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Neuroscience

ब्लू और लाल स्थानांतरित चैनलोडोप्सिन के साथ अवर कोलिकुलस न्यूरॉन्स की लंबी दूरी की चैनलोडोप्सिन-असिस्टेड सर्किट मैपिंग

Published: February 7, 2020 doi: 10.3791/60760
Automatic Translation
1, 1
1Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

Summary

चैनलोडोपसिन-असिस्टेड सर्किट मैपिंग (सीआरएसीएम) न्यूरोनके शारीरिक और/या आनुवंशिक रूप से पहचाने गए न्यूरॉन्स के समूहों के बीच लंबी दूरी के न्यूरोनल अनुमानों के कार्यात्मक मानचित्रण के लिए एक सटीक तकनीक है । यहां, हम वर्णन कैसे CRACM का उपयोग करने के लिए श्रवण brainstem कनेक्शन नक्शा, एक लाल स्थानांतरित ऑप्सिन, ChrimsonR के उपयोग सहित ।

Abstract

तंत्रिका सर्किट की जांच करते समय, इन विट्रो पैच क्लैंप दृष्टिकोण की एक मानक सीमा यह है कि कई स्रोतों से एक्सोन अक्सर इंटरमिक्स होते हैं, जिससे विद्युत उत्तेजना के साथ व्यक्तिगत स्रोतों से इनपुट को अलग करना मुश्किल हो जाता है। हालांकि, चैनलोडोपसिन असिस्टेड सर्किट मैपिंग (सीआरएसीएम) का उपयोग करके, इस सीमा को अब दूर किया जा सकता है। यहां, हम कम श्रवण ब्रेनस्टेम नाभिक और कम्मिचुअल इनपुट से आरोही इनपुट को अवर कोलिकुलस (आईसी), श्रवण प्रणाली के मिडब्रेन नाभिक में न्यूरॉन्स के एक चिन्हित वर्ग को मैप करने के लिए सीआरएसीएम का उपयोग करने की एक विधि की रिपोर्ट करते हैं। आईसी में, स्थानीय, कॉमिसरल, आरोही, और उतरते हुए अक्षों भारी जुड़े हुए हैं और इसलिए विद्युत उत्तेजना के साथ अविवेच्य हैं। एक प्रेग्नेंसी नाभिक में एक चैनलोडोपसिन की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक वायरल निर्माण इंजेक्शन द्वारा, पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के बाद चैनलोडोपसिन-व्यक्त सिनैप्टिक इनपुट की उपस्थिति और शरीर विज्ञान की विशेषता के लिए, एक विशिष्ट स्रोत से अनुमानों आईसी न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट आबादी के लिए सेल प्रकार विशिष्ट सटीकता के साथ मैप किया जा सकता है। हम बताते हैं कि यह दृष्टिकोण क्रोनोस, नीली रोशनी से सक्रिय चैनलोडोपसिन और एक लाल-स्थानांतरित चैनलोडोपसिन, चिरिमकोनआर दोनों के साथ काम करता है। अग्रमस्तिष्क से पिछली रिपोर्टों के विपरीत, हम पाते हैं कि चिरिसोंर को पृष्ठीय कॉकलियर न्यूक्लियस प्रिंसिपल न्यूरॉन्स के अक्षतों की मजबूती से तस्करी की जाती है, यह दर्शाता है कि क्रेमसनर ब्रेनस्टेम में सीआरएसीएम प्रयोगों के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में इंट्राक्रैनियल वायरस इंजेक्शन सर्जरी का विस्तृत विवरण शामिल है, जिसमें पृष्ठीय कॉकलियर नाभिक और चूहों के आईसी को इंजेक्शन को लक्षित करने के लिए स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक शामिल हैं, और पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग को कैसे मिलाएं आईसी न्यूरॉन्स के लिए लंबी दूरी के अनुमानों की जांच करने के लिए चैनलोडोपसिन सक्रियण के साथ। हालांकि इस प्रोटोकॉल आईसी के लिए श्रवण आदानों की विशेषता के अनुरूप है, यह आसानी से श्रवण brainstem और परे में अंय लंबी दूरी के अनुमानों की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

तंत्रिका सर्किट फ़ंक्शन के लिए सिनैप्टिक कनेक्शन महत्वपूर्ण हैं, लेकिन तंत्रिका सर्किट के भीतर सिनेप्स की सटीक टोपोलॉजी और शरीर विज्ञान अक्सर प्रायोगिक रूप से जांच करना मुश्किल होता है। इसका कारण यह है कि विद्युत उत्तेजना, सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का पारंपरिक उपकरण, उत्तेजना साइट के पास अक्षतको सक्रिय करता है, और अधिकांश मस्तिष्क क्षेत्रों में, विभिन्न स्रोतों (स्थानीय, आरोही, और/या उतरते) इंटरट्विन से एक्सोन। हालांकि, चैनलोडोपसिन असिस्टेड सर्किट मैपिंग (सीआरएसीएम)1,2का उपयोग करके, इस सीमा को अब3से पार किया जा सकता है। चैनलोडोपसिन (ChR2) एक प्रकाश सक्रिय, कोट-चयनात्मक आयन चैनल है जो मूल रूप से हरे शैगा क्लैमाइडोमोनास रेनहार्ड्टीमें पाया जाता है। ChR2 450-490 एनएम के आसपास एक तरंगदैर्ध्य की नीली रोशनी से सक्रिय किया जा सकता है, जो कोटेशन प्रवाह के माध्यम से सेल को ध्रुवीकरण करता है। ChR2 को पहले नागेल और सहयोगियों द्वारा ज़ेनोपस ओसाइट्स में वर्णित और व्यक्त किया गया था। उसके कुछ ही समय बाद, Boyden और सहयोगियों5 स्तनधारी न्यूरॉन्स में ChR2 व्यक्त की और पता चला है कि वे प्रकाश दालों का उपयोग करने के लिए मज़बूती से एक मिलीसेकंड टाइमस्केल पर स्पाइकिंग नियंत्रण सकता है, कार्रवाई क्षमता inducing ~10 एमएस नीली रोशनी के साथ ChR2 के सक्रियण के बाद । हाल ही में (जैसे, क्रोनोस6)भी तेजी से गतिज के साथ ऑप्टोजेनेटिक चैनल पाए गए हैं।

