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Neuroscience

Langstrecken-Channelrhodopsin-unterstützte Schaltungszuordnung von minderwertigen Colliculus-Neuronen mit blauen und rot verschiebten Channelrhodopsinen

Published: February 7, 2020 doi: 10.3791/60760
Automatic Translation
1, 1
1Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

Summary

Channelrhodopsin-assisted circuit mapping (CRACM) ist eine Präzisionstechnik zur funktionellen Kartierung von neuronalen Langzeitprojektionen zwischen anatomisch und/oder genetisch identifizierten Gruppen von Neuronen. Hier beschreiben wir, wie man CRACM nutzt, um auditive Hirnstammverbindungen zu kartieren, einschließlich der Verwendung eines rot verschobenen Opsins, ChrimsonR.

Abstract

Bei der Untersuchung neuronaler Schaltkreise besteht eine Standardbeschränkung des In-vitro-Patchklemmenansatzes darin, dass Axone aus mehreren Quellen häufig miteinander vermischt werden, was es schwierig macht, Eingänge aus einzelnen Quellen mit elektrischer Stimulation zu isolieren. Durch die Verwendung von Channelrhodopsin-Unterstützter Schaltungszuordnung (CRACM) kann diese Einschränkung nun jedoch überwunden werden. Hier berichten wir über eine Methode zur Verwendung von CRACM zur Kartierung aufsteigender Inputs von unteren auditiven Hirnstammkernen und kommissarischen Inputs einer identifizierten Klasse von Neuronen im unteren Colliculus (IC), dem Mittelhirnkern des Hörsystems. Im IC sind lokale, kommissarische, aufsteigende und absteigende Axone stark miteinander verflochten und daher nicht mit elektrischer Stimulation zu unterscheiden. Durch Injektion eines viralen Konstrukts zur Expression eines Channelrhodopsins in einen präsynaptischen Kern, gefolgt von Patch-Klemmenaufzeichnung, um das Vorhandensein und die Physiologie von kanalrhodopsin-exezierenden synaptischen Eingängen, Projektionen aus einer bestimmten Quelle zu charakterisieren einer bestimmten Population von IC-Neuronen kann mit zelltypspezifischer Genauigkeit zugeordnet werden. Wir zeigen, dass dieser Ansatz sowohl mit Chronos, einem blaulichtaktivierten Channelrhodopsin, als auch mit ChrimsonR, einem rot verschiebbaren Channelrhodopsin, funktioniert. Im Gegensatz zu früheren Berichten aus dem Vorderhirn stellen wir fest, dass ChrimsonR robust auf die Axone der dorsalen Cochlea-Kern-Hauptneuronen eingeschleust wird, was darauf hindeutet, dass ChrimsonR ein nützliches Werkzeug für CRACM-Experimente im Hirnstamm sein kann. Das hier vorgestellte Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen der intrakraniellen Virusinjektionschirurgie, einschließlich stereotaxic-Koordinaten für die Ausrichtung von Injektionen in den dorsalen Cochlea-Kern und IC von Mäusen, und wie man die Aufzeichnung ganzer Zell-Patch-Klemmen kombiniert. mit Channelrhodopsin-Aktivierung zur Untersuchung von Fernprojektionen auf IC-Neuronen. Obwohl dieses Protokoll auf die Charakterisierung von akustischen Eingängen in den IC zugeschnitten ist, kann es leicht angepasst werden, um andere langfristige Projektionen im auditiven Hirnstamm und darüber hinaus zu untersuchen.

Introduction

Synaptische Verbindungen sind entscheidend für die Funktion des neuronalen Schaltkreises, aber die genaue Topologie und Physiologie von Synapsen innerhalb neuronaler Schaltkreise ist oft schwierig, experimentell zu erforschen. Dies liegt daran, dass die elektrische Stimulation, das traditionelle Werkzeug der zellulären Elektrophysiologie, wahllos Axone in der Nähe der Stimulationsstelle aktiviert, und in den meisten Hirnregionen verflechten sich Axone aus verschiedenen Quellen (lokal, aufsteigend und/oder absteigend). Jedoch, durch die Verwendung von channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)1,2, kann diese Einschränkung jetzt3überwunden werden. Channelrhodopsin (ChR2) ist ein lichtaktivierter, kationselektiver Ionenkanal, der ursprünglich in der grünen Alge Chlamydomonas reinhardtiigefunden wurde. ChR2 kann durch blaues Licht einer Wellenlänge von etwa 450-490 nm aktiviert werden, wodurch die Zelle durch Kationenzustrom depolarisiert wird. ChR2 wurde zuerst von Nagel und Kollegen4in Xenopus oocytes beschrieben und ausgedrückt. Kurz darauf drückten Boyden und Kollegen5 ChR2 in Säugetierneuronen aus und zeigten, dass sie Lichtimpulse verwenden konnten, um das Spiking auf einer Millisekunden-Zeitskala zuverlässig zu steuern, wodurch Aktionspotentiale von 10 ms nach Aktivierung von ChR2 mit blauem Licht induzieren. Optogenetische Kanäle mit noch schnellerer Kinetik wurden in letzter Zeit gefunden (z.B. Chronos6).

