Summary
通道多普辛辅助电路映射 （CRACM） 是一种精确的技术，用于在解剖学和/或基因识别的神经元组之间进行远程神经元投影的功能映射。在这里，我们描述了如何使用CRACM来映射听觉脑干连接，包括使用红移蛋白，ChrimsonR。
Abstract
在研究神经回路时，体外贴片夹方法的标准限制是，来自多个源的斧头经常混合在一起，因此很难通过电刺激从单个源分离输入。然而，通过使用通道多普辛辅助电路映射（CRACM），现在可以克服这种限制。在这里，我们报告一种使用CRACM来绘制从低听觉脑干核和小分输入到低序曲（IC）中一类已识别的神经元的提升输入，即听觉系统的中脑核。在IC中，局部、小工、升和降的斧子紧密地交织在一起，因此与电刺激无法区分。通过注入病毒结构，以驱动在先发核中的通道性多普辛的表达，然后修补夹记录，以表征通道性药物表达突触输入的存在和生理学，从特定来源投影IC神经元的特定总体可以映射为细胞类型特定的精度。我们表明，这种方法适用于Chronos，一种蓝光激活的通道，和ChrimsonR，一种红移导管。与前脑以前的报告相比，我们发现ChrimsonR被强强地向下枢击耳蜗核主要神经元的斧突下，这表明ChrimsonR可能是脑干中CRACM实验的有用工具。此处介绍的协议包括颅内病毒注射手术的详细说明，包括针对小鼠背耳蜗核和IC注射的立体坐标，以及如何结合整个细胞贴片夹记录与通道性多普辛激活，以研究对IC神经元的远距离投影。尽管此协议是为 IC 的听觉输入而定制的，但它可以很容易地调整，以研究听觉脑干及以后的其他远程投影。
Introduction
突触连接对神经回路功能至关重要，但神经回路中突触的精确拓扑和生理学往往难以进行实验探讨。这是因为电刺激，传统的细胞电生理学工具，不分青红皂白地激活刺激部位附近的斧子，在大多数大脑区域，来自不同来源的斧子（局部、升序和/或降）交织。然而，通过使用通道多普辛辅助电路映射（CRACM）1，2，这种限制现在可以克服3。通道多普辛（ChR2）是一种光激活，阳离子选择性离子通道最初发现在绿色藻原体雷哈德蒂。ChR2可通过波长约为450-490nm的蓝光激活，通过阳离子流入使细胞去极化。ChR2首先由纳格尔及其同事4用异种卵母细胞描述和表达。不久之后，Boyden和他的同事5在哺乳动物神经元中表达ChR2，并表明他们可以使用光脉冲可靠地控制在毫秒时间尺度上的尖峰，在用蓝光激活ChR2后诱导行动电位+10毫秒。最近发现了具有更快动力学的光遗传学通道（例如，Chronos6）。
CRACM实验的基本方法是转染一个假定的预突触神经元群体，该病毒带有一种重组腺相关病毒（rAAV），该病毒携带通道性腺蛋白的遗传信息。具有rAAV的神经元转染导致编码通道性腺蛋白的表达。通常，通道性多普司子被标记有荧光蛋白，如GFP（绿色荧光蛋白）或tdTomato（红色荧光蛋白），以便通过荧光成像可以很容易地确认目标区域神经元的转染。由于rAAV是非致病性的，具有低炎症潜力和持久的基因表达7，8，它们已成为向神经元提供通道性多普辛的标准技术。如果转染假定的神经元预突触群后，通过光闪烁激活通道性多普辛在目标神经元中引起突触电位或电流，这是从转染细胞核到记录细胞的斧突连接的证据。由于脑切片实验中被切断的斧突可以通过通道性腺素激活来释放神经递质，因此，位于急性切片外部但向脑后脑区域发送斧子的原子核可以通过CRACM识别。该技术的作用是，可以直接研究已识别的远距离突触输入的连接性和生理学。
除了被蓝光兴奋的通道性多普辛外，调查人员最近还发现了几种红移导引性多普辛9，10，包括Chrimson及其更快的模拟ChrimsonR，两者都因660nm6的红光而兴奋。红移蛋白酶是感兴趣的，因为红光穿透组织比蓝光更好，红光可能具有比蓝光10，11，12更低的细胞毒性。红移通道性多普辛也开辟了双色CRACM实验的可能性，其中来自同一神经元不同核的斧突的收敛可以在一个实验6，13，14中测试。然而，目前的红移蛋白经常表现出不必要的交叉激活与蓝光15，16，17，使两个颜色实验困难。此外，一些报告指出，ChrimsonR受到有限的斧突贩运，这使得使用ChrimsonR进行CRACM实验16、17具有挑战性。
