Summary
Channelrhodopsin-assisteret kredsløb kortlægning (CRACM) er en præcision teknik til funktionel kortlægning af langtrækkende neuronal fremskrivninger mellem anatomisk og / eller genetisk identificerede grupper af neuroner. Her beskriver vi, hvordan du udnytter CRACM til at kortlægge auditive hjernestammen forbindelser, herunder brugen af en rød-flyttet opsin, ChrimsonR.
Abstract
Når man undersøger neurale kredsløb, en standard begrænsning af in vitro patch klemme tilgang er, at axoner fra flere kilder er ofte blandet, hvilket gør det vanskeligt at isolere input fra individuelle kilder med elektrisk stimulation. Men ved hjælp af channelrhodopsin assisteret kredsløb kortlægning (CRACM), kan denne begrænsning nu overvindes. Her rapporterer vi en metode til at bruge CRACM til at kortlægge stigende input fra lavere auditive hjernestammen kerner og commissural input til en identificeret klasse af neuroner i ringere colliculus (IC), midthjernen kernen i det auditive system. I IC, lokale, commissural, stigende, og faldende axoner er stærkt sammenflettet og derfor umulig at skelne med elektrisk stimulation. Ved at injicere en viral konstruktion til at drive udtryk for en kanalrhodopsin i en presynaptic kerne, efterfulgt af patch clamp optagelse til at karakterisere tilstedeværelsen og fysiologi en kanalrhodopsin-udtrykke synaptiske indgange, fremskrivninger fra en bestemt kilde til en bestemt population af IC-neuroner kan kortlægges med celletypespecifik nøjagtighed. Vi viser, at denne tilgang virker med både Chronos, en blå lyse-aktiveret channelrhodopsin, og ChrimsonR, en rød-flyttet kanalrhodopsin. I modsætning til tidligere rapporter fra forhjernen, finder vi, at ChrimsonR er robust smuglet ned axoner af rygsamarbejde cochlear kerne vigtigste neuroner, hvilket indikerer, at ChrimsonR kan være et nyttigt redskab til CRACM eksperimenter i hjernestammen. Protokollen præsenteres her indeholder detaljerede beskrivelser af intrakraniel virus injektion kirurgi, herunder stereotaxic koordinater for målretning injektioner til rygsamarbejde cochlear kernen og IC af mus, og hvordan man kombinerer hele celle patch clamp optagelse med channelrhodopsin aktivering for at undersøge langtrækkende fremskrivninger til IC neuroner. Selv om denne protokol er skræddersyet til at karakterisere auditive input til IC, kan den nemt tilpasses til at undersøge andre langtrækkende fremskrivninger i den auditive hjernestammen og videre.
Introduction
Synaptiske forbindelser er afgørende for neurale kredsløb funktion, men den præcise topologi og fysiologi af synapser i neurale kredsløb er ofte vanskelige at sonde eksperimentelt. Dette skyldes, at elektrisk stimulation, det traditionelle værktøj af cellulær elektrofysiologi, vilkårligt aktiverer axoner nær stimulering sstedet, og i de fleste hjerneregioner, axoner fra forskellige kilder (lokale, stigende, og / eller faldende) intertwine. Ved hjælp af channelrhodopsin assisteret kredsløb kortlægning (CRACM)1,2, denne begrænsning kan nu overvindes3. Channelrhodopsin (ChR2) er en lys aktiveret, kation-selektiv ion kanal oprindeligt findes i den grønne alga Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan aktiveres ved blåt lys af en bølgelængde omkring 450-490 nm, depolariserende cellen gennem kation tilstrømning. ChR2 blev først beskrevet og udtrykt i Xenopus oocytes af Nagel og kolleger4. Kort tid efter udtrykte Boyden og kolleger5 ChR2 i pattedyrneuroner og viste, at de kunne bruge lysimpulser til pålideligt at styre spiking på en millisekund tidsskala, inducerende virkningpotentialer ~ 10 ms efter aktivering af ChR2 med blåt lys. Optogenetiske kanaler med endnu hurtigere kinetik er blevet fundet for nylig (f.eks Chronos6).