सीआरएसीएम प्रयोग के लिए मूल दृष्टिकोण एक पुनः संयोजन एडेनो-संबद्ध वायरस (आरएएवी) के साथ ख्यात प्रेग्नेंसी न्यूरॉन्स की आबादी को स्थानांतरित करना है जो चैनलोडोपसिन के लिए आनुवंशिक जानकारी ले जाता है। आरएएवी के साथ न्यूरॉन्स का ट्रांसफेक्शन एन्कोडेड चैनलोडोप्सिन की अभिव्यक्ति की ओर जाता है। आमतौर पर, चैनलोडोप्सिन को जीएफपी (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) या टीडीमैटो (एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन) जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया जाता है, ताकि लक्ष्य क्षेत्र में न्यूरॉन्स के ट्रांसफेक्शन को फ्लोरेस इमेजिंग के साथ आसानी से पुष्टि की जा सके। क्योंकि आरएएवी गैर-रोगजनक हैं, इसमें कम भड़काऊ क्षमता और लंबे समय तक चलने वाली जीन अभिव्यक्ति7,8है, वे न्यूरॉन्स को चैनलोडोप्सिन देने के लिए एक मानक तकनीक बन गए हैं। यदि, न्यूरॉन्स की ख्यात प्रेग्नेंसी आबादी के ट्रांसफेक्शन के बाद, प्रकाश चमक के माध्यम से एक चैनलोडोप्सिन की सक्रियता लक्ष्य न्यूरॉन्स में पोस्टसिनैप्टिक क्षमता या धाराओं को प्रकाश में लाना, यह ट्रांससंक्रमित नाभिक से रिकॉर्ड किए गए सेल में एक एक्सोनल कनेक्शन का सबूत है। क्योंकि मस्तिष्क टुकड़ा प्रयोगों में कटे अक्षों को चैनलोडोपसिन सक्रियण के माध्यम से न्यूरोट्रांसमीटर जारी करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है, नाभिक जो तीव्र टुकड़ा के बाहर झूठ बोलता है लेकिन पोस्टसिनैप्टिक मस्तिष्क क्षेत्र में एक्सोन भेजता है, सीआरएसीएम के साथ पहचाना जा सकता है। इस तकनीक की शक्ति यह है कि चिन्हित लंबी दूरी के सिनैप्टिक इनपुट्स की कनेक्टिविटी और फिजियोलॉजी की सीधी जांच की जा सकती है।

नीली रोशनी से उत्तेजनीय चैनलोडोप्सिन के अलावा, जांचकर्ताओं ने हाल ही में कई लाल-स्थानांतरित चैनलोडोप्सिन 9,10कीपहचान की है, जिसमें चिरिमसन और इसकी तेजी से एनालॉग चिरिमसनर शामिल हैं, दोनों ~ 660 एनएम6की लाल बत्ती से उत्साहित हैं। लाल-स्थानांतरित ऑप्सिन ब्याज के होते हैं क्योंकि लाल बत्ती नीली रोशनी की तुलना में ऊतक में प्रवेश करती है, और लाल बत्ती में नीली रोशनी10,11,12की तुलना में कम साइटोटॉक्सिकिटी हो सकती है। लाल-स्थानांतरित चैनलोडोप्सिन भी दोहरे रंग सीआरएसीएम प्रयोगों की संभावना को खोलते हैं, जहां एक ही न्यूरॉन पर विभिन्न नाभिक से अक्षों के अभिसरण का परीक्षण एक प्रयोग6,13,14में किया जा सकता है। हालांकि, वर्तमान लाल-स्थानांतरित ऑप्सिन अक्सर नीली रोशनी15,16,17के साथ अवांछित क्रॉस-एक्टिवेशन का प्रदर्शन करते हैं, जिससे दो रंग प्रयोग मुश्किल हो जाते हैं। इसके अलावा, कुछ रिपोर्टों में संकेत दिया गया है कि चिरिमकोनर सीमित अक्षीय तस्करी से गुजरता है, जो सीआरएसीएम प्रयोगों16,17के लिए चिरिमकोनर का उपयोग करना चुनौतीपूर्ण बना सकता है ।

निचले श्रवण ब्रेनस्टेम न्यूक्लिक नाभिक से लगभग सभी आरोही अनुमान अवर कोलिकुलस (आईसी), केंद्रीय श्रवण मार्ग के मिडब्रेन हब में एकाग्र होते हैं। इसमें कॉकलियर न्यूक्लियस (सीएन)18,19,अधिकांश सुपीरियर ओलिवार कॉम्प्लेक्स (एसओसी)20और पार्श्व लेमिनिसस21के पृष्ठीय (डीएएनएलएल) और वेंट्रल (वीएनएलएल) नाभिक के अनुमान शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, श्रवण प्रांतस्था से एक बड़ा उतरते प्रक्षेपण आईसी18,19,20,21,22में समाप्त होजाता है, और आईसी न्यूरॉन्स खुद को मोटे तौर पर आईसी23के स्थानीय और कॉन्ट्रालेटरल पालि के भीतर सिनेप्स करते हैं। कई स्रोतों से अक्षतों के आपस में मिलने से विद्युत उत्तेजना24का उपयोग करआईसी सर्किट की जांच करना मुश्किल हो गया है । नतीजतन, भले ही आईसी में न्यूरॉन्स ध्वनि स्थानीयकरण के लिए महत्वपूर्ण गणना करते हैं और भाषण और अन्य संचार की पहचान25,26लगता है, आईसी में तंत्रिका सर्किट का संगठन काफी हद तक अज्ञात है। हमने हाल ही में वीआईपी न्यूरॉन्स को आईसी27में पहली आणविक पहचानने योग्य न्यूरॉन वर्ग के रूप में पहचाना । वीआईपी न्यूरॉन्स ग्लूटामिजर स्टेलेट न्यूरॉन्स हैं जो श्रवण थैलेसीमिया और बेहतर कोलिकुलस सहित कई लंबी दूरी के लक्ष्यों को प्रोजेक्ट करते हैं। अब हम वीआईपी न्यूरॉन्स के लिए स्थानीय और लंबी दूरी की जानकारी के स्रोतों और कार्य को निर्धारित करने में सक्षम हैं और यह निर्धारित करने में सक्षम हैं कि ये सर्किट कनेक्शन ध्वनि प्रसंस्करण में कैसे योगदान देते हैं।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल चूहों के आईसी में वीआईपी न्यूरॉन्स के लिए सिनैप्टिक इनपुट की जांच करने के लिए सिलवाया है, विशेष रूप से कॉन्ट्रालेटरल आईसी और डीसीएन(चित्रा 1)से । प्रोटोकॉल को आसानी से इनपुट के विभिन्न स्रोतों, एक अलग न्यूरॉन प्रकार या एक अलग मस्तिष्क क्षेत्र के लिए पूरी तरह से अनुकूलित किया जा सकता है। हम यह भी बताते हैं कि चैरिसोनर श्रवण ब्रेनस्टेम में लंबी दूरी के सर्किट मानचित्रण के लिए एक प्रभावी लाल-स्थानांतरित चैनलोडोप्सिन है। हालांकि, हम प्रदर्शित करते हैं कि चिरिसोंर नीली रोशनी द्वारा दृढ़ता से सक्रिय होता है, यहां तक कि कम तीव्रता पर भी, और इस प्रकार, दो रंग सीआरएसीएम प्रयोगों में क्रोनोस के साथ चिरिसोंर को संयोजित करने के लिए, चिरिसोंर के क्रॉस-एक्टिवेशन को रोकने के लिए सावधानीपूर्वक नियंत्रण का उपयोग किया जाना चाहिए।

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Protocol

स्थानीय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) से अनुमोदन प्राप्त करें और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच दिशानिर्देशों का पालन करें। इस प्रोटोकॉल में सभी प्रक्रियाओं मिशिगन IACUC विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था और देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए NIH दिशा निर्देशों के अनुसार थे ।

