Summary
Channelrhodopsin-assisterad krets kartläggning (CRACM) är en precisionsteknik för funktionell kartläggning av långväga neuronala prognoser mellan anatomiskt och / eller genetiskt identifierade grupper av nervceller. Här beskriver vi hur man använder CRACM för att kartlägga auditiva hjärnstammen anslutningar, inklusive användning av en rödskiftad opsin, ChrimsonR.
Abstract
Vid undersökning av neurala kretsar, en standard begränsning av in vitro patch klämma strategi är att axoner från flera källor ofta blandas, vilket gör det svårt att isolera ingångar från enskilda källor med elektrisk stimulering. Men genom att använda channelrhodopsin assisterad krets kartläggning (CRACM), denna begränsning kan nu övervinnas. Här rapporterar vi en metod för att använda CRACM för att kartlägga stigande ingångar från lägre auditiva hjärnstammen kärnor och commissural ingångar till en identifierad klass av nervceller i sämre colliculus (IC), midbrain kärnan i hörselsystemet. I IC, lokala, commissural, stigande och fallande axons är starkt sammanflätade och därför omöjlig att skilja med elektrisk stimulering. Genom att injicera en viral konstruktion för att driva uttryck för en channelrhodopsin i en presynaptisk kärna, följt av patch klämma inspelning för att karakterisera närvaro och fysiologi channelrhodopsin-uttrycker synaptiska ingångar, prognoser från en viss källa till en specifik population av IC nervceller kan mappas med cell typ-specifik noggrannhet. Vi visar att detta tillvägagångssätt fungerar med både Chronos, en blå ljusaktiverad channelrhodopsin, och ChrimsonR, en rödskiftad channelrhodopsin. I motsats till tidigare rapporter från förhjärnan, finner vi att ChrimsonR är robust smugglas ner axons av dorsal cochlear kärnan huvudsakliga nervceller, vilket tyder på att ChrimsonR kan vara ett användbart verktyg för CRACM experiment i hjärnstammen. Protokollet som presenteras här innehåller detaljerade beskrivningar av intrakraniell virusinjektionskirurgi, inklusive stereotaxic koordinater för inriktning injektioner till dorsala cochlear kärnan och IC av möss, och hur man kombinerar hela cell patch klämma inspelning med channelrhodopsin aktivering för att undersöka långväga prognoser till IC nervceller. Även om detta protokoll är skräddarsytt för att karakterisera auditiva ingångar till IC, kan det enkelt anpassas för att undersöka andra långväga prognoser i hörselhjärnstammen och därefter.
Introduction
Synaptiska anslutningar är kritiska till neural kretsfunktion, men den exakta topologi och fysiologi synapser inom neurala kretsar är ofta svåra att sondera experimentellt. Detta beror på att elektrisk stimulering, det traditionella verktyget för cellulär elektrofysiologi, urskillningslöst aktiverar axoner nära stimuleringsplatsen, och i de flesta hjärnregioner, axoner från olika källor (lokala, stigande och/eller fallande) intertwine. Men genom att använda channelrhodopsin assisterad krets kartläggning (CRACM)1,2, denna begränsning kan nu övervinnas3. Channelrhodopsin (ChR2) är en ljusaktiverad, katjon-selektiv jonkanal som ursprungligen hittades i den gröna alga Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan aktiveras med blått ljus av en våglängd runt 450-490 nm, depolarisera cellen genom katjontillströmningen. ChR2 beskrevs först och uttrycktes i Xenopus äggceller av Nagel och kollegor4. Kort därefter uttryckte Boyden och kollegor5 ChR2 i däggdjursnervceller och visade att de kunde använda ljuspulser för att på ett tillförlitligt sätt kontrollera spikning på en millisekundstidsskala, vilket inducerar åtgärdspotentialerna ~ 10 ms efter aktivering av ChR2 med blått ljus. Optogenetiska kanaler med ännu snabbare kinetik har hittats nyligen (t.ex. Chronos6).