Den grundlæggende tilgang til en CRACM eksperiment er at transfect en befolkning af formodede presynaptic neuroner med en rekombinant adeno-associeret virus (rAAV), der bærer den genetiske information til en kanalrhodopsin. Transfection af neuroner med rAAV fører til udtryk for den kodede channelrhodopsin. Typisk er kanalrhodopsin mærket med et fluorescerende protein som GFP (Green Fluorescerende Protein) eller tdTomato (et rødt fluorescerende protein), således at transfection af neuroner i målregionen nemt kan bekræftes med fluorescensbilleddannelse. Fordi rAV'er er ikke-patogene, har et lavt inflammatorisk potentiale og langvarig genekspression7,8, er de blevet en standard teknik til at levere kanalrhodopsins til neuroner. Hvis aktivering af en kanalrhodopsin gennem lysblinker efter transfection af en formodet presynaptisk population af neuroner fremkalder postsynaptiske potentialer eller strømme i målneuronerne, hvilket er tegn på en axonal forbindelse fra den transfunderede kerne til den registrerede celle. Fordi afhuggede axoner i hjernen skive eksperimenter kan køres til at frigive neurotransmitter gennem channelrhodopsin aktivering, kerner, der ligger uden for den akutte skive, men sende axoner ind i postsynaptiske hjerne regionen kan identificeres med CRACM. Kraften i denne teknik er, at tilslutning og fysiologi af identificerede langtrækkende synaptiske input kan undersøges direkte.
Ud over kanalrhodopsins, der er excitable af blåt lys, efterforskere har for nylig identificeret flere rød-flyttet channelrhodopsins9,10, herunder Chrimson og dens hurtigere analogChrimsonR, som begge er begejstrede med rødt lys på ~ 660 nm6. Rød-skiftede opsins er af interesse, fordi rødt lys trænger væv bedre end blåt lys, og rødt lys kan have en lavere cytotoksicitet end blåt lys10,11,12. Rød-flyttet channelrhodopsins også åbne mulighed for dobbelt farve CRACM eksperimenter, hvor konvergensen af axoner fra forskellige kerner på samme neuron kan testes i et eksperiment6,13,14. Men, nuværende rød-skiftede opsins ofte udviser uønsket krydsaktivering med blåt lys15,16,17, hvilket gør to farveeksperimenter vanskelig. Desuden har nogle rapporter vist, at ChrimsonR gennemgår begrænset axonal handel, hvilket kan gøre det udfordrende at bruge ChrimsonR til CRACM eksperimenter16,17.
Næsten alle stigende fremskrivninger fra den lavere auditive hjernestammen kerner konvergerer i ringere colliculus (IC), midthjernen hub af den centrale auditive vej. Dette omfatter fremskrivninger fra cochlear kernen (CN)18,19, det meste af det overlegne olivary kompleks (SOC)20, og ryg (DNLL) og ventral (VNLL) kerner af den laterale lemniscus21. Derudover en stor faldende fremskrivning fra den auditive cortex ophører i IC18,19,20,21,22, og IC neuroner selv synapse bredt inden for de lokale og kontralaterale lapper af IC23. Sammenblanding af axoner fra mange kilder har gjort det vanskeligt at sonde IC kredsløb ved hjælp af elektrisk stimulation24. Som et resultat, selv om neuroner i IC udføre beregninger vigtigt for lyd lokalisering og identifikation af tale og anden kommunikation lyde25,26, organiseringen af neurale kredsløb i IC er stort set ukendt. Vi har for nylig identificeret VIP neuroner som den første molekylært identificerbare neuron klasse i IC27. VIP neuroner er glutamatergic stellate neuroner, der projektet til flere langtrækkende mål, herunder auditive thalamus og overlegen colliculus. Vi er nu i stand til at bestemme kilderne til og funktionen af lokale og langtrækkende input til VIP neuroner og til at bestemme, hvordan disse kredsløb forbindelser bidrager til lydbehandling.
Protokollen præsenteres her er skræddersyet til at undersøge synaptiske input til VIP neuroner i IC af mus, specielt fra den kontralaterale IC og DCN (Figur 1). Protokollen kan nemt tilpasses forskellige kilder til input, en anden neuron type eller en anden hjerne region helt. Vi viser også, at ChrimsonR er en effektiv rød-flyttet kanalrhodopsin for langtrækkende kredsløb kortlægning i auditive hjernestammen. Men vi viser, at ChrimsonR er stærkt aktiveret af blåt lys, selv ved lave intensiteter, og dermed, at kombinere ChrimsonR med Chronos i to-farve CRACM eksperimenter, omhyggeligkontrol skal bruges til at forhindre krydsaktivering af ChrimsonR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Få godkendelse fra den lokale institutionelle Animal Care and Use Committee (IACUC) og overholde NIH retningslinjer for pleje og brug af laboratoriedyr. Alle procedurer i denne protokol blev godkendt af University of Michigan IACUC og var i overensstemmelse med NIH retningslinjer for pleje og brug af laboratoriedyr.
1. Kirurgi Præparater
- Udfør operationer under aseptiske forhold. Autoklave / sterilisere alle kirurgi værktøjer og materialer før operationen. Bær kirurgi kjole og maske til operationen.
