Summary
Channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)은 해부학 및 / 또는 유전적으로 식별 된 뉴런 그룹 사이의 장거리 신경 투영의 기능 적 매핑을위한 정밀 기술입니다. 여기에서는 CRACM을 사용하여 적색 이동 옵신, ChrimsonR의 사용을 포함하여 청각 뇌간 연결을 매핑하는 방법을 설명합니다.
Abstract
신경 회로를 조사할 때, 시험관 내 패치 클램프 접근법의 표준 제한은 여러 소스의 축슨이 종종 혼합되어 전기 자극을 가진 개별 소스로부터 입력을 분리하는 것을 어렵게 만드는 것입니다. 그러나, channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)을 사용하여, 이러한 한계는 이제 극복 할 수있다. 여기에서, 우리는 낮은 청각 뇌간 핵및 commissural 입력에서 청각 시스템의 중간 뇌 핵인 열등한 콜리큘러스 (IC)에 있는 신경의 확인된 부류에 오름차순 입력을 지도로 하기 위하여 CRACM를 이용하는 방법을 보고합니다. IC에서, 로컬, 커미션, 오름차순 및 내림차순 축색은 무겁게 얽혀 있고 따라서 전기 자극과 구별할 수 없습니다. 시냅스 핵에서 채널로덕신의 발현을 유도하기 위해 바이러스 성 구조를 주입하고, 패치 클램프 기록을 이어서 채널로도셉신 발현 시냅스 입력, 특정 소스로부터의 프로젝션의 존재 및 생리학을 특성화한다. IC 뉴런의 특정 집단에 세포 유형별 정확도로 매핑될 수 있다. 이 접근법은 청색 광 활성화 채널러도셉신인 크로노스와 적색 채널로도이프신인 ChrimsonR과 함께 작동한다는 것을 보여줍니다. 전뇌의 이전 보고서와는 달리, 우리는 ChrimsonR이 등지 달팽이관 핵 주요 뉴런의 축축을 강력하게 인신 매매하고 있음을 발견하며, 이는 ChrimsonR이 뇌간 CRACM 실험에 유용한 도구가 될 수 있음을 나타냅니다. 여기에 제시된 프로토콜에는 쥐의 등쪽 달팽이관 핵 및 IC에 주사를 표적으로 하는 입체 좌표를 포함하여 두개내 바이러스 주사 수술에 대한 자세한 설명과 전체 세포 패치 클램프 기록을 결합하는 방법 등이 포함되어 있습니다. IC 뉴런에 대한 장거리 프로젝션을 조사하기 위해 채널로도셉신 활성화를 통해 이 프로토콜은 IC에 청각 입력을 특성화하는 데 맞춤화되어 있지만, 청각 뇌간 및 그 너머의 다른 장거리 예측을 조사하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.
Introduction
시냅스 연결은 신경 회로 기능에 매우 중요하지만, 신경 회로 내의 시냅스의 정확한 토폴로지와 생리학은 종종 실험적으로 조사하기가 어렵습니다. 이는 세포 전기 생리학의 전통적인 도구인 전기 자극이 자극 부위 근처의 축사를 무차별적으로 활성화하고 대부분의 뇌 영역에서 다른 소스(로컬, 오름차순 및/또는 내림차순)의 축축을 서로 연결하기 때문입니다. 그러나, channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)1,2를사용하여, 이러한 제한은 이제3을극복 할 수있다 . 채널로도셉신(ChR2)은 원래 녹색 조류 클라미도모나스 린하르트티에서발견되는 광 활성화, 양이온 선택적 이온 채널이다. ChR2는 450-490 nm 의 파장의 청색광에 의해 활성화될 수 있으며, 양이온 유입을 통해 세포를 탈분극화할 수 있다. ChR2는 먼저 나겔과 동료4에의해 제노푸스 oocytes에서 설명하고 표현되었다. 그 직후, Boyden과 동료5 포유류 뉴런에서 ChR2를 표현하고 그들이 안정적으로 밀리 초 타임 스케일에 스파이크를 제어하는 광 펄스를 사용할 수 있음을 보여 주었다, 블루 라이트와 ChR2의 활성화 후 ~ 10 ms 행동 전위를 유도. 더 빠른 역학을 가진 광유전학 채널은 최근에 발견되었습니다 (예를 들어, 크로노스6).