Den grundläggande metoden för en CRACM experiment är att transfect en population av förmodade presynaptiska nervceller med en rekombinant adeno-associerade virus (rAAV) som bär den genetiska informationen för en channelrhodopsin. Transfection av nervceller med rAAV leder till uttrycket av den kodade channelrhodopsin. Typiskt är channelrhodopsin märkt med ett fluorescerande protein som GFP (Green Fluorescerande protein) eller tdTomato (ett rött fluorescerande protein), så att transfection av nervceller i målregionen lätt kan bekräftas med fluorescens avbildning. Eftersom rAAVs är icke-patogena, har en låg inflammatorisk potential och långvariga genuttryck7,8, de har blivit en standard teknik för att leverera channelrhodopsins till nervceller. Om, efter transfection av en förmodade presynaptic befolkningen av nervceller, aktivering av en channelrhodopsin genom ljusblinkar framkallar postsynaptiska potentialer eller strömmar i målet nervceller, Detta är ett bevis på en axonal anslutning från den transfected kärnan till den inspelade cellen. Eftersom avhuggna axoner i hjärnan skiva experiment kan drivas att släppa signalsubstansen genom channelrhodopsin aktivering, nuclei som ligger utanför den akuta skiva men skicka axoner i postsynaptic hjärnan regionen kan identifieras med CRACM. Kraften i denna teknik är att anslutningen och fysiologiidentifierade långväga synaptiska ingångar kan undersökas direkt.
Förutom channelrhodopsins som är retliga av blått ljus, utredare har nyligen identifierat flera rödskiftade channelrhodopsins9,10, inklusive Chrimson och dess snabbare analoga ChrimsonR, som båda är glada med rött ljus på ~ 660 nm6. Rödskiftade opsins är av intresse eftersom rött ljus tränger in vävnad bättre än blått ljus, och rött ljus kan ha en lägre cytotoxicitet än blått ljus10,11,12. Rödskiftade channelrhodopsins öppnar också upp möjligheten till dubbla färg CRACM experiment, där konvergensen av axoner från olika kärnor på samma neuron kan testas i ett experiment6,13,14. Men nuvarande rödskiftade opsins uppvisar ofta oönskadkorsaktivering med blått ljus15,16,17, vilket gör två färgexperiment svåra. Dessutom har vissa rapporter visat att ChrimsonR genomgår begränsad axonal handel, vilket kan göra det svårt att använda ChrimsonR för CRACM experiment16,17.
Nästan alla stigande prognoser från den lägre auditiva hjärnstammen kärnor konvergerar i sämre colliculus (IC), midbrain navet i den centrala auditiva vägen. Detta inkluderar projektioner från cochlear kärnan (CN)18,19, de flesta av de överlägsna olivary komplex (SOC)20, och dorsala (DNLL) och ventral (VNLL) kärnor av laterala lemniscus21. Dessutom avslutas en stor fallande projektion från hörselbarken i IC18,19,20,21,22, och IC nervceller själva synapse i stort sett inom den lokala och kontralaterala lober ic ic23. Den sammanblandning av axoner från många källor har gjort det svårt att sondera IC kretsar med elektrisk stimulering24. Som ett resultat, även om nervceller i IC utföra utrop viktigt för ljudlokalisering och identifiering av tal och annan kommunikation ljud25,26, organisationen av neurala kretsar i IC är i stort sett okänd. Vi identifierade nyligen VIP-nervceller som den första molekylärt identifierbara neuron klassen i IC27. VIP nervceller är glutamaterga stellate nervceller som projektet till flera långväga mål, inklusive auditiva talamus och överlägsen colliculus. Vi kan nu bestämma källorna och funktionen hos lokala och långväga ingångar till VIP-nervceller och för att avgöra hur dessa kretsanslutningar bidrar till ljudbehandling.
Protokollet som presenteras här är skräddarsytt för att undersöka synaptiska ingångar till VIP-nervceller i IC av möss, särskilt från den kontralaterala IC och DCN(figur 1). Protokollet kan enkelt anpassas till olika källor till input, en annan neuron typ eller en annan hjärnregion helt och hållet. Vi visar också att ChrimsonR är en effektiv rödskiftad channelrhodopsin för långväga krets kartläggning i hörselhjärnstammen. Vi visar dock att ChrimsonR är starkt aktiverad av blått ljus, även vid låga intensiteter, och därmed för att kombinera ChrimsonR med Chronos i tvåfärgade CRACM-experiment, måste noggranna kontroller användas för att förhindra korsaktivering av ChrimsonR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Få godkännande från den lokala institutionella djurvårds- och användningskommittén (IACUC) och följ NIH:s riktlinjer för vård och användning av försöksdjur. Alla förfaranden i detta protokoll godkändes av University of Michigan IACUC och var i enlighet med NIH riktlinjer för vård och användning av försöksdjur.
1. Kirurgi Preparat
- Utför operationer under aseptiska förhållanden. Autoklav/sterilisera alla operationsverktyg och material före operation. Använd kirurgi klänning och mask för operationen.