1. सर्जरी की तैयारी

  1. असेप्टिक स्थितियों में सर्जरी करें। ऑटोक्लेव/सर्जरी से पहले सभी सर्जरी उपकरण और सामग्री निष्फल । सर्जरी के लिए सर्जरी गाउन और मास्क पहनें।
  2. सर्जरी क्षेत्र को साफ करें (70% इथेनॉल के साथ स्प्रे और पोंछें), और सर्जरी क्षेत्र को कवर करने के लिए बाँझ तौलिया पर्दे रखें।
  3. रिकवरी पिंजरे तैयार करें। श्वासनली के जोखिम को सीमित करने के लिए पिंजरे बिस्तर निकालें। पिंजरे के नीचे एक हीटिंग पैड रखो। एक भोजन और जल स्रोत प्रदान करें।
  4. एक पिपेट खींचने पर नैनोइंजेक्टर के लिए एक ग्लास केशिका खींचें। पुलिंग प्रक्रिया के दौरान हीटिंग फिलामेंट की तीव्र गर्मी कांच केशिका को स्टरलाइज करेगी। व्यास में लगभग 5 माइक्रोन खोलने प्राप्त करने के लिए टिप को काट ें या तोड़ें।
  5. ऊतक प्रवेश में सुधार और क्लोजिंग को कम करने के लिए लगभग 30 डिग्री कोण पर केशिका टिप को बेवेल करें। खनिज तेल के साथ केशिका को बैकफिल और एक नैनोलीटर इंजेक्टर में डालें।
  6. वांछित चैनलोडोपसिन-एन्कोडिंग आरएएवी का एक बहाना प्राप्त करें और बाँझ पीबीएस का उपयोग करके वांछित टिटर को पतला करें।
    नोट: हमने पाया है कि सेरोटाइप 1 आरएएवी श्रवण ब्रेनस्टेम न्यूक्लिक के ट्रांसफेक्शन के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं। विशेष रूप से, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (नीली रोशनी सक्रिय चैनलरोडोपसिन) और rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (लाल-स्थानांतरित चैनलोडोपसिन), जो सार्वजनिक रूप से सुलभ भंडार और वेक्टर कोर से उपलब्ध हैं, सीआरएसीएम प्रयोगों के लिए आवश्यक चैनलोडोपसिन की उच्च अभिव्यक्ति स्तर और अच्छी लंबी दूरी की एक्सोनल तस्करी लगातार उपज।
  7. बाँझ पीबीएस में आरएएवी के 1-3 माइक्रोन के साथ केशिका भरने के लिए इंजेक्टर निर्देशों का पालन करें।

2. सर्जरी

  1. जानवर को एक इंडक्शन कक्ष में रखें और एक कैलिब्रेटेड आइसोफ्लोरीन वाष्पीकरण के माध्यम से वितरित ऑक्सीजन में 3% आइसोफ्लोरीन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें। माउस का निरीक्षण करें जब तक सांस गहरी और धीमी हो जाती है और एक अंगूठे की चुटकी पलटा अनुपस्थित है, लगभग 3-5 मिन।
  2. जानवर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में स्थानांतरित करें। एक गैस संज्ञाहरण मुखौटा के साथ एक तालु पट्टी पर अपना मुंह डाल कर और दोनों कान नहरों में गैर छिद्रण कान सलाखों की स्थिति से जानवर के सिर सुरक्षित ।
  3. एक गुदा तापमान जांच डालें और होमोस्टैटिक तापमान नियंत्रक पर स्विच।
  4. आंखों को सूखने से रोकने के लिए नेत्र मलम लगाएं।
  5. 5 मिलीग्राम/किलो कार्प्रोफेन का रिक्तिपूर्व एनाल्जेसिक (उदाहरण के लिए, चमड़े के नीचे इंजेक्शन) का प्रशासन करें।
  6. एनेस्थेटाइज्ड स्टेट की गहराई के मुताबिक आइसोफ्लोरीन को 1-2.5% तक एडजस्ट करें । प्रक्रिया के दौरान कम से कम हर 15 मिनट में म्यूकस झिल्ली के तापमान, श्वास और रंग की निगरानी करें।
  7. इलेक्ट्रिक क्लिपर्स के साथ शेव खोपड़ी। एसेप्टिक रूप से पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल के तीन बारी-बारी झाड़ू के साथ खोपड़ी तैयार करें।
  8. कान के बीच शुरू होने वाले मिडलाइन के साथ खोपड़ी में एक चीरा बनाएं और आंखों के लिए रोस्ट्रल जारी रखें, लैम्ब्डा और ब्रेग्मा टांके को उजागर करें। त्वचा को साइड में पुश करें और यदि आवश्यक हो तो उजागर हड्डी से पेरिओस्टेम को हटा दें।
  9. लैम्ब्डा सीवन को बाँझ सर्जिकल मार्कर के साथ चिह्नित करें, नैनोइंजेक्टर की नोक को रखें ताकि यह सिर्फ लैम्ब्डा को छू सके, और माइक्रोजोड़क निर्देशांक को शून्य कर सके। लैम्ब्डा और ब्रेग्मा टांके के बीच ऊंचाई में अंतर को मापने के लिए नैनोइंजेक्टर टिप और माइक्रोजोड़क का उपयोग करें। ± 100 माइक्रोन ऊंचाई अंतर के भीतर लैम्ब्डा और ब्रेग्मा लाने के लिए तालू बार ऊंचाई समायोजित करें।
  10. नैनोइंजेक्टर टिप और माइक्रोजोड़क समन्वय प्रणाली का उपयोग करइंजेक्शन साइट का नक्शा और एक बाँझ सर्जिकल मार्कर के साथ साइट को चिह्नित करें। पी 21-पी 30 चूहों के आईसी या डीसीएन को इंजेक्ट करने के लिए, लैम्ब्डा सीवन के सापेक्ष निर्देशांक का उपयोग करें, जैसा कि तालिका 1में दिखाया गया है। ध्यान दें कि हमारे निर्देशांक में जेड गहराई लैम्ब्डा में खोपड़ी की सतह से मापा जाता है।
  11. इंजेक्शन साइट पर एक क्रैनिओटॉमी करने के लिए बाँझ 0.5 मिमी ड्रिल बर्र के साथ एक माइक्रोमोटर ड्रिल का उपयोग करें।
  12. लक्ष्य नाभिक में न्यूरॉन्स के व्यापक ट्रांसफेक्शन को सुनिश्चित करने के लिए, ऊतक(टेबल 1,जेड निर्देशांक) में विभिन्न गहराई पर इंजेक्शन बनाएं, और, आईसी जैसे बड़े मस्तिष्क क्षेत्रों के मामले में, विभिन्न एक्स और वाई निर्देशांक(टेबल 1,राइट आईसी प्रवेश 1 और दाएं आईसी प्रवेश 2) में दो या अधिक प्रवेश के दौरान इंजेक्शन बनाते हैं।
  13. इंजेक्शन प्रदर्शन करें। आईसी इंजेक्शन के लिए, 2,250 माइक्रोन और 1750 माइक्रोन गहराई के बीच जेड एक्सिस (इंजेक्शन गहराई) के साथ 250 माइक्रोन के अंतराल में वायरस के 20 nL जमा करें। डीसीएन इंजेक्शन के लिए, क्रमशः 4,750 माइक्रोन और 4,550 माइक्रोन की गहराई पर वायरस के 20 nL जमा करें।
  14. प्रत्येक जेड समन्वय पर इंजेक्शन के बाद, अगले जेड समन्वय के लिए इंजेक्टर ले जाने से पहले 2-3 मिन इंतजार करें। यह वायरस के लिए इंजेक्शन साइट से दूर फैलाना करने के लिए समय की अनुमति देगा, संभावना है कि वायरस इंजेक्शन पथ चूसा जाएगा जब नैनोइंजेक्टर repositioned है कम ।
  15. एक प्रवेश में अंतिम इंजेक्शन के बाद, मस्तिष्क से नैनोइंजेक्टर वापस लेने से पहले 3-5 मिन रुको।
  16. जब नैनोइंजेक्टर को प्रवेश और जानवरों के बीच मस्तिष्क से हटा दिया जाता है, तो यह जांचने के लिए टिप से वायरस की एक छोटी मात्रा को बाहर निकालें कि टिप नहीं भरा है।
  17. इंजेक्शन के बाद, खोपड़ी के कटे किनारों को गीला करने के लिए बाँझ पीबीएस का उपयोग करें और फिर धीरे से त्वचा को मिडलाइन की ओर वापस ले जाएं। 6-0 (0.7 मीट्रिक) नायलॉन टांके का उपयोग कर सरल बाधित टांके के साथ घाव बंद करें।
  18. घाव पर 2% लिडोकेन जेल का 0.5-1 mL लागू करें।
  19. कान की सलाखों और तापमान की जांच निकालें, isoflurane बंद कर दें, तालू बार से माउस को हटा दें और इसे रिकवरी पिंजरे में स्थानांतरित करें।
  20. वसूली की बारीकी से निगरानी करें। एक बार जब जानवर पूरी तरह से जाग जाता है, घूम रहा है, और दर्द या संकट के कोई संकेत नहीं दिखा रहा है, तो इसे वापस अपने पिंजरे में स्थानांतरित करें और पिंजरे को विवरियम में वापस कर दें।
  21. यदि सर्जरी एक दिन में कई जानवरों पर किया जाएगा, एक गर्म बीनड़ स्टरलाइजर का उपयोग करने के लिए सर्जरी उपकरण साफ और अगली सर्जरी से पहले burr ड्रिल ।