CRACM 실험에 대한 기본적인 접근법은 채널로도프신에 대한 유전 정보를 전달하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)로 가설전전 시냅스 뉴런의 집단을 트랜스펙트하는 것이다. rAAV를 가진 뉴런의 형질감염은 인코딩된 채널로도프신의 발현을 이끈다. 전형적으로, 채널로집신은 GFP (녹색 형광 단백질) 또는 tdTomato (적색 형광 단백질) 같이 형광 단백질로 꼬리표를 붙입니다, 그래서 표적 지구에 있는 신경의 형질감염은 형광 화상 진찰로 쉽게 확인될 수 있습니다. rAAV는 비병원성이기 때문에, 낮은 염증 전위 및 오래 지속되는 유전자발현7,8,그들은 뉴런에 채널로도신을 전달하는 표준 기술이 되었다. 만약, 뉴런의 시냅스 전 형질전환 후, 빛 깜박임을 통한 채널로도냅신의 활성화가 표적 뉴런의 후통 전위 또는 전류를 유도하는 경우, 이것은 형질전환된 핵에서 기록된 세포로의 축삭 연결의 증거이다. 뇌 슬라이스 실험에서 절단 된 축삭은 channelrhodopsin 활성화를 통해 신경 전달 물질을 방출하도록 구동 될 수 있기 때문에, 급성 슬라이스의 외부에 놓여 있지만 후시 냅스 뇌 영역으로 축삭을 보내는 핵은 CRACM으로 식별 할 수 있습니다. 이 기술의 힘은 확인 된 장거리 시 냅 스 입력의 연결 및 생리 직접 조사 될 수 있다.
청색광에 의해 흥분되는 channelrhodopsins 이외에, 조사자는 최근에 Chrimson및 그것의 더 빠른 아날로그 ChrimsonR를 포함하여 몇몇 적색 이동 채널로도실9,10를확인했습니다, 둘 다 ~ 660 nm6의빨간 빛으로 흥분됩니다. 적색시프트 옵신은 청색광보다 조직에 더 잘 침투하기 때문에 관심의, 적색광은청색광(10,11,12)보다세포독성이 낮을 수 있다. 적색 이동 채널러도프신은 또한 동일한 뉴런상에 상이한 핵으로부터 축세포의 수렴이 하나의실험6,13,14에서시험될 수 있는 이중색 CRACM 실험의 가능성을 열어주어있다. 그러나, 현재 적색 이동 opsins 종종 블루 라이트와 원치 않는 교차 활성화를 전시15,16,17,두 가지 색상 실험을 어렵게 만들기. 또한, 일부 보고서는 ChrimsonR이 제한된 축산 인신 매매를 겪고 있음을 지적했으며, 이는 CRACM 실험16,17에ChrimsonR을 사용하기가 어려울 수 있습니다.
하부 청각 뇌간 핵에서 거의 모든 오름차순 예측은 열등한 콜리큘러스 (IC)에 수렴, 중앙 청각 통로의 중뇌 허브. 이는 달팽이관 핵(CN)18,19,대부분의 우수한 올리바리 복합체(SOC)20,및 측면 lemniscus21의등쪽(DNLL) 및 복부(VNLL) 핵으로부터의 투영을 포함한다. 부가적으로, 청각 피질로부터의 큰 내림차순 투영은 IC18,19,20,21,22,및 IC 뉴런 자체가 IC23의국소 및 반대측 엽 내에서 광범위하게 시냅스로 종료된다. 많은 소스에서 축색의 혼합은 전기 자극(24)을사용하여 IC 회로를 프로브하기 어렵게했다. 그 결과, IC 내의 뉴런들이 건전한 국소화 및 음성 및 기타 통신소리의 식별에 중요한 계산을 수행하더라도25,26,IC 내의 신경 회로의 조직은 크게 알려지지 않았다. 우리는 최근에 IC27에있는 첫번째 분자로 식별가능한 뉴런 으로 VIP 뉴런을 확인했습니다. VIP 뉴런은 청각 시상및 우수한 콜리큘러스를 포함한 여러 장거리 표적에 투영되는 글루타마테르이트 성세포 뉴런이다. 이제 VIP 뉴런에 대한 로컬 및 장거리 입력의 소스와 기능을 결정하고 이러한 회로 연결이 사운드 처리에 어떻게 기여하는지 확인할 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 마우스의 IC에서 VIP 뉴런에 대한 시냅스 입력을 조사하기 위해, 특히 반대쪽 IC 및 DCN(그림1)에서맞춤화된다. 프로토콜은 입력의 다른 근원, 다른 신경 모형 또는 전부 다른 두뇌 지구에 쉽게 적응될 수 있습니다. 우리는 또한 ChrimsonR청각 뇌간에서 장거리 회로 매핑을위한 효과적인 적색 이동 채널로도프신임을 보여줍니다. 그러나 ChrimsonR은 낮은 강도에서도 청색광에 의해 강력하게 활성화되어 있으므로 ChrimsonR과 크로노스를 2가지 색상의 CRACM 실험에서 결합하기 위해서는 ChrimsonR의 교차 활성화를 방지하기 위해 신중한 컨트롤을 사용해야 합니다.
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Protocol
현지 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받고 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침을 준수합니다. 이 프로토콜의 모든 절차는 미시간 대학교 IACUC에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라 승인되었습니다.
1. 수술 준비
- 무균 조건에서 수술을 수행합니다. 오토클레이브/수술 전에 모든 수술 도구 및 재료를 소독하십시오. 수술 가운과 마스크를 착용.
- 수술 부위를 소독하고(70% 에탄올로 스프레이하고 닦아내고) 멸균 수건 커튼을 놓아 수술 부위를 덮습니다.