几乎所有来自下耳脑干核的上升投影都收敛在下级结体（IC），这是中央听觉通路的中脑中心。这包括从耳蜗核（CN）18，19，大多数优越的橄榄复合物（SOC）20，和背（DNLL）和腹腔（VNLL）核的侧耳核21的投影。此外，听觉皮层的大降投影在IC18、19、20、21、22中终止，IC神经元本身在IC23的局部和反向叶内广泛突触。来自许多来源的斧子的混杂使得使用电刺激24探测IC电路变得困难。因此，尽管IC中的神经元执行对声音定位和语音和其他通信声音识别至关重要的计算，IC中神经回路的组织在很大程度上还是未知的。我们最近确定VIP神经元是IC27中第一个分子可识别的神经元类别。VIP神经元是谷氨酸硬质质质质的硬质质神经元，投射到几个远程目标，包括听觉丘脑和高级胶质。我们现在能够确定VIP神经元的本地和远距离输入的来源和功能，并确定这些电路连接如何促进声音处理。
此处介绍的协议是专为研究小鼠 IC 中的 VIP 神经元的突触输入而定制的，特别是来自反向 IC 和 DCN 的突触输入（图 1）。该协议可以很容易地适应不同的输入源，不同的神经元类型或完全不同的大脑区域。我们还表明，ChrimsonR 是一种有效的红移通道，用于听觉脑干中的长距离电路映射。然而，我们证明，ChrimsonR被蓝光强激活，即使在低强度下，因此，在双色CRACM实验中，ChrimsonR与Chronos结合，必须使用谨慎的控制来防止ChrimsonR的交叉激活。
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Protocol
获得当地机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并遵守NIH关于实验室动物护理和使用的指导方针。本议定书中的所有程序均经密歇根大学IACUC批准，符合NIH关于护理和使用实验室动物的准则。
1. 手术准备
- 在无菌条件下进行手术。高压灭菌/消毒所有手术工具和材料在手术前。为手术穿手术服和口罩。
- 消毒手术区域（用70%乙醇喷洒和擦拭），并放置无菌毛巾窗帘覆盖手术区域。
- 准备恢复笼。取出笼式床上用品，以限制窒息风险。将加热垫放在笼子下。提供食物和水源。
- 在移液器拉拔器上为纳米注射器拉动玻璃毛细管。在拉动过程中加热灯丝的高温将使玻璃毛细管消毒。切掉或折断尖端，以获得直径约为 5 μm 的开口。
- 将毛细管尖端斜到大约 30° 角，以改善组织渗透并减少堵塞。用矿物油回填毛细管，并插入纳米升喷油器中。
- 获得所需通道多普辛编码rAAV的等分，并使用无菌PBS稀释至所需度子。
注：我们发现血清型1 rAAV对听觉脑干核的转染工作良好。具体来说，rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH（蓝光激活通道）和rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdtomato.WPRE.bGH（红移通道多普辛），可从公共可访问的储存库和向量核心，持续产生CRACM实验所需的高表达水平和良好的长距离的通道性等同质性。 - 按照喷油器说明，在无菌 PBS 中用 1-3 μL 的 rAAV 前填充毛细管。
2. 外科
- 将动物放入感应室，通过校准的异二苯蒸发器在氧气中诱导麻醉，其中3%的异二苯。观察鼠标，直到呼吸变得深和缓慢，脚趾捏反射不存在，约3-5分钟。
- 将动物转移到立体框架。用气体麻醉面罩将嘴放在唇上，并在两个耳道中放置非穿孔耳杆，从而固定动物的头部。
- 插入直肠温度探头并打开稳压温度控制器。
- 应用眼膏，防止眼睛干燥。
- 施用先发制人的镇痛药（例如，皮下注射5毫克/千克卡洛芬）。
- 根据麻醉状态的深度调整到1-2.5%。在手术过程中，至少每15分钟监测粘膜的温度、呼吸和颜色。
- 用电动剪子刮头皮。无菌地用三个交替的拭子来准备头皮，其中有三个交替的棉签，即四分五碘和70%乙醇。
- 沿着中线在头皮上切开一个切口，从耳朵之间开始，继续到眼睛上，露出羔羊和胸膜缝合线。如有必要，将皮肤推到侧面，从裸露的骨骼中取出骨质。