- Desinficere kirurgi område (spray og tørre ned med 70% ethanol), og placere sterile håndklæde gardiner til at dække kirurgi område.
- Gør opvågningsburet klar. Fjern bur strøelse for at begrænse risikoen for kvælning. Sæt en varmepude under buret. Giv en føde- og vandkilde.
- Træk en glaskapillær til nanoinjektoren på en pipettetrækker. Den intense varme af varmeglødetråden under trækprocessen vil sterilisere glaskapillær. Skær eller afbryd spidsen for at opnå en åbning med en diameter på ca. 5 μm.
- Facet kapillær spidsen til en ca 30 ° vinkel for at forbedre væv penetration og reducere tilstopning. Fyld kapillæren op med mineralsk olie, og indsæt i en nanoliterinjektor.
- Anskaffe en aliquot af den ønskede kanalrhodopsin-kodning rAAV og fortyndes til den ønskede titer ved hjælp af sterile PBS.
BEMÆRK: Vi har konstateret, at serotype 1 rAV'er fungerer godt for omfektion af auditive hjernestammen kerner. Specifikt rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (blå lyse-aktiveret channelrhodopsin) og rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (rød-flyttet channelrhodopsin), som er tilgængelige fra offentligt tilgængelige depoter og vektor kerner, konsekvent give det høje udtryk niveauer og god langtrækkende axonal handel med channelrhodopsins er nødvendige for CRACM eksperimenter. - Følg injektorinstruktioner for at udfylde kapillær foran med 1-3 μL rAAV i steril PBS.
2. Kirurgi
- Sæt dyret i et induktionskammer og fremkalde anæstesi med 3% isofluran i ilt leveret via en kalibreret isofluran fordamper. Overhold musen, indtil vejrtrækningbliver dyb og langsom og en tå knivspids refleks er fraværende, omkring 3-5 min.
- Overfør dyret til en stereoskattemæssig ramme. Fastgør dyrets hoved ved at sætte munden på en ganebar med en gasanæstesimaske og ved at placere ikke-perforerende ørestænger i begge ørekanaler.
- Sæt en rektal temperatursonde i, og tænd for den homøostatiske temperaturregulator.
- Påfør oftalmologiske salve for at forhindre øjnene i at tørre ud.
- Administrere forebyggende smertestillende (f.eks. subkutan injektion på 5 mg/kg carprofen).
- Juster isofluran til 1-2,5%, i henhold til dybden af den bestøvede tilstand. Overvåg temperatur, vejrtrækning og farve af slimhinder mindst hvert 15.
- Barber hovedbunden med elektriske klippere. Aseptisk forberede hovedbunden med tre skiftevis podninger af povidone-jod og 70% ethanol.
- Lav et snit i hovedbunden langs midterlinjen starter mellem ørerne og fortsatte rostral til øjnene, udsætter lambda og bregma suturer. Skub huden til siden og fjern periosteum fra eksponeret knogle, hvis det er nødvendigt.
- Marker lambda suturen med en steril kirurgisk markør, placer spidsen af nanoinkojektoren, så den bare rører lambda, og nul mikromanipulatorkoordinaterne. Brug nanoinkogensspidsen og mikromanipulatoren til at måle forskellen i højde mellem lambda- og bregmasuturerne. Juster ganebarhøjden for at bringe lambda og bregma inden for ± 100 μm højdeforskel.
- Kortlæg injektionsstedet ved hjælp af nanoinjektorspidsen og mikromanipulatorkoordinatsystemet, og marker stedet med en steril kirurgisk markør. For at injicere IC eller DCN af P21-P30 mus, skal du bruge koordinater i forhold til lambda suturen, som vist i tabel 1. Bemærk, at Z-dybden i vores koordinater måles fra kraniets overflade ved lambda.
- Brug en mikromotorboremaskine med en steril boregrat på 0,5 mm til at udføre en kraniotomi over injektionsstedet.
- For at sikre bred omladning af neuroner i målkernen skal injektioner på forskellige dybder ind i vævet(tabel 1,Z-koordinater) og, hvis der er tale om større hjerneregioner som IC, foretage injektioner i løbet af to eller flere gennemføringer ved forskellige X- og Y-koordinater (tabel 1, højre IC penetration 1 og højre IC penetration 2).
- Udfør injektioner. For IC-injektioner deponeres 20 nL virus i intervaller på 250 μm langs Z-aksen (injektionsdybden) mellem 2.250 μm og 1750 μm dybde. For DCN-injektioner deponeres 20 nL virus i en dybde af henholdsvis 4.750 μm og 4.550 μm.