- 복구 케이지를 준비합니다. 질식의 위험을 제한하기 위해 케이지 침구를 제거하십시오. 가열 패드를 케이지 아래에 놓습니다. 음식과 물 소스를 제공합니다.
- 파이펫 풀러에서 나노 인젝터용 유리 모세관을 당깁니다. 당기는 과정 동안 가열 필라멘트의 강렬한 열은 유리 모세관을 살균합니다. 팁을 잘라내거나 끊어 직경 약 5 μm의 개구부를 얻습니다.
- 모세관 팁을 약 30° 각도로 경사하여 조직 침투를 개선하고 막힘을 줄입니다. 미네랄 오일로 모세관을 채우고 나노 리터 인젝터에 삽입하십시오.
- 원하는 채널로도셉신 인코딩 rAAV의 알리쿼트를 얻고 멸균 PBS를 사용하여 원하는 적시로 희석한다.
참고 : 우리는 혈청형 1 rAAv가 청각 뇌간 핵의 형질 전환에 잘 작동한다는 것을 발견했습니다. 구체적으로, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (청색 광 활성화 채널로돕신) 및 rAAV1.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (적색 이동 채널로도프신), 공개적으로 접근할 수 있는 저장소 및 벡터 코어에서 사용할 수 있음 CRACM 실험에 필요한 채널로도프신의 높은 발현 수준과 양호한 장거리 축색 인신매매를 일관되게 산출합니다. - 멸균 PBS에서 rAAV 1-3 μL로 모세관을 전면 에 필기하기 위해 인젝터 지침을 따르십시오.
2. 수술
- 동물을 유도 챔버에 넣고 교정 된 이소플루란 기화기를 통해 전달되는 산소에 3 % 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 호흡이 깊고 느려지고 발가락 핀치 반사가 없을 때까지 마우스를 관찰하십시오(약 3-5분).
- 동물을 입체적 프레임으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮김을 옮김 가스 마취 마스크가 있는 구개 바에 입을 대고 두 외이도에 비천복이 있는 이어 바를 배치하여 동물의 머리를 고정시하십시오.
- 직장 온도 프로브를 삽입하고 항상성 온도 컨트롤러를 켭타.
- 안과 연고를 바르면 눈이 마르지 않도록 하십시오.
- 선제 진통제 (예를 들어, 5 mg / kg 카프로펜의 피하 주사)를 투여하십시오.
- 마취 상태의 깊이에 따라 이소플루란을 1-2.5%로 조정합니다. 시술 중 적어도 15분마다 점막의 온도, 호흡 및 색상을 모니터링합니다.
- 전기 클리퍼로 두피를 면도하십시오. 포비동 요오드와 70% 에탄올의 세 번갈아 면봉으로 두피를 무균적으로 준비합니다.
- 귀 사이를 시작하여 눈에 로스트랄을 계속하여 람다와 bregma 봉합사를 노출시킴을 따라 두피에 절개를 하십시오. 피부를 옆으로 밀어 내고 필요한 경우 노출된 뼈에서 골막을 제거합니다.
- 멸균 수술 마커로 람다 봉합사를 표시하고 나노 인젝터의 끝을 배치하여 람다만 만지고 미세 조작자 좌표를 0으로 설정합니다. 나노 인젝터 팁과 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 람다 봉합사와 bregma 봉합사 사이의 고도 차이를 측정하십시오. 입천장 바 높이를 조정하여 람다와 브레그마를 ± 100 μm 높이 차이로 가져옵니다.
- 나노 인젝터 팁 및 마이크로 매니더레이터 좌표계를 사용하여 사출 부위를 매핑하고 멸균 수술 마커로 부위를 표시합니다. P21-P30 마우스의 IC 또는 DCN을 주입하려면 표 1과같이 람다 봉합사를 기준으로 좌표를 사용하십시오. 좌표의 Z 깊이는 람다의 두개골 표면에서 측정됩니다.
- 멸균 0.5mm 드릴 버가 있는 마이크로모터 드릴을 사용하여 사출 부위에 개두술을 수행합니다.
- 표적 핵에 있는 뉴런의 광범위한 형질침입을 보장하기 위하여, 조직으로 각종 깊이에서 주사를 합니다(표 1,Z 좌표), IC같이 더 큰 두뇌 지구의 경우에, 다른 X와 Y 좌표에 있는 2개 이상의 침투의 과정을 통해 주사를 합니다(표 1,오른쪽 IC 침투 1 및 오른쪽 IC 침투 2).
- 주사를 수행합니다. IC 주사의 경우, 2,250 μm와 1,750 μm 깊이 사이의 Z 축 (주입 깊이)을 따라 250 μm 간격으로 20 nL의 바이러스를 침전시 입힙니다. DCN 주사의 경우, 각각 4,750 μm 및 4,550 μm의 깊이에서 20 nL의 바이러스를 증착합니다.
- 각 Z 좌표에 주입한 후 인젝터를 다음 Z 좌표로 이동하기 전에 2-3분 정도 기다립니다. 이렇게 하면 바이러스가 주사 부위에서 멀리 확산되어 나노 인젝터가 재배치될 때 바이러스가 주사 관으로 빨려 들어올 확률을 줄입니다.
