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Neuroscience

Cartographie à long terme de circuit assisté e de Channelrhodopsine des neurones colliculus inférieurs avec des Channelrhodopsins bleus et rouges

Published: February 7, 2020 doi: 10.3791/60760

Summary

La cartographie de circuit assistée par la chaînerhodopsine (CRACM) est une technique de précision pour la cartographie fonctionnelle des projections neuronales à longue portée entre les groupes anatomiques et/ou génétiquement identifiés des neurones. Ici, nous décrivons comment utiliser CRACM pour cartographier les connexions auditives du tronc cérébral, y compris l’utilisation d’une opsine rouge décalée, ChrimsonR.

Abstract

Lors de l’étude des circuits neuronaux, une limitation standard de l’approche de pince de correction in vitro est que les axones de sources multiples sont souvent mélangés, ce qui rend difficile d’isoler les entrées de sources individuelles avec stimulation électrique. Cependant, en utilisant la cartographie assistée de circuit de canalrhodopsine (CRACM), cette limitation peut maintenant être surmontée. Ici, nous rapportons une méthode pour employer CRACM pour cartographier les entrées ascendantes des noyaux auditifs inférieurs de tronc cérébral et des entrées commissural à une classe identifiée de neurones dans le colliculus inférieur (IC), le noyau de midbrain du système auditif. Dans l’IC, les axones locaux, commissuraux, ascendants et descendants sont fortement entrelacés et donc indiscernables avec la stimulation électrique. En injectant une construction virale pour conduire l’expression d’un canalrhodopsin dans un noyau presynaptique, suivi de l’enregistrement de pince de correction pour caractériser la présence et la physiologie des entrées synaptiques channelrhodopsin-exprimant, projections d’une source spécifique à une population spécifique de neurones IC peut être cartographié avec une précision spécifique au type cellulaire. Nous montrons que cette approche fonctionne à la fois avec Chronos, une canalrhodopsine activée par la lumière bleue, et ChrimsonR, une canalrhodopsine à décalée rouge. Contrairement aux rapports précédents de l’avant-cerveau, nous constatons que ChrimsonR est solidement trafiqué dans les axones des neurones principaux du noyau cochléaire dorsal, ce qui indique que ChrimsonR peut être un outil utile pour les expériences CRACM dans le tronc cérébral. Le protocole présenté ici comprend des descriptions détaillées de la chirurgie par injection de virus intracrânien, y compris des coordonnées stéréotaxiques pour cibler les injections au noyau cochléaire dorsal et ic des souris, et comment combiner l’enregistrement de pince de patch cellulaire entier avec l’activation de channelrhodopsine pour étudier des projections à longue portée aux neurones ic. Bien que ce protocole soit conçu pour caractériser les apports auditifs à l’IC, il peut être facilement adapté pour étudier d’autres projections à long terme dans le tronc cérébral auditif et au-delà.

Introduction

Les connexions synaptiques sont essentielles à la fonction du circuit neuronal, mais la topologie et la physiologie précises des synapses dans les circuits neuronaux sont souvent difficiles à sonder expérimentalement. C’est parce que la stimulation électrique, l’outil traditionnel de l’électrophysiologie cellulaire, active sans discernement les axones près du site de stimulation, et dans la plupart des régions du cerveau, les axones de différentes sources (locales, ascendantes et/ou descendantes) s’entremêlent. Cependant, en utilisant channelrhodopsine cartographie de circuit assisté (CRACM)1,2, cette limitation peut maintenant être surmontée3. Channelrhodopsin (ChR2) est une lumière activée, canal d’ions cation-sélectif à l’origine trouvé dans l’algue verte Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 peut être activé par la lumière bleue d’une longueur d’onde autour de 450-490 nm, dépolarisant la cellule par l’afflux de cation. ChR2 a été décrit pour la première fois et exprimé dans les ovocytes Xenopus par Nagel et ses collègues4. Peu de temps après, Boyden et ses collègues5 ont exprimé le ChR2 dans les neurones mammifères et ont montré qu’ils pouvaient utiliser des impulsions lumineuses pour contrôler de façon fiable les pointes sur une échelle de temps milliseconde, induisant des potentiels d’action de 10 ms après l’activation de ChR2 avec la lumière bleue. Des canaux optogénétiques avec des cinétiques encore plus rapides ont été trouvés récemment (par exemple, Chronos6).

