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Neuroscience

Mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina de longo alcance de neurônios de coláculo inferior com canaldopsinas de mudança azul e vermelha

Published: February 7, 2020 doi: 10.3791/60760
Automatic Translation
1, 1
1Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

Summary

O mapeamento de circuitoassistido pela canaldopsina (CRACM) é uma técnica de precisão para o mapeamento funcional de projeções neuronais de longo alcance entre grupos anatomicamente e/ou geneticamente identificados de neurônios. Aqui, descrevemos como utilizar o CRACM para mapear conexões cérebros auditivas, incluindo o uso de uma opsina de mudança vermelha, ChrimsonR.

Abstract

Ao investigar circuitos neurais, uma limitação padrão da abordagem do grampo de patch in vitro é que axônons de múltiplas fontes são frequentemente intermisturadas, dificultando a isoposição de entradas de fontes individuais com estimulação elétrica. No entanto, usando o mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina (CRACM), essa limitação agora pode ser superada. Aqui, relatamos um método para usar o CRACM para mapear entradas ascendentes de núcleos cerebrais auditivos inferiores e entradas commissivas para uma classe identificada de neurônios no colliculus inferior (IC), o núcleo do cérebro médio do sistema auditivo. No IC, axônons locais, comissários, ascendentes e descendentes estão fortemente entrelaçados e, portanto, indistinguíveis com estimulação elétrica. Injetando uma construção viral para conduzir a expressão de uma canaldopsina em um núcleo presinaptico, seguido de gravação de grampo de patch para caracterizar a presença e a fisiologia de entradas sinápticas expressando canaldopsina, projeções de uma fonte específica para uma população específica de neurônios IC pode ser mapeado com precisão específica do tipo celular. Mostramos que essa abordagem funciona com chronos, uma canaldopsina azul ativada pela luz, e ChrimsonR, uma canaldopsina de mudança vermelha. Em contraste com relatórios anteriores do cérebro anterior, descobrimos que ChrimsonR é robustamente traficado para baixo os axôngos de neurônios principais do núcleo coclear dorsal, indicando que chrimsonR pode ser uma ferramenta útil para experimentos CRACM no tronco cerebral. O protocolo aqui apresentado inclui descrições detalhadas da cirurgia intracraniana de injeção de vírus, incluindo coordenadas estereotaxicas para injeções direcionadas ao núcleo coclear dorsal e IC de camundongos, e como combinar gravação completa do grampo de patch celular com a ativação da canaldopsina para investigar projeções de longo alcance para neurônios IC. Embora este protocolo seja adaptado para caracterizar insumos auditivos para o IC, ele pode ser facilmente adaptado para investigar outras projeções de longo alcance no cérebro auditivo e além.

Introduction

As conexões sinápticas são críticas à função do circuito neural, mas a topologia precisa e a fisiologia das sinapses dentro de circuitos neurais são muitas vezes difíceis de sondar experimentalmente. Isso porque a estimulação elétrica, a ferramenta tradicional de eletrofisiologia celular, ativa indiscriminadamente axônhons perto do local de estimulação, e na maioria das regiões cerebrais, axônons de diferentes fontes (local, ascendente e/ou descendente) entrelaçam-se. No entanto, usando o mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina (CRACM)1,2, essa limitação agora pode ser superada3. A canaldopsina (ChR2) é um canal de íon seleção ativado originalmente encontrado na alga verde Chlamydomonas reinhardtii. O ChR2 pode ser ativado pela luz azul de um comprimento de onda em torno de 450-490 nm, despolarizando a célula através do fluxo de cisão. ChR2 foi descrito e expresso pela primeira vez em oócitos xenopus por Nagel e colegas4. Pouco depois disso, Boyden e seus colegas5 expressaram ChR2 em neurônios mamíferos e mostraram que poderiam usar pulsos de luz para controlar de forma confiável o espiamento em uma escala de tempo milissegundos, induzindo potenciais de ação ~10 ms após a ativação do ChR2 com luz azul. Canais optogenéticos com cinética ainda mais rápida foram encontrados recentemente (por exemplo, Chronos6).