Der grundlegende Ansatz für ein CRACM-Experiment besteht darin, eine Population von vermeintlichen präsynaptischen Neuronen mit einem rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) zu transfetieren, das die genetische information für ein Kanalrhodopsin trägt. Die Transfektion von Neuronen mit rAAV führt zur Expression des codierten Kanalrhodopsins. Typischerweise wird das Channelrhodopsin mit einem fluoreszierenden Protein wie GFP (Green Fluorescent Protein) oder tdTomato (ein rotes fluoreszierendes Protein) markiert, so dass die Transfektion von Neuronen im Zielbereich leicht mit Fluoreszenz-Bildgebung bestätigt werden kann. Da rAAVs nicht pathogen sind, ein geringes Entzündliches Potential und eine langanhaltende Genexpressionhaben 7,8, sind sie zu einer Standardtechnik geworden, um Kanalrhodopsine an Neuronen zu liefern. Wenn nach der Transfektion einer vermeintlichen präsynaptischen Population von Neuronen die Aktivierung eines Channelrhodopsins durch Lichtblitze postsynaptische Potenziale oder Ströme in den Zielneuronen auslöst, ist dies ein Beweis für eine axonale Verbindung vom transfizierten Kern zur aufgezeichneten Zelle. Da abgetrennte Axone in Gehirnscheibenexperimenten durch Channelrhodopsin-Aktivierung zum Neurotransmitter angetrieben werden können, können Kerne, die außerhalb der akuten Scheibe liegen, aber Axone in die postsynaptische Hirnregion senden, mit CRACM identifiziert werden. Die Stärke dieser Technik besteht darin, dass die Konnektivität und Physiologie identifizierter synaptischer Langzeiteingänge direkt untersucht werden kann.

Zusätzlich zu Denrromobpsinen, die durch blaues Licht erregbar sind, haben die Ermittler vor kurzem mehrere rot verschobene Kanalrhodopsine9,10, einschließlich Chrimson und seine schnellere analoge ChrimsonR, die beide mit rotem Licht von 660 nm6angeregt sind identifiziert. Rot versetzte Opsine sind von Interesse, weil rotes Licht besser in Gewebe eindringt als blaues Licht, und rotes Licht kann eine geringere Zytotoxizität als blaues Lichthaben 10,11,12. Rot verschiebte Kanalrhodopsine eröffnen auch die Möglichkeit von dualen CRACM-Experimenten, bei denen die Konvergenz von Axonen aus verschiedenen Kernen auf demselben Neuron in einem Experiment6,13,14getestet werden kann. Allerdings zeigen aktuelle rot-versetzte Opsine oft unerwünschte Kreuzaktivierung mit blauem Licht15,16,17, was zwei Farbexperimente schwierig macht. Darüber hinaus haben einige Berichte darauf hingewiesen, dass ChrimsonR einem begrenzten axonalen Handel unterzogen wird, was es schwierig machen kann, ChrimsonR für CRACM-Experimente16,17zu verwenden.

Fast alle aufsteigenden Projektionen aus den unteren auditiven Hirnkernen konvergieren im unteren Colliculus (IC), dem Mittelhirnhub des zentralen Auditwegs. Dazu gehören Projektionen aus dem Cochlea-Kern (CN)18,19, die meisten der überlegenen Olivary-Komplex (SOC)20, und die dorsalen (DNLL) und ventralen (VNLL) Kerne der seitlichen lemniscus21. Zusätzlich endet eine große absteigende Projektion aus dem auditiven Kortex im IC18,19,20,21,22und IC Neuronen selbst Synapsen breit innerhalb der lokalen und kontralateralen Lappen des IC23. Die Vermischung von Axonen aus vielen Quellen hat es schwierig gemacht, IC-Schaltungen mit elektrischer Stimulation zu sonden24. Obwohl Neuronen im IC Berechnungen durchführen, die für die Klanglokalisierung und die Identifizierung von Sprach- und anderen Kommunikationsgeräuschen wichtigsind,ist die Organisation neuronaler Schaltkreise im IC weitgehend unbekannt. Wir haben vor kurzem VIP-Neuronen als die erste molekular identifizierbare Neuronenklasse im IC27identifiziert. VIP-Neuronen sind glutamaterge stellate Neuronen, die auf mehrere Langstreckenziele projizieren, einschließlich des auditiven Thalamus und des überlegenen Colliculus. Wir sind nun in der Lage, die Quellen und die Funktion lokaler und langfristiger Eingänge in VIP-Neuronen zu bestimmen und zu bestimmen, wie diese Schaltungsverbindungen zur Klangverarbeitung beitragen.

Das hier vorgestellte Protokoll ist auf die Untersuchung synaptischer Inputs für VIP-Neuronen im IC von Mäusen zugeschnitten, insbesondere aus dem kontralateralen IC und dem DCN (Abbildung 1). Das Protokoll kann leicht an verschiedene Eingabequellen, einen anderen Neuronentyp oder eine andere Hirnregion insgesamt angepasst werden. Wir zeigen auch, dass ChrimsonR ein effektives rot-versetztes Channelrhodopsin für Langstrecken-Schaltungs-Mapping im auditiven Hirnstamm ist. Wir zeigen jedoch, dass ChrimsonR durch blaues Licht auch bei niedrigen Intensitäten stark aktiviert wird, und daher muss, um ChrimsonR mit Chronos in zweifarbigen CRACM-Experimenten zu kombinieren, sorgfältige Kontrollen eingesetzt werden, um eine Kreuzaktivierung von ChrimsonR zu verhindern.