- Sanera operationsområdet (spraya och torka av med 70% etanol), och placera sterila handdukdraperier för att täcka kirurgi området.
- Förbered återhämtningsburen. Ta bort bursängkläder för att begränsa risken för kvävning. Sätt en värmeplatta under bur. Ge en mat- och vattenkälla.
- Dra en glaskapillär för nanoinjektorpå en pipett avdragare. Värmeglödtrådens intensiva värme under dragprocessen kommer att sterilisera glaskapillären. Kapa eller bryt av spetsen för att få en öppning med en diameter på cirka 5 μm.
- Avfasa kapillärspetsen till en ca 30° vinkel för att förbättra vävnadspenetrationen och minska igensättning. Fyll kapillären med mineralolja och sätt in i en nanoliterinjektor.
- Skaffa en alikvot av önskad channelrhodopsin-kodning rAAV och späd till önskad titer med steril PBS.
OBS: Vi har funnit att serotyp 1 rAAVs fungerar bra för transfection av auditiva hjärnstammen kärnor. Specifikt rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (blå ljusaktiverad channelrhodopsin) och rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (rödskiftad channelrhodopsin), som är tillgängliga från allmänt tillgängliga förråd och vektorkärnor, konsekvent ge höga uttryck nivåer och bra långväga axonal handel med channelrhodopsins behövs för CRACM experiment. - Följ injektorinstruktioner för att fylla kapillär med 1-3 μl rAAV i steril PBS.
2. Kirurgi
- Sätt djuret i en induktionskammare och inducera anestesi med 3% isofflune i syre som levereras via en kalibrerad isofluran spridare. Observera musen tills andningen blir djup och långsam och en tå nypa reflex är frånvarande, ca 3-5 min.
- Överför djuret till en stereotaxic ram. Säkra djurets huvud genom att sätta munnen på en gomstång med en gasanestesimask och genom att placera icke-perforering öronstänger i båda hörselkanalerna.
- Sätt i en rektaltemperatursond och slå på den homeostatiska temperaturregulatorn.
- Applicera oftalmisk salva för att förhindra att ögonen torkar ut.
- Administrera förebyggande smärtstillande medel (t.ex. subkutan injektion av 5 mg/kg karprofen).
- Justera isofluran till 1-2,5%, beroende på djupet av det sövda tillståndet. Övervaka temperatur, andning och färg på slemhinnor minst var 15:e minut under proceduren.
- Raka hårbotten med elektriska klippare. Aseptiskt förbereda hårbotten med tre alternerande svabbprover av povidone-jod och 70% etanol.
- Gör ett snitt i hårbotten längs mittlinjen börjar mellan öronen och fortsätter rostral aögonen, utsätta lambda och brasuturer. Tryck huden åt sidan och ta bort periosteum från exponerat ben om det behövs.
- Markera lambda sutur med en steril kirurgisk markör, placera spetsen på nanoinjektoren så att den bara vidrör lambda, och noll micromanipulator koordinater. Använd nanoinjektorspetsen och mikromanipulatorn för att mäta skillnaden i höjd mellan lambda och brasuturer. Justera gomstångsstångshöjd för att få lambda och brasom inom ± 100 μm höjdskillnad.
- Kartlägga injektionsstället med hjälp av nanoinjektorspetsen och mikromanipulatorkoordatorkoordinatsystemet och markera platsen med en steril kirurgisk markör. Om du vill injicera IC- eller DCN av P21-P30-möss använder du koordinater i förhållande till lambdasuturen, enligt tabell 1. Observera att Z-djupet i våra koordinater mäts från skallens yta vid lambda.
- Använd en mikromotorborr med en steril 0,5 mm borrgrad för att utföra en kraniotomy över injektionsstället.
- För att säkerställa bred transfection av nervceller i målet kärnan, göra injektioner på olika djup i vävnaden(Tabell 1,Z koordinater), och, när det gäller större hjärnregioner som IC, göra injektioner under loppet av två eller flera penetrationer vid olika X och Y koordinater(Tabell 1,Rätt IC penetration 1 och höger IC penetration 2).
- Utför injektioner. För IC-injektioner, sätt in 20 nL virus i intervall erom 250 μm längs Z-axeln (injektionsdjup) mellan 2 250 μm och 1750 μm djup. För DCN-injektioner, sätt in 20 nL virus på ett djup av 4 750 μm respektive 4 550 μm.