A abordagem básica de um experimento CRACM é transfectar uma população de neurônios presinapticos putativos com um vírus associado adeno recombinante (rAAV) que carrega as informações genéticas para uma canaldopsina. A transfecção de neurônios com rAAV leva à expressão da canalizopsina codificada. Normalmente, a canaldopsina é marcada com uma proteína fluorescente como GFP (Proteína Fluorescente Verde) ou tdTomato (uma proteína fluorescente vermelha), de modo que a transfecção de neurônios na região alvo pode ser facilmente confirmada com imagens de fluorescência. Como os rAAVs não são patogênicos, têm um baixo potencial inflamatório e expressão genética de longa duração7,8,eles se tornaram uma técnica padrão para entregar canaldopsinas aos neurônios. Se, após a transfecção de uma população presunnótica putativa de neurônios, a ativação de uma canaldopsina através de flashes de luz provoca potenciais postinapticos ou correntes nos neurônios-alvo, isso é evidência de uma conexão axonal do núcleo transinfectado à célula gravada. Como axôlos cortados em experimentos de fatia cerebral podem ser levados a liberar neurotransmissor através da ativação da canaldopsina, núcleos que ficam fora da fatia aguda, mas enviam axôlos para a região cerebral elástica podem ser identificados com CRACM. O poder desta técnica é que a conectividade e a fisiologia de entradas sinápticas de longo alcance identificadas podem ser investigadas diretamente.

Além das canaldopsinas que são excitáveis pela luz azul, os investigadores identificaram recentemente várias canaldopsinas de mudança vermelha9,10,incluindo Chrimson e seu ChrimsonR analógico mais rápido, ambos animados com a luz vermelha de ~660 nm6. As opsinas de mudança vermelha são de interesse porque a luz vermelha penetra tecido melhor do que a luz azul, e a luz vermelha pode ter uma citotoxicidade menor do que a luz azul10,11,12. Canalizodopsinas de mudança vermelha também abrem a possibilidade de experimentos de CRACM de dupla cor, onde a convergência de axôlos de diferentes núcleos no mesmo neurônio pode ser testada em um experimento6,13,14. No entanto, as operações atuais com mudança vermelha muitas vezes exibem ativação cruzada indesejada com luz azul15,16,17, dificultando dois experimentos de cores. Além disso, alguns relatórios indicaram que chrimsonR sofre tráfico axonal limitado, o que pode tornar desafiador o uso de ChrimsonR para experimentos CRACM16,17.

Quase todas as projeções ascendentes dos núcleos de troncos auditivos mais baixos convergem no colículo inferior (IC), o centro do cérebro médio da via auditiva central. Isso inclui projeções do núcleo coclear (CN)18,19, a maioria do complexo olivary superior (SOC)20, e os núcleos dorsal (DNLL) e ventral (VNLL) do lemnisco lateral21. Além disso, uma grande projeção descendente do córtex auditivo termina no IC18,19,20,21,22, e os próprios neurônios ic siempse amplamente dentro dos lóbulos locais e contralaterais do IC23. A mistura de axônons de muitas fontes tornou difícil sondar circuitos ic usando estimulação elétrica24. Como resultado, embora os neurônios do IC realizem cálculos importantes para a localização sonora e a identificação da fala e outras comunicações soem25,26, a organização de circuitos neurais no IC é amplamente desconhecida. Recentemente identificamos os neurônios VIP como a primeira classe de neurôniomolecular identificável no IC27. Os neurônios VIP são neurônios stellate glutamatergicos que projetam para vários alvos de longo alcance, incluindo o tálamo auditivo e o colículo superior. Agora somos capazes de determinar as fontes e a função das entradas locais e de longo alcance para os neurônios VIP e determinar como essas conexões de circuito contribuem para o processamento de som.