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Protocol

Lassen Sie sich vom lokalen Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung (IACUC) genehmigen und halten Sie sich an die NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden von der University of Michigan IACUC genehmigt und entsprachen den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Chirurgische Präparate

  1. Führen Sie Operationen unter aseptischen Bedingungen durch. Autoklav/sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge und Materialien vor der Operation. Tragen Sie OP-Kleid und Maske für die Operation.
  2. Sanitisieren Sie den Operationsbereich (sprühen und wischen Sie mit 70% Ethanol ab), und legen Sie sterile Handtuchvorhänge, um den Operationsbereich zu bedecken.
  3. Bereiten Sie den Wiederherstellungskäfig vor. Entfernen Sie Käfigbetten, um das Erstickungsrisiko zu begrenzen. Legen Sie ein Heizkissen unter den Käfig. Geben Sie eine Nahrungs- und Wasserquelle an.
  4. Ziehen Sie eine Glaskapillare für den Nanoinjektor auf einen Pipettenzieher. Die intensive Hitze des Heizfadens während des Ziehens wird die Glaskapillare sterilisieren. Schneiden oder brechen Sie die Spitze ab, um eine Öffnung von ca. 5 m Durchmesser zu erhalten.
  5. Verschrägen Sie die Kapillarspitze auf einen Winkel von ca. 30°, um die Gewebedurchdringung zu verbessern und Verstopfungen zu reduzieren. Füllen Sie die Kapillare mit Mineralöl und fügen Sie sie in einen Nanoliter-Injektor ein.
  6. Erhalten Sie ein Aliquot des gewünschten Channelrhodopsin-kodierenden rAAV und verdünnen Sie den gewünschten Titer mit sterilem PBS.
    HINWEIS: Wir haben festgestellt, dass Serotyp 1 rAAVs gut für die Transfektion von auditiven Hirnstammkernen funktionieren. Insbesondere rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (blaulichtaktiviertes Channelrhodopsin) und rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (rot versetztes Channelrhodopsin), die über öffentlich zugängliche Repositories und Vektorkerne erhältlich sind, konstant ergeben die hohe Expression und gute Langstrecken axonalen Handel mit Kanalrhodopsinen für CRACM-Experimente benötigt.
  7. Befolgen Sie die Injektoranweisungen, um die Kapillare mit 1-3 l rAAV in sterilem PBS zu füllen.

2. Chirurgie

  1. Setzen Sie das Tier in eine Induktionskammer und induzieren Sie Anästhesie mit 3% Isofluran in Sauerstoff, der über einen kalibrierten Isofluranverdampfer zukommt. Beobachten Sie die Maus, bis die Atmung tief und langsam wird und ein Zehenkniffreflex fehlt, ca. 3-5 min.
  2. Übertragen Sie das Tier auf einen stereotaxic Rahmen. Sichern Sie den Kopf des Tieres, indem Sie den Mund auf einen Gaumenbalken mit einer Gasanästhesiemaske legen und nicht perforierende Ohrstangen in beiden Gehörgängen positionieren.
  3. Setzen Sie einen rektalen Temperaturfühler ein und schalten Sie den hausostatischen Temperaturregler ein.
  4. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf, um zu verhindern, dass die Augen austrocknen.
  5. Präemptive analgetische (z. B. subkutane Injektion von 5 mg/kg Carprofen).
  6. Stellen Sie Isofluran auf 1-2,5% ein, entsprechend der Tiefe des anästhesierten Zustands. Überwachen Sie Temperatur, Atmung und Farbe der Schleimhäute mindestens alle 15 Minuten während des Eingriffs.
  7. Rasieren Kopfhaut mit elektrischen Clippers. Aseptisch die Kopfhaut mit drei abwechselnden Tupfern Povidon-Jod und 70% Ethanol zubereiten.
  8. Machen Sie einen Schnitt in der Kopfhaut entlang der Mittellinie beginnend zwischen den Ohren und fortsetzung rostral zu den Augen, die Lambda und Bregma Nähte aussetzen. Schieben Sie die Haut zur Seite und entfernen Sie bei Bedarf Periost aus dem exponierten Knochen.
  9. Markieren Sie die Lambda-Nähte mit einem sterilen chirurgischen Marker, positionieren Sie die Spitze des Nanoinjektors so, dass sie nur Lambda berührt, und null die Mikromanipulator-Koordinaten. Verwenden Sie die Nanoinjektorspitze und den Mikromanipulator, um den Höhenunterschied zwischen Lambda- und Bregma-Nähten zu messen. Passen Sie die Höhe des Gaumenbalkens an, um Lambda und Bregma auf einen Höhenunterschied von 100 m zu bringen.
  10. Ordnen Sie die Injektionsstelle mit dem Nanoinjektorspitze und dem Mikromanipulator-Koordinatensystem zu und markieren Sie die Stelle mit einem sterilen chirurgischen Marker. Um den IC oder DCN von P21-P30-Mäusen zu injizieren, verwenden Sie Koordinaten relativ zur Lambdanahtur, wie in Tabelle 1dargestellt. Beachten Sie, dass die Z-Tiefe in unseren Koordinaten von der Oberfläche des Schädels bei Lambda gemessen wird.
  11. Verwenden Sie einen Mikromotorbohrer mit einem sterilen 0,5 mm Bohrgrat, um eine Kraniotomie über der Injektionsstelle durchzuführen.
  12. Um eine breite Transfektion von Neuronen im Zielkern zu gewährleisten, machen Sie Injektionen in verschiedenen Tiefen in das Gewebe(Tabelle 1,Z-Koordinaten) und, im Falle größerer Hirnregionen wie dem IC, Injektionen im Laufe von zwei oder mehr Penetrationen an verschiedenen X- und Y-Koordinaten(Tabelle 1, Rechte IC-Penetration 1 und Rechte IC-Penetration 2).
  13. Führen Sie Injektionen durch. Bei IC-Injektionen lagern Sie 20 nL Virus in Intervallen von 250 m entlang der Z-Achse (Injektionstiefe) zwischen 2.250 m und 1750 m Tiefe ab. Bei DCN-Injektionen 20 nL Virus in einer Tiefe von 4.750 m bzw. 4.550 m ablagern.
  14. Warten Sie nach der Injektion an jeder Z-Koordinate 2-3 min, bevor Sie den Injektor auf die nächste Z-Koordinate verschieben. Dies wird zeitgeben, damit das Virus von der Injektionsstelle wegdiffusiumen kann, wodurch die Wahrscheinlichkeit verringert wird, dass das Virus im Injektionstrakt angesaugt wird, wenn der Nanoinjektor neu positioniert wird.
  15. Nach der letzten Injektion in eine Penetration, warten Sie 3-5 min, bevor Sie Deninjektor aus dem Gehirn zurückziehen.
  16. Wenn der Nanoinjektor zwischen Penetrationen und zwischen Tieren aus dem Gehirn entfernt wird, werfen Sie ein kleines Virusvolumen aus der Spitze aus, um zu überprüfen, ob die Spitze nicht verstopft ist.
  17. Nach Injektionen verwenden Sie steriles PBS, um die Schnittkanten der Kopfhaut zu befeuchten und dann die Haut sanft zurück in Richtung Mittellinie zu bewegen. Schließen Sie die Wunde mit einfachen unterbrochenen Nähten mit 6-0 (0,7 metrische) Nylonnähten.
  18. 0,5-1 ml 2% Lidocaingel auf die Wunde auftragen.
  19. Entfernen Sie Ohrstangen und Temperatursonde, schalten Sie Isofluran aus, entfernen Sie die Maus aus der Gaumenstange und übertragen Sie sie in den Erholungskäfig.
  20. Überwachen Sie die Wiederherstellung genau. Sobald das Tier vollständig wach ist, sich bewegt und keine Anzeichen von Schmerz oder Bedrängnis zeigt, überträgt es es zurück in seinen Käfig und gibt den Käfig ins Vivarium zurück.
  21. Wenn Operationen an mehreren Tieren an einem Tag durchgeführt werden, verwenden Sie einen heißen Perlensterilisator, um chirurgische Werkzeuge zu desinzipieren und Grat vor der nächsten Operation zu bohren.