L’approche de base d’une expérience CRACM est de transfect une population de neurones présynaptiques putatifs avec un virus adéno-associé recombinant (rAAV) qui porte l’information génétique pour une canalrhodopsine. La transfection des neurones avec le rAAV conduit à l’expression de la channelrhodopsine codée. Typiquement, la canalrhodopsine est marquée avec une protéine fluorescente comme GFP (protéine fluorescente verte) ou tdTomato (une protéine fluorescente rouge), de sorte que la transfection des neurones dans la région cible peut facilement être confirmée avec l’imagerie de fluorescence. Parce que les rAAV sont non pathogènes, ont un faible potentiel inflammatoire et l’expression génique de longue durée7,8, ils sont devenus une technique standard pour livrer des canalrhodopsines aux neurones. Si, après transfection d’une population présynaptique putative de neurones, l’activation d’une canalrhodopsine par des éclairs de lumière suscite des potentiels ou des courants postsynaptiques dans les neurones cibles, c’est l’évidence d’une connexion axonale du noyau transfecté à la cellule enregistrée. Puisque les axones coupés dans des expériences de tranche de cerveau peuvent être conduits pour libérer le neurotransmetteur par l’activation de canalrhodopsine, les noyaux qui se trouvent en dehors de la tranche aigue mais envoient des axones dans la région de cerveau postsynaptic peuvent être identifiés avec CRACM. La puissance de cette technique est que la connectivité et la physiologie des entrées synaptiques à longue portée identifiées peuvent être étudiées directement.

En plus de channelrhodopsines qui sont excitables par la lumière bleue, les enquêteurs ont récemment identifié plusieurs canalrhodopsines rouges décalées9,10, y compris Chrimson et son plus rapide analogique ChrimsonR, qui sont tous deux excités par la lumière rouge de 660 nm6. Les opsines à décalé rouge sont d’intérêt parce que la lumière rouge pénètre le tissu mieux que la lumière bleue, et la lumière rouge peut avoir une cytotoxicité inférieure à la lumière bleue10,11,12. Les canalrhodopsines décalées rouges ouvrent également la possibilité d’expériences CRACM à double couleur, où la convergence des axones de différents noyaux sur le même neurone peut être testée dans une expérience6,13,14. Cependant, les opsines rouges actuelles présentent souvent une activation croisée non désirée avec une lumière bleue15,16,17, ce qui rend deux expériences de couleur difficiles. En outre, certains rapports ont indiqué que ChrimsonR subit un trafic axonal limité, ce qui peut rendre difficile l’utilisation de ChrimsonR pour les expériences du CRACM16,17.

Presque toutes les projections ascendantes des noyaux auditifs inférieurs de tronc cérébral convergent dans le colliculus inférieur (IC), le centre de cerveau moyen de la voie auditive centrale. Cela comprend les projections du noyau cochléaire (CN)18,19, la plupart du complexe olivaire supérieur (SOC)20, et le dorsal (DNLL) et ventral (VNLL) noyaux du lemniscus latéral21. En outre, une grande projection descendante du cortex auditif se termine dans l’IC18,19,20,21,22, et les neurones IC eux-mêmes synapse largement dans les lobes locaux et contralatéraux de l’IC23. L’entremêlement d’axones provenant de nombreuses sources a rendu difficile la sonde des circuits IC à l’aide de la stimulation électrique24. En conséquence, même si les neurones de l’IC effectuent des calculs importants pour la localisation sonore et l’identification de la parole et d’autres sons de communication25,26, l’organisation des circuits neuronaux dans l’IC est largement inconnue. Nous avons récemment identifié les neurones VIP comme la première classe de neurones moléculairement identifiables dans l’IC27. Les neurones VIP sont des neurones stellates glutamatergiques qui projettent à plusieurs cibles à longue portée, y compris le thalamus auditif et colliculus supérieur. Nous sommes maintenant en mesure de déterminer les sources et la fonction des entrées locales et à longue portée aux neurones VIP et de déterminer comment ces connexions de circuit contribuent au traitement du son.

Le protocole présenté ici est conçu pour étudier les apports synaptiques aux neurones VIP dans l’IC des souris, en particulier de l’IC contralatéral et le DCN (Figure 1). Le protocole peut être facilement adapté à différentes sources d’entrée, un type de neurone différent ou une région différente du cerveau tout à fait. Nous montrons également que ChrimsonR est une canalrhodopsine rouge-décalée efficace pour la cartographie à longue distance de circuit dans le tronc cérébral auditif. Cependant, nous démontrons que ChrimsonR est fortement activé par la lumière bleue, même à faible intensité, et donc, pour combiner ChrimsonR avec Chronos dans des expériences CRACM bicolores, des contrôles prudents doivent être utilisés pour empêcher l’activation croisée de ChrimsonR.

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Protocol

Obtenir l’approbation du Comité local de soins et d’utilisation des animaux en établissement (IACUC) et adhérer aux lignes directrices des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures de ce protocole ont été approuvées par l’IACUC de l’Université du Michigan et étaient conformes aux lignes directrices des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparations chirurgicales