- Efter injektion vid varje Z-koordinat väntar du 2-3 min innan du flyttar injektoren till nästa Z-koordinat. Detta kommer att ge tid för viruset att sprida sig bort från injektionsstället, vilket minskar sannolikheten för att viruset kommer att sugas upp injektionskanalen när nanoinjektorn flyttas.
- Efter sista injektionen i en penetration, vänta 3-5 min innan du drar tillbaka nanoinjektor från hjärnan.
- När nanoinjetorn avlägsnas från hjärnan mellan penetrationer och mellan djur, mata ut en liten mängd virus från spetsen för att kontrollera att spetsen inte har igensatts.
- Efter injektioner, använd steril PBS för att blöta de skurna kanterna på hårbotten och sedan försiktigt flytta huden tillbaka mot mittlinjen. Stäng såret med enkla avbrutna suturer med 6-0 (0,7 metriska) nylonsuturer.
- Applicera 0,5-1 ml av 2% lidokaingel på såret.
- Ta bort öronstänger och temperatursond, stäng av isofluran, ta bort musen från gomstången och överför den till återhämtningsburen.
- Övervaka återställningen noga. När djuret är helt vaken, flytta runt, och visar inga tecken på smärta eller ångest, överföra den tillbaka till sin bur och returnera buren till vivarium.
- Om operationer kommer att utföras på flera djur på en dag, använd en varm bead sterilizer för att sanera kirurgi verktyg och borra burr före nästa operation.
3. Kirurgisk uppföljning
- Kontrollera djur dagligen för sårstängning, infektion eller tecken på smärta eller ångest under de närmaste 10 dagarna, följa institutionens riktlinjer för djurvård.
- Vänta 3-4 veckor innan du använder djur i försök för att möjliggöra optimalt uttryck för kanalrhodopsins.
4. Hjärnan Slice förberedelse och bekräftelse av injektion Target
- För CRACM, använd akut beredda hjärnan skivor från transfected djur i standard in vitro elektrofysiologi experiment, beskrivs här endast kort (se Goyer et al. 2019 för en mer detaljerad beskrivning27).
- Förbered konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) som innehåller (i mM): 125 NaCl, 12,5 D-glukos, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,5 CaCl2, 1 MgSO4. Bubble ACSF till ett pH på 7,4 med 5% CO2 i 95% O2.
- Utför alla följande steg, inklusive elektrofysiologi in vitro, i nästan mörker eller rött ljus för att begränsa aktiveringen av channelrhodopsins.
- Djupt söp mus med isofluran och halshugga den snabbt. Dissekera hjärnan snabbt i ~34 °C ACSF.
- Skär koronaskivor (200-250 μm) som innehåller IC i ~34 °C ACSF med vibrerande mikrotome och inkubera skivorna vid 34 °C i 30 min i en anläggningskammare fylld med ACSF bubblade med 5% CO2 i 95% O2. Efter inkubationsin, lagra skivor i rumstemperatur tills de används för inspelningar.
- Om injektionsmålet inte var IC, skär ytterligare koronala skivor av den injicerade hjärnregionen och kontrollera transfection av målkärnan under ett fluorescensmikroskop. Om det inte finns någon transfection i målkärnan eller ytterligare transfection i olika hjärnregioner, fortsätt inte med experiment.
5. In Vitro Inspelning och CRACM Experiment
OBS: För att ge optisk stimulering av Chronos och ChrimsonR använder vi lysdioder kopplade till mikroskopets epifluorescensport. Lasrar kan dock användas i stället för lysdioder. Om du använder lasrar, få förhandsgodkännande från institutionella säkerhetstjänstemän och följ lämpliga riktlinjer för säker laseranvändning.
- Dra elektroder från borosilikatglas till ett motstånd på 3,5-4,5 MΩ. Den elektriska elektriska inre lösningen bör innehålla (i mM): 115 K-glukonat, 7,73 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 fosfocreatin, 4 MgATP, 0,3 NaGTP, kompletterad med 0,1% biocytin (w /v), pH justerat till 7,3 med KOH och osmolality till 290 mOsm/kg med sackaros.
- För att göra inspelningar, använd vanliga patch klämma metoder. Placera skivan i en inspelningskammare under ett fast steg upprätt mikroskop och kontinuerligt perfuse med ACSF på ~ 2 mL / min. Genomföra inspelningar nära fysiologisk temperatur (~ 34-36 °C).