- 用无菌手术标记标记羔羊下牙缝合线，定位纳米注射器的尖端，使其只是触摸 lambda，并将微操作器坐标归零。使用纳米注射器尖端和微操作器测量 lambda 和 bregma 缝合线之间的高程差。调整口感杆高度，使 lambda 和 bregma 达到 ± 100 μm 高度差。
- 使用纳米注射器尖端和微操作器坐标系绘制注射部位图，并用无菌手术标记标记该部位。要注射P21-P30小鼠的IC或DCN，请使用相对于羔羊缝合的坐标，如表1所示。请注意，坐标中的 Z 深度是从 lambda 处的头骨表面测量的。
- 使用具有无菌 0.5 mm 钻头的微电机钻在注射部位进行颅骨切除术。
- 为了确保目标核神经元的广泛转染，在不同深度向组织进行注射（表1，Z坐标），在IC等较大的大脑区域的情况下，在不同的X和Y坐标上进行两次或两次以上渗透（表1，右IC渗透1和右IC穿透2）。
- 执行喷射。对于 IC 注射，沿 Z 轴（注射深度）沿 2，250 μm 和 1750 μm 深度之间以 250 μm 的间隔沉积 20 nL 病毒。对于DCN注射，分别在4，750μm和4，550μm的深度沉积20 nL病毒。
- 在每个 Z 坐标上喷射后，等待 2-3 分钟，然后再将喷油器移到下一个 Z 坐标。这将允许病毒从注射部位扩散，减少当纳米注射剂重新定位时病毒被吸走注射道的可能性。
- 最后一次注射渗透后，等待3-5分钟，然后从大脑中缩回纳米注射剂。
- 当纳米注射器从大脑中去除渗透和动物之间时，从尖端弹出少量病毒，以检查尖端是否堵塞。
- 注射后，使用无菌PBS润湿头皮的切边，然后轻轻地将皮肤移回中线。使用 6-0 （0.7 公制） 尼龙缝合线用简单的中断缝合关闭伤口。
- 在伤口上涂抹0.5-1 mL的2%利多卡因凝胶。
- 拆下耳杆和温度探头，关闭异胶，将鼠标从唇杆中取出，并将其转移到恢复笼中。
- 密切监视恢复。一旦动物完全清醒，四处走动，没有疼痛或痛苦的迹象，将其转移到笼子里，并将笼子放回笼子里。
- 如果一天内对多只动物进行手术，请使用热珠消毒器在下次手术前对手术工具和钻头进行消毒。
3. 手术随访
- 在未来10天内，每天检查动物是否有伤口封闭、感染或疼痛或疼痛的迹象，并遵守该机构的动物护理指南。
- 在实验中使用动物之前等待3-4周，以允许通道性多普辛的最佳表达。
4. 脑切片制备及注射目标的确认
- 对于CRACM，在标准的体外电生理学实验中使用经过转染的动物的急性制备的脑切片，这里只简要描述（见Goyer等人，2019年，关于更详细的描述27）。
- 制备含有（mM）的人工脑脊液（ACSF）：125纳Cl，12.5 D-葡萄糖，25 NaHCO3，3KCl，1.25 NaH2PO 4，1.5 CaCl2，1MgSO4。气泡 ACSF 的 pH 为 7.4，在 95% O2中为 5% CO2 。
- 在接近黑暗或红灯下执行以下所有步骤，包括体外电生理学，以限制通道性多普辛的激活。
- 用极性胶对老鼠进行深度麻醉，并迅速将其斩首。在 +34 °C ACSF 中快速切除大脑。
- 用振动微体切割含有IC的日冕切片（200-250 μm），在34°C下孵育切片30分钟，在装有ACSF气泡的保持室中孵育30分钟，在95%O2中填充5%CO2。孵育后，将切片储存在室温下，直到用于记录。
- 如果注射目标不是IC，则切下注射脑区域的额外日冕切片，并在荧光显微镜下检查目标核的转染。如果目标核没有转染，或不同大脑区域没有额外的转染，请不要继续实验。
5. 体外记录和CRACM实验
注：为了提供Chronos和ChrimsonR的光学刺激，我们使用与显微镜的荧光端口耦合的LED。但是，可以使用激光代替 LED。如果使用激光，请事先获得机构安全官员的批准，并遵循适当的安全激光使用指南。
- 将电极从硼硅酸盐玻璃拉至 3.5-4.5 MΩ 的电阻。电极内部溶液应包含（mM）：115 K-葡萄糖酸， 7.73 KCl， 0.5 EGTA， 10 HEPES， 10 Na2磷酸素， 4 MgATP， 0.3 NaGTP， 辅以 0.1% 生物细胞素 （w/v）， pH 调整为 7.3 与 KOH 和渗透率到 290 mOsm/kg 与蔗糖.