  1. Effectuer des chirurgies dans des conditions aseptiques. Autoclave/stériliser tous les outils et matériaux de chirurgie avant la chirurgie. Portez une robe de chirurgie et un masque pour la chirurgie.
  2. Assainiz la zone de chirurgie (vaporiser et essuyer avec 70% d’éthanol), et placez des rideaux stériles de serviette pour couvrir la zone de chirurgie.
  3. Préparer la cage de récupération. Enlever la literie de la cage pour limiter le risque d’asphyxie. Placez un coussin chauffant sous la cage. Fournir une source de nourriture et d’eau.
  4. Tirez un capillaire en verre pour le nanoinjecteur sur un puller pipette. La chaleur intense du filament de chauffage pendant le processus de traction stérilisera le capillaire en verre. Couper ou casser la pointe pour obtenir une ouverture d’environ 5 m de diamètre.
  5. Léguez la pointe capillaire à un angle d’environ 30 degrés pour améliorer la pénétration des tissus et réduire l’engorgement. Remblayez le capillaire avec de l’huile minérale et insérez-le dans un injecteur de nanolitres.
  6. Obtenir un aliquot de la rAAV de channelrhodopsin-encodage souhaitée et diluer au tter désiré utilisant le PBS stérile.
    REMARQUE : Nous avons constaté que les rAAV de sérotype 1 fonctionnent bien pour la transfection des noyaux auditifs de tronc cérébral. Plus précisément, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (blue light-activated channelrhodopsin) et rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (red-shifted channelrhodopsin), qui sont disponibles à partir de dépôts accessibles au public et les cœurs vectoriels, rendement constant des niveaux d’expression élevés et du bon trafic axonal à longue portée de canalrhodopsines nécessaires aux expériences du CRACM.
  7. Suivez les instructions de l’injecteur pour remplir le capillaire avant avec 1-3 L de rAAV en PBS stérile.

2. Chirurgie

  1. Mettre l’animal dans une chambre d’induction et induire l’anesthésie avec 3% d’isoflurane dans l’oxygène livré via un vaporisateur d’isoflurane calibré. Observez la souris jusqu’à ce que la respiration devienne profonde et lente et qu’un réflexe de pincement des orteils soit absent, environ 3-5 min.
  2. Transférer l’animal dans un cadre stéréotaxique. Sécurisez la tête de l’animal en mettant sa bouche sur une barre de palais avec un masque d’anesthésie à gaz et en positionnant des barres d’oreilles non perforantes dans les deux canaux auditifs.
  3. Insérez une sonde de température rectale et allumez le contrôleur de température homéostatique.
  4. Appliquer une pommade ophtalmique pour empêcher les yeux de se dessécher.
  5. Administrer un analgésique préventif (p. ex., injection sous-cutanée de 5 mg/kg de carprofène).
  6. Ajuster l’isoflurane à 1-2,5%, selon la profondeur de l’état anesthésié. Surveillez la température, la respiration et la couleur des muqueuses au moins toutes les 15 minutes pendant l’intervention.
  7. Raser le cuir chevelu avec des tondeuses électriques. Préparer aseptiquement le cuir chevelu avec trois écouvillons alternés de povidone-iode et 70% d’éthanol.
  8. Faire une incision dans le cuir chevelu le long de la ligne médiane en commençant entre les oreilles et en continuant rostral aux yeux, en exposant les sutures lambda et bregma. Poussez la peau sur le côté et retirez le périosteume de l’os exposé si nécessaire.
  9. Marquer la suture lambda avec un marqueur chirurgical stérile, positionner la pointe du nanoinjecteur de sorte qu’il est juste toucher lambda, et zéro les coordonnées micromanipulateur. Utilisez la pointe nanoinjecteur et le micromanipulateur pour mesurer la différence d’altitude entre les sutures lambda et bregma. Ajuster la hauteur de la barre de bouche pour amener lambda et bregma à moins de 100 m de hauteur.
  10. Cartographiez le site d’injection à l’aide de la pointe nanoinjecteur et du système de coordonnées micromanipulateurs et marquez le site à l’aide d’un marqueur chirurgical stérile. Pour injecter l’IC ou le DCN des souris P21-P30, utilisez des coordonnées par rapport à la suture lambda, comme le montre le tableau 1. Notez que la profondeur Z dans nos coordonnées est mesurée à partir de la surface du crâne à lambda.
  11. Utilisez une perceuse micromotrice avec une bavure stérile de 0,5 mm pour effectuer une craniotomie au-dessus du site d’injection.
  12. Pour assurer une transfection large des neurones dans le noyau cible, faire des injections à différentes profondeurs dans le tissu(tableau 1, coordonnées Z), et, dans le cas de plus grandes régions du cerveau comme l’IC, faire des injections au cours de deux pénétrations ou plus à différentes coordonnées X et Y(tableau 1, pénétration ic droite 1 et pénétration IC droit 2).
  13. Effectuer des injections. Pour les injections d’IC, déposez 20 nL de virus dans des intervalles de 250 m le long de l’axe Z (profondeur d’injection) entre 2 250 et 1750 m de profondeur. Pour les injections de DCN, déposez 20 nL de virus à une profondeur de 4 750 m et 4 550 m, respectivement.
  14. Après l’injection à chaque coordonnées Z, attendez 2-3 min avant de déplacer l’injecteur à la prochaine coordonnées Z. Cela donnera le temps au virus de se diffuser loin du site d’injection, ce qui réduira la probabilité que le virus soit aspiré dans le tractus d’injection lorsque le nanoinjecteur sera repositionné.
  15. Après la dernière injection dans une pénétration, attendre 3-5 min avant de rétracter nanoinjecteur du cerveau.
  16. Lorsque le nanoinjecteur est retiré du cerveau entre les pénétrations et entre les animaux, éjecter un petit volume de virus de la pointe pour vérifier que la pointe n’a pas obstrué.
  17. Après les injections, utiliser du PBS stérile pour mouiller les bords coupés du cuir chevelu, puis déplacer doucement la peau vers la ligne médiane. Fermez la plaie avec de simples sutures interrompues à l’aide de sutures en nylon 6-0 (0,7 métrique).
  18. Appliquer 0,5-1 ml de gel de lidocaïne de 2% sur la plaie.
  19. Retirez les barres d’oreille et la sonde de température, éteignez l’isoflurane, retirez la souris de la barre du palais et transférez-la dans la cage de récupération.
  20. Surveillez la récupération de près. Une fois que l’animal est complètement éveillé, se déplaçant, et ne montrant aucun signe de douleur ou de détresse, transférez-le de nouveau dans sa cage et retournez la cage au vivarium.
  21. Si des chirurgies seront effectuées sur plusieurs animaux en une journée, utilisez un stérilisateur à perles chaudes pour assainir les outils de chirurgie et forer la bavure avant la prochaine chirurgie.