O protocolo aqui apresentado é adaptado para investigar insumos sinápticos aos neurônios VIP no IC dos camundongos, especificamente do IC contralateral e da DCN (Figura 1). O protocolo pode ser facilmente adaptado a diferentes fontes de entrada, um tipo de neurônio diferente ou uma região cerebral completamente diferente. Também mostramos que ChrimsonR é uma canaldopsina de mudança vermelha eficaz para mapeamento de circuitos de longo alcance no tronco auditivo. No entanto, demonstramos que chrimsonR é fortemente ativado pela luz azul, mesmo em baixas intensidades e, assim, para combinar ChrimsonR com Chronos em experimentos CRACM de duas cores, controles cuidadosos devem ser usados para evitar a interativação de ChrimsonR.

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Protocol

Obtenha aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) local e adere às diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório. Todos os procedimentos neste protocolo foram aprovados pela Universidade de Michigan IACUC e estavam de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. Preparações de cirurgia

  1. Realizar cirurgias em condições assépticas. Autoclave/esterilizar todas as ferramentas e materiais de cirurgia antes da cirurgia. Use vestido de cirurgia e máscara para a cirurgia.
  2. Higienize a área de cirurgia (pulverizar e limpar com 70% de etanol) e coloque cortinas de toalha estéril para cobrir a área cirúrgica.
  3. Prepare a gaiola de recuperação. Remova a cama da gaiola para limitar o risco de asfixia. Coloque uma almofada de aquecimento debaixo da gaiola. Forneça uma fonte de comida e água.
  4. Puxe um capilar de vidro para o nanoinjetor em um puxador pipette. O calor intenso do filamento de aquecimento durante o processo de puxar esterilizará o capilar de vidro. Corte ou quebre a ponta para obter uma abertura de aproximadamente 5 μm de diâmetro.
  5. Acerte a ponta capilar a um ângulo de aproximadamente 30° para melhorar a penetração do tecido e reduzir o entupimento. Encha o capilar com óleo mineral e insira em um injetor de nanolitro.
  6. Obtenha uma alíquota do rAAV de codificação de canaldopsina desejada e diluir ao titer desejado usando PBS estéreis.
    NOTA: Descobrimos que os rAAVs sorotipo 1 funcionam bem para transfecção de núcleos de troncos auditivos. Especificamente, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (canaldopsina ativada pela luz azul) e rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (canaldopsina de mudança vermelha), que estão disponíveis a partir de repositórios e núcleos vetoris acessíveis publicamente, consistentemente produzir os altos níveis de expressão e o bom tráfico axonal de longo alcance de canaldopsinas necessárias para experimentos CRACM.
  7. Siga as instruções do injetor para o preenchimento dianteiro capilar com 1-3 μL de rAAV em PBS estéreis.