- 要进行录制，请使用标准贴片夹方法。将切片置于固定级直立显微镜下的录音室中，以±2 mL/min持续注入ACSF。在生理温度（+34-36°C）附近进行记录。
- 使用合适的贴片夹放大器在视觉控制下的贴片神经元。正确进行串联电阻、移液器电容和液体结电位。
- 在整个细胞记录过程中，通过提供 470 nm 光的短脉冲（1-5 ms）或通过市售 LED 提供 580 nm 光的短脉冲来激活 Chronos。确定蛋白酶激活的阈值，并使用最小的刺激方案来引起发贴电位。通常，使用产生 PSP 的最短刺激持续时间，并将光功率设置为激发 PSP 所需的阈值功率的 120%。
- 为了确认所记录的膜电位变化确实是神经元的突触输入，在实验期间可以清洗兴奋/抑制的午贴受体的标准拮抗剂。为了研究对PSP的不同受体贡献（例如NMDA与AMPA受体），可以清洗合适的受体拮抗剂。对于每个受体拮抗剂，药物效果应在冲洗后逆转。
- 使用 PSP 的延迟、抖动和可靠性来确认光激活突触输入源自记录神经元上的突触的直接光学激活，而不是对介入的通道性突触的激活神经元突触记录的神经元。通常，低延迟（<2 ms）、低抖动（<1 ms 延迟标准偏差）和高可靠性（>50%）指示从表达前突触神经元的通道性腺蛋白到记录神经元的直接突触连接。
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Representative Results
我们穿过VIP-IRES-Cre小鼠（Viptm1（cre）Zjh/J）和Ai14克雷-报告鼠（B6）。Cg-Gt（ROSA）26Sortm14（CAG-tdTomato）赫兹/J）生成F1后代，其中VIP神经元表达荧光蛋白tdTomato。使用两个性别的F1后代，年龄为产后日（P）21至P70。在这项研究中，共有22只动物被使用。
AAV1 的立体注入。Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH 进入VIP-IRES-Cre x Ai14小鼠的右IC，使用表1所示的坐标，在右侧IC中产生强的Chronos-EGFP表达式（图2A）。对Chronos-EGFP荧光的目视检查表明，在右侧IC标记的大多数索马塔位于IC（ICc）的中央核，但标有somata有时也存在于IC（ICd）的背皮层中，偶尔也存在于IC（IClc）的侧皮层中。应检查实验中使用的每种动物的定向和转染范围，因为非靶区中通道性多普辛的表达可能导致误报。为了实现Chronos的更广泛或更受限制的表达，可以很容易地调整沉积病毒的数量以及立体坐标，以达到预期的结果。
AAV1 的立体注入。SYN.Chronos-GFP.WPRE.bGH 进入DCN（见表1坐标）的VIP-IRES-Cre x Ai14小鼠导致DCN神经元的强转染（图2B）。为了确认DCN的选择性转染，应切切每个动物的脑干，以验证EGFP表达是否存在并限于DCN。如果没有转染，或者在听觉神经或VCN中有相当的EGFP表达，则不应进行录音。使用表 1所示总注入体积为 40 nL 的坐标，在大多数情况下，Chronos-EGFP 表达式将仅限于 DCN。在IC和DCN注射部位注射后3周内，左侧（反向）ICc中存在EGFP标记的斧子（图2A右，2B右侧）。
以测试ChrimsonR，AAV1的远程贩运。Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH被注射到VIP-IRES-Cre x Ai14小鼠的右侧DCN中，使用与Chronos注射相同的坐标。ChrimsonR注射导致DCN的强烈表达，在细胞和纤维中可见tdTomato荧光（图3A）。在反向ICc中，在3周后清晰可见标有tdTomato的纤维，表明ChrimsonR-tdTomato结构在注入听觉脑干核时的远程贩运能力（图3B）。ChrimsonR在ICVIP神经元中引起EPSP的光学激活（图3C），表明当实验参数需要使用红光而不是蓝光时，ChrimsonR是远程CRACM实验的有用工具。然而，我们发现ChrimsonR很容易用蓝光激活，显示与Chronos相同的蓝光激活阈值（图4）。ChrimsonR对蓝光的敏感性意味着必须特别注意区分在同一动物13中用ChrimsonR或Chronos转染的输入。