3. सर्जिकल फॉलो अप

  1. अगले 10 दिनों में घाव बंद होने, संक्रमण, या दर्द या संकट के लक्षणों के लिए दैनिक जानवरों की जांच करें, संस्था के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करें।
  2. चैनलोडोप्सिन की इष्टतम अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए प्रयोगों में जानवरों का उपयोग करने से पहले 3-4 सप्ताह इंतजार करें।

4. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी और इंजेक्शन लक्ष्य की पुष्टि

  1. सीआरएसीएम के लिए, मानक इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों में ट्रांससंक्रमित जानवरों से तीव्रता से तैयार मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करें, यहां केवल संक्षेप में वर्णित है (अधिक विस्तृत विवरण27के लिए गोयर एट अल 2019 देखें)।
  2. कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (ACSF) युक्त (एमएम में): 125 NaCl, 12.5 डी-ग्लूकोज, 25 NaHCO3,3 KCl, 1.25 NaH2पीओ4,1.5 CaCl2,1 MgSO4तैयार करें। 95% O2में 5% सीओ2 के साथ 7.4 के पीएच करने के लिए बुलबुला ACSF।
  3. चैनलोडोप्सिन की सक्रियता को सीमित करने के लिए इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सहित सभी निम्नलिखित चरणों को करें।
  4. आइसोफ्लोरीन के साथ माउस को गहराई से एनेस्थेटाइज़ करें और इसे जल्दी से काट लें। ~34 डिग्री सेल्सियस एसीएसएफ में मस्तिष्क को जल्दी से विच्छेदन करें।
  5. कट कोरोनल स्लाइस (200-250 माइक्रोन) एक कंपन माइक्रोटोम के साथ ~ 34 डिग्री सेल्सियस ACSF में आईसी युक्त और एक होल्डिंग चैंबर में 30 min के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइस इनक्यूबेट 95% O2में 5% सीओ2 के साथ बुलबुला। ऊष्मायन के बाद, रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए जाने तक कमरे के तापमान पर स्लाइस स्टोर करें।
  6. यदि इंजेक्शन लक्ष्य आईसी नहीं था, इंजेक्शन मस्तिष्क क्षेत्र के अतिरिक्त कोरोनल स्लाइस में कटौती और एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत लक्ष्य नाभिक के ट्रांसफेक्शन की जांच करें । यदि विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में लक्ष्य नाभिक या अतिरिक्त ट्रांसफेक्शन में कोई ट्रांसफेक्शन नहीं है, तो प्रयोग जारी न रखें।

5. इन विट्रो रिकॉर्डिंग और सीआरएसीएम प्रयोग

नोट: क्रोनोस और चिरिमसनर की ऑप्टिकल उत्तेजना प्रदान करने के लिए, हम माइक्रोस्कोप के एपिफ्लोरेसेंस बंदरगाह के साथ मिलकर एलईडी का उपयोग करते हैं। हालांकि एलईडी के बजाय लेजर का इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि लेजर का उपयोग कर रहे हैं, संस्थागत सुरक्षा अधिकारियों से पूर्व अनुमोदन प्राप्त करें और सुरक्षित लेजर उपयोग के लिए उचित दिशा निर्देशों का पालन करें ।

  1. 3.5-4.5 MΩ के प्रतिरोध के लिए बोरोसिलिकेट ग्लास से इलेक्ट्रोड खींचें। इलेक्ट्रोड आंतरिक समाधान में शामिल होना चाहिए (एमएम में): 115 के-ग्लूकोनेट, 7.73 केसीएल, 0.5 ईगटा, 10 हेप्स, 10 एनए2 फॉस्फोक्रिएटिन, 4 एमजीएटीपी, 0.3 नाजीटीपी, 0.1% बायोसिटिन (डब्ल्यू/वी), पीएच कोएच और ऑस्मोलैटी के साथ 7.3 में समायोजित होंगे।
  2. रिकॉर्डिंग करने के लिए, मानक पैच क्लैंप विधियों का उपयोग करें। स्लाइस को एक निश्चित चरण ईमानदार माइक्रोस्कोप के नीचे एक रिकॉर्डिंग कक्ष में रखें और लगातार एसीएसएफ के साथ ~ 2 mL/min. शारीरिक तापमान (~ 34-36 डिग्री सेल्सियस) के पास रिकॉर्डिंग का संचालन करें।
  3. एक उपयुक्त पैच क्लैंप एम्पलीफायर का उपयोग करदृश्य नियंत्रण के तहत पैच न्यूरॉन्स। श्रृंखला प्रतिरोध, पिपेट क्षमता और तरल जंक्शन क्षमता के लिए सही है।
  4. पूरी सेल रिकॉर्डिंग के दौरान, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध एलईडी के माध्यम से 580 एनएम प्रकाश की संक्षिप्त दालों द्वारा 470 एनएम प्रकाश या चिरिमकोनर की संक्षिप्त दालें (1-5 एमएस) वितरित करके क्रोनोस को सक्रिय करें। ऑप्सिन सक्रियण की सीमा निर्धारित करें और पोस्टसिनैप्टिक क्षमता प्राप्त करने के लिए न्यूनतम उत्तेजना प्रोटोकॉल का उपयोग करें। सामान्य तौर पर, सबसे कम उत्तेजना अवधि का उपयोग करें जो पीएसपी को प्रकाश में आती है, और पीएसपी को प्रकाश में लाने के लिए आवश्यक सीमा शक्ति के 120% तक ऑप्टिकल शक्ति निर्धारित करता है।
  5. इस बात की पुष्टि करने के लिए कि झिल्ली की क्षमता में दर्ज परिवर्तन वास्तव में न्यूरॉन को सिनैप्टिक इनपुट हैं, एक्सेक्टेटर/निरोधात्मक पोस्टसिनैप्टिक रिसेप्टर्स के लिए मानक विरोधी प्रयोग के दौरान धोया जा सकता है । पीएसपी (जैसे एनएमडीए बनाम AMPA रिसेप्टर्स) में विभिन्न रिसेप्टर योगदान की जांच करने के लिए, उपयुक्त रिसेप्टर विरोधी को धोया जा सकता है। प्रत्येक रिसेप्टर विरोधी के लिए, दवा प्रभाव धोने के बाद रिवर्स करना चाहिए।
  6. इस बात की पुष्टि करने के लिए पीएसपी की विलंबता, नर्वस और विश्वसनीयता का उपयोग करें कि प्रकाश-सक्रिय सिनैप्टिक इनपुट रिकॉर्ड किए गए न्यूरॉन पर सिनेप्स की प्रत्यक्ष, ऑप्टिकल सक्रियण से उत्पन्न होते हैं, जैसा कि एक बीच पर चैनल्ड्रोडोप्सिन-व्यक्त सिनेप्स की सक्रियता के विपरीत है न्यूरॉन जो रिकॉर्ड किए गए न्यूरॉन पर सिनेप्स करता है। सामान्य तौर पर, कम विलंबता (<2 एमएस), कम नर्वस (<1 एमएस मानक विचलन में विलंबता), और उच्च विश्वसनीयता (>50%) चैनलोडोप्सिन से एक सीधा सिनैप्टिक कनेक्शन इंगित करता है जो रिकॉर्ड किए गए न्यूरॉन को प्रेसनैप्टिक न्यूरॉन व्यक्त करता है।