2. Cirurgia

  1. Coloque o animal em uma câmara de indução e induz anestesia com 3% de isoflurano em oxigênio entregue através de um vaporizador de isoflurano calibrado. Observe o mouse até que a respiração se torne profunda e lenta e um reflexo de pitada de dedo do dedo do dodo do do dodo esteja ausente, cerca de 3-5 min.
  2. Transfira o animal para uma moldura estereotaxica. Proteja a cabeça do animal colocando a boca em uma barra de paladar com uma máscara de anestesia a gás e posicionando barras de ouvido não perfurantes em ambos os canais auditivos.
  3. Insira uma sonda de temperatura retal e ligue o controlador de temperatura homeostático.
  4. Aplique pomada oftalma para evitar que os olhos sequem.
  5. Administrar analgésico preventivo (por exemplo, injeção subcutânea de 5 mg/kg de carprofeno).
  6. Ajuste o isoflurano para 1-2,5%, de acordo com a profundidade do estado anestesiado. Monitore a temperatura, a respiração e a cor das membranas mucosas pelo menos a cada 15 minutos durante o procedimento.
  7. Raspe o couro cabeludo com cortadores elétricos. Prepare o couro cabeludo com três cotonetes alternados de povido-iodo e 70% de etanol.
  8. Faça uma incisão no couro cabeludo ao longo da linha média começando entre as orelhas e continuando rostral aos olhos, expondo as suturas lambda e bregma. Empurre a pele para o lado e remova o periosteum do osso exposto, se necessário.
  9. Marque a sutura lambda com um marcador cirúrgico estéril, posicione a ponta do nanoinjetor para que ele esteja apenas tocando lambda, e zero as coordenadas micromanipuladoras. Use a ponta nanoinjetora e o micromanipulador para medir a diferença de elevação entre as suturas lambda e bregma. Ajuste a altura da barra de paladar para levar lambda e bregma para dentro de ± 100 μm de altura diferença.
  10. Mapeie o local da injeção usando o sistema de coordenadas nanoinjetor e micromanipulador e marque o local com um marcador cirúrgico estéril. Para injetar o IC ou DCN de camundongos P21-P30, use coordenadas relativas à sutura lambda, como mostrado na Tabela 1. Note que a profundidade Z em nossas coordenadas é medida da superfície do crânio em lambda.
  11. Use uma broca micromotora com uma broca estéril de 0,5 mm para realizar uma craniotomia sobre o local da injeção.
  12. Para garantir uma grande transfecção de neurônios no núcleo alvo, faça injeções em várias profundidades no tecido (Tabela 1, coordenadas Z), e, no caso de regiões cerebrais maiores como a IC, faça injeções ao longo de duas ou mais penetrações em diferentes coordenadas X e Y (Tabela 1, Penetração de IC direito 1 e penetração de IC direito 2).
  13. Faça injeções. Para injeções ic, deposite 20 nL de vírus em intervalos de 250 μm ao longo do eixo Z (profundidade de injeção) entre 2.250 μm e 1750 μm de profundidade. Para injeções DCN, deposite 20 nL de vírus a uma profundidade de 4.750 μm e 4.550 μm, respectivamente.
  14. Após a injeção em cada coordenada Z, espere 2-3 min antes de mover o injetor para a próxima coordenada Z. Isso permitirá tempo para o vírus se difundir do local da injeção, reduzindo a probabilidade de que o vírus seja sugado pelo trato de injeção quando o nanoinjetor for reposicionado.
  15. Após a última injeção em uma penetração, espere 3-5 min antes de retrair nanoinjetor do cérebro.
  16. Quando o nanoinjetor é removido do cérebro entre penetrações e entre animais, ejete um pequeno volume de vírus da ponta para verificar se a ponta não entupiu.
  17. Após as injeções, use PBS estéreis para musfar as bordas cortadas do couro cabeludo e, em seguida, mova suavemente a pele de volta para a linha média. Feche a ferida com suturas simples interrompidas usando suturas de nylon 6-0 (0,7 métricas).
  18. Aplique 0,5-1 mL de 2% de gel lidocaína na ferida.
  19. Remova as barras de ouvido e a sonda de temperatura, desligue isoflurane, retire o mouse da barra de paladar e transfira-o para a gaiola de recuperação.
  20. Monitore a recuperação de perto. Uma vez que o animal está totalmente acordado, movendo-se, e não mostrando sinais de dor ou angústia, transfira-o de volta para sua gaiola e devolva a gaiola para o vivarium.
  21. Se as cirurgias forem realizadas em vários animais em um dia, use um esterilizador de contas quentes para higienizar ferramentas de cirurgia e perfurar rebarba antes da próxima cirurgia.

3. Acompanhamento cirúrgico

  1. Verifique diariamente os animais para fechamento de feridas, infecção ou sinais de dor ou angústia nos próximos 10 dias, aderindo às diretrizes de cuidados com os animais da instituição.
  2. Espere 3-4 semanas antes de usar animais em experimentos para permitir a expressão ideal das canaldopsinas.