在注射到右侧 IC 后，将录音定向到反向（左侧）ICc 中的 VIP 神经元时，蓝光闪烁会引发兴奋的分贴后电位 （EPSPs） 或抑制性贴片电位 （IPSP）。这证实了对VIP神经元的体向投影。为了分别分析网络EPSP和IPSP，我们使用受体拮抗剂在EPSP记录期间阻止IPSP，反之亦然。在CRACM实验中记录的代表性EPSP和IPSP如图5所示。在12个经过测试的ICc VIP神经元中，有6个进行了IPSP。IPSP体积小（1.53 mV = 0.96 mV），具有中等动力学。IPSP 的 10- 90% 上升时间为 7.8 ms = 2.1 ms，半宽度为 15.1 ms = 6.8 ms，衰减时间常数为 32.4 ms = 17.0 ms（图 5A，左图）。IPSP由GABAA受体介导，因为它们被5μM加巴辛（GABAA受体拮抗剂）阻塞（图5A，右图;n = 6）。在测试的27个ICc VIP神经元中，有11个观察到EPSP。EPSP 也很小（1.52 mV = 1.08 mV），具有中等的动力学。EPSP 的 10 - 90% 上升时间为 8.3 ms = 4.3 ms，半宽度为 19.6 ms = 7.6 ms，衰减时间常数为 43.5 ms = 16.8 ms（图 5B"控制"）。EPSPs由AMPA和NMDA受体介导。应用 50 μM D-AP5， 一个NMDA受体拮抗剂，降低EPSP半宽度（14.3 ms = 4.7 ms，p = 0.006），并趋向于减少上升时间（6.3 ms = 1.6 ms，p = 0.09），衰减时间常数（30.6 ms = 7.3 ms，p = 0.06），EPSP 振幅（1.38 ± 0.33 mV，p = 0.105;使用图基专位测试进行重复测量的 ANOVA）。应用10μM NBQX，一种AMPA受体拮抗剂，阻断了EPSP的剩余部分（图5B"+AP5和NBQX"）。
DCN 注射后左侧 ICC 中的 VIP 神经元记录显示，由蓝光闪烁引起的 EPSP，确认从 DCN 到 IC 中的 VIP 神经元的突触输入。DCN CRACM 实验在浴缸中用 GABAergic 和甘氨酸阻滞剂进行，以阻止自发 IPSP。我们发现，在25个神经元中，有19个脉冲的蓝光脉冲引出EPSP。光唤起EPSPs具有中等振幅（2.85 mV = 2.98 mV）和相对缓慢的上升时间（4.2 ms = 1.3 ms）、半宽度（20.6 ms = 14.4 ms）和衰减时间常数（22.0 ms = 6.7 ms）（n = 6 个单元，未显示数据）。
Chronos 或 ChrimsonR 激活引发的所有 PSP 都以全或全无的方式激发，并且不会随光功率的增加（未显示数据）来缩放其振幅。然而，这一结果取决于转染突触的数量和生理学，为特定神经元提供输入，因此可能因正在研究的斧突投影和神经元类型的特定组合而异。
图1：rAAV注射部位和实验设置。（A） 注射部位和实验装置，以调查小孔投影.左：rAAV构造（例如，rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH）注入到正确的IC中，并在反向IC中执行目标记录。右图：在贴片夹记录期间，Chronos 转染的纤维会用蓝光激发，以激发贴片电位。（B） 注射场和实验设置，以研究从DCN到IC的远距离投影。左图：ChrimsonR 构造被注入右侧 DCN，目标录制在反向 IC 中执行。右图：在贴片夹记录期间，ChrimsonR 转染纤维会用红光激发，以记录 ChrimsonR 唤起的贴片电位。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：进入IC和DCN后，Chronos-EGFP表达。