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Representative Results

हम वीआईपी-IRES-Cre चूहों(वीआईपीtm1 (cre) Zjh/J)और Ai14 क्रे रिपोर्टर चूहों (B6) को पार कर गया । सीजी-जीटी (रोजा) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze/J)F1 संतान पैदा करने के लिए जिसमें वीआईपी न्यूरॉन्स फ्लोरोसेंट प्रोटीन tdTomato व्यक्त करते हैं । या तो सेक्स के F1 संतानों का इस्तेमाल किया गया, प्रसवोत्तर दिन (पी) 21 से P70 आयु वर्ग के । इस अध्ययन में कुल 22 जानवरों का इस्तेमाल किया गया।

AAV1 का स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन। Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH वीआईपी-IRES-Cre x Ai14 चूहों के सही आईसी में तालिका 1 में दिखाए गए निर्देशांक का उपयोग करसही आईसी में मजबूत क्रोनोस-EGFP अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप(चित्रा 2ए)। क्रोनोस-ईजीएफपी फ्लोरेसेंस के दृश्य निरीक्षण से संकेत मिलता है कि सही आईसी में लेबल वाली अधिकांश सोमता आईसी (आईसीसी) के केंद्रीय नाभिक में स्थित थीं, लेकिन लेबल वाली सोमता कभी-कभी आईसी (आईसीडी) के पृष्ठीय कॉर्टेक्स में और कभी-कभी आईसी (आईसीएलसी) के पार्श्व प्रांतस्था में भी मौजूद थीं। एक प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक जानवर के लिए लक्ष्यीकरण और पार्फेक्शन की सीमा की जांच की जानी चाहिए, क्योंकि गैर-लक्षित क्षेत्रों में चैनलोडोप्सिन की अभिव्यक्ति झूठी सकारात्मक हो सकती है। क्रोनोस की व्यापक या अधिक प्रतिबंधित अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, जमा वायरस की मात्रा के साथ-साथ स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक को वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए आसानी से समायोजित किया जा सकता है।

AAV1 का स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन। Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH DCN में (टेबल 1में निर्देशांक देखें) वीआईपी-IRES-Cre x Ai14 चूहों के कारण डीसीएन न्यूरॉन्स(चित्रा 2बी)का मजबूत ट्रांसफेक्शन हुआ । DCN के चयनात्मक ट्रांसफेक्शन की पुष्टि करने के लिए, हर जानवर के ब्रेनस्टेम को यह सत्यापित करने के लिए कटा हुआ होना चाहिए कि ईजीएफपी अभिव्यक्ति मौजूद थी और डीसीएन तक सीमित थी। यदि कोई ट्रांसफेक्शन नहीं है या यदि श्रवण तंत्रिका या वीएसएन में ईएफएफपी की काफी अभिव्यक्ति है, तो रिकॉर्डिंग नहीं की जानी चाहिए। 40 nL के कुल इंजेक्शन की मात्रा के साथ तालिका 1 में दिखाए गए निर्देशांक का उपयोग करना, क्रोनोस-ईजीएफपी अभिव्यक्ति ज्यादातर मामलों में डीसीएन तक सीमित होगी। EGFP लेबल अक्षतबाएं (contralateral) आईसीसी 3 सप्ताह दोनों आईसी और DCN इंजेक्शन साइटों के लिए इंजेक्शन के बाद(चित्रा 2एक सही, 2B सही)में मौजूद थे ।

चिरिमकोनर, AAV1 की लंबी दूरी की तस्करी का परीक्षण करने के लिए । Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH को वीआईपी-IRES-Cre x Ai14 चूहों के दाहिने डीसीएन में इंजेक्ट किया गया था, जो क्रोनोस इंजेक्शन के साथ समान निर्देशांक का उपयोग कर रहा था। चिरिमसनर इंजेक्शन ने डीसीएन में मजबूत अभिव्यक्ति का नेतृत्व किया, जिसमें टीडीटोमैटो फ्लोरेसेंस कोशिकाओं और फाइबर(चित्रा 3ए)में दिखाई देता है। कॉन्ट्रालेटरल आईसीसी में, टीडीटमाटर के साथ दृढ़ता से लेबल किए गए फाइबर 3 सप्ताह के बाद स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे, जो श्रवण ब्रेनस्टेम नाभिक(चित्रा 3बी)में इंजेक्शन दिए जाने पर चिरिमसनर-टीडीटमाटर निर्माण की लंबी दूरी की तस्करी क्षमता का प्रदर्शन करते थे। चिरिसोंर की ऑप्टिकल सक्रियण ने आईसी वीआईपी न्यूरॉन्स(चित्रा 3सी)में ईपीएस को प्राप्त किया, यह दर्शाता है कि चिरिसोंर लंबी दूरी के सीआरएसीएम प्रयोगों के लिए एक उपयोगी उपकरण है जब प्रायोगिक पैरामीटर नीली रोशनी के बजाय लाल बत्ती के उपयोग की मांग करते हैं। हालांकि, हमने पाया कि चिरिमसनर को नीली रोशनी के साथ आसानी से सक्रिय किया गया था, जो क्रोनोस(चित्रा 4)के रूप में नीली रोशनी सक्रियण के लिए एक ही सीमा दिखा रहा था। नीली रोशनी के लिए चिरिमकोनर की संवेदनशीलता का अर्थ है कि एक ही पशु13में चिरिमकोनर या क्रोनोस से संक्रमित आदानों के बीच अंतर करने के लिए विशेष सावधानी बरती जानी चाहिए।