- Efter injektion ved hver Z-koordinat skal du vente 2-3 min, før injektoren flyttes til den næste Z-koordinat. Dette vil give virusret tid til at sprede sig væk fra injektionsstedet, hvilket reducerer sandsynligheden for, at virus vil blive suget op injektionskanalen, når nanoinjektoren er flyttet.
- Efter sidste injektion i en penetration, vente 3-5 min før tilbagetrækning nanoininjector fra hjernen.
- Når nanoinjektoren fjernes fra hjernen mellem gennemføringer og mellem dyr, skubbe en lille mængde virus fra spidsen for at kontrollere, at spidsen ikke har tilstoppet.
- Efter injektioner skal du bruge sterile PBS til at vådbeskære hovedbundens afskårne kanter og derefter forsigtigt flytte huden tilbage mod midterlinjen. Luk såret med enkle afbrudte suturer ved hjælp af 6-0 (0,7 metriske) nylon suturer.
- Påfør 0,5-1 ml lidocaingel på såret.
- Fjern ørestænger og temperatursonde, sluk for isofluran, fjern musen fra ganen bar og overføre den til opsving bur.
- Overvåg opsvinget nøje. Når dyret er helt vågen, bevæger sig rundt, og viser ingen tegn på smerte eller angst, overføre det tilbage i sit bur og returnere buret til vivarium.
- Hvis operationer vil blive udført på flere dyr på én dag, bruge en varm perle sterilizer at desinficere kirurgi værktøjer og bore burr før næste operation.
3. Kirurgisk opfølgning
- Tjek dyr dagligt for sårlukning, infektion, eller tegn på smerte eller angst i løbet af de næste 10 dage, idet der henvises til institutionens dyrepleje retningslinjer.
- Vent 3-4 uger, før du bruger dyr i forsøg for at tillade optimal ekspression af kanalrhodopsins.
4. Brain Slice Forberedelse og bekræftelse af injektion Target
- For CRACM, brug akut forberedt hjerne skiver fra transpopførte dyr i standard in vitro elektrofysiologi eksperimenter, beskrevet her kun kort (se Goyer et al. 2019 for en mere detaljeret beskrivelse27).
- Forbered kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) indeholdende (i mM): 125 NaCl, 12,5 D-glucose, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,5 CaCl2, 1 MgSO4. Bubble ACSF til en pH-pc på 7,4 med 5% CO2 i 95% O2.
- Udfør alle følgende trin, herunder in vitro elektrofysiologi, i nær-mørke eller rødt lys for at begrænse aktivering af kanalrhodopsins.
- Dybt bedøve musen med isofluran og halshugge det hurtigt. Dissekere hjernen hurtigt i ~ 34 °C ACSF.
- Skær koronale skiver (200-250 μm) indeholdende IC i ~ 34 °C ACSF med en vibrerende mikrotom og inkubere skiverne ved 34 °C i 30 min i et holdekammer fyldt med ACSF boblet med 5% CO2 i 95% O2. Efter inkubation, opbevare skiver ved stuetemperatur, indtil de anvendes til optagelser.
- Hvis injektionsmålet ikke var IC, skæres yderligere koronale skiver af den injicerede hjerneregion og kontroller omladningen af målkernen under et fluorescensmikroskop. Hvis der ikke er nogen transfection i målkernen eller yderligere transfection i forskellige hjerneregioner, skal du ikke fortsætte med eksperimentet.
5. In Vitro Optagelse og CRACM Eksperiment
BEMÆRK: For at give optisk stimulering af Chronos og ChrimsonR bruger vi lysdioder koblet til mikroskopets epifluorescensport. Men, lasere kan bruges i stedet for lysdioder. Hvis du bruger lasere, skal du indhente forudgående godkendelse fra institutionelle sikkerhedsfolk og følge passende retningslinjer for sikker laserbrug.
- Træk elektroder fra borosilikatglas til en modstand på 3,5-4,5 MΩ. Elektrodens interne opløsning skal indeholde (i mM): 115 K-gluconat, 7.73 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 phosphocreatin, 4 MgATP, 0,3 NaGTP, suppleret med 0,1% biocytin (w /v), pH justeret til 7,3 med KOH og osmolalitet til 290 mOsm/kg med saccharose.
- Hvis du vil foretage optagelser, skal du bruge standardpatch clamp metoder. Placer skiven i et optagekammer under et fast trin opretstående mikroskop og gennemgår kontinuerligt ACSF ved ~ 2 ml/min. Udfør optagelser nær fysiologisk temperatur (~34-36 °C).