4. Preparação de fatias cerebrais e confirmação do alvo de injeção

  1. Para o CRACM, use fatias cerebrais agudamente preparadas de animais transfeccionados em experimentos de eletrofisiologia in vitro padrão, descritos aqui apenas brevemente (veja Goyer et al. 2019 para uma descrição mais detalhada27).
  2. Prepare fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF) contendo (em mM): 125 NaCl, 12,5 D-glicose, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1,5 CaCl2,1 MgSO4. Bubble ACSF a um pH de 7,4 com 5% de CO2 em 95% O2.
  3. Executar todas as etapas seguintes, incluindo eletrofisiologia in vitro, em quase escuridão ou luz vermelha para limitar a ativação de canaldopsinas.
  4. Anestesiaprofundamente o rato com isoflurano e decapitá-lo rapidamente. Disseceu o cérebro rapidamente em ~34 °C ACSF.
  5. Corte as fatias coronal (200-250 μm) contendo o IC em ~34 °C ACSF com um microtome vibratório e incubar as fatias a 34 °C por 30 min em uma câmara de espera cheia de ACSF borbulhava com 5% de CO2 em 95% O2. Após a incubação, armazene fatias à temperatura ambiente até ser usada para gravações.
  6. Se o alvo de injeção não fosse o IC, corte fatias coronais adicionais da região cerebral injetada e verifique a transfecção do núcleo alvo um microscópio de fluorescência. Se não houver transfecção no núcleo alvo ou transfecção adicional em diferentes regiões cerebrais, não continue com o experimento.

5. Gravação in vitro e experimento CRACM

NOTA: Para fornecer estimulação óptica de Chronos e ChrimsonR, usamos LEDs acoplados à porta de epifluorescência do microscópio. No entanto, os lasers podem ser usados em vez de LEDs. Se usar lasers, obtenha aprovação prévia dos oficiais de segurança institucional e siga as diretrizes apropriadas para o uso seguro do laser.

  1. Puxe eletrodos do vidro borosilica para uma resistência de 3,5-4,5 MΩ. A solução interna eletrodo deve conter (em mM): 115 K-gluconato, 7,73 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 fosfócritina, 4 MgATP, 0,3 NaGTP, complementado com 0,1% de biocitina (w/v), pH ajustado a 7,3 com KOH e osmolalidade a 290 mOsm/kg sucrose com sucrose.
  2. Para fazer gravações, use métodos padrão de fixação de patches. Coloque a fatia em uma câmara de gravação um microscópio vertical de estágio fixo e perfume continuamente com ACSF a ~2 mL/min. Realizar gravações perto da temperatura fisiológica (~34-36 °C).
  3. Patch neurônios controle visual usando um amplificador de grampo de remendo adequado. Correto para resistência em séries, capacitância de pipeta e potencial de junção líquida.
  4. Durante gravações de células inteiras, ative chronos entregando pulsos breves (1-5 ms) de 470 nm de luz ou ChrimsonR por pulsos curtos de luz de 580 nm através de LEDs comercialmente disponíveis. Determine o limiar de ativação de opsina e use um protocolo mínimo de estimulação para provocar potenciais postinapticos. Em geral, use a duração de estímulo mais curta que provoca um PSP e defina a potência óptica para 120% da potência limiar necessária para provocar PSPs.
  5. Para confirmar que as alterações registradas no potencial da membrana são de fato entradas sinápticas ao neurônio, antagonistas padrão para receptores ecinéticos excitatórios/inibitórios podem ser lavados durante o experimento. Para investigar diferentes contribuições de receptores para um PSP (por exemplo, receptores NMDA vs AMPA), antagonistas receptores adequados podem ser lavados. Para cada antagonista receptor, os efeitos da droga devem reverter após o lavagem.
  6. Use a latência, o nervosismo e a confiabilidade dos PSPs para confirmar que as entradas sinápticas ativadas pela luz são originárias da ativação direta e óptica de sinapses no neurônio gravado, em oposição à ativação de sinapses expressando canaldopsina em uma intervenção neurônio que sinapses no neurônio registrado. Em geral, baixa latência (<2 ms), baixo nervosismo (<1 ms desvio padrão em latência) e alta confiabilidade (>50%) indicar uma conexão sináptica direta da canaldopsina expressando neurônio pré-naptico ao neurônio gravado.