- Patch nervceller under visuell kontroll med hjälp av en lämplig patch klämma förstärkare. Korrekt för seriemotstånd, pipettkapacitans och vätskekorsningspotential.
- Under hela cellinspelningar, aktivera Chronos genom att leverera korta pulser (1-5 ms) på 470 nm ljus eller ChrimsonR med korta pulser på 580 nm ljus genom kommersiellt tillgängliga lysdioder. Bestäm tröskelvärdet för opsin aktivering och använd en minimal stimulering protokoll för att framkalla postsynaptic potentialer. I allmänhet, använd den kortaste stimulans varaktighet som framkallar en PSP, och ställa in den optiska kraften till 120% av tröskelvärdet makt som krävs för att framkalla PSPs.
- För att bekräfta att de inspelade förändringarna i membranpotentialen verkligen är synaptiska ingångar till neuron, standardantagonister för excitatoriska/hämmande postsynaptiska receptorer kan tvättas in under experimentet. För att undersöka olika receptorbidrag till en PSP (t.ex. NMDA vs AMPA-receptorer) kan lämpliga receptorantagonister tvättas in. För varje receptorantagonist bör läkemedelseffekterna vända efter washout.
- Använd psps latens, jitter och tillförlitlighet för att bekräfta att ljusaktiverade synaptiska ingångar kommer från direkt, optisk aktivering av synapser på den inspelade neuronen, i motsats till aktivering av channelrhodopsin-uttrycker synapser på ett ingripande neuron som synapser på den inspelade neuron. I allmänhet låg latens (<2 ms), låg jitter (<1 ms standardavvikelse i svarstid) och hög tillförlitlighet (>50%) ange en direkt synaptisk anslutning från channelrhodopsin som uttrycker presynaptisk neuron till den inspelade neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi korsade VIP-IRES-Cre möss(Viptm1 (cre)Zjh/J) och Ai14 Cre-reporter möss (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14 (CAG-tdTomato)Hze/J) för att generera F1 avkommor där VIP-nervceller uttrycker fluorescerande protein tdTomato. F1 avkommor av något kön användes, åldrades postnatal dag (P) 21 till P70. Sammanlagt 22 djur användes i denna studie.
Stereotaxic injektion av AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH i rätt IC av VIP-IRES-Cre x Ai14 möss med koordinater som visas i tabell 1 resulterade i starka Chronos-EGFP uttryck i rätt IC(figur 2A). Okulärbesiktning av Chronos-EGFP fluorescens anges att de flesta av somata märkt i rätt IC var belägna i den centrala kärnan i IC (ICc), men märkta somata var ibland också närvarande i dorsala cortex av IC (ICd) och ibland i den laterala cortex av IC (IClc). Transfectionens inriktning och omfattning bör kontrolleras för varje djur som används i ett experiment, eftersom uttryck för kanalrhodopsiner i icke-riktade regioner kan leda till falska positiva. För att uppnå ett bredare eller mer begränsat uttryck för Chronos kan mängden deponerat virus samt stereotaxickoordinaterna enkelt justeras för att uppnå önskat resultat.
Stereotaxic injektion av AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH i DCN (se koordinater i tabell 1) av VIP-IRES-Cre x Ai14-möss resulterade i stark transfection av DCN-nervceller(figur 2B). För att bekräfta selektiv transfection av DCN, hjärnstammen av varje djur bör skivas för att kontrollera att EGFP uttryck var närvarande och begränsad till DCN. Om det inte finns någon transfection eller om det finns ett betydande uttryck för EGFP i hörselnerven eller VCN, bör inspelningar inte utföras. Med hjälp av koordinaterna som visas i tabell 1 med en total injektionsvolym på 40 nL begränsas Chronos-EGFP-uttrycket till DCN i de flesta fall. EGFP-märkta axoner fanns i vänster (kontralateral) ICc 3 veckor efter injektion för både IC och DCN injektionsställen(figur 2A höger, 2B höger).