सही आईसी में इंजेक्शन के बाद कॉन्ट्रालेटरल (बाएं) आईसीसी में वीआईपी न्यूरॉन्स को रिकॉर्डिंग लक्षित करते समय, नीली रोशनी चमक उत्तेजित पोस्टसिनैप्टिक क्षमता (ईपीएस) या निरोधात्मक पोस्टसिनैप्टिक क्षमता (IPSPs) को प्राप्त करती है। यह वीआईपी न्यूरॉन्स के लिए कॉमिसड्यूरल अनुमानों की पुष्टि करता है। कॉमिसरल ईपीएस और आईपीएसपी का अलग से विश्लेषण करने के लिए, हमने ईपीएसपी रिकॉर्डिंग के दौरान आईपीएसपी को ब्लॉक करने के लिए रिसेप्टर विरोधी का उपयोग किया, और इसके विपरीत। सीआरएसीएम प्रयोगों के दौरान दर्ज प्रतिनिधि ईपीएस और आईपीएस को चित्रा 5में दिखाया गया है । 12 में से 6 परीक्षण आईसीसी वीआईपी न्यूरॉन्स में आईपीएसपी देखे गए। IPSPs छोटे थे (1.53 एमवी ± 0.96 एमवी) और मध्यम गतिज था। IPSPs के 10 -90% वृद्धि समय 7.8 एमएस ± 2.1 एमएस थे, आधा चौड़ाई 15.1 एमएस ± 6.8 एमएस थे, और क्षय समय स्थिरांक 32.4 एमएस ± 17.0 एमएस(चित्रा 5ए,बाएं) थे। IPSPs गाबाए रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता की गई थी, क्योंकि उन्हें 5 μM gabazine, एक गाबाए रिसेप्टर विरोधी(चित्रा 5ए,सही; एन = 6) द्वारा अवरुद्ध किया गया था। 27 आईसीसी वीआईपी न्यूरॉन्स में से 11 में ईपीएस का परीक्षण किया गया। ईपीएस भी छोटे थे (1.52 एमवी ± 1.08 एमवी) और मध्यम गतिज थे। ईपीएसपी के 10 - 90% वृद्धि के समय 8.3 एमएस ± 4.3 एमएस थे, हाफविड्थ 19.6 एमएस ± 7.6 एमएस थे, और क्षय समय स्थिरता 43.5 एमएस ± 16.8 एमएस(चित्रा 5बी "नियंत्रण") थी। ईपीएस को एएमपीए और एनएमडीए रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता की गई थी। 50 माइक्रोन डी-एपी5 का आवेदन, एक एनएमडीए रिसेप्टर विरोधी, कम EPSP आधा चौड़ाई (14.3 एमएस ± 4.7 एमएस, पी = 0.006) और वृद्धि समय को कम करने की ओर रुझान (6.3 एमएस ± 1.6 एमएस, पी = 0.09), क्षय समय स्थिर (30.6 एमएस ± 7.3 एमएस, पी = 0.06), और EPSP आयाम (1.38 ± 0.33 mV, पी = 0.105; Tukey पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ दोहराया माप के लिए ANOVA) । 10 माइक्रोएम एनबीक्यूएक्स, एक एएमए रिसेप्टर विरोधी के आवेदन ने ईपीएसपी(चित्रा 5बी "+ AP5 और NBQX") के शेष को अवरुद्ध कर दिया।

डीसीएन इंजेक्शन के बाद बाएं आईसीसी में वीआईपी न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग से पता चला ईपीएस नीली रोशनी की चमक से पैदा हुआ, डीसीएन से आईसी में वीआईपी न्यूरॉन्स के लिए सिनैप्टिक इनपुट की पुष्टि । डीसीएन सीआरएसीएम प्रयोग सहज आईपीएसपी को ब्लॉक करने के लिए स्नान में गैबाएर्गिक और ग्लाइसिनर्गिक ब्लॉकर्स के साथ किए गए थे। हमने पाया कि नीली रोशनी की 2-5 एमएस दालों ने 25 न्यूरॉन्स में से 19 में ईपीएस का परीक्षण किया । प्रकाश पैदा किए गए ईपीएसपी में मध्यम आयाम (2.85 एमवी ± 2.98 एमवी) और अपेक्षाकृत धीमी वृद्धि बार (4.2 एमएस ± 1.3 एमएस), हाफविड्थ (20.6 एमएस ± 14.4 एमएस) और क्षय समय स्थिरांक (22.0 एमएस ± 6.7 एमएस) (एन = 6 कोशिकाएं, डेटा नहीं दिखाया गया) था।

क्रोनोस या चिरिसनर सक्रियण द्वारा पैदा किए गए सभी पीएस को एक सभी या कोई भी फैशन में प्राप्त किया गया था और बढ़ती ऑप्टिकल शक्ति (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ उनके आयाम को स्केल नहीं किया गया था। हालांकि, यह परिणाम एक विशेष न्यूरॉन को इनपुट प्रदान करने वाले ट्रांससंक्रमित सिनेप्स की संख्या और शरीर विज्ञान पर निर्भर करता है और इसलिए एक्सोनल प्रक्षेपण और न्यूरॉन प्रकार की जांच के विशेष संयोजन के आधार पर भिन्न होने की संभावना है।