3. Suivi chirurgical

  1. Vérifiez les animaux tous les jours pour vérifier la fermeture des plaies, l’infection ou des signes de douleur ou de détresse au cours des 10 prochains jours, en adhérant aux lignes directrices de l’établissement en matière de soins aux animaux.
  2. Attendez 3-4 semaines avant d’utiliser les animaux dans des expériences pour permettre l’expression optimale des channelrhodopsines.

4. Préparation de tranche de cerveau et confirmation de la cible d’injection

  1. Pour le CRACM, utiliser des tranches de cerveau préparées de façon aigue à partir d’animaux transfectés dans des expériences d’électrophysiologie in vitro standard, décrites ici brièvement (voir Goyer et al., 2019 pour une description plus détaillée27).
  2. Préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) contenant (en mM): 125 NaCl, 12,5 D-glucose, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,5 CaCl2, 1 MgSO4. Bulle ACSF à un pH de 7,4 avec 5% CO2 dans 95% O2.
  3. Effectuez toutes les étapes suivantes, y compris l’électrophysiologie in vitro, dans la quasi-obscurité ou la lumière rouge pour limiter l’activation des channelrhodopsines.
  4. Anesthésiez profondément la souris avec l’isoflurane et la décapitez rapidement. Disséquez le cerveau rapidement dans un ACSF de 34 oC.
  5. Couper les tranches coronales (200-250 m) contenant l’IC en ACSF à 34 oC avec un microtome vibrant et incuber les tranches à 34 oC pendant 30 min dans une chambre de retenue remplie d’ACSF bouillonné de 5% de CO2 à 95% O2. Après l’incubation, conserver les tranches à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour les enregistrements.
  6. Si la cible d’injection n’était pas l’IC, couper des tranches coronales supplémentaires de la région du cerveau injectée et vérifier la transfection du noyau cible sous un microscope à fluorescence. S’il n’y a pas de transfection dans le noyau cible ou de transfection supplémentaire dans différentes régions du cerveau, ne continuez pas l’expérience.

5. In Vitro Recording et CRACM Expérience

REMARQUE : Pour fournir la stimulation optique de Chronos et de ChrimsonR, nous utilisons des LED couplées au port d’épifluorescence du microscope. Cependant, les lasers peuvent être utilisés au lieu de LED. Si vous utilisez des lasers, obtenez l’approbation préalable des responsables de la sécurité des établissements et suivez les lignes directrices appropriées pour une utilisation sécuritaire au laser.

  1. Tirez des électrodes du verre borosilicate à une résistance de 3,5 à 4,5 M. La solution interne d’électrode devrait contenir (en mM) : 115 K-gluconate, 7,73 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 phosphocreatine, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, complété par 0,1% de biocytine (w/v), pH ajusté à 7,3 avec KOH et osmolality à 290 mOs/kgucrose.
  2. Pour faire des enregistrements, utilisez des méthodes standard de pince de correction. Placer la tranche dans une chambre d’enregistrement sous un microscope droit à stade fixe et perfuser continuellement avec l’ACSF à 2 ml/min. Conduire des enregistrements près de la température physiologique (34-36 oC).
  3. Patch neurones sous contrôle visuel à l’aide d’un amplificateur de pince de patch approprié. Correct pour la résistance de série, la capacité de pipette et le potentiel liquide de jonction.
  4. Pendant les enregistrements de cellules entières, activez Chronos en livrant de brèves impulsions (1-5 ms) de 470 nm de lumière ou ChrimsonR par de brèves impulsions de 580 nm de lumière grâce à des LED disponibles dans le commerce. Déterminer le seuil d’activation de l’opsine et utiliser un protocole de stimulation minimal pour obtenir des potentiels postsynaptiques. En général, utilisez la durée de stimulation la plus courte qui suscite un PSP, et fixez la puissance optique à 120% de la puissance de seuil requise pour obtenir PSPs.
  5. Pour confirmer que les changements enregistrés dans le potentiel membranaire sont en effet des entrées synaptiques dans le neurone, les antagonistes standard pour les récepteurs postsynaptiques excitateurs/inhibiteurs peuvent être lavés pendant l’expérience. Pour étudier différentes contributions des récepteurs à un PSP (p. ex. récepteurs NMDA vs AMPA), les antagonistes des récepteurs appropriés peuvent être lavés. Pour chaque antagoniste des récepteurs, les effets des médicaments doivent s’inverser après le lavage.
  6. Utilisez la latence, la nervosité et la fiabilité des PSP pour confirmer que les entrées synaptiques activées par la lumière proviennent de l’activation directe et optique des synapses sur le neurone enregistré, par opposition à l’activation des synapses exprimant la nérhodopsine sur une intervention neurone qui synapses sur le neurone enregistré. En général, faible latence (lt;2 ms), faible nervosité (écart standard de 1 ms en latence) et grande fiabilité (-gt;50%) indiquer une connexion synaptique directe de la channelrhodopsine exprimant le neurone presynaptic au neurone enregistré.