3. Chirurgische Sukto-Up

  1. Überprüfen Sie die Tiere in den nächsten 10 Tagen täglich auf Wundverschluss, Infektionen oder Anzeichen von Schmerzen oder Schmerzen, und halten Sie sich an die Tierpflegerichtlinien der Einrichtung.
  2. Warten Sie 3-4 Wochen, bevor Sie Tiere in Experimenten verwenden, um eine optimale Expression der Kanalrhodopsine zu ermöglichen.

4. Gehirn-Slice-Vorbereitung und Bestätigung des Injektionsziels

  1. Verwenden Sie für CRACM akut präparierte Hirnscheiben von transfizierten Tieren in Standard-Elektrophysiologieexperimenten, die hier nur kurz beschrieben werden (siehe Goyer et al. 2019 für eine ausführlichere Beschreibung27).
  2. Herstellung künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) mit (in mM): 125 NaCl, 12.5 D-Glucose, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1.5 CaCl2, 1 MgSO4. Blase ACSF auf einen pH-Wert von 7,4 mit 5% CO2 in 95% O2.
  3. Führen Sie alle folgenden Schritte, einschließlich der In-vitro-Elektrophysiologie, bei Dunkelheit oder rotem Licht durch, um die Aktivierung von Kanalrhodopsinen zu begrenzen.
  4. Die Maus mit Isoflurane tief anästhesieren und schnell enthaupten. Sezieren Sie das Gehirn schnell in 34 °C ACSF.
  5. Koronakrale (200-250 m) mit dem IC in 34 °C ACSF mit einem vibrierenden Mikrotome schneiden und die Scheiben bei 34 °C 30 min in einer mit ACSF gefüllten Haltekammer mit 5% CO2 in 95% O2inkubieren. Nach der Inkubation Scheiben bei Raumtemperatur aufbewahren, bis sie für Aufnahmen verwendet werden.
  6. Wenn das Injektionsziel nicht der IC war, schneiden Sie zusätzliche koronale Scheiben der injizierten Hirnregion und überprüfen Sie die Transfektion des Zielkerns unter einem Fluoreszenzmikroskop. Wenn es keine Transfektion im Zielkern oder zusätzliche Transfektion in verschiedenen Hirnregionen gibt, setzen Sie das Experiment nicht fort.

5. In Vitro Recording und CRACM Experiment

HINWEIS: Um eine optische Stimulation von Chronos und ChrimsonR zu ermöglichen, verwenden wir LEDs, die an den Epifluoreszenzport des Mikroskops gekoppelt sind. Anstelle von LEDs können jedoch Laser verwendet werden. Wenn Sie Laser verwenden, sollten Sie die vorherige Genehmigung von institutionellen Sicherheitsbeamten einholen und die entsprechenden Richtlinien für den sicheren Lasereinsatz befolgen.