För att testa den långväga handeln med ChrimsonR, AAV1. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH injicerades i rätt DCN av VIP-IRES-Cre x Ai14 möss, med samma koordinater som med Chronos injektioner. ChrimsonR injektion ledde till starkt uttryck i DCN, med tdTomato fluorescens synlig i celler och fibrer(Figur 3A). I den kontralaterala ICc, fibrer starkt märkta med tdTomato var tydligt synliga efter 3 veckor, visar långväga människohandel kapacitet ChrimsonR-tdTomato konstruktion när injiceras i auditiva hjärnstammen kärnor(Figur 3B). Optisk aktivering av ChrimsonR framkallas EPSPs i IC VIP nervceller(Figur 3C), vilket tyder på att ChrimsonR är ett användbart verktyg för långväga CRACM experiment när de experimentella parametrarna kräver användning av rött ljus i stället för blått ljus. Vi fann dock att ChrimsonR var lätt aktiverad med blått ljus, som visar samma tröskel för blått ljus aktivering som Chronos(figur 4). ChrimsonR:s känslighet för blått ljus innebär att särskild försiktighet måste iakttas för att skilja mellan insatsvaror som transfected med ChrimsonR eller Chronos i samma djur13.
När du riktar inspelningar till VIP-nervceller i den kontralaterala (vänster) ICc efter injektioner i rätt IC, blå ljus blinkar framkallas excitatoriska postsynaptiska potentialer (EPSPs) eller hämmande postsynaptic potentialer (IPSPs). Detta bekräftar commissural prognoser till VIP nervceller. För att analysera commissural EPSPs och IPSPs separat, vi använde receptorantagonister för att blockera IPSPs under EPSP inspelningar, och vice versa. Representativa EPSPs och IPSPs som registrerats under CRACM-experiment visas i figur 5. IPSPs observerades i 6 av 12 testade ICc VIP nervceller. IPSPs var små (1,53 mV ± 0,96 mV) och hade måttligkinetik. De 10- 90% ökningstiderna för IPSPs var 7,8 ms ± 2,1 ms, halvbredder var 15,1 ms ± 6,8 ms, och förfall tiden konstanter var 32,4 ms ± 17,0 ms (figur 5A, vänster). IPSPs medierades av GABA A-receptorer, eftersom de blockerades av 5 μM gabazin, en GABAA-receptorantagonist (figur 5A, höger; n = 6). EPSPs observerades i 11 av 27 ICc VIP nervceller testas. EpsPs var också små (1,52 mV ± 1,08 mV) och hade måttligkinetik. 10- 90% ökningstiderna för EPSPs var 8,3 ms ± 4,3 ms, halvbredder var 19,6 ms ± 7,6 ms, och förfallstidkonstanter var 43,5 ms ± 16,8 ms(figur 5B "Kontroll"). EPSPs medierades av AMPA- och NMDA-receptorer. Tillämpning av 50 μM D-AP5, en NMDA-receptorantagonist, minskad EPSP halvbredd (14,3 ms ± 4,7 ms, p = 0,006) och trendat mot att minska ökningstiden (6,3 ms ± 1,6 ms, p = 0,09), sönderfallstid konstant (30,6 ms ± 7,3 ms, p = 0,06) och EPSP amplitud (1,38 ± 0,33 mV, p = 0,105; ANOVA för upprepade mätningar med Tukey post-hoc test). Tillämpning av 10 μM NBQX, en AMPA-receptorantagonist, blockerade återstoden av EPSP(figur 5B "+ AP5 & NBQX").
Inspelningar av VIP-nervceller i vänster ICc efter DCN injektioner visade EPSPs framkallas av blå ljus blinkar, bekräftar synaptiska ingångar från DCN till VIP nervceller i IC. DCN CRACM experiment genomfördes med GABAergic och glycinergic blockerare i badet för att blockera spontana IPSPs. Vi fann att 2-5 ms pulser av blått ljus framkallas EPSPs i 19 av 25 nervceller testas. Ljusframkallade EPSPs hade måttliga amplituder (2,85 mV ± 2,98 mV) och relativt långsamma restider (4,2 ms ± 1,3 ms), halvbredder (20,6 ms ± 14,4 ms) och förfalltidskonstanter (22,0 ms ± 6,7 ms) (n = 6 celler, data som inte visas).
Alla PSPs framkallas av Chronos eller ChrimsonR aktivering framkallades på ett allt-eller-ingen sätt och inte skala deras amplitud med ökande optisk makt (data visas inte). Detta resultat beror dock på antalet och fysiologin hos de transinfekterade synapser som ger input till en viss neuron och kommer därför sannolikt att variera beroende på den särskilda kombinationen av axonal projektion och neuron typ som undersöks.