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Representative Results

Nous avons croisé des souris VIP-IRES-Cre(Viptm1(cre)Zjh/J) et Ai14 Cre-reporter souris (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) pour générer la progéniture F1 dans laquelle les neurones VIP expriment la protéine fluorescente tdTomato. F1 progéniture de l’un ou l’autre sexe ont été utilisés, le jour postnatal âgé (P) 21 à P70. Au total, 22 animaux ont été utilisés dans cette étude.

Injection stéréotaxique d’AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH dans le ic droit de VIP-IRES-Cre x Ai14 souris en utilisant les coordonnées montrées dans le tableau 1 a abouti à une forte expression Chronos-EGFP dans le ic droit (Figure 2A). L’inspection visuelle de la fluorescence Chronos-EGFP a indiqué que la plupart des somata s’étiquetant dans l’IC droit étaient situés dans le noyau central de l’IC (ICc), mais les somatas étiquetés étaient parfois également présents dans le cortex dorsal de l’IC (ICd) et occasionnellement dans le cortex latéral de l’IC (IClc). Le ciblage et l’étendue de la transfection doivent être vérifiés pour chaque animal utilisé dans une expérience, car l’expression des canalrhodopsines dans les régions non ciblées peut conduire à de faux positifs. Pour obtenir une expression plus large ou plus restreinte de Chronos, la quantité de virus déposéainsi que les coordonnées stéréotaxiques peuvent être facilement ajustées pour atteindre le résultat souhaité.

Injection stéréotaxique d’AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH dans le DCN (voir coordonnées dans le tableau 1) des souris VIP-IRES-Cre x Ai14 ont entraîné une forte transfection des neurones DCN ( Figure2B). Pour confirmer la transfection sélective du DCN, le tronc cérébral de chaque animal doit être tranché pour vérifier que l’expression DE l’EGFP était présente et limitée à la DCN. S’il n’y a pas de transfection ou s’il y a une expression considérable de l’EGFP dans le nerf auditif ou le VCN, les enregistrements ne doivent pas être exécutés. À l’aide des coordonnées indiquées dans le tableau 1 avec un volume d’injection total de 40 nL, l’expression Chronos-EGFP sera limitée à la DCN dans la plupart des cas. Les axones étiquetés EGFP étaient présents dans le CDI gauche (contralatéral) 3 semaines après l’injection pour les sites d’injection IC et DCN(figure 2A droite, 2B à droite).

Pour tester le trafic à long terme de ChrimsonR, AAV1. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH a été injecté dans le DCN droit des souris VIP-IRES-Cre x Ai14, en utilisant les mêmes coordonnées qu’avec les injections de Chronos. L’injection de ChrimsonR a conduit à une forte expression dans le DCN, avec la fluorescence tdTomato visible dans les cellules et les fibres (Figure 3A). Dans l’ICc contralatéral, les fibres fortement étiquetées avec tdTomato étaient clairement visibles après 3 semaines, démontrant la capacité de trafic à longue portée de la construction ChrimsonR-tdTomato lorsqu’elles sont injectées dans des noyaux de tronc cérébral auditifs (Figure 3B). L’activation optique de ChrimsonR a suscité des EPSP dans les neurones VIP IC (Figure 3C), ce qui indique que ChrimsonR est un outil utile pour les expériences CRACM à longue portée lorsque les paramètres expérimentaux exigent l’utilisation de la lumière rouge au lieu de la lumière bleue. Cependant, nous avons constaté que ChrimsonR était facilement activé avec la lumière bleue, montrant le même seuil pour l’activation de la lumière bleue que Chronos (Figure 4). La sensibilité de ChrimsonR à la lumière bleue signifie qu’il faut faire un soin particulier pour faire la distinction entre les entrées transfectées avec ChrimsonR ou Chronos dans le même animal13.