- 침투에 마지막 주입 후, 대기 3-5 두뇌에서 나노 인젝터를 철회 하기 전에 분.
- 나노 인젝터가 침투와 동물 사이의 뇌에서 제거되면 팁에서 소량의 바이러스를 꺼내 팁이 막히지 않은지 확인하십시오.
- 주사 후 멸균 된 PBS를 사용하여 두피의 절단 된 가장자리를 적신 다음 피부를 중간 선으로 부드럽게 이동하십시오. 6-0 (0.7 미터미터) 나일론 봉합사를 사용하여 간단한 중단 봉합사로 상처를 닫습니다.
- 상처에 2 % 리도카인 젤0.5-1 mL을 적용하십시오.
- 이어 바와 온도 프로브를 제거하고, 이소플루란을 끄고, 구개 바에서 마우스를 제거하고 복구 케이지로 옮김을 옮니다.
- 복구를 면밀히 모니터링합니다. 동물이 완전히 깨어 나고, 움직이고, 통증이나 고통의 흔적을 보이지 않는 경우, 케이지로 다시 옮기고 케이지를 사육장으로 되돌릴 수 있습니다.
- 수술이 하루에 여러 동물에 수행 될 경우, 수술 도구를 살균하고 다음 수술 전에 드릴 버를 뜨거운 비드 소독기를 사용합니다.
3. 외과 후속 조치
- 다음 10일 동안 상처 폐쇄, 감염 또는 통증이나 고통의 징후가 있는지 매일 동물을 검사하여 기관의 동물 관리 지침을 준수하십시오.
- 실험에서 동물을 사용하기 전에 3-4 주를 기다려 채널로도프신의 최적의 발현을 허용하십시오.
4. 두뇌 슬라이스 준비 및 주입 대상의 확인
- CRACM의 경우, 표준 체외 전기생리학 실험에서 형질감염된 동물로부터 급성 준비된 뇌 슬라이스를 사용하며, 여기서 는 간략하게 설명된다(자세한설명27에대한 Goyer et al. 2019 참조).
- (mM에서) 포함하는 인공 뇌척수액 (ACSF)를 준비하십시오 : 125 NaCl, 12.5 D-포도당, 25 NaHCO3,3 KCl, 1.25 NaH2PO4,1.5 CaCl2,1 MgSO4. 버블 ACSF는 7.4의 pH로 5%CO2를 95%O2로한다.
- 채널로독신의 활성화를 제한하기 위해 거의 어둠 또는 붉은 빛에서 시험관 내 전기 생리학을 포함한 모든 다음 단계를 수행합니다.
- 깊이 이소플루란으로 마우스를 마취하고 신속하게 참수. ~ 34 °C ACSF에서 뇌를 빠르게 해부하십시오.
- IC를 함유한 관상동맥 슬라이스(200-250 μm)를 진동 마이크로토메로 ~34°CACSF로 절단하고, ACSF로 채워진 홀딩 챔버에서 30분 동안 34°C에서 슬라이스를 배양하여 95%O2에서5%CO2로 버블링하였다. 배양 후, 기록에 사용될 때까지 실온에서 슬라이스를 저장합니다.
- 주사 대상이 IC가 아닌 경우, 주입된 뇌 영역의 추가 관상 동맥 조각을 절단하고 형광 현미경 하에서 표적 핵의 형질변형을 확인한다. 표적 핵에 형질감염이 없거나 다른 뇌 영역에서 추가형형이 없다면 실험을 계속하지 마십시오.
5. 체외 녹음 및 CRACM 실험
참고: 크로노스와 ChrimsonR의 광학 자극을 제공하기 위해 현미경의 에피플루오레전 포트에 결합된 LED를 사용합니다. 그러나 레이저는 LED 대신 사용할 수 있습니다. 레이저를 사용 하는 경우, 기관 안전 관계자로부터 사전 승인을 얻고 안전한 레이저 사용에 대 한 적절 한 지침을 따르십시오.
- 보로실리케이트 유리에서 3.5-4.5 MΩ의 저항으로 전극을 당깁니다. 전극 내부 용액은 (mM) 포함해야합니다 : 115 K-글루코네이트, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 포스포크크레아틴, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, 0.1% 바이오시틴(w/v),pH는 KOH와 290 mosm/kg으로 7.3으로 조정되었습니다.
- 레코딩하려면 표준 패치 클램프 방법을 사용하십시오. 고정 된 단계 직립 현미경 아래에 기록 챔버에 슬라이스를 놓고 지속적으로 ~ 2 mL / min에서 ACSF와 함께 침전. 생리 적 온도 근처 기록을 실시 (~ 34-36 °C).
- 적절한 패치 클램프 앰프를 사용하여 시각적 제어 하에 뉴런을 패치합니다. 계열 저항, 파이펫 정전 용량 및 액체 접합 전위가 정확합니다.