  1. Ziehen Sie Elektroden aus Borosilikatglas auf einen Widerstand von 3,5-4,5 Mio. € . Die Elektroden-Innenlösung sollte (in mM) enthalten: 115 K-Gluconat, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 Phosphokreatin, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, ergänzt mit 0,1% Biocytin (w/v), pH-Just auf 7,3 mit KOH und Osmolalität auf 290 mOsm/kg mit Saccharose.
  2. Verwenden Sie für Aufnahmen Standard-Patch-Clamp-Methoden. Legen Sie die Scheibe in eine Aufnahmekammer unter einem festen Bühnenmikroskop und durchdringen Sie kontinuierlich mit ACSF bei 2 ml/min. Führen Sie Aufnahmen bei physiologischer Temperatur (34-36 °C) durch.
  3. Patch Neuronen unter visueller Kontrolle mit einem geeigneten Patch Klemmverstärker. Korrekt für Serienwiderstand, Pipettenkapazität und Flüssigkeitsknotenpotenzial.
  4. Aktivieren Sie Chronos bei Gesamtzellenaufnahmen, indem Sie kurze Impulse (1-5 ms) von 470 nm Licht oder ChrimsonR durch kurze Impulse von 580 nm Licht durch handelsübliche LEDs liefern. Bestimmen Sie den Schwellenwert der Opsinaktivierung und verwenden Sie ein minimales Stimulationsprotokoll, um postsynaptische Potenziale zu entlocken. Verwenden Sie im Allgemeinen die kürzeste Stimulusdauer, die einen PSP auslöst, und stellen Sie die optische Leistung auf 120 % der Schwellenleistung fest, die erforderlich ist, um PSPs auszulösen.
  5. Um zu bestätigen, dass die aufgezeichneten Veränderungen des Membranpotenzials tatsächlich synaptische Inputs in das Neuron sind, können Standardantagonisten für erregende/hemmende postsynaptische Rezeptoren während des Experiments eingewaschen werden. Um verschiedene Rezeptorbeiträge zu einem PSP zu untersuchen (z.B. NMDA vs AMPA-Rezeptoren), können geeignete Rezeptorantagonisten eingewaschen werden. Für jeden Rezeptor-Antagonisten sollten Arzneimittelwirkungen nach dem Auswaschen umkehren.
  6. Verwenden Sie die Latenz, den Jitter und die Zuverlässigkeit von PSPs, um zu bestätigen, dass lichtaktivierte synaptische Eingänge von der direkten, optischen Aktivierung von Synapsen auf dem aufgezeichneten Neuron stammen, im Gegensatz zur Aktivierung von Kanalrhodopsin-exezierenden Synapsen an einem dazwischen liegenden Neuron, das synapsiert auf dem aufgezeichneten Neuron. Im Allgemeinen niedrige Latenz (<2 ms), geringer Jitter (<1 ms Standardabweichung in der Latenz) und hohe Zuverlässigkeit (>50%) eine direkte synaptische Verbindung vom Kanalrhodopsin, das präsynaptische Sneuron ausdrückt, auf das aufgezeichnete Neuron hinweisen.

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Representative Results

Wir kreuzten VIP-IRES-Cre Mäuse (Viptm1(cre)Zjh/J) und Ai14 Cre-reporter Mäuse (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) zur Generierung von F1-Nachkommen, bei denen VIP-Neuronen das fluoreszierende Protein tdTomato ausdrücken. F1-Nachkommen beider Geschlechter wurden verwendet, im Alter von 21 bis P70. Insgesamt wurden in dieser Studie 22 Tiere verwendet.

Stereotaxie Injektion von AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH in den rechten IC von VIP-IRES-Cre x Ai14 Mäusen unter Verwendung von Koordinaten in Tabelle 1 führte zu einem starken Chronos-EGFP-Ausdruck im rechten IC (Abbildung 2A). Die Sichtprüfung der Chronos-EGFP-Fluoreszenz ergab, dass sich die meisten der im rechten IC beschrifteten Somata im zentralen Kern des IC (ICc) befanden, aber mit somata manchmal auch im dorsalen Kortex des IC (ICd) und gelegentlich im lateralen Kortex des IC (IClc) vorhanden waren. Die Ausrichtung und das Ausmaß der Transfektion sollten für jedes In einem Experiment verwendete Tier überprüft werden, da die Expression von Kanalrhodopsinen in nicht zielgerichteten Regionen zu falschen Positivmeldungen führen kann. Um eine breitere oder eingeschränktere Expression von Chronos zu erreichen, können die Menge des abgelagerten Virus sowie die stereotaxic-Koordinaten leicht angepasst werden, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen.

Stereotaxie Injektion von AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH in die DCN (siehe Koordinaten in Tabelle 1) von VIP-IRES-Cre x Ai14 Mäusen führte zu einer starken Transfektion von DCN-Neuronen (Abbildung 2B). Um die selektive Transfektion des DCN zu bestätigen, sollte der Hirnstamm jedes Tieres in Scheiben geschnitten werden, um zu überprüfen, ob die EGFP-Expression vorhanden und auf den DCN beschränkt war. Wenn es keine Transfektion gibt oder wenn es einen erheblichen Ausdruck von EGFP im Hörnerv oder VCN gibt, sollten keine Aufnahmen durchgeführt werden. Unter Verwendung der in Tabelle 1 dargestellten Koordinaten mit einem Gesamtinjektionsvolumen von 40 nL ist die Chronos-EGFP-Expression in den meisten Fällen auf den DCN beschränkt. EGFP-markierte Axone waren im linken (kontralateralen) ICc 3 Wochen nach der Injektion sowohl für IC- als auch DCN-Injektionsstellen vorhanden(Abbildung 2A rechts, 2B rechts).

Um den Fernhandel von ChrimsonR, AAV1, zu testen. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH wurde in den rechten DCN von VIP-IRES-Cre x Ai14 Mäusen mit den gleichen Koordinaten wie bei Chronos-Injektionen injiziert. Die ChrimsonR-Injektion führte zu einer starken Expression im DCN, wobei die tdTomato-Fluoreszenz in Zellen und Fasern sichtbar ist (Abbildung 3A). Im kontralateralen ICc waren Fasern, die stark mit tdTomato gekennzeichnet waren, nach 3 Wochen deutlich sichtbar, was die Fähigkeit des ChrimsonR-tdTomato-Konstrukts demonstriert, wenn es in auditive Hirnstammkerne injiziert wird (Abbildung 3B). Die optische Aktivierung von ChrimsonR löste EPSPs in IC-VIP-Neuronen aus (Abbildung 3C), was darauf hindeutet, dass ChrimsonR ein nützliches Werkzeug für lange CRACM-Experimente ist, wenn die experimentellen Parameter die Verwendung von rotem Licht anstelle von blauem Licht erfordern. Wir stellten jedoch fest, dass ChrimsonR problemlos mit blauem Licht aktiviert wurde und die gleiche Schwelle für die Aktivierung des blauen Lichts wie Chronos(Abbildung 4) zeigte. Die Empfindlichkeit von ChrimsonR gegenüber blauem Licht bedeutet, dass besonders darauf geachtet werden muss, zwischen Eingängen zu unterscheiden, die mit ChrimsonR oder Chronos im selben Tier transfiziert sind13.