- Patch neuroner under visuel kontrol ved hjælp af en passende patch clamp forstærker. Korrekt for seriemodstand, pipettekapacitans og flydende krydspotentiale.
- Under helcelleoptagelser skal Chronos aktiveres ved at levere korte impulser (1-5 ms) af 470 nm lys eller ChrimsonR ved korte impulser på 580 nm lys gennem kommercielt tilgængelige lysdioder. Bestem tærsklen for opsinaktivering, og brug en minimal stimuleringsprotokol til at fremkalde postsynaptiske potentialer. Generelt skal du bruge den korteste stimulus varighed, der fremkalder en PSP, og indstille den optiske effekt til 120% af tærsklen magt, der kræves for at fremkalde PSP' er.
- For at bekræfte, at de registrerede ændringer i membranpotentiale faktisk er synaptiske input til neuronen, kan standardantagonister for excitatoriske/hæmmende postsynaptiske receptorer vaskes ind under forsøget. For at undersøge forskellige receptorbidrag til en PSP (f.eks. For hver receptor antagonist, narkotika effekter bør vende efter udvaskning.
- Brug pps'ernes ventetid, nervøsitet og pålidelighed til at bekræfte, at lysaktiverede synaptiske input stammer fra direkte, optisk aktivering af synapser på den registrerede neuron, i modsætning til aktivering af kanalrhodopsin-udtrykkesynaps er på en mellemliggende neuron, der synapser på den registrerede neuron. Generelt lav ventetid (<2 ms), lav jitter (<1 ms standardafvigelse i ventetiden) og høj pålidelighed (>50%) indikerer en direkte synaptisk forbindelse fra kanalrhodopsin, der udtrykker presynaptisk neuron til den registrerede neuron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi krydsede VIP-IRES-Cre mus(Viptm1 (cre) Zjh/ J) og Ai14 Cre-reporter mus (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/ J) til at generere F1 afkom, hvor VIP neuroner udtrykke fluorescerende protein tdTomato. F1 afkom af begge køn blev brugt, alderen postnatal dag (P) 21 til P70. I alt 22 dyr blev anvendt i denne undersøgelse.
Stereotaxic injektion af AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH ind i højre IC af VIP-IRES-Cre x Ai14 mus ved hjælp af koordinater vist i tabel 1 resulterede i stærke Chronos-EGFP udtryk i højre IC (Figur 2A). Visuel inspektion af Chronos-EGFP fluorescens viste, at de fleste af de somata mærket i højre IC var placeret i den centrale kerne af IC (ICc), men mærket somata var undertiden også til stede i dorsale cortex af IC (ICd) og lejlighedsvis i den laterale cortex af IC (IClc). Spredningen og omfanget af omladning bør kontrolleres for hvert dyr, der anvendes i et forsøg, da udtryk for kanalrhodopsins i ikke-målrettede regioner kan føre til falske positiver. For at opnå bredere eller mere begrænset udtryk for Chronos, mængden af deponeret virus samt stereotaxic koordinater kan nemt justeres for at opnå det ønskede resultat.
Stereotaxic injektion af AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH ind i DCN (se koordinater i tabel 1)af VIP-IRES-Cre x Ai14 mus resulterede i stærk transfection af DCN neuroner(Figur 2B). For at bekræfte den selektive transfektion af DCN bør hvert dyrs hjernestamme skæres i skiver for at kontrollere, at EGFP-udtrykket var til stede og begrænset til DCN. Hvis der ikke er nogen omladning, eller hvis der er et betydeligt udtryk for EGFP i hørenerven eller VCN, bør der ikke udføres optagelser. Ved hjælp af koordinaterne i tabel 1 med et samlet injektionsvolumen på 40 nL vil Chronos-EGFP-udtrykket i de fleste tilfælde være begrænset til DCN. EGFP-mærkede axoner var til stede i venstre (kontralaterale) ICc 3 uger efter injektion for både IC og DCN injektionssteder(figur 2A højre, 2B højre).
