da caixa de campo aberto, que estava cercada pela cortina para evitar pistas desnecessárias. (B) Teste de objetos de amostra para o novo teste de localização de objeto (NL), reconhecimento de objeto novo (NO) e separação de padrões (PS). Para o teste de PS, uma placa de piso com padrões diferentes, ou seja, grades largas e estreitas, foi inserida na caixa de campo aberto para fornecer pistas adicionais. (C) Gráficos mostrando o tempo de exploração de cada objeto apresentados juntos durante a sessão de teste NO e PS (n = 7), respectivamente. Note-se que não houve diferença significativa na preferência entre os dois objetos avaliados pelo teste Mann-Whitney U (para não teste) e o teste t não pago do Aluno (para teste PS). (D) Uma imagem mostrando que um sistema de rastreamento de vídeo detectou o mouse experimental na caixa de campo aberto. O quadrado vermelho indica a zona predefinida para rastrear a trajetória do mouse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Memória espacial prejudicada e separação de padrões em camundongos epilépticos. (A) Uma apresentação esquemática dos testes de localização do objeto novo (NL), reconhecimento de objetos novos (NO) e separação de padrões (PS). Um novo objeto é indicado como um círculo vermelho. (B) Gráficos que mostram a razão de discriminação nos testes NL, NO e PS entre camundongos sham (n = 8) e epiléticos (n = 10). Observe que os camundongos epilépticos demonstraram prejuízos significativos nos testes NL, NO e PS, que testam a função de memória para lugares, objetos e contextos, respectivamente. *p < 0,05 por Mann-Whitney U teste para o teste NL. *p < 0,05 por T-teste não pago do Estudante para as provas NO. *p < 0,05 pelo teste t não pago do Student com a correção de Welch para o teste PS. (C) Um gráfico mostrando a atividade locomotor de camundongos sham (n = 8) e camundongos epilépticos (n = 10). Note-se que os camundongos epilépticos demonstraram aumento da locomoção, em consonância com os relatórios anteriores. *p < 0,05 pelo teste t não pago do Estudante. (D) Gráficos que mostram latência a critérios de 30 s na sessão de familiarização dos testes NL, NO e PS. Note-se que não houve diferenças na motivação para explorar os objetos entre falso (n = 8) e ratos epilépticos (n = 10). Os dados são apresentados como média ± erro de média (SEM). SE = estado epiléptico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Morte neuronal no hipocampo após epiléptico de estado induzido por pilocarpina (SE). Imagens representativas dos grupos epilépticos (A) e(B)58 dias após a injeção de pilocarpina. Imagens ampliadas mostram o hilus (a, d),subcampo CA1(b, e),e o subcampo CA3(c, f)do hipocampo, que são indicados como quadrados brancos nas imagens com baixa ampliação. Note as células pyknotic no pré-campo hilus e CA3 do hipocampo. Barra de escala na imagem de extrema esquerda = 200 μm, também válida para a imagem inferior; barra de escala em a, b, c = 40 μm, também válido para d, e, f, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este trabalho descreve procedimentos experimentais para avaliação da função cognitiva em camundongos com epilepsia crônica. Muitos paradigmas de teste comportamental diferentes são usados para avaliar funções de aprendizagem e memória em camundongos18. O labirinto de água morris, labirinto de braço radial, labirinto Y, condicionamento de medo contextual e testes baseados em objetos são os testes comportamentais mais usados e fornecem resultados confiáveis. Entre eles, os testes de NL, NO e PS são métodos eficientes e simples para avaliar o aprendizado e a memória em camundongos epilépticos8,,10. Como camundongos epilépticos podem ter convulsões espontâneas inesperadas durante as sessões de comportamento, é melhor usar testes comportamentais baseados na inclinação natural dos animais para explorar a novidade sem adicionar outros reforços positivos ou negativos, como aqueles usados em tarefas aversivas motivadas, como condicionamento do medo, fome leve ou natação forçada a permanecer à tona, o que pode desencadear convulsões recorrentes19,,20. Além disso, em comparação com outros testes comportamentais, os testes baseados em novidades são menos estressantes para os animais, pois não são necessárias extensas sessões de treinamento. Além disso, os testes comportamentais baseados em novidades podem ser facilmente modificados para avaliar diferentes tipos de memória (ou seja, memória espacial, memória de reconhecimento ou memória episódica) simplesmente alterando a localização do objeto, apresentando um novo objeto ou combinando estímulos adicionais. Juntos, testes baseados em novidades como os testes NL, NO e PS têm vantagens versáteis para avaliar funções cognitivas em camundongos epilépticos.