Bild 1: rAAV injektionsställen och experimentell installation. (A)Injektionsstället och experimentell installation för att undersöka commissural projektioner. Vänster: En rAAV-konstruktion (t.ex. rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH) injiceras i höger IC och riktade inspelningar utförs i den kontralaterala IC. Höger: Under patch klämma inspelningar, Chronos-transfected fibrer är glada med blått ljus för att framkalla postsynaptic potentialer. (B)Injektionsstället och experimentell installation för att undersöka långdistansprojektioner från DCN till IC. Vänster: ChrimsonR-konstruktionen injiceras i rätt DCN och riktade inspelningar utförs i den kontralaterala IC. Höger: Under patch klämma inspelningar, ChrimsonR-transfected fibrer är glada med rött ljus för att spela in ChrimsonR framkallat postsynaptic potentialer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Chronos-EGFP uttryck efter injektioner i IC och DCN. (A) Vänster: Bild av koronal IC skiva som visar tdTomato-märkta VIP-nervceller i hela IC (magenta) och Chronos-EGFP uttryck i somata lokaliserad till injektionsställeni rätt IC (grön). Höger: Högre förstoringsbild som visar en inspelad VIP neuron (vitgrön) i IC kontralateral till injektionsstället. Grön puncta är Chronos-EGFP uttrycker prognoser från kontralateralIC. (B)Bild av koronal hjärnstamskiva som visar Chronos-EGFP-uttryck i DCN efter rAAV-Chronos-EGFP-injektion. Vänster: Bild av DCN, som visar transfected DCN och EGFP-positiva fibrer in i dorsala akustiska stria. Mitten: Högre förstoringsbild som visar Chronos-transfected cellorgan i DCN. Höger: Chronos-EGFP uttryck i fibrer och terminaler i kontralateralA IC från långväga DCN-IC prognoser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: ChrimsonR-tdTomato uttryck i DCN och DCN prognoser till IC. (A)Bild av en koronal hjärnstam skiva från en mus där rätt DCN injicerades med rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH. Vänster: Bild av ChrimsonR-uttrycket i höger DCN. Höger: Högre förstoringsbild av rätt DCN visar stark transfection av nervceller med ChrimsonR. (B)Hög förstoringsbild av ChrimsonR-transfected DCN axons i IC. (C)Optogenetiskt framkallat EPSPs registreras från en VIP neuron i IC kontralateral till rAAV-ChrimsonR injiceras DCN. Originalspår visas i ljusgrå och genomsnittlig EPSP är i rött. Orange låda indikerar tidpunkten för 590 nm ljuspuls. Skalstänger = 20 ms/0,5 mV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Aktivering av ChrimsonR med låga nivåer av blått ljus. (A)Aktivering av Chronos i commissural projektioner med pulser på 470 nm blått ljus. Överst: Originalspår (ljusgrå) och medelvärde (cyan) av Chronos-drivna IPSPs, framkallas vid en optisk effekt något över tröskeln för Chronos aktivering (skalstänger visar 20 ms/0,5 mV). Botten: Förhållandet mellan optisk effekt på 470 nm och sannolikheten för att observera en Chronos-framkallad PSP. (B)Aktivering av ChrimsonR med 470 nm blått ljus. Överst: Originalspår (ljusgrå) och genomsnittliga (röda) av ChrimsonR-drivna EPSPs, framkallat med 470 nm blått ljus vid samma optiska effekt som används i A, topp (skala barer visar 20 ms/0,5 mV). Botten: Förhållandet mellan optisk effekt vid 470 nm och sannolikheten för att observera en ChrimsonR-driven PSP. Observera att tröskeln för blåljusaktivering av ChrimsonR PSPs var identisk med tröskeln för att framkalla Chronos PSPs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Karakterisering av ljusframkallade PSPs från commissural synapser på VIP nervceller. Rätt IC injicerades med rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH och inspelningar gjordes från VIP nervceller i kontralateral ICc. (A)Optogenetiskt framkallade Ippsps frammanades av 2-5 ms blå ljusblinkar (vänster) medan EPSPs blockerades av 10 μM NBQX och 50 μM D-AP5. IPSPs avskaffades av gabazine (höger). (B)Optogenetiskt framkallade EPSPs frammanades av 2-5 ms blå ljusblinkar (vänster) medan IPSPs blockerades med 1 μM stryknin och 5 μM gabazin. Tvätt-in av 50 μM D-AP5 minskade signifikant halvbredd och förfalltid konstant ljus-framkallat EPSPs (mitten). Tvättning av 10 μM NBQX avskaffade resterande EPSP (höger). Originalspår i A och B visas i ljusgrått, och genomsnitt från upp till 50 enskilda spår visas i svart. Från Goyer m.fl., 2019. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| X (lateral) | Y (caudal) | Z (djup) | |
| Höger IC penetration 1 | 1 000 μm | -900 μm | 2 250-1500 μm (250 μm steg) |
| Höger IC penetration 2 | 1 250 μm | -900 μm | 2 250-1750 μm (250 μm steg) |
| Höger DCN | 2 155 μm | -1325 μm | 4 750 μm, 4 550 μm |
Tabell 1: Stereotaxic koordinater för rAAV injektioner i IC och DCN. Alla koordinater är relativa till lambda i μm. Z-koordinater mäts från skallens dorsala yta vid lambda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har funnit att CRACM är en kraftfull teknik för att identifiera och karakterisera långväga synaptiska ingångar till nervceller i musen IC. Efter protokollet som beskrivs här uppnådde vi robust transfection av nervceller i DCN och IC samt tillförlitlig axonal handel med Chronos och ChrimsonR till synaptiska terminaler i IC. Dessutom visade vi att denna teknik möjliggör mätning och analys av postsynaptiska händelser, inklusive PSP amplitud, halvbredd, förfall tid, och receptor farmakologi. Vår erfarenhet tyder på att detta tillvägagångssätt lätt kan anpassas för att utföra funktionella krets kartläggning experiment i hela hörselhjärnan hjärnstammen och därefter.