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Representative Results

Cruzamos os ratos VIP-IRES-Cre (Viptm1(cre)Zjh/J) e Ai14 Cre-reporter mice (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14 (CAG-tdTomato)Hze/J) para gerar filhotes de F1 em que os neurônios VIP expressam a proteína fluorescente tdTomato. Foram utilizadas proles de F1 de ambos os sexos, idade pós-natal (P) 21 a P70. Foram utilizados 22 animais neste estudo.

Injeção estereotaxista de AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH no IC certo dos ratos VIP-IRES-Cre x Ai14 usando coordenadas mostradas na Tabela 1 resultou em forte expressão Chronos-EGFP no IC certo (Figura 2A). A inspeção visual da fluorescência Chronos-EGFP indicou que a maior parte do somata rotulado no IC direito estava localizado no núcleo central do IC (CcI), mas os somata rotulados às vezes também estavam presentes no córtex dorsal do IC (CID) e ocasionalmente no córtex lateral do IC (IClc). O direcionamento e extensão da transfecção devem ser verificados para cada animal usado em um experimento, pois a expressão de canaldopsinas em regiões não direcionadas pode levar a falsos positivos. Para alcançar uma expressão mais ampla ou mais restrita de Chronos, a quantidade de vírus depositado, bem como as coordenadas estereotaxiadas podem ser facilmente ajustadas para alcançar o resultado desejado.

Injeção estereotaxista de AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH na DCN (ver coordenadas na Tabela 1) de camundongos VIP-IRES-Cre x Ai14 resultou em forte transfecção de neurônios DCN (Figura 2B). Para confirmar a transfecção seletiva da DCN, o tronco cerebral de cada animal deve ser fatiado para verificar se a expressão EGFP estava presente e limitada ao DCN. Se não houver transfecção ou se houver considerável expressão de EGFP no nervo auditivo ou VCN, as gravações não devem ser realizadas. Usando as coordenadas mostradas na Tabela 1 com um volume total de injeção de 40 nL, a expressão Chronos-EGFP será limitada à DCN na maioria dos casos. Axons rotulados por EGFP estiveram presentes na CCI esquerda (contralateral) 3 semanas após a injeção para locais de injeção ic e DCN(Figura 2A direita, 2B à direita).

Para testar o tráfico de longo alcance de ChrimsonR, AAV1. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH foi injetado na DCN direita de ratos VIP-IRES-Cre x Ai14, usando as mesmas coordenadas das injeções de Chronos. A injeção de chrimsonR levou à forte expressão no DCN, com fluorescência tdTomato visível em células e fibras (Figura 3A). No CcI contralateral, as fibras fortemente rotuladas com tdTomato eram claramente visíveis após 3 semanas, demonstrando a capacidade de tráfico de longo alcance da construção ChrimsonR-tdTomato quando injetadas em núcleos auditivos de tronco cerebral(Figura 3B). Ativação óptica de EPS SupsonR provocou EPSPs em neurônios IC VIP(Figura 3C),indicando que chrimsonR é uma ferramenta útil para experimentos CRACM de longo alcance quando os parâmetros experimentais exigem o uso de luz vermelha em vez de luz azul. No entanto, descobrimos que ChrimsonR foi prontamente ativado com luz azul, mostrando o mesmo limiar para ativação da luz azul que Chronos(Figura 4). A sensibilidade de ChrimsonR à luz azul significa que devem ser tomados cuidados especiais para distinguir entre insumos transinfectados com ChrimsonR ou Chronos no mesmo animal13.