Embora os testes de NL, NO e PS sejam modelos experimentais rápidos e úteis para investigar a aprendizagem e a função da memória em camundongos epilépticos, vários fatores devem ser considerados ao usá-los. É sabido que camundongos epilépticos crônicos apresentam ansiedade aumentada das injeções de pilocarpina7,levando a uma diminuição acentuada na exploração de objetos durante as sessões de familiarização. Essa falta de exploração pode causar má interpretação dos resultados dos testes. Portanto, é importante incluir habituação suficiente ao campo aberto para que os ratos se acostumem com o ambiente antes da sessão de familiarização. Dependendo das cepas, os ratos ainda podem deixar de explorar os objetos por 30 s dentro dos 20 minutos da sessão de familiarização, mesmo após 3 sessões de habituação. Nesse caso, adicionar outra sessão de habituação com pares extras dos objetos na caixa de campo aberto poderia ajudar a reduzir a ansiedade do mouse em direção aos objetos. Cortinas ao redor da caixa de campo aberto podem minimizar as pistas externas da sala, permitindo que os ratos experimentais se concentrem nos objetos no campo aberto. Além disso, os critérios de exploração devem ser rigorosos o suficiente para excluir comportamentos nos quais o focinho do animal não aponta para o objeto, como sentar-se sobre o objeto, passar pelo objeto ou descansar com sua extremidade traseira apontando para o objeto. Finalmente, embora possa ser muito raro, eventos de convulsão podem ocorrer durante as tarefas comportamentais. Neste caso, recomenda-se que esses animais sejam removidos de novas avaliações, pois isso pode ser uma possível fonte de viés de confusão para a avaliação da função de memória.

Como os testes de NL, NÃO e PS são experimentos muito sensíveis que dependem da curiosidade natural dos animais para novos estímulos, mudanças sutis podem afetar o comportamento exploratório dos camundongos, resultando em razões de discriminação inconclusivas21,22. Por exemplo, o manuseio severo do mouse, uma mudança de roupa de cama logo antes das tarefas comportamentais, o tempo inconsistente do teste e a aclimatação insuficiente para a sala de testes podem elevar os níveis de estresse dos animais, causando resultados de testes equívocos. Além disso, ambientes de teste alterados, como apresentações inconsistentes de objetos assimétricos em cada sessão, colocação de gaiolas domésticas perto da arena experimental ou troca da assinatura olfativa do experimentador devem ser cuidadosamente considerados para evitar fatores adicionais. Na fase de análise de dados, avaliações de vários experimentadores podem contribuir para o aumento das variabilidades nos desfechos comportamentais devido a diferentes critérios de comportamentos exploratórios de roedores ou usos de cronômetros. Coletivamente, esses aspectos também devem ser mantidos em mente para a implementação bem sucedida dos testes DE NL, NO e PS.