- 전체 셀 레코딩 중에 시판되는 LED를 통해 580 nm 빛의 짧은 펄스(1-5ms)의 470nm 빛 또는 ChrimsonR을 전달하여 크로노를 활성화합니다. opsin 활성화의 임계값을 결정하고 포스트 내피 전위를 유도하기 위해 최소한의 자극 프로토콜을 사용합니다. 일반적으로 PSP를 유도하는 최단 자극 지속 시간을 사용하고 PSP를 유도하는 데 필요한 임계 전력의 120%로 광학 전력을 설정합니다.
- 막 전위에 기록된 변경이 실제로 뉴런에 시냅스 입력인것을 확인하기 위하여는, 흥분성/억제 성 후약 수용체를 위한 표준 길항제는 실험 도중에 세척될 수 있습니다. PSP에 다른 수용체 기여도를 조사하기 위해 (예를 들어 NMDA 대 AMPA 수용체), 적합한 수용체 길항제는 세척될 수 있다. 각 수용 체 길 항 제에 대 한, 약물 효과 세척 후 반전 한다.
- PSP의 대기 시간, 지터 및 신뢰성을 사용하여 중간에 채널로도신 을 발현하는 시냅스의 활성화와는 달리, 기록된 뉴런에 대한 시냅스의 직접적이고 광학적인 활성화에서 비롯된 광시냅스 입력이 발생한다는 것을 확인합니다. 기록 된 뉴런에 시냅스 뉴런. 일반적으로 낮은 대기 시간(&2ms), 낮은 지터(&1 ms 표준 대기 시간 편차), 높은 신뢰성(>50%) 기록된 뉴런에 시냅스 전 뉴런을 발현하는 채널로덕신으로부터 직접 시냅스 연결을 나타낸다.
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Representative Results
우리는 VIP-IRES-Cre 마우스(VIPtm1 (cre)Zjh/J)와 Ai14 Cre-리포터 마우스 (B6)를 교차했습니다. CG-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)는VIP 뉴런이 형광 단백질 tdTomato를 발현하는 F1 자손을 생성한다. 어느 성별의 F1 자손이 사용되었고, 산후일(P) 21 에서 P70으로 사용되었다. 이 연구에서는 총 22마리의 동물이 사용되었습니다.
AAV1의 입체 주입. 표 1에 나타낸 좌표를 사용하여 VIP-IRES-Cre x Ai14 마우스의 오른쪽 IC에 Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH가 오른쪽 IC에서 강한 크로노스-EGFP 발현을 초래하였다(도2A). 크로노스-EGFP 형광의 육안 검사는 오른쪽 IC에 표지된 소마타의 대부분이 IC(ICc)의 중앙 핵에 위치하지만, 소마타는 때때로 IC(ICd)의 등쪽 피질과 IC(IClc)의 측면 피질에도 존재함을 나타냈다. 비표적 지역에서 채널로도프신의 발현이 거짓 긍정으로 이어질 수 있기 때문에 실험에 사용된 모든 동물에 대해 표적화 및 형질감염 정도를 확인해야 합니다. 크로노스의 더 광범위하거나 더 제한된 표현을 달성하기 위해, 증착 된 바이러스의 양뿐만 아니라 입체 좌표는 원하는 결과를 달성하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.
AAV1의 입체 주입. SYN.Chronos-GFP.WPRE.bGH를 DCN 내로(참조 좌표 1참조) VIP-IRES-Cre x Ai14 마우스의 DCN 뉴런의 강한 형질변환을 초래하였다(도2B). DCN의 선택적 형질표현을 확인하기 위해, 모든 동물의 뇌간은 EGFP 발현이 존재하고 DCN에 국한되었는지 확인하기 위해 슬라이스되어야 한다. 형질감염이 없거나 청각 신경 또는 VCN에서 EGFP의 상당한 발현이있는 경우 기록을 수행해서는 안됩니다. 표 1에 도시된 좌표를 총 40 nL의 사출 부피를 사용하여, 크로노스-EGFP 발현은 대부분의 경우 DCN으로 제한된다. EGFP 표지된 축삭은 IC 및 DCN 주사 부위 모두에 대해 주사 후 3주 후 왼쪽(반대측) ICc에 존재하였다(도2A 오른쪽, 2B 우측).
ChrimsonR, AAV1의 장거리 인신 매매를 테스트합니다. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH는 크로노스 주사와 동일한 좌표를 사용하여 VIP-IRES-Cre x Ai14 마우스의 오른쪽 DCN에 주입하였다. ChrimsonR 주사는 세포 및 섬유에서 볼 수 있는 tdTomato 형광과 함께 DCN에서 강한 발현을 이끌어냈습니다(그림 3A). 반대로 ICc에서, tdTomato로 강하게 표지된 섬유는 3주 후에 명확하게 보였으며, 청각 뇌간 핵에 주입되었을 때 ChrimsonR-tdTomato 구조의 장거리 인신 매매 능력을 입증하였다(그림3B). Ic VIP 뉴런에서 ChrimsonR의 광학 활성화는 Ic VIP 뉴런에서 EPSPs를 유도(그림 3C),ChrimsonR은 실험 매개 변수가 청색광 대신 적색 광의 사용을 요구할 때 장거리 CRACM 실험을위한 유용한 도구임을 나타냅니다. 그러나 ChrimsonR은 청색광으로 쉽게 활성화되어 크로노스(Chronos)와 동일한 청색광 활성화 임계값을 나타낸다는 것을발견했습니다(그림 4). 청색광에 대한 ChrimsonR의 민감도는 동일한 동물13에서ChrimsonR 또는 크로노스로 형질전환된 입력을 구별하기 위해 특별한 주의를 기울여야 함을 의미한다.