Ao direcionar gravações para neurônios VIP no ICc contralateral (esquerda) após injeções no IC direito, flashes de luz azul provocaram potenciais eclásticas excitatórios (EPSPs) ou potenciais postinapticos inibidores (IPSPs). Isso confirma projeções amissais para neurônios VIP. Para analisar epsps e IPSPs comissários separadamente, usamos antagonistas receptores para bloquear IPSPs durante gravações de EPSP, e vice-versa. EPSPs representativos e IPSPs registrados durante experimentos cracm são mostrados na Figura 5. IpSPs foram observados em 6 dos 12 neurônios VIP iCc testados. Os IPSPs eram pequenos (1,53 mV ± 0,96 mV) e tinham cinética moderada. Os tempos de aumento de 10 a 90% dos IPSPs foram de 7,8 ms ± 2,1 ms, meia-largura s1 ms ± 6,8 ms, e as constantes de tempo de decomposição foram de 32,4 ms ± 17,0 ms (Figura 5A, esquerda). Os IPSPs foram mediados pelos receptores GABAA, pois foram bloqueados por 5 μM gabazine, um antagonista do receptor GABAA (Figura 5A,à direita; n = 6). Os EPSPs foram observados em 11 dos 27 neurônios VIP iCc testados. Os EPSPs também eram pequenos (1,52 mV ± 1,08 mV) e tinham cinética moderada. Os tempos de aumento de 10 a 90% dos EPSPs foram de 8,3 ms ± 4,3 ms, meia-largura s 19,6 ms ± 7,6 ms, e as constantes de tempo de decomposição foram de 43,5 ms ± 16,8 ms (Figura 5B "Controle"). Os EPSPs foram mediados por receptores AMPA e NMDA. Aplicação de 50 μM D-AP5, um antagonista receptor NMDA, reduziu a meia largura de EPSP (14,3 ms ± 4,7 ms, p = 0,006) e tendência para reduzir o tempo de elevação (6,3 ms ± 1,6 ms, p = 0,09), tempo de decomposição constante (30,6 ms ± 7,3 ms, p = 0,06) e amplitude EPSP (1,38 ± 0,33 mV, p = 0,105; ANOVA para medições repetidas com teste pós-hoc tukey). Aplicação de 10 μM NBQX, um antagonista receptor AMPA, bloqueou o restante do EPSP (Figura 5B "+ AP5 & NBQX").

Gravações de neurônios VIP no ICc esquerdo após injeções de DCN revelaram EPSPs evocados por flashes de luz azul, confirmando entradas sinápticas do DCN para neurônios VIP no IC. Os experimentos do DCN CRACM foram realizados com bloqueadores gabaergicos e glicinérgicos no banho para bloquear IPSPs espontâneos. Descobrimos que pulsos de 2-5 ms de luz azul provocaram EPSPs em 19 dos 25 neurônios testados. Os EPS leves apresentaram amplitudes moderadas (2,85 mV ± 2,98 mV) e tempos de elevação relativamente lentos (4,2 ms ± 1,3 ms), meias larguras (20,6 ms ± 14,4 ms) e constantes de tempo de decomposição (22,0 ms ± 6,7 ms) (n = 6 células, dados não mostrados).

Todos os PSPs evocados pela ativação chronos ou ChrimsonR foram provocados de forma all-ou-none e não dimensionaram sua amplitude com o aumento da potência óptica (dados não mostrados). No entanto, esse resultado depende do número e fisiologia das sinapses transinfectadas que fornecem entrada para um determinado neurônio e, portanto, é provável que varie dependendo da combinação particular de projeção axonal e tipo de neurônio sendo investigado.