O hipocampo e a região parahiptocampal são conhecidos por desempenhar papéis únicos no processamento da memória23,24. É amplamente aceito que a memória espacial depende em grande parte da função do hipocampo, que pode ser facilmente avaliada pelo teste NL23,24. Por outro lado, a memória de reconhecimento de objetos parece envolver múltiplas regiões cerebrais, incluindo o córtex perirhinal, córtex insular e córtex pré-frontal ventromedial, além do hipocampo25,,26,,27,28,,29,30,,31,32,33,,34,35,,36,,37,38. Camundongos epilépticos tratados com pilocarpina têm demonstrado consistentemente prejuízos comportamentais em testes de memória espacial com extensos danos neuronais hipocampal39,,40,,41,,42, enquanto os testes de memória de reconhecimento de objetos produziram desfechos controversos, com degeneração neuronal variável nas regiões cerebrais parahiptocampal10,,41,,42,,43,,44. Esses dados implicam que o reconhecimento de objetos pode exigir conexões de rede sofisticadas entre várias regiões cerebrais, ao contrário da memória espacial na qual o hipocampo pode desempenhar um papel central. Quando os subcampos hipocampais específicos são avaliados de perto, as regiões de giro de CA1 e CA3/dentado são encontradas para processar informações diferentes. Especificamente, acredita-se que os neurônios CA1 sejam ativados pela exposição a itens semelhantes, enquanto o CA3 e o giro dentado estão envolvidos na discriminação de objetos semelhantes23,45. Consistente com essa hipótese, evidências emergentes sugerem que neurônios recém-nascidos dentos podem contribuir para o desempenho de separação de padrões45,46,47. Dado que a neurogênese hipocampal aberrante pode ser induzida durante a episetogênese10,camundongos epilépticos podem demonstrar desempenho prejudicado em experiências análogas discriminatórias devido à integração interrompida de neurônios recém-nascidos na epilepsia crônica.

Em conclusão, descrevemos como avaliar os prejuízos de memória em camundongos epilépticos. Especificamente, fornecemos protocolos experimentais para três testes comportamentais, os testes NL, NO e PS, que testam a memória para lugares, objetos e contextos, respectivamente. Entre os muitos paradigmas de teste cognitivo disponíveis para camundongos, os testes de NL, NO e PS são ensaios bastante simples e curtos que minimamente estressam os animais, o que os torna ótimos para avaliar a função da memória em animais epilépticos sem desencadear convulsões recorrentes.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Jae-Min Lee pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiado pelo governo coreano (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringe Sung-shim Use with the 26 or 30 gauge needle
70% Ethanol Duksan UN1170 Spray to clean the box and objects
black curtain For avoiding unnecessary visual cues
Cresyl violet Sigma C5042 For Cresyl violet staining
cryotome Leica E21040041 For tissue sectioning
double-sided sticky tape For the firm placement of the objects
DPX mounting medium Sigma 06522
ethanol series Duksan UN1170 Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions
floor plate with narrow grid patterns Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm
floor plate with wide grid patterns Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm
illuminometer TES Electrical Electronic Corp. 1334A For the measurement of the room lighting (60 Lux)
Intensive care unit Thermocare #W-1
ketamine hydrochloride Yuhan 7003 Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
LED lamp Lungo P13A-0422-WW-04 Lighting for the behavioral test room
objects Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle
open field box Leehyo-bio Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm
paper towel Yuhan-Kimberly 47201 Use to dry open field box and objects
paraformaldehyde Merck Millipore 104005 Make 4% solution
pilocarpine hydrochloride Sigma P6503
ruler Use to locate the objects in the open field box
scopolamine methyl nitrate Sigma S2250 Make 10X stock
Smart system 3.0 Panlab Video tracking system
stopwatch Junso JS-307 For the measurement of explorative activities of mice
sucrose Sigma S9378 For cryoprotection of tissue sections
terbutaline hemisulfate salt Sigma T2528 Make 10X stock
video camera (CCD camera) Vision VCE56HQ-12 Place the camera directly overhead of the open field box
xylazine (Rompun) Bayer korea KR10381 Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
xylene Duksan UN1307 For Cresyl violet staining

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Park, K. M., Kim, J. E., Choi, I. Y., Cho, K. O. Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice. J. Vis. Exp. (160), e60751, doi:10.3791/60751 (2020).

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