（A） 左图：日冕IC切片的图像，显示整个IC（品红色）和Chronos-EGFP表达在整个IC（品红色）和Chronos-EGFP表达中，在右侧IC（绿色）中本地化到注射部位。右图：较高的放大倍率图像，显示IC对注射部位的IC反向中记录的VIP神经元（白色-绿色）。绿色双子卡是Chronos-EGFP，表示来自反向IC的预测。（B） 在 rAAV-Chronos-EGFP 注射后，在 DCN 中显示 Chronos-EGFP 表达的日冕脑干切片图像。左图：DCN 图像，显示进入背声学纹状体的转染 DCN 和 EGFP 正纤维。中间：显示 DCN 中 Chronos 转染细胞体的更高放大倍率图像。右图：长距离 DCN-IC 投影的光纤和端子中的 Chronos-EGFP 表达式。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：DCN中的ChrimsonR-tdTomato表达，DCN向IC投影。（A） 从小鼠的日冕脑干切片的图像，其中右 DCN 被注射 rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH。左图：右侧 DCN 中的 ChrimsonR 表达式图像。右图：右图为右DCN图像，显示具有ChrimsonR的神经元强转染。（B） IC 中 ChrimsonR 转染 DCN 斧子的高倍率图像。（C） 从IC反向到rAAV-ChrimsonR注射DCN的VIP神经元记录的蛋白酶体。原始轨迹以浅灰色显示，平均 EPSP 显示为红色。橙色框表示 590 nm 光脉冲的正时。刻度条 = 20 ms/0.5 mV。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：低蓝光激活ChrimsonR。（A） 通过 470 nm 蓝光脉冲激活小月表在小范围投影中。顶部：Chronos 驱动的 IPSP 的原始轨迹（浅灰色）和平均值（青色），在光学功率略高于 Chronos 激活阈值时引起（刻度条显示 20 ms/0.5 mV）。底部：470 nm 的光学功率与观察 Chronos-调用 PSP 的概率之间的关系。（B） 用470nm蓝光激活ChrimsonR。顶部：ChrimsonR驱动EPSPs的原始轨迹（浅灰色）和平均（红色），在A，顶部（刻度条显示20 ms/0.5 mV）中使用的光功率为470nm蓝光。底部：470 nm 的光学功率与观察 ChrimsonR 驱动的 PSP 的概率之间的关系。请注意，ChrimsonR PSPs的蓝光激活阈值与引出Chronos PSPs的阈值相同。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：从小肠突触到VIP神经元的光唤起PS的特性。正确的IC被注射了rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH，录音是从反向ICc的VIP神经元。（A） 光基因引起的IPSP被2-5 ms蓝光闪烁（左）引起，而EPSP被10μM NBQX和50μM D-AP5阻挡。国际公共部门计划被加巴津（右）废除。（B） 光遗传学引起EPSP被2-5 ms蓝光闪烁（左）唤起，而IPSP被1μM strychnine和5μM加巴辛阻断。50 μM D-AP5 的洗涤显著降低了光唤起 EPSP（中间）的半宽和衰减时间常数。洗涤 10 μM NBQX 废除了剩余的 EPSP（右）。A和B中的原始轨迹以浅灰色显示，最多 50 个单个轨迹的平均值以黑色显示。Goyer等人，2019年。请点击此处查看此图的较大版本。
| X（侧） | Y（牛） | Z（深度） | |
| 右侧 IC 穿透力 1 | 1，000 μm | -900 μm | 2，250-1500 μm （250 μm 增量） |
| 右侧 IC 穿透 2 | 1，250 μm | -900 μm | 2，250-1750 μm （250 μm 增量） |