Bei der Ausrichtung von Aufnahmen auf VIP-Neuronen im kontralateralen (links) ICc nach Injektionen in den rechten IC, blaues Licht blinkt erregende postsynaptische Potenziale (EPSPs) oder hemmende postsynaptische Potenziale (IPSPs). Dies bestätigt die kommatole Projektionen auf VIP-Neuronen. Um kommissarische EPSPs und IPSPs getrennt zu analysieren, verwendeten wir Rezeptorantagonisten, um IPSPs während EPSP-Aufnahmen zu blockieren und umgekehrt. Repräsentative EPSPs und IPSp, die während CRACM-Experimenten aufgezeichnet wurden, sind in Abbildung 5dargestellt. IPSPs wurden bei 6 von 12 getesteten ICc VIP Neuronen beobachtet. IPSPs waren klein (1,53 mV bei 0,96 mV) und hatten eine moderate Kinetik. Die Anstiegszeiten von IPSPs um 10 - 90 % betrugen 7,8 ms bei 2,1 ms, die Halbbreiten 15,1 ms bei 6,8 ms und die Zerfallszeitkonstanten 32,4 ms bei 17,0 ms(Abbildung 5A, links). IPSPs wurden vonGABA-A-Rezeptoren vermittelt, da sie durch 5 M Gabazin, einen GABA-A-Rezeptor-Antagonisten, blockiert wurden(Abbildung 5A, rechts; n = 6). EPSPs wurden in 11 von 27 getesteten ICc VIP-Neuronen beobachtet. Die EPSPs waren ebenfalls klein (1,52 mV bei 1,08 mV) und hatten eine moderate Kinetik. Die Anstiegszeiten von EPSPs um 10 - 90 % betrugen 8,3 ms bei 4,3 ms, die Halbbreiten 19,6 ms bei 7,6 ms und die Zerfallszeitkonstanten 43,5 ms bei 16,8 ms(Abbildung 5B "Kontrolle"). EPSPs wurden von AMPA- und NMDA-Rezeptoren vermittelt. Anwendung von 50 'M D-AP5, ein NMDA-Rezeptor-Antagonist, reduzierte EPSP-Halbbreite (14,3 ms bei 4,7 ms, p = 0,006) und tendierte zur Verkürzung der Anstiegszeit (6,3 ms bei 1,6 ms, p = 0,09), Zerfallszeitkonstant (30,6 ms bei 7,3 ms, p = 0,06) und EPSP-Amplitude (1,38 x 0,33 mV, p = 0,105; ANOVA für wiederholte Messungen mit Tukey Post-hoc-Test). Die Anwendung von 10 M NBQX, einem AMPA-Rezeptor-Antagonisten, blockierte den Rest des EPSP(Abbildung 5B "+ AP5 & NBQX").

Aufnahmen von VIP-Neuronen im linken ICc nach DCN-Injektionen ergaben EPSPs, die durch blaue Lichtblitze evoziert wurden und synaptische Eingaben vom DCN zu VIP-Neuronen im IC bestätigten. DCN CRACM-Experimente wurden mit GABAergen und glycinergen Blockern im Bad durchgeführt, um spontane IPSPs zu blockieren. Wir fanden heraus, dass 2-5 ms Impulse von blauem Licht EPSPs in 19 von 25 getesteten Neuronen hervorriefen. Lichtbeschworene EPSPs wiesen moderate Amplituden (2,85 mV bei 2,98 mV) und relativ langsame Anstiegszeiten (4,2 ms bei 1,3 ms), Halbbreiten (20,6 ms bei 14,4 ms) und Zerfallszeitkonstanten (22,0 ms bei 6,7 ms) (n = 6 Zellen, nicht gezeigte Daten) auf.

Alle PSPs, die durch Chronos oder ChrimsonR-Aktivierung evoziert werden, wurden in einer All-or-none-Manier ausgelöst und skalierten ihre Amplitude nicht mit zunehmender optischer Leistung (Daten nicht angezeigt). Dieses Ergebnis hängt jedoch von der Anzahl und Physiologie der transfizierten Synapsen ab, die Input für ein bestimmtes Neuron liefern, und ist daher wahrscheinlich je nach der untersuchten Kombination von axonaler Projektion und Neurontyp variieren.