Lorsque vous ciblez des enregistrements aux neurones VIP dans l’IC contralatéral (gauche) après des injections dans l’IC droit, les flashs de lumière bleue ont suscité des potentiels postsynaptiques excitateurs (EPSP) ou des potentiels postsynaptiques inhibiteurs (IPSP). Cela confirme les projections commissural aux neurones VIP. Pour analyser séparément les EPSP et les IPSP commis, nous avons utilisé des antagonistes des récepteurs pour bloquer les IPSP pendant les enregistrements EPSP, et vice versa. Les PSE et les PSE représentatifs enregistrés au cours des expériences du CRACM sont présentés à la figure 5. Les IPSP ont été observés dans 6 des 12 neurones VIP ICc testés. Les IPSP étaient petits (1,53 mV à 0,96 mV) et présentaient une cinétique modérée. Les temps d’augmentation de 10 à 90 % des IPSP étaient de 7,8 ms à 2,1 m, les demi-largeurs étaient de 15,1 ms à 6,8 ms, et les constantes de temps de décomposition étaient de 32,4 ms à 17,0 ms(figure 5A, à gauche). Les IPSP ont été médiatisés par les récepteurs GABAA, car ils ont été bloqués par un gabazine de 5 MM, un antagoniste des récepteurs GABAA (Figure 5A, droite; n - 6). Des EPSP ont été observés dans 11 des 27 neurones VIP ICc testés. Les EPSP étaient également petits (1,52 mV et 1,08 mV) et présentaient une cinétique modérée. Les temps d’augmentation de 10 à 90 % des PSE étaient de 8,3 ms à 4,3 m, les demi-largeurs étaient de 19,6 ms à 7,6 m, et les constantes de temps de décomposition étaient de 43,5 ms à 16,8 ms(figure 5B « Contrôle »). Les EPSP ont été négociés par les récepteurs AMPA et NMDA. Application de 50 M D-AP5, un antagoniste des récepteurs NMDA, réduction de la demi-largeur du PSEEP (14,3 ms à 4,7 ms, p - 0,006) et tendait à réduire le temps de montée (6,3 ms à 1,6 m, p - 0,09 mV), le temps de décomposition constant (30,6 ms à 7,3 ms, p - 0,06), et l’amplitude EPSP (1,38 à 0,33 mV, p . ANOVA pour les mesures répétées avec Le test post-hoc de Tukey). L’application de 10 M NBQX, un antagoniste des récepteurs DE l’AMPA, a bloqué le reste du PEEP(figure 5B « AP5 et NBQX »).

Enregistrements de neurones VIP dans l’ICc gauche après injections DCN a révélé EPSPs évoqué par des éclairs de lumière bleue, confirmant les entrées synaptiques de la DCN aux neurones VIP dans l’IC. Des expériences de CRACM de DCN ont été menées avec des bloqueurs GABAergic et glycinergic dans le bain pour bloquer les IPSP spontanés. Nous avons constaté que 2-5 ms impulsions de lumière bleue a suscité EPSPs dans 19 des 25 neurones testés. Les EPSP évoqués par la lumière présentaient des amplitudes modérées (2,85 mV et 2,98 mV) et des temps d’élévation relativement lents (4,2 ms à 1,3 m), des demi-largeurs (20,6 ms à 14,4 m) et des constantes de temps de décomposition (22,0 ms à 6,7 ms) (n - 6 cellules, données non montrées).

Tous les PSP évoqués par Chronos ou ChrimsonR activation ont été obtenus d’une manière tout ou non et n’a pas l’échelle de leur amplitude avec l’augmentation de la puissance optique (données non affichées). Cependant, ce résultat dépend du nombre et de la physiologie des synapses transfectées fournissant l’entrée à un neurone particulier et est donc susceptible de varier en fonction de la combinaison particulière de la projection axonale et du type de neurone à l’étude.