오른쪽 IC에 주사 후 반대측 (왼쪽) ICc에서 VIP 뉴런에 기록을 대상으로 할 때, 청색 광등이 흥분성 후발성 전위 (EPSPs) 또는 억제 후통 전위 전위 (IPSPs)를 유도. 이것은 VIP 뉴런에 대한 통신 투영을 확인합니다. 통신 EPSP와 IPSP를 별도로 분석하기 위해, 우리는 EPSP 기록 동안 IPSP를 차단하기 위해 수용체 길항제를 사용, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. CRACM 실험 중에 기록된 대표적인 EPSP 및 IPSP는 그림 5에나와 있습니다. IPSPs는 시험된 ICc VIP 뉴런 12개 중 6개에서 관찰되었다. IPSP는 작음(1.53 mV±0.96 mV)이었고, 적당한 역학을 가졌다. IPSP의 10-90% 상승 시간은 7.8 ms ±2.1 ms였고, 반폭은 15.1 ms ±6.8 ms였고, 붕괴 시간 상수는 32.4 ms ±17.0ms(도 5A,왼쪽)였다. IPSPs는 GABAA 수용체에 의해 매개되었고, 그들은 5 μM gabazine, GABAA 수용체 길항제(그림 5A,오른쪽; n = 6)에 의해 차단되었다. EPSP는 시험된 27개의 ICc VIP 뉴런 중 11개에서 관찰되었다. EPSP는 또한 작음(1.52 mV±1.08 mV)이었고, 적당한 역학을 가졌다. EPSP의 10-90% 상승 시간은 8.3 ms ±4.3 ms였고, 반폭은 19.6 ms ±7.6 ms였고, 붕괴 시간 상수는 43.5 ms ±16.8ms(도 5B "대조군")이었다. EPSPs는 AMPA 및 NMDA 수용체에 의해 매개되었다. 50 μM D-AP5의 적용, NMDA 수용체 길항제, 감소된 EPSP 하프폭(14.3 ms ±4.7 ms, p =0.006) 상승 시간 감소(6.3 ms±1.6 ms, p=0.09), 부패 시간 상수(30.6 ms±7.3 ms, p= 0.06) 및 EPSP 진폭(1.38±0.33 mV, 0.33 mV= 1.38 ±0.33 mV) 감소추세 Tukey 사후 테스트를 통해 반복 측정을 위한 ANOVA). 10 μM NBQX의 적용, AMPA 수용체 길항제, EPSP의 나머지를 차단(그림 5B "+ AP5 & NBQX").
DCN 주사 후 왼쪽 ICc의 VIP 뉴런의 기록은 청색 광이 깜박이는 EPSPs를 밝혀, IC에서 VIP 뉴런에 DCN에서 시냅스 입력을 확인. DCN CRACM 실험은 자발적인 IPSPs를 차단하기 위해 목욕중의 GABAergic 및 글리시네르지성 차단제와 함께 수행되었다. 우리는 청색광의 2-5 ms 펄스가 시험된 25개의 뉴런 중 19개에서 EPSP를 유도한다는 것을 발견했습니다. 빛을 불러일으킨 EPSPs는 중간 진폭(2.85 mV ±2.98 mV)과 상대적으로 느린 상승 시간(4.2 ms±1.3 ms), 하프폭(20.6 ms ±14.4 ms) 및 감쇠 시간 상수(22.0 ms ±6.7 ms)(n=6 셀, 데이터가 나타내지 않음)를 가졌다.
크로노스 또는 ChrimsonR 활성화에 의해 유발된 모든 PS는 전부 또는 전혀 없는 방식으로 유도되었으며 광학 전력(표시되지 않은 데이터)을 증가시켜 진폭을 확장하지 않았습니다. 그러나, 이 결과는 특정 뉴런에 입력을 제공하는 형질감염된 시냅스의 수 그리고 생리학에 달려 있으며, 따라서 조사중인 축색 투영 및 뉴런 유형의 특정 조합에 따라 달라질 가능성이 있다.