Figure 1
चित्रा 1: आरएएवी इंजेक्शन साइटें और प्रायोगिक सेटअप। (A)इंजेक्शन साइट और प्रायोगिक सेटअप कॉमिसरल अनुमानों की जांच करने के लिए । बाएं: एक आरएएवी निर्माण (उदाहरण के लिए, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH) सही आईसी में इंजेक्ट किया जाता है और लक्षित रिकॉर्डिंग कॉन्ट्रालेटरल आईसी में की जाती है। सही: पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के दौरान, क्रोनोस-ट्रांससंक्रमित फाइबर पोस्टसिनैप्टिक क्षमता प्राप्त करने के लिए नीली रोशनी से उत्साहित होते हैं। (ख)डीसीएन से आईसी तक लंबी दूरी के अनुमानों की जांच के लिए इंजेक्शन साइट और प्रायोगिक सेटअप । बाएं: ChrimsonR निर्माण सही DCN में इंजेक्शन है और लक्षित रिकॉर्डिंग contralateral आईसी में किया जाता है । सही: पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के दौरान, ChrimsonR-ट्रांससंक्रमित फाइबर लाल बत्ती के साथ उत्साहित करने के लिए ChrimsonR पोस्टिनैप्टिक क्षमता पैदा कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आईसी और डीसीएन में इंजेक्शन के बाद क्रोनोस-ईजीएफपी अभिव्यक्ति। (ए)बाएं: कोरोनल आईसी स्लाइस की छवि जो आईसी (मजेंटा) और क्रोनोस-ईजीएफपी अभिव्यक्ति में टीडीटमाटर-लेबल वाले वीआईपी न्यूरॉन्स को दाएं आईसी (हरे) में इंजेक्शन साइटों के लिए स्थानीयकृत करती है। सही: उच्च आवर्धन छवि इंजेक्शन साइट के लिए आईसी कॉन्ट्रालेटरल में एक रिकॉर्ड वीआईपी न्यूरॉन (सफेद-हरे) दिखा । ग्रीन पुक्टा क्रोनोस-ईजीएफपी हैं जो कॉन्ट्रालेटरल आईसी से अनुमान व्यक्त करते हैं। (ख)कोरोनल ब्रेनस्टेम स्लाइस की छवि आरएएवी-क्रोनोस-ईजीएफपी इंजेक्शन के बाद डीसीएन में क्रोनोस-ईजीएफपी अभिव्यक्ति दिखाती है। बाएं: DCN की छवि, ट्रांससंक्रमित DCN और EGFP-सकारात्मक पृष्ठीय ध्वनिक stria में प्रवेश फाइबर दिखा । मध्य: उच्च आवर्धन छवि डीसीएन में क्रोनोस-ट्रांससंक्रमित सेल निकायों को दिखाती है। सही: लंबी दूरी डीसीएन-आईसी अनुमानों से कॉन्ट्रालेटरल आईसी में फाइबर और टर्मिनलों में क्रोनोस-ईजीएफपी अभिव्यक्ति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आईसी के लिए DCN और DCN अनुमानों में ChrimsonR-tdTomato अभिव्यक्ति । (A)एक माउस से एक कोरोनल ब्रेनस्टेम स्लाइस की छवि जिसमें सही डीसीएन rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH के साथ इंजेक्ट किया गया था । बाएं: सही DCN में ChrimsonR अभिव्यक्ति की छवि । सही: सही DCN की उच्च आवर्धन छवि ChrimsonR के साथ न्यूरॉन्स के मजबूत ट्रांसफेक्शन दिखा । (ख)आईसी में चिरिमसनआर-ट्रांससंक्रमित डीसीएन एक्सॉन की उच्च आवर्धन छवि । (ग)ऑप्टोजेनेटिकनेआई ने आईसी कॉन्ट्रालेटरल में वीआईपी न्यूरॉन से आरएएवी-क्रेमोनर को DCN इंजेक्शन लगाने के लिए रिकॉर्ड किए गए ईपीएस पैदा किए । मूल निशान हल्के भूरे रंग में दिखाए जाते हैं और औसत ईपीएस लाल रंग में होता है। ऑरेंज बॉक्स 590 एनएम प्रकाश नाड़ी के समय इंगित करता है। स्केल बार = 20 एमएस/0.5 एमवी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: नीली रोशनी के निम्न स्तर से चिरिमसनर की सक्रियता। (A)470 एनएम नीली रोशनी की दालों द्वारा कॉमिसड्यूरल अनुमानों में क्रोनोस की सक्रियता। शीर्ष: क्रोनोस-चालित आईपीएसपी के मूल निशान (हल्के ग्रे) और औसत (सियान), क्रोनोस सक्रियण के लिए दहलीज से थोड़ा ऊपर एक ऑप्टिकल शक्ति पर पैदा हुए (स्केल बार 20 एमएस/0.5 एमवी दिखाते हैं)। नीचे: 470 एनएम पर ऑप्टिकल पावर के बीच संबंध और क्रोनोस-पैदा पीएसपी को देखने की संभावना। (ख)470 एनएम नीली रोशनी के साथ चिरिमकोनर की सक्रियता। शीर्ष: मूल निशान (हल्के ग्रे) और औसत (लाल) ChrimsonR संचालित EPSPs, एक ही ऑप्टिकल एक, शीर्ष (पैमाने सलाखों के शो 20 एमएस/0.5 एमवी) में इस्तेमाल बिजली पर ४७० एनएम नीली रोशनी के साथ पैदा की । नीचे: 470 एनएम पर ऑप्टिकल पावर के बीच संबंध और एक ChrimsonR संचालित पीएसपी देख की संभावना है। ध्यान दें कि चिरिसॉनर पीएसपी की नीली रोशनी सक्रियण की सीमा क्रोनोस पीएसपी प्राप्त करने के लिए दहलीज के समान थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: वीआईपी न्यूरॉन्स पर कॉमिसरल सिनेप्स से प्रकाश पैदा किए गए पीएसपी का लक्षण वर्णन। सही आईसी rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH के साथ इंजेक्शन दिया गया था और रिकॉर्डिंग विआइटरल आईसीसी में वीआईपी न्यूरॉन्स से किए गए थे । (A)ऑप्टोजेनेटिक-पैदा करने वाले आईपीएसपी को 2-5 एमएस ब्लू लाइट फ्लैश (बाएं) द्वारा पैदा किया गया था जबकि ईपीएस को 10 माइक्रोन एनबीक्यूएक्स और ५० माइक्रोन डी-एपी5 द्वारा अवरुद्ध किया गया था । IPSPs gabazine (दाएं) द्वारा समाप्त कर दिया गया । (ख)ऑप्टोजेनेटिक-पैदा किए गए ईपीएस को 2-5 एमएस ब्लू लाइट फ्लैश (बाएं) से पैदा किया गया जबकि आईपीएसपी को 1 माइक्रोन स्ट्रीचिनिन और 5 माइक्रोन गबाजिन के साथ ब्लॉक कर दिया गया । 50 माइक्रोन डी-एपी5 के वॉश-इन ने हल्के पैदा किए गए ईपीएस (मध्य) के हाफविड्थ और क्षय समय को स्थिर कर दिया। 10 माइक्रोन एनबीक्यूएक्स के वॉश-इन ने शेष ईपीएस (दाएं) को समाप्त कर दिया। ए और बी में मूल निशान हल्के ग्रे में दिखाए जाते हैं, और औसत अप से ५० व्यक्तिगत निशान काले रंग में दिखाए जाते हैं । गोयर एट अल से, 2019. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक्स (पार्श्व) वाई (कौडल) जेड (गहराई)
सही आईसी प्रवेश 1 1,000 माइक्रोन -900 माइक्रोन 2,250-1500 माइक्रोन
(250 माइक्रोन वेतन वृद्धि)
सही आईसी प्रवेश 2 1,250 माइक्रोन -900 माइक्रोन 2,250-1750 माइक्रोन
(250 माइक्रोन वेतन वृद्धि)
राइट डीसीएन 2,155 माइक्रोन -1325 माइक्रोन 4,750 माइक्रोन, 4,550 माइक्रोन

तालिका 1: स्टीरियोटैक्सिक आईसी और डीसीएन में आरएएवी इंजेक्शन के लिए निर्देशांक। सभी निर्देशांक μm में लैम्ब्डा के सापेक्ष हैं । जेड निर्देशांक लैम्ब्डा में खोपड़ी की पृष्ठीय सतह से मापा जाता है ।

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Discussion

हमने पाया है कि CRACM माउस आईसी में न्यूरॉन्स के लिए लंबी दूरी के सिनैप्टिक इनपुट की पहचान करने और विशेषता के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। यहां विस्तृत प्रोटोकॉल के बाद, हमने डीसीएन और आईसी में न्यूरॉन्स के मजबूत ट्रांसफेक्शन के साथ-साथ आईसी में सिनैप्टिक टर्मिनलों के लिए क्रोनोस और चिरिमसनर की विश्वसनीय एक्सोनल तस्करी हासिल की। इसके अतिरिक्त, हमने दिखादिया कि यह तकनीक पीएसपी आयाम, हाफविथ, क्षय समय और रिसेप्टर फार्माकोलॉजी सहित पोस्टसिनैप्टिक घटनाओं के माप और विश्लेषण को सक्षम बनाती है। हमारे अनुभव से पता चलता है कि इस दृष्टिकोण को श्रवण ब्रेनस्टेम और उससे आगे के कार्यात्मक सर्किट मानचित्रण प्रयोगों को करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