Figure 1
Figure 1 : sites d’injection de rAAV et configuration expérimentale. (A) Site d’injection et installation expérimentale pour étudier les projections commissurales. Gauche : Une construction de rAAV (par exemple, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH) est injectée dans le IC droit et les enregistrements ciblés sont exécutés dans l’IC contralatéral. Droite : Pendant les enregistrements de pinces de correction, les fibres chrono-transfectées sont excitées avec la lumière bleue pour obtenir des potentiels postsynaptiques. (B) Installation d’injection et d’expérimentation pour étudier les projections à long terme de DCN à IC. Gauche : La construction ChrimsonR est injectée dans le DCN droit et des enregistrements ciblés sont réalisés dans l’IC contralatéral. Droite : Pendant les enregistrements de pinces de correction, les fibres ChrimsonR-transfected sont excitées avec la lumière rouge pour enregistrer ChrimsonR a évoqué des potentiels postsynaptic. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Expression Chronos-EGFP après injections dans IC et DCN. (A) Gauche : Image de tranche coronale IC montrant les neurones VIP étiquetés tdTomato dans toute l’expression IC (magenta) et Chronos-EGFP dans somata localisée aux sites d’injection dans le ic droit (vert). Droite : Image de grossissement plus élevée montrant un neurone VIP enregistré (blanc-vert) dans l’IC contralatéral au site d’injection. Les ponctuas vertes sont Chronos-EGFP exprimant des projections de l’IC contralatéral. (B) Image de la tranche coronale de tronc cérébral montrant l’expression de Chronos-EGFP dans le DCN après l’injection de rAAV-Chronos-EGFP. Gauche : Image du DCN, montrant des fibres DCN transfectées et EGFP-positives entrant dans la stria acoustique dorsal. Milieu : Image de grossissement plus élevée montrant les corps cellulaires transfectés Chronos dans le DCN. Droite : Expression Chronos-EGFP dans les fibres et les terminaux dans l’IC contralatéral à partir de projections DCN-IC à longue portée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Expression chrimsonR-tdTomato dans les projections de DCN et de DCN à l’IC. (A) Image d’une tranche coronale de tronc cérébral d’une souris dans laquelle le Droit DCN a été injecté avec rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH. Gauche : Image de l’expression de ChrimsonR dans le DCN droit. Droite : Image de grossissement plus élevée de DCN droit montrant la transfection forte des neurones avec ChrimsonR. (B) Image de grossissement élevé des axones DCN transfectés ChrimsonR dans l’IC. (C) Optogenetically évoqué EPSPs enregistré à partir d’un neurone VIP dans le contralatéral IC à la rAAV-ChrimsonR injecté DCN. Les traces originales sont indiquées en gris clair et l’EPSP moyen est en rouge. La boîte orange indique le moment de l’impulsion lumineuse de 590 nm. Barres d’échelle de 20 ms/0,5 mV. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Activation de ChrimsonR par de faibles niveaux de lumière bleue. (A) Activation des Chronos dans les projections commissurales par des impulsions de 470 nm de lumière bleue. Haut : Traces originales (gris clair) et moyennes (cyan) des IPSP pilotés par Chronos, évoquées à une puissance optique légèrement au-dessus du seuil d’activation chronos (les barres d’échelle montrent 20 ms/0,5 mV). En bas : Relation entre la puissance optique à 470 nm et la probabilité d’observer un PSP chronorémateur. (B) Activation de ChrimsonR avec 470 nm de lumière bleue. Haut : Traces originales (gris clair) et moyennes (rouges) d’EPSP pilotés par ChrimsonR, évoquées avec une lumière bleue de 470 nm à la même puissance optique utilisée en A, en haut (les barres d’échelle montrent 20 ms/0,5 mV). En bas : Relation entre la puissance optique à 470 nm et la probabilité d’observer un PSP piloté par ChrimsonR. Notez que le seuil d’activation de la lumière bleue des PSP ChrimsonR était identique au seuil pour obtenir les PSP Chronos. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Caractérisation des PSP lumineux des synapses commissaires sur les neurones VIP. Le bon IC a été injecté avec rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH et les enregistrements ont été faits à partir de neurones VIP dans le Contralateral ICc. (A) Les IPSP évoqués par des optogénétiquements ont été évoqués par des flashs de lumière bleue de 2 à 5 ms (à gauche) tandis que les EPSP ont été bloqués par 10 M NBQX et 50 M D-AP5. Les IPSP ont été supprimés par la gabazine (à droite). (B) Les EPSP évoqués par des optogénétiquements ont été évoqués par des flashs de lumière bleue de 2 à 5 ms (à gauche) tandis que les IPSP ont été bloqués par une strychnine de 1 M et une gabazine de 5 m. L’aménagement de 50 M D-AP5 a considérablement réduit la constante de temps de demi-largeur et de décomposition des EPSP évoqués par la lumière (au milieu). L’arrivée de 10 M NBQX a aboli le reste du PEEp (à droite). Les traces originales en A et B sont représentées en gris clair, et les moyennes allant jusqu’à 50 traces individuelles sont représentées en noir. De Goyer et coll., 2019. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

X (latéral) Y (caudal) Z (profondeur)
Pénétration IC droite 1 1 000 m -900 m 2 250-1500 m
(250 incréments de m)
Pénétration IC droite 2 1 250 m -900 m 2 250-1750 m
(250 incréments de m)
DCN droit 2 155 m -1325 m 4 750 m, 4 550 m

Tableau 1 : Coordonnées stéréotaxiques pour les injections de rAAV dans IC et DCN. Toutes les coordonnées sont relatives à lambda en m. Les coordonnées Z sont mesurées à partir de la surface dorsale du crâne à lambda.

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Discussion

Nous avons constaté que CRACM est une technique puissante pour identifier et caractériser les entrées synaptiques à longue portée aux neurones de la souris IC. En suivant le protocole détaillé ici, nous avons réalisé une transfection robuste des neurones dans le DCN et IC ainsi que le trafic axonal fiable de Chronos et ChrimsonR aux terminaux synaptiques dans l’IC. En outre, nous avons démontré que cette technique permet la mesure et l’analyse des événements postsynaptiques, y compris l’amplitude PSP, demi-largeur, temps de décomposition, et la pharmacologie des récepteurs. Notre expérience suggère que cette approche peut être facilement adaptée pour effectuer des expériences de cartographie de circuits fonctionnels dans tout le tronc cérébral auditif et au-delà.