| 右侧 DCN | 2，155 μm | -1325 μm | 4，750 μm， 4，550 μm |
表1：rAAV注入IC和DCN的立体坐标。所有坐标均相对于μm中的羔羊，Z坐标从羊头骨的背表面测量。
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Discussion
我们发现，CRACM 是一种强大的技术，用于识别和描述小鼠 IC 中神经元的长距离突触输入。按照此处详述的协议，我们实现了 DCN 和 IC 神经元的强健转染，以及将 Chronos 和 ChrimsonR 可靠通过同步体贩运到 IC 中的突触终端。此外，我们证明，该技术能够测量和分析午睡事件，包括PSP振幅，半宽，衰变时间和受体药理学。我们的经验表明，这种方法可以很容易地适应在整个听觉脑干和超越进行功能电路映射实验。
总体而言，光遗传学电路映射的特异性比电刺激的斧子具有明显的优势。病毒转染提供了在空间和分子上限制通道性药物表达到预突触神经元的目标人群的能力。相反，当这些突触混合时，电刺激不能区分来自不同前突触核的斧子，就像大多数大脑区域一样。电刺激也可以启动正交和抗流刺，当远端刺激部位含有来自位于记录位点附近的神经元的斧头时，进一步复杂化问题。
为了确保稳定的表情和良好的通道性毒杆菌贩运，选择正确的病毒载体和血清型至关重要。我们发现，在IC神经元中，Chronos的稳定表达是通过血清型1 rAAV实现的，包括Chronos或ChrimsonR结构，结合木丘克肝炎转录后调节因子（WPRE）和牛生长激素（BGH）多化化信号。rAAV 血清型 5 未能在 IC 中产生功能蛋白酶，但在 DCN 中起作用（未显示数据）。严格验证每个实验的注射坐标，并确保蛋白酶表达仅限于目标大脑区域也同样重要。只有仔细检查和记录每个实验的蛋白酶的表达，才能对输入进行有意义的识别。
上述协议中使用的rAAV1.ChrimsonR结构产生了稳定的表达和良好的蛋白质的斧突贩运，即使在从DCN到IC的远距离投影中（图3）。这使得 ChrimsonR 成为适合（远程）电路映射的蛋白酶。如果实验参数需要光线深入组织，像 ChrimsonR 这样的红移蛋白酶可能很有用，但实验者必须意识到，所有目前可用的红移蛋白酶都显示出一些与蓝光交叉激活。虽然一些研究认为，ChrimsonR和Chronos可以分别激活6，14，16，我们的数据表明，必须非常小心这种方法。最近的一份报告详细说明了在试图将红移蛋白从Chronos13中分离出来时应该使用的其他方法。因此，在两种颜色CRACM实验中使用ChrimsonR和Chronos时，需要执行精心设计的控制实验，以确保蓝色和红色移位蛋白酶激活的明确分离。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了德国福森斯格明舍夫特研究奖学金（GO 3060/1-1，项目号401540516，DG）和国家卫生研究院资助R56 DC016880（MTR）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
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| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
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| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
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| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
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References
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