Figure 1
Abbildung 1: rAAV-Injektionsstellen und Versuchsaufbau. (A) Injektionsstelle und Versuchsaufbau zur Untersuchung von Kommissarurprojektionen. Links: Ein rAAV-Konstrukt (z.B. rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH) wird in den rechten IC injiziert und gezielte Aufnahmen im kontralateralen IC durchgeführt. Rechts: Bei Patch-Klemmenaufnahmen werden Chronos-transfikierte Fasern mit blauem Licht angeregt, um postsynaptische Potenziale zu erwecken. (B) Injektionsstelle und Versuchsaufbau zur Untersuchung von Langstreckenprojektionen von DCN zu IC. Links: Das ChrimsonR-Konstrukt wird in den rechten DCN injiziert und gezielte Aufnahmen werden im kontralateralen IC durchgeführt. Rechts: Bei Patch-Klemmenaufnahmen werden ChrimsonR-transfikierte Fasern mit rotem Licht angeregt, um ChrimsonR evozierte postsynaptische Potenziale aufzunehmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Chronos-EGFP-Expression nach Injektionen in IC und DCN. (A) Links: Bild der koronaren IC-Scheibe, die tdTomato-markierte VIP-Neuronen im gesamten IC (Magenta) und Chronos-EGFP-Ausdruck in Somata zeigt, lokalisiert zu den Injektionsstellen im rechten IC (grün). Rechts: HöhereVergrößerungsbild, das ein aufgezeichnetes VIP-Neuron (weiß-grün) im IC kontralateral zur Injektionsstelle zeigt. Grüne Puncta sind Chronos-EGFP, die Projektionen aus dem kontralateralen IC ausdrücken. (B) Bild der koronaren Hirnstammscheibe mit Chronos-EGFP-Expression im DCN nach rAAV-Chronos-EGFP-Injektion. Links: Bild des DCN, das transfizierte DCN- und EGFP-positive Fasern zeigt, die in die dorsalen akustischen Stria eindringen. Mitte: HöhereVergrößerungsbild, das Chronos-transfizierte Zellkörper im DCN zeigt. Rechts: Chronos-EGFP-Expression in Fasern und Klemmen im kontralateralen IC aus DcN-IC-Weitbereichsprojektionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: ChrimsonR-tdTomato-Expression in den DCN- und DCN-Projektionen zum IC. (A) Bild einer koronaren Hirnstammscheibe einer Maus, in die das rechte DCN mit rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH injiziert wurde. Links: Bild des ChrimsonR-Ausdrucks im rechten DCN. Rechts: HöhereVergrößerung Bild der rechten DCN zeigt starke Transfektion von Neuronen mit ChrimsonR. (B) Bild mit hoher Vergrößerung von ChrimsonR-transfizierten DCN-Axonen im IC. (C) Optogenetisch evozierte EPSPs, die von einem VIP-Neuron im IC kontralateral zum rAAV-ChrimsonR injizierten DCN aufgezeichnet wurden. Originalspuren werden in hellgrau und der durchschnittliche EPSP in Rot dargestellt. Orange Box zeigt Timing von 590 nm Lichtimpuls. Skalenbalken = 20 ms/0,5 mV. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Aktivierung von ChrimsonR durch niedrige swertes blaues Licht. (A) Aktivierung von Chronos in Kommissarurprojektionen durch Impulse von 470 nm blauem Licht. Oben: Originalspuren (hellgrau) und Durchschnittsspuren (Cyan) von Chronos-gesteuerten IPSPs, die bei einer optischen Leistung leicht über dem Schwellenwert für die Chronos-Aktivierung evoziert werden (Skalaleisten zeigen 20 ms/0,5 mV). Unten: Beziehung zwischen optischer Leistung bei 470 nm und der Wahrscheinlichkeit, einen Chronos-evozierten PSP zu beobachten. (B) Aktivierung von ChrimsonR mit 470 nm blauem Licht. Oben: Originalspuren (hellgrau) und Durchschnittliche (rot) von ChrimsonR-getriebenen EPSPs, evoziert mit 470 nm blauem Licht bei gleicher optischer Leistung wie A, top (Skalaleisten zeigen 20 ms/0,5 mV). Unten: Beziehung zwischen optischer Leistung bei 470 nm und der Wahrscheinlichkeit, einen ChrimsonR-gesteuerten PSP zu beobachten. Beachten Sie, dass der Schwellenwert für die Blaulichtaktivierung von ChrimsonR PSPs mit dem Schwellenwert für die Auslösung von Chronos PSPs identisch war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Charakterisierung von lichtbeschworenen PSPs von kommissarischen Synapsen auf VIP-Neuronen. Der rechte IC wurde mit rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH injiziert und Aufnahmen wurden aus VIP-Neuronen im kontralateralen ICc gemacht. (A) Optogenetisch evozierte IPSPs wurden durch 2-5 ms blaue Lichtblitze (links) evoziert, während EPSPs durch 10 M NBQX und 50 M D-AP5 blockiert wurden. IPSPs wurden durch Gabazin (rechts) abgeschafft. (B) Optogenetisch evozierte EPSPs wurden durch 2-5 ms blaue Lichtblitze (links) evoziert, während IPSPs mit 1 'M Strychnin und 5 'M Gabazin blockiert wurden. Das Einwaschen von 50 'M D-AP5 reduzierte die Halbbreite und Zerfallszeitkonstante von lichtbeschworenen EPSPs (Mitte) signifikant. Das Einwaschen von 10 M NBQX hat den verbleibenden EPSP (rechts) abgeschafft. Originalspuren in A und B werden in hellgrau und Durchschnittswerte von bis zu 50 Einzelspuren in Schwarz dargestellt. Aus Goyer et al., 2019. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

X (seitlich) Y (kaudal) Z (Tiefe)
Rechte IC-Penetration 1 1.000 m -900 m 2.250-1500 m
(250 m Inkremente)
Rechte IC-Penetration 2 1.250 m -900 m 2.250-1750 m
(250 m Inkremente)
Rechte DCN 2.155 m -1325 m 4.750 m, 4.550 m

Tabelle 1: Stereotaxie Koordinaten für rAAV-Injektionen in IC und DCN. Alle Koordinaten sind relativ zu Lambda in m. Z-Koordinaten werden von der dorsalen Oberfläche des Schädels bei Lambda gemessen.

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Discussion

Wir haben herausgefunden, dass CRACM eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung und Charakterisierung von synaptischen Langzeitinputs für Neuronen im Maus-IC ist. Nach dem hier beschriebenen Protokoll erreichten wir eine robuste Transfektion von Neuronen im DCN und IC sowie einen zuverlässigen axonalen Handel mit Chronos und ChrimsonR zu synaptischen Terminals im IC. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass diese Technik die Messung und Analyse von postsynaptischen Ereignissen ermöglicht, einschließlich PSP-Amplitude, Halbbreite, Zerfallszeit und Rezeptorpharmakologie. Unsere Erfahrung legt nahe, dass dieser Ansatz leicht angepasst werden kann, um funktionelle Schaltkreis-Mapping-Experimente im gesamten auditiven Hirnstamm und darüber hinaus durchzuführen.