Dans l’ensemble, la spécificité de la cartographie des circuits optogénétiques offre un net avantage sur la stimulation électrique des axones. Les transfections virales offrent la capacité de restreindre spatialement et moléculairement l’expression des channelrhodopsines à une population ciblée de neurones présynaptiques. En revanche, la stimulation électrique ne peut pas différencier entre les axones provenant de différents noyaux présynaptiques lorsque ces axones sont mélangés, comme c’est le cas dans la plupart des régions du cerveau. La stimulation électrique peut également initier des pointes orthodromicques et antidromic, compliquant davantage des choses quand un site de stimulation distal contient des axones provenant des neurones situés près du site d’enregistrement.

Pour assurer une expression stable et un bon trafic axonal d’un canalrhodopsine, le choix du bon vecteur viral et sérotype est primordial. Nous avons constaté que l’expression stable de Chronos dans les neurones IC a été réalisée avec un sérotype 1 rAAV comprenant une construction chronos ou ChrimsonR combinée avec un élément régulateur posttranscriptionnel d’hépatite de marmotte (WPRE) et hormone de croissance bovine (BGH) signal de polyadenylation. rAAV serotype 5 n’a pas produit d’opsines fonctionnelles dans l’IC, mais était fonctionnel dans le DCN (données non montrées). La validation rigoureuse des coordonnées d’injection pour chaque expérience et de s’assurer que l’expression opsine est limitée à la région ciblée du cerveau est tout aussi important. Une identification significative des intrants n’est possible que si l’expression de l’opsine est soigneusement vérifiée et documentée pour chaque expérience.

La construction rAAV1.ChrimsonR utilisée dans le protocole ci-dessus a donné une expression stable et un bon trafic axonal de la protéine, même dans les projections à longue portée de la DCN à l’IC (Figure 3). Cela fait de ChrimsonR une opsine appropriée pour la cartographie de circuit (à longue portée). Une opsine rouge décalée comme ChrimsonR peut être utile si les paramètres expérimentaux nécessitent une pénétration de la lumière profondément dans le tissu, mais l’expérimentateur doit être conscient que toutes les opsines actuellement disponibles à décalé rouge montrent une certaine activation croisée avec la lumière bleue. Bien que certaines études aient fait valoir que ChrimsonR et Chronos peuvent être activés séparément6,14,16, nos données suggèrent qu’il faut faire très attention à cette approche. Un rapport récent détaille des méthodes supplémentaires qui devraient être utilisées si vous tentez de séparer les opsines à décalées rouges de Chronos13. Par conséquent, lors de l’utilisation de ChrimsonR et Chronos dans deux expériences DE CRACM de couleur, des expériences de contrôle soigneusement conçues doivent être exécutées pour assurer une séparation claire de l’activation de l’opsine bleue et rouge décalée.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une bourse de recherche Deutsche Forschungsgemeinschaft (GO 3060/1-1, numéro de projet 401540516, à la DG) et la subvention des National Institutes of Health R56 DC016880 (MTR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH Addgene 59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Addgene 59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) Jackson Laboratory stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-B4
Carproject (carprofen) Henry Schein Animal Health 59149
Drummond glas capillaries Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3 Drummond Scientific Company 3-300-207
Electrode beveler Sutter Instrument FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures Ethicon local pharmacy
Fixed stage microscope any n/a
Gas anesthesia head holder David Kopf Instruments 933-B
General surgery tools Fine Science Tools N/A
Golden A5 pet clipper Oster 078005-010-003
Heating pad Custom build N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system Patterson Scientific 78917760
Hot bead sterilizer Steri 250 Inotech IS-250
Iodine solution 10% MedChoice local pharmacy
Isoflurane vaporizer Patterson Scientific 07-8703592
Lidocain topical jelly 2% Akorn local pharmacy
Micro motor drill 1050 Henry Schein Animal Health 7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm Fine Science Tools 19007-05
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears Akorn local pharmacy
P-1000 electrode puller Sutter Instrument P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software any n/a
Portable anethesia machine Patterson Scientific 07-8914724
Small animal steroetaxic frame David Kopf Instruments 930-B
Standard chemicals local vendors N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes Dynarex 4410
Surgical marker Fine Science Tools 18000-30
Temperature controller Custom build N/A
Vibratome any n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) Jackson Laboratory stock #010908
Water bath any n/a

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References

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Neurosciences Numéro 156 Cartographie des circuits assistés par Channelrhodopsin optogénétique Chronos ChrimsonR colliculus inférieur tronc cérébral auditif
Cartographie à long terme de circuit assisté e de Channelrhodopsine des neurones colliculus inférieurs avec des Channelrhodopsins bleus et rouges
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Goyer, D., Roberts, M. T. Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (156), e60760, doi:10.3791/60760 (2020).

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