For at teste den langtrækkende handel med ChrimsonR, AAV1. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH blev injiceret i højre DCN af VIP-IRES-Cre x Ai14 mus, ved hjælp af de samme koordinater som med Chronos injektioner. ChrimsonR injektion førte til stærkt udtryk i DCN, med tdTomato fluorescens synlig i celler og fibre (Figur 3A). I den kontralaterale ICc, fibre stærkt mærket med tdTomato var klart synlige efter 3 uger, der viser langtrækkende menneskehandel evne ChrimsonR-tdTomato konstruere, når injiceres i auditive hjernestammen kerner (Figur 3B). Optisk aktivering af ChrimsonR fremkaldte EPSPs i IC VIP-neuroner (Figur 3C), hvilket indikerer, at ChrimsonR er et nyttigt værktøj til langtrækkende CRACM-eksperimenter, når de eksperimentelle parametre kræver brug af rødt lys i stedet for blåt lys. Vi fandt imidlertid, at ChrimsonR let blev aktiveret med blåt lys, hvilket viser den samme tærskel for aktivering af blåt lys som Chronos (figur 4). ChrimsonR's følsomhed over for blåt lys betyder, at der skal udvises særlig forsigtighed for at skelne mellem indgange, der overføres med ChrimsonR eller Chronos i samme dyr13.
Når målretning optagelser til VIP neuroner i kontralaterale (venstre) ICc efter injektioner i højre IC, blåt lys blinker fremkaldt excitatoriske postsynaptiske potentialer (EPSPs) eller hæmmende postsynaptiske potentialer (IPPS). Dette bekræfter commissural fremskrivninger til VIP neuroner. For at analysere commissuralEPSPs og IpPSPs separat, vi brugte receptor antagonister til at blokere IPPsPs under EPSP optagelser, og vice versa. Repræsentative EPSPs og IpPSPs nedskrevet under CRACM-forsøg er vist i figur 5. IpPS blev observeret i 6 ud af 12 testede ICc VIP neuroner. IP'er var små (1,53 mV ± 0,96 mV) og havde moderat kinetik. De 10 -90% stigninggange for IpPS var 7,8 ms ± 2,1 ms, halvbredder var 15,1 ms ± 6,8 ms, og henfaldstidskonstanter var 32,4 ms ± 17,0 ms (figur 5A, venstre). IPPsblev medieret af GABAA receptorer, da de blev blokeret af 5 μM gabazine, en GABAA receptor antagonist (Figur 5A, højre; n = 6). EPSPs blev observeret i 11 ud af 27 ICc VIP neuroner testet. EPS'er var også små (1,52 mV ± 1,08 mV) og havde moderat kinetik. De 10 -90% stigninggange for EPSPs var 8,3 ms ± 4,3 ms, halvbreddevar 19,6 ms ± 7,6 ms, og henfaldstidskonstanter var 43,5 ms ± 16,8 ms(figur 5B "Kontrol"). EPS Blev medieret af AMPA- og NMDA-receptorer. Anvendelse af 50 μM D-AP5, en NMDA receptor antagonist, reduceret EPSP halvbredde (14,3 ms ± 4,7 ms, p = 0,006) og tendens til at reducere stigningstiden (6,3 ms ± 1,6 ms, p = 0,09), forfaldstid konstant (30,6 ms ± 7,3 ms, p = 0,06), og EPSP amplitude (1,38 ± 0,33 mV, p = 0,105; ANOVA til gentagne målinger med Tukey post hoc-test). Anvendelse af 10 μM NBQX, en AMPA-receptorantagonist, blokerede resten af EPSP(figur 5B "+ AP5 & NBQX").
Optagelser af VIP-neuroner i venstre ICc efter DCN injektioner afslørede EPSPs fremkaldt af blåt lys blinker, bekræfter synaptiske input fra DCN til VIP neuroner i IC. DCN CRACM eksperimenter blev udført med GABAergic og glycinerge blokkere i badet for at blokere spontane IPPsPs. Vi fandt, at 2-5 ms pulser af blåt lys fremkaldte EPSPs i 19 af 25 neuroner testet. Lette epsps havde moderate amplitudes (2,85 mV ± 2,98 mV) og relativt langsomme stigningstider (4,2 ms ± 1,3 ms), halvbredder (20,6 ms ± 14,4 ms) og henfaldstidskonstanter (22,0 ms ± 6,7 ms) (n = 6 celler, data, der ikke er vist).
Alle PS'er fremkaldt af Chronos eller ChrimsonR aktivering blev fremkaldt i en alt-eller-ingen måde og ikke skalere deres amplitude med stigende optisk effekt (data ikke vist). Dette resultat afhænger imidlertid af antallet og fysiologien af de transpopførte synapser, der giver input til en bestemt neuron, og det vil derfor sandsynligvis variere afhængigt af den særlige kombination af axonal projektion og neurontype, der undersøges.