도 1: rAAV 사출 부위 및 실험 설정. (A)사출 부위 및 실험 설정으로 통신 투영을 조사합니다. 왼쪽: rAAV 구문(예: rAAV1.Synonos-GFP.WPRE.bGH)이 오른쪽 IC에 주입되고 표적 레코딩이 반대IC에서 수행됩니다. 오른쪽: 패치 클램프 녹화 중에 크로노스 형질염 섬유는 청색광으로 흥분하여 후분증 전위를 유도합니다. (B)DCN에서 IC에 이르는 장거리 프로젝션을 조사하기 위한 사출 부위 및 실험 설정. 왼쪽: ChrimsonR 구문은 오른쪽 DCN에 주입되고 표적 레코딩은 반대 측 IC에서 수행됩니다. 오른쪽: 패치 클램프 레코딩 중에 ChrimsonR형 섬유는 적색 신호등으로 흥분하여 ChrimsonR이 포스트내피전가능성을 불러일으켰습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: IC 및 DCN에 주사후 크로노스-EGFP 발현. (a)왼쪽: 우측 IC(녹색)의 사출 부위에 국한된 소마타에서의 IC(마젠타) 및 크로노스-EGFP 발현 전반에 걸쳐 tdTomato 표지된 VIP 뉴런을 나타내는 관상 IC 슬라이스의 이미지. 오른쪽: 주사 부위에 IC 반대측에서 기록된 VIP 뉴런(흰색-녹색)을 보여주는 더 높은 배율 이미지. 녹색 puncta는 반대로 IC에서 투영을 표현하는 크로노스-EGFP입니다. (B)rAAV-크로노스-EGFP 주사 후 DCN에서 크로노스-EGFP 발현을 나타내는 관상 뇌간 슬라이스의 이미지. 왼쪽: DCN의 이미지, 등지 어쿠스틱 줄무늬로 들어가는 형질 감염된 DCN 및 EGFP 양성 섬유를 보여주는. 중간: DCN에서 크로노스 형질감염된 세포체를 보여주는 더 높은 배율 이미지. 오른쪽: 장거리 DCN-IC 프로젝션에서 반대측 IC의 섬유 및 단말에서 크로노스-EGFP 발현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: IC에 대한 DCN 및 DCN 프로젝션에서 ChrimsonR-tdTomato 식. (A)오른쪽 DCN이 rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH로 주입된 마우스에서 코로나 뇌간 슬라이스의 이미지. 왼쪽: 오른쪽 DCN의 ChrimsonR 표현의 이미지입니다. 오른쪽: ChrimsonR을 가진 뉴런의 강한 형질을 보여주는 오른쪽 DCN의 더 높은 배율 심상. (B)IC에서 ChrimsonR 형질감염된 DCN 축색의 고배율 이미지. (C)OPTOGENETICE는 RAAV-ChrimsonR 주입 DCN에 IC 반대측의 VIP 뉴런으로부터 기록된 EPSPs를 불러일으켰다. 원래 추적은 밝은 회색으로 표시되고 평균 EPSP는 빨간색입니다. 주황색 상자는 590 nm 광 펄스의 타이밍을 나타냅니다. 배율 막대 = 20 ms/0.5 mV. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 낮은 청색광 레벨에 의한 ChrimsonR 의 활성화. (A)470 nm 청색광의 펄스에 의한 크로노의 활성화. 위: 크로노스 구동 IPSP의 원래 트레이스(라이트 그레이)와 평균(시안)은 크로노스 활성화 임계값보다 약간 높은 광학 전력에서 연상됩니다(스케일 바는 20ms/0.5 mV표시). 하단: 470 nm의 광전력과 크로노스가 불러온 PSP를 관찰할 확률 사이의 관계. (B)470 nm 청색광으로 ChrimsonR 활성화. 위: A, 상단(스케일 바는 20ms/0.5mV)에 사용되는 동일한 광학 전력에서 470nm 의 청색광으로 떠오르는 ChrimsonR 기반 EPSP의 원래 트레이스(밝은 회색)와 평균(빨간색)입니다. 하단: 470 nm의 광전력과 ChrimsonR 구동 PSP를 관찰할 확률 간의 관계. ChrimsonR PSP의 청색광 활성화 임계값은 크로노스 PSP를 유도하기 위한 임계값과 동일합니다.
그림 5: VIP 뉴런에 대한 절제시냅스에서 빛을 불러일으킨 PS의 특성화. 오른쪽 IC는 rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH로 주입되었고, 기록은 반대측 ICc의 VIP 뉴런으로 만들어졌다. (A)광유전학적으로 유발된 IPSPs는 2-5 ms 청색광 깜박임(왼쪽)에 의해 유발되었고, EPSPs는 10 μM NBQX 및 50 μM D-AP5에 의해 차단되었다. IPSP는 가바진 (오른쪽)에 의해 폐지되었다. (B)광유전학적으로 유발된 EPSPs는 2-5 ms 청색광 깜박임(왼쪽)에 의해 유발되었고, IPSPs는 1 μM 스트리크닌 및 5 μM 가바진으로 차단되었다. 50 μM D-AP5의 워시인은 빛을 발하는 EPSP(중간)의 반폭 및 부패 시간 상수를 현저히 감소시켰습니다. 10 μM NBQX의 세척은 나머지 EPSP (오른쪽)를 폐지하였다. A와 B의 원래 추적은 밝은 회색으로 표시되며 최대 50개의 개별 자취의 평균이 검은색으로 표시됩니다. 고이어 외, 2019. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| X(측면) | Y (꼬리) | Z(깊이) | |
| 오른쪽 IC 침투 1 | 1,000 μm | -900 μm | 2,250-1500 μm (250 μm 증분) |
| 오른쪽 IC 침투 2 | 1,250 μm | -900 μm | 2,250-1750 μm (250 μm 증분) |
| 오른쪽 DCN | 2,155 μm | -1325 μm | 4,750 μm, 4,550 μm |
표 1: IC 및 DCN에 rAAV 주사를 위한 스테레오탁시크 좌표. 모든 좌표는 μm. Z 좌표에서 람다를 기준으로 하며, 람다에서 두개골의 등지 표면에서 측정됩니다.