कुल मिलाकर, ऑप्टोजेनेटिक सर्किट मैपिंग की विशिष्टता एक्सोन की विद्युत उत्तेजना पर एक अलग लाभ प्रदान करती है। वायरल ट्रांसफेक्शन प्रेसीनैप्टिक न्यूरॉन्स की लक्षित आबादी के लिए चैनलोडोप्सिन की अभिव्यक्ति को स्थानिक और आणविक रूप से प्रतिबंधित करने की क्षमता प्रदान करते हैं। इसके विपरीत, विद्युत उत्तेजना विभिन्न प्रेसीनैप्टिक नाभिक से उत्पन्न होने वाले एक्सोन के बीच अंतर नहीं कर सकती जब उन एक्सॉन आपस में मिल जाते हैं, जैसा कि अधिकांश मस्तिष्क क्षेत्रों में मामला है। विद्युत उत्तेजना ऑर्थोड्रोमिक और एंटीड्रोमिक स्पाइक्स दोनों को भी शुरू कर सकती है, आगे उलझी हुई मामलों में जब एक डिस्टल उत्तेजना साइट में रिकॉर्डिंग साइट के पास स्थित न्यूरॉन्स से निकलने वाले एक्सोन होते हैं।

स्थिर अभिव्यक्ति और एक चैनलोडोपसिन की अच्छी अक्षीय तस्करी सुनिश्चित करने के लिए, सही वायरल वेक्टर और सेरोटाइप का चयन सर्वोपरि है । हमने पाया कि आईसी न्यूरॉन्स में क्रोनोस की स्थिर अभिव्यक्ति एक क्रोनोस या चिरिसोंर सहित एक सेरोटाइप 1 आरएएवी के साथ हासिल की गई थी, जिसमें वुडचक हेपेटाइटिस पोस्टट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेटरी एलिमेंट (डब्ल्यूआरईआर) और गोजातीय विकास हार्मोन (बीजीएच) के साथ संयुक्त निर्माण किया गया था। पॉलीएडेनेशन सिग्नल। आरएएवी सेरोटाइप 5 आईसी में कार्यात्मक ऑप्सिन का उत्पादन करने में विफल रहा, लेकिन डीसीएन (डेटा नहीं दिखाया गया) में कार्यात्मक था। इंजेक्शन का कठोर सत्यापन हर प्रयोग के लिए निर्देशांक और यह सुनिश्चित करना कि ओप्सिन अभिव्यक्ति लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र तक ही सीमित है, इसी तरह महत्वपूर्ण है । आदानों की एक सार्थक पहचान तभी संभव है जब ऑप्सिन की अभिव्यक्ति को ध्यान से चेक किया जाए और हर प्रयोग के लिए प्रलेखित किया जाए।

उपरोक्त प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले RAAV1.ChrimsonR निर्माण में स्थिर अभिव्यक्ति और प्रोटीन की अच्छी अक्षीय तस्करी हुई, यहां तक कि डीसीएन से आईसी(चित्रा 3)तक लंबी दूरी के अनुमानों में भी। यह चिरिमसनर (लंबी दूरी) सर्किट मैपिंग के लिए एक उपयुक्त ऑप्सिन बनाता है। ChrimsonR की तरह एक लाल स्थानांतरित ऑप्सिन उपयोगी हो सकता है यदि प्रयोगात्मक मापदंडों को ऊतक में गहरी प्रकाश प्रवेश की आवश्यकता होती है, लेकिन प्रयोगकर्ता को पता होना चाहिए कि वर्तमान में उपलब्ध सभी लाल-स्थानांतरित ऑप्सिन नीली रोशनी के साथ कुछ क्रॉस-एक्टिवेशन दिखाते हैं। हालांकि कुछ अध्ययनों ने तर्क दिया है कि चिरिमकोनर और क्रोनोसको 6,14,16अलग से सक्रिय किया जा सकता है, हमारे डेटा से पता चलता है कि इस दृष्टिकोण के साथ बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए। हाल ही में एक रिपोर्ट में अतिरिक्त तरीकों का विवरण दिया गया है जिनका उपयोग क्रोनोस13से लाल-स्थानांतरित ऑप्सिन को अलग करने का प्रयास करने पर किया जाना चाहिए। इसलिए, दो रंग सीआरएसीएम प्रयोगों में चिरिमसनर और क्रोनोस का उपयोग करते समय, नीले और लाल-स्थानांतरित ऑप्सिन सक्रियण के स्पष्ट अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक डिजाइन किए गए नियंत्रण प्रयोगों को निष्पादित करने की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को ड्यूश फोर्स्ट्सजेमेसिनस्चेफ्ट रिसर्च फेलोशिप (GO 3060/1-1, प्रोजेक्ट नंबर 401540516, डीजी को) और नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ ग्रांट R56 DC016880 (एमटीआर) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH Addgene 59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Addgene 59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) Jackson Laboratory stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-B4
Carproject (carprofen) Henry Schein Animal Health 59149
Drummond glas capillaries Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3 Drummond Scientific Company 3-300-207
Electrode beveler Sutter Instrument FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures Ethicon local pharmacy
Fixed stage microscope any n/a
Gas anesthesia head holder David Kopf Instruments 933-B
General surgery tools Fine Science Tools N/A
Golden A5 pet clipper Oster 078005-010-003
Heating pad Custom build N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system Patterson Scientific 78917760
Hot bead sterilizer Steri 250 Inotech IS-250
Iodine solution 10% MedChoice local pharmacy
Isoflurane vaporizer Patterson Scientific 07-8703592
Lidocain topical jelly 2% Akorn local pharmacy
Micro motor drill 1050 Henry Schein Animal Health 7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm Fine Science Tools 19007-05
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears Akorn local pharmacy
P-1000 electrode puller Sutter Instrument P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software any n/a
Portable anethesia machine Patterson Scientific 07-8914724
Small animal steroetaxic frame David Kopf Instruments 930-B
Standard chemicals local vendors N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes Dynarex 4410
Surgical marker Fine Science Tools 18000-30
Temperature controller Custom build N/A
Vibratome any n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) Jackson Laboratory stock #010908
Water bath any n/a

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References

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न्यूरोसाइंस इश्यू 156 चैनलोडोप्सिन-असिस्टेड सर्किट मैपिंग ऑप्टोजेनेटिक्स क्रोनोस चिरिसनर अवर कोलिकुलस श्रवण ब्रेनस्टेम
ब्लू और लाल स्थानांतरित चैनलोडोप्सिन के साथ अवर कोलिकुलस न्यूरॉन्स की लंबी दूरी की चैनलोडोप्सिन-असिस्टेड सर्किट मैपिंग
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Goyer, D., Roberts, M. T. Long-range … More

Goyer, D., Roberts, M. T. Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (156), e60760, doi:10.3791/60760 (2020).

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