Figur 1: rAAV-injektionssteder og eksperimentel opsætning. (A) Injektionssted og eksperimentel opsætning til at undersøge commissural fremskrivninger. Venstre: En rAAV konstruktion (f.eks rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH) injiceres i højre IC og målrettede optagelser udføres i kontralateralIC. Højre: Under patch clamp optagelser, Chronos-transfected fibre er ophidset med blåt lys til at fremkalde postsynaptiske potentialer. (B) Injektionssted og eksperimentel opsætning for at undersøge langtrækkende fremskrivninger fra DCN til IC. Venstre: ChrimsonR konstruktionen sprøjtes ind i højre DCN, og målrettede optagelser udføres i det kontralaterale IC. Højre: Under patch clamp optagelser, ChrimsonR-transpected fibre er ophidset med rødt lys til at optage ChrimsonR fremkaldt postsynaptiske potentialer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Chronos-EGFP-udtryk efter injektioner i IC og DCN. (A) Venstre: Billede af koronale IC skive viser tdTomato-mærket VIP neuroner i hele IC (magenta) og Chronos-EGFP udtryk i somata lokaliseret til injektionssteder i højre IC (grøn). Højre: Højere forstørrelsebillede, der viser en optaget VIP-neuron (hvid-grøn) i IC-kontralateralt til injektionsstedet. Grøn punktlighed er Chronos-EGFP udtrykke fremskrivninger fra kontralateralic. (B) Billede af koronale hjernestammeskive, der viser Chronos-EGFP-udtrykket i DCN efter rAAV-Chronos-EGFP-injektionen. Venstre: Billede af DCN, der viser transfected DCN og EGFP-positive fibre ind i dorsale akustiske stria. Middle: Højere forstørrelsebillede, der viser Chronos-transfected cellekroppe i DCN. Højre: Chronos-EGFP udtryk i fibre og terminaler i kontralateralic fra langtrækkende DCN-IC fremskrivninger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: ChrimsonR-tdTomiudtryk i DCN- og DCN-projektionerne til IC'en. (A) Billede af en koronal hjernestamme skive fra en mus, hvor den højre DCN blev injiceret med rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH. Venstre: Billede af ChrimsonR-udtryk i højre DCN. Højre: Højere forstørrelse billede af højre DCN viser stærk transfection af neuroner med ChrimsonR. (B) Høj forstørrelse billede af ChrimsonR-transfected DCN axoner i IC. (C) Optogenetisk fremkaldte EPSPs indspillet fra en VIP-neuron i IC-kontralateral til rAAV-ChrimsonR injicerede DCN. Originale spor vises i lysegrå, og den gennemsnitlige EPSP er rød. Orange boks angiver timingen af 590 nm lys puls. Skalastænger = 20 ms/0,5 mV. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Aktivering af ChrimsonR med lave niveauer af blåt lys. (A) Aktivering af Chronos i commissural fremskrivninger af impulser på 470 nm blåt lys. Top: Originale spor (lysegrå) og gennemsnitlige (cyan) af Chronos-drevne IPPsPs, fremkaldt ved en optisk effekt lidt over tærsklen for Chronos aktivering (skalabarer viser 20 ms/0,5 mV). Bund: Forholdet mellem optisk effekt ved 470 nm og sandsynligheden for at observere en Chronos-fremkaldt PSP. (B) Aktivering af ChrimsonR med 470 nm blåt lys. Top: Originale spor (lysegrå) og gennemsnitlige (røde) chrimsonR-drevne EPSPs, fremkaldt med 470 nm blåt lys ved samme optiske effekt, der anvendes i A, top (skala barer viser 20 ms/0.5 mV). Bund: Forholdet mellem optisk effekt ved 470 nm og sandsynligheden for at observere en ChrimsonR-drevet PSP. Bemærk, at tærsklen for aktivering af ChrimsonR-betalingsmidler i blåt lys var identisk med tærsklen for fremkaldt af Chronos-betalingsmidler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Karakterisering af lys-fremkaldte PSPs fra commissural synapser på VIP neuroner. Den rigtige IC blev injiceret med rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH og optagelser blev lavet af VIP neuroner i kontralaterale ICc. (A) Optogenetisk fremkaldte IpPS blev fremkaldt af 2-5 ms blåt lys blinker (venstre), mens EPS Blev blokeret af 10 μM NBQX og 50 μM D-AP5. IP'er blev afskaffet af gabazine (til højre). B) Optogenetisk fremkaldte EPSPs blev fremkaldt af 2-5 ms blåt lys blinker (venstre), mens IpPS blev blokeret med 1 μM stryknin og 5 μM gabazine. Wash-in på 50 μM D-AP5 reducerede halvbredden og henfaldstidens konstant for lysfremkaldte EPSPs (i midten). Wash-in på 10 μM NBQX afskaffede den resterende EPSP (til højre). Originale spor i A og B vises i lysegrå, og gennemsnit fra op til 50 individuelle spor vises i sort. Fra Goyer et al., 2019. Klik her for at se en større version af denne figur.