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Discussion
우리는 CRACM이 마우스 IC에 있는 뉴런에 장거리 시냅스 입력을 확인하고 특성화하기 위한 강력한 기술이다는 것을 것을을 발견했습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜에 따라, 우리는 DCN 및 IC에서 뉴런의 강력한 트랜스펙션뿐만 아니라 IC의 시냅스 터미널에 크로노스와 ChrimsonR의 신뢰할 수있는 축산 인신 매매를 달성했습니다. 또한, 우리는 이 기술이 PSP 진폭, 하프 폭, 부패 시간 및 수용체 약리학을 포함하여 포스트나피 사건의 측정 그리고 분석을 가능하게 한다는 것을 설명했습니다. 우리의 경험은 이 접근이 청각 뇌간 및 그 너머에 걸쳐 기능적인 회로 매핑 실험을 능력을 발휘하기 위하여 쉽게 적응될 수 있다는 것을 건의합니다.
전반적으로, 광유전학 회로 매핑의 특이성은 축색의 전기 자극에 비해 뚜렷한 이점을 제공한다. 바이러스성 형질감염은 시냅스 전 뉴런의 표적 집단에 채널로도인의 발현을 공간적으로 그리고 분자적으로 제한하는 기능을 제공한다. 대조적으로, 전기 자극은 대부분의 두뇌 지구에 있는 것과 같이 그 축세포가 섞일 때 다른 synaptic 핵에서 유래하는 축사 사이에서 분화할 수 없습니다. 전기 자극은 또한 발신 구체 및 항드로믹 스파이크를 모두 시작할 수 있으며, 말단 자극 부위에 기록 부위 근처에 있는 뉴런에서 발생하는 축색이 포함되어 있을 때 더욱 복잡한 문제가 발생합니다.
채널로덕신의 안정적인 발현과 좋은 축색 인신 매매를 보장하기 위해 올바른 바이러스 벡터와 혈청형을 선택하는 것이 가장 중요합니다. 우리는 IC 뉴런에서 크로노의 안정적인 발현이 크로노스 또는 ChrimsonR 구성을 포함하는 혈청형 1 rAAV로 달성되었다는 것을 발견했습니다. 폴리아데닐화 신호. rAAV 혈청형 5는 IC에서 기능성 옵신을 생성하는 데 실패했지만, DCN에서 기능하였다(데이터는 도시되지 않음). 모든 실험에 대 한 주사 좌표의 엄격한 유효성 검사 및 opsin 발현 대상된 뇌 영역으로 제한 되도록 마찬가지로 중요 하다. 입력의 의미 있는 식별은 opsin의 발현이 신중하게 검사되고 모든 실험에 대해 문서화되는 경우에만 가능합니다.
상기 프로토콜에 사용된 rAAV1.ChrimsonR 구성은 DCN에서 IC에 이르는 장거리 프로젝션에서도 단백질의 안정한 발현 및 양호한 축색 인신을 산출하였다(그림3). 따라서 ChrimsonR은 (장거리) 회로 매핑에 적합한 옵신이 됩니다. ChrimsonR과 같은 적색 이동 opsin은 실험 매개 변수가 조직 깊숙이 빛 침투를 필요로하는 경우 유용 할 수 있지만 실험자는 현재 사용 가능한 모든 적색 시프트 opsins가 청색광과 일부 교차 활성화를 보여 준다는 것을 알고 있어야합니다. 일부 연구는 ChrimsonR과 크로노스가 별도로 활성화 될 수 있다고 주장하지만6,14,16,우리의 데이터는이 접근 법으로 주의를 기울여야한다고 제안합니다. 최근 보고서는 크로노스13에서적색 이동 작전을 분리하려고 할 때 사용해야 하는 추가 방법을 자세히 설명합니다. 따라서 ChrimsonR 및 Chronos를 두 가지 색상 CRACM 실험에서 사용할 때 신중하게 설계된 제어 실험을 실행하여 파란색과 적색 이동 opsin 활성화를 명확하게 분리해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 도이치 Forschungsgemeinschaft 연구 펠로우십 (GO 3060/1-1, 프로젝트 번호 401540516, DG) 및 국립 보건 원부 R56 DC016880 (MTR)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
References
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