Sammantaget ger specificiteten hos optogenetisk kretskartläggning en tydlig fördel jämfört med elektrisk stimulering av axoner. Viral afestiker ger förmågan att rumsligt och molekylärt begränsa uttrycket av channelrhodopsins till en riktad population av presynaptiska nervceller. Däremot kan elektrisk stimulering inte skilja mellan axoner som kommer från olika presynaptiska kärnor när dessa axoner är förfödelade, vilket är fallet i de flesta hjärnregioner. Elektrisk stimulering kan också initiera både ortodromiska och antidromiska spikar, ytterligare komplicera frågor när en distala stimulering webbplats innehåller axoner som kommer från nervceller som ligger nära inspelningsplatsen.
För att säkerställa ett stabilt uttryck och god axonal handel med en channelrhodopsin är valet av rätt virusvektor och serotyp av största vikt. Vi fann att stabilt uttryck för Chronos i IC nervceller uppnåddes med en serotyp 1 rAAV inklusive en Chronos eller ChrimsonR konstruktion i kombination med en woodchuck hepatit posttranscriptional reglerande element (WPRE) och nötkreatur tillväxthormon (BGH) polyadenyleringssignal. rAAV serotyp 5 misslyckades med att producera funktionella opsins i IC, men var funktionell i DCN (data visas inte). Den rigorösa valideringen av injektionskoordinater för varje experiment och se till att opsin-uttrycket är begränsat till den riktade hjärnregionen är lika viktig. En meningsfull identifiering av indata är endast möjlig om uttryck för opsin kontrolleras noggrant och dokumenteras för varje experiment.
Den rAAV1.ChrimsonR konstruktion som används i ovanstående protokoll gav stabilt uttryck och god axonal handel med proteinet, även i långa avstånd prognoser från DCN till IC(figur 3). Detta gör ChrimsonR till en lämplig opsin för (långväga) kretskartläggning. En rödskiftad opsin som ChrimsonR kan vara användbart om de experimentella parametrarna kräver ljuspenetration djupt in i vävnaden, men experimentören måste vara medveten om att alla för närvarande tillgängliga rödskiftade opsins visar några korsaktivering med blått ljus. Även om vissa studier har hävdat att ChrimsonR och Chronos kan vara separat aktiveras6,14,16, våra uppgifter tyder på att stor försiktighet måste iakttas med detta tillvägagångssätt. En färsk rapport innehåller ytterligare metoder som bör användas om du försöker separera rödskiftade opsins från Chronos13. Därför, när du använder ChrimsonR och Chronos i två färg CRACM experiment, noggrant utformade kontrollexperiment måste utföras för att säkerställa tydlig separation av blå och röd-skiftade opsin aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, projektnummer 401540516, till GD) och National Institutes of Health bevilja R56 DC016880 (MTR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
- Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
- Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
- Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
- Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
- Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
- Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 1029-1034 (2015).
- Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
- Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
- Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
- Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
- Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
- Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
- Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
- Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
- Winer, J. A., Schreiner, C., et al. The inferior colliculus: with 168 illustrations. Winer, J. A., Schreiner, C. , Springer. New York, NY. (2005).
- Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770 (2019).