| X (lateral) | Y (caudal) | Z (dybde) | |
| Højre IC penetration 1 | 1.000 μm | -900 μm | 2.250-1500 μm (250 μm intervaller) |
| Højre IC penetration 2 | 1.250 μm | -900 μm | 2.250-1750 μm (250 μm intervaller) |
| Højre DCN | 2.155 μm | -1325 μm | 4.750 μm, 4.550 μm |
Tabel 1: Stereotaxic koordinater for rAAV injektioner i IC og DCN. Alle koordinater er i forhold til lambda i μm. Z koordinater måles fra kraniumets rygoverflade ved lambda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har konstateret, at CRACM er en kraftfuld teknik til at identificere og karakterisere langtrækkende synaptiske input til neuroner i musen IC. Efter den protokol, der er beskrevet her, opnåede vi robust transfection af neuroner i DCN og IC samt pålidelig axonal handel med Chronos og ChrimsonR til synaptiske terminaler i IC. Derudover viste vi, at denne teknik muliggør måling og analyse af postsynaptiske hændelser, herunder PSP amplitude, halvbredde, henfaldstid og receptorfarmakologi. Vores erfaring tyder på, at denne tilgang let kan tilpasses til at udføre funktionelle kredsløb kortlægning eksperimenter i hele auditive hjernestammen og videre.
Samlet set er specificiteten af optogenetiske kredsløb kortlægning giver en klar fordel i forhold til elektrisk stimulation af axoner. Virale transfections giver evnen til at rumligt og molekylært begrænse udtrykket af kanalrhodopsins til en målrettet population af presynaptiske neuroner. I modsætning hertil kan elektrisk stimulation ikke skelne mellem axoner, der stammer fra forskellige presynaptiske kerner, når disse axoner blandes sammen, som det er tilfældet i de fleste hjerneregioner. Elektrisk stimulation kan også indlede både orthodromic og antidromic pigge, yderligere komplicerende spørgsmål, når en distal stimulation site indeholder axoner stammer fra neuroner placeret i nærheden af optagelsen site.
For at sikre stabil tonal handel med en kanalrhodopsin, at vælge den rigtige viralvektor og serotype er altafgørende. Vi fandt, at stabil ekspression af Chronos i IC neuroner blev opnået med en serotype 1 rAAV herunder en Chronos eller ChrimsonR konstruktion kombineret med en woodchuck hepatitis posttranscriptional regulerende element (WPRE) og kvæg væksthormon (BGH) polyadenylationsignal. rAAV serotype 5 producerede ikke funktionelle opsins i IC'et, men var funktionel i DCN (data blev ikke vist). Den strenge validering af injektionskoordinater for hvert eksperiment og sikring af, at opsinekspression er begrænset til den målrettede hjerneregion, er ligeledes vigtig. En meningsfuld identifikation af input er kun mulig, hvis udtryk for opsin kontrolleres og dokumenteres omhyggeligt for hvert eksperiment.
Den rAAV1.ChrimsonR konstruktion, der anvendes i ovennævnte protokol gav stabilt udtryk og god axonal handel med proteinet, selv i langtrækkende fremskrivninger fra DCN til IC (Figur 3). Dette gør ChrimsonR til en passende opsin til (langtrækkende) kredsløbkortlægning. En rød-flyttet opsin som ChrimsonR kan være nyttigt, hvis de eksperimentelle parametre kræver lys indtrængning dybt ind i vævet, men eksperimentatoren skal være opmærksom på, at alle i øjeblikket tilgængelige rød-flyttet opsins viser nogle krydsaktivering med blåt lys. Selv om nogle undersøgelser har hævdet, at ChrimsonR og Chronos kan aktiveres separat6,14,16, vores data tyder på, at der skal udvises stor omhu med denne tilgang. En nylig rapport indeholder yderligere metoder , der skal anvendes, hvis du forsøger at adskille rød-flyttet opsins fra Chronos13. Derfor, når du bruger ChrimsonR og Chronos i to farve CRACM eksperimenter, omhyggeligt designet kontrol eksperimenter skal udføres for at sikre klar adskillelse af blå og rød-flyttet opsin aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, projektnummer 401540516, til GD) og National Institutes of Health grant R56 DC016880 (MTR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
- Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
- Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
- Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
- Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
- Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
- Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 1029-1034 (2015).
- Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
- Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
- Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
- Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
- Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
- Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
- Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
- Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
- Winer, J. A., Schreiner, C., et al. The inferior colliculus: with 168 illustrations. Winer, J. A., Schreiner, C. , Springer. New York, NY. (2005).
- Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770 (2019).