Insgesamt bietet die Spezifität der optogenetischen Schaltungskartierung einen deutlichen Vorteil gegenüber der elektrischen Stimulation von Axonen. Virale Transfektionen bieten die Möglichkeit, die Expression von Channelrhodopsinen räumlich und molekular auf eine gezielte Population präsynaptischer Neuronen zu beschränken. Im Gegensatz dazu kann die elektrische Stimulation nicht zwischen Axonen unterscheiden, die aus verschiedenen präsynaptischen Kernen stammen, wenn diese Axone vermischt werden, wie dies in den meisten Hirnregionen der Fall ist. Elektrische Stimulation kann auch orthodromische und antidromische Spitzen initiieren, was die Situation weiter erschwert, wenn eine distale Stimulationsstelle Axone enthält, die von Neuronen stammen, die sich in der Nähe der Aufnahmestelle befinden.

Um eine stabile Expression und einen guten axonalen Handel mit einem Kanalrhodopsin zu gewährleisten, ist die Wahl des richtigen viralen Vektors und Serotyps von größter Bedeutung. Wir fanden heraus, dass eine stabile Expression von Chronos in IC-Neuronen mit einem Serotyp 1 rAAV einschließlich eines Chronos oder ChrimsonR-Konstrukts in Kombination mit einem woodchuck Hepatitis posttranscriptional regulatorischen Element (WPRE) und Rinderwachstumshormon (BGH) erreicht wurde. Polyadenylierungssignal. rAAV-Serotyp 5 konnte keine funktionellen Opsine im IC erzeugen, war aber im DCN funktionsfähig (Daten wurden nicht angezeigt). Die strenge Validierung der Injektionskoordinaten für jedes Experiment und die Sicherstellung, dass die Opsin-Expression auf die Zielhirnregion beschränkt ist, ist ähnlich wichtig. Eine sinnvolle Identifikation der Eingaben ist nur möglich, wenn die Expression des Opsins für jedes Experiment sorgfältig geprüft und dokumentiert wird.

Das rAAV1.ChrimsonR-Konstrukt, das im obigen Protokoll verwendet wurde, lieferte eine stabile Expression und einen guten axonalen Handel mit dem Protein, selbst bei Weitbereichsprojektionen vom DCN bis zum IC (Abbildung 3). Dies macht ChrimsonR zu einem geeigneten Opsin für (Langstrecken-)Schaltungs-Mapping. Ein rot versetztes Opsin wie ChrimsonR kann nützlich sein, wenn die experimentellen Parameter ein Lichteindringen tief in das Gewebe erfordern, aber der Experimentator muss sich bewusst sein, dass alle derzeit verfügbaren rot versetzten Opsine eine Kreuzaktivierung mit blauem Licht aufweisen. Obwohl einige Studien argumentiert haben, dass ChrimsonR und Chronos separat aktiviert werden können6,14,16, unsere Daten deuten darauf hin, dass bei diesem Ansatz große Vorsicht geboten ist. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht werden weitere Methoden beschrieben, die beim Versuch, rot verschobene Opsins von Chronos13zu trennen, verwendet werden sollten. Daher müssen bei der Verwendung von ChrimsonR und Chronos in zwei Farb-CRACM-Experimenten sorgfältig konzipierte Steuerungsexperimente durchgeführt werden, um eine klare Trennung von blauer und rot versetzter Opsinaktivierung zu gewährleisten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (GO 3060/1-1, Projektnummer 401540516, an die GD) und das Stipendium der National Institutes of Health R56 DC016880 (MTR) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH Addgene 59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Addgene 59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) Jackson Laboratory stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-B4
Carproject (carprofen) Henry Schein Animal Health 59149
Drummond glas capillaries Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3 Drummond Scientific Company 3-300-207
Electrode beveler Sutter Instrument FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures Ethicon local pharmacy
Fixed stage microscope any n/a
Gas anesthesia head holder David Kopf Instruments 933-B
General surgery tools Fine Science Tools N/A
Golden A5 pet clipper Oster 078005-010-003
Heating pad Custom build N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system Patterson Scientific 78917760
Hot bead sterilizer Steri 250 Inotech IS-250
Iodine solution 10% MedChoice local pharmacy
Isoflurane vaporizer Patterson Scientific 07-8703592
Lidocain topical jelly 2% Akorn local pharmacy
Micro motor drill 1050 Henry Schein Animal Health 7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm Fine Science Tools 19007-05
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears Akorn local pharmacy
P-1000 electrode puller Sutter Instrument P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software any n/a
Portable anethesia machine Patterson Scientific 07-8914724
Small animal steroetaxic frame David Kopf Instruments 930-B
Standard chemicals local vendors N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes Dynarex 4410
Surgical marker Fine Science Tools 18000-30
Temperature controller Custom build N/A
Vibratome any n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) Jackson Laboratory stock #010908
Water bath any n/a

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 156 Channelrhodopsin-unterstützte Schaltungskartierung Optogenetik Chronos ChrimsonR minderwertiger Colliculus auditiver Hirnstamm
Langstrecken-Channelrhodopsin-unterstützte Schaltungszuordnung von minderwertigen Colliculus-Neuronen mit blauen und rot verschiebten Channelrhodopsinen
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Goyer, D., Roberts, M. T. Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (156), e60760, doi:10.3791/60760 (2020).

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