Figure 1
Figura 1: locais de injeção de rAAV e configuração experimental. (A)Local de injeção e configuração experimental para investigar projeções amissais. Esquerda: Uma construção rAAV (por exemplo, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH) é injetada no IC direito e gravações direcionadas são realizadas no IC contralateral. Certo: Durante as gravações de grampo de patch, as fibras transfectidas de Chronos são animadas com luz azul para provocar potenciais esponápticos. (B)Local de injeção e configuração experimental para investigar projeções de longo alcance da DCN ao IC. Esquerda: A construção chrimsonR é injetada na DCN direita e gravações direcionadas são executadas no IC contralateral. Certo: Durante as gravações de grampo de patch, as fibras transfecdas com ChrimsonR estão animadas com a luz vermelha para registrar potenciais postinapticos evocados pelo ChrimsonR. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: Expressão cronos-EGFP após injeções em IC e DCN. (A) Esquerda: Imagem da fatia coronal ic mostrando neurônios VIP com rótulo de tdTomato em toda a EXPRESSÃO IC (magenta) e Chronos-EGFP em somata localizada aos locais de injeção no IC direito (verde). Direito: Imagem de ampliação mais alta mostrando um neurônio VIP gravado (verde-branco) no IC contralateral ao local da injeção. A pontuação verde são chronos-EGFP expressando projeções do IC contralateral. (B) Imagem de fatia de tronco coronal mostrando expressão Cronos-EGFP no DCN após injeção rAAV-Chronos-EGFP. Esquerda: Imagem da DCN, mostrando fibras Transfecdas DCN e EGFP-positivas entrando na estria acústica dorsal. Meio: Imagem de ampliação mais alta mostrando corpos celulares transfeccionados por Chronos na DCN. Direito: Expressão cronos-EGFP em fibras e terminais no IC contralateral a partir de projeções DCN-IC de longo alcance. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 3
Figura 3: Expressão chrimsonR-tdTomato nas projeções da DCN e da DCN para o IC. (A) Imagem de uma fatia de tronco coronal de um rato em que o DCN certo foi injetado com rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH. Esquerda: Imagem da expressão ChrimsonR na DCN direita. Imagem de ampliação mais alta da DCN direita mostrando forte transfecção de neurônios com ChrimsonR. (B)Alta imagem de ampliação de axões DCN transfeccionados por ChrimsonR no IC. (C) EPSE optogeneticamente evocados registrados a partir de um neurônio VIP no IC contralateral ao rAAV-ChrimsonR injetou DCN. Traços originais são mostrados em cinza claro e EPSP médio está em vermelho. Caixa laranja indica tempo de 590 nm pulso de luz. Barras de escala = 20 ms/0,5 mV. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 4
Figura 4: Ativação de ChrimsonR por baixos níveis de luz azul. (A)Ativação de Chronos em projeções amissais por pulsos de 470 nm de luz azul. Topo: Traços originais (cinza claro) e médio (ciano) de IPSPs orientados por Chronos, evocados a uma potência óptica ligeiramente acima do limiar para ativação de Chronos (barras de escala mostram 20 ms/0,5 mV). Fundo: Relação entre potência óptica a 470 nm e a probabilidade de observar um PSP evocado por Chronos. (B)Ativação de ChrimsonR com 470 nm de luz azul. Topo: Traços originais (cinza claro) e média (vermelho) de EPS EPS orientados por ChrimsonR, evocados com 470 nm de luz azul na mesma potência óptica usada em A, topo (barras de escala mostram 20 ms/0,5 mV). Fundo: Relação entre potência óptica a 470 nm e a probabilidade de observar um PSP orientado por ChrimsonR. Observe que o limiar para ativação da luz azul dos PSPs ChrimsonR era idêntico ao limiar para provocar PSPs Chronos. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 5
Figura 5: Caracterização de PSPs evocados pela luz de sinapses comuns a neurônios VIP. O IC direito foi injetado com rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH e gravações foram feitas de neurônios VIP na CCI contralateral. (A)IPSPs optogeneticamente evocados foram evocados por flashes de luz azul de 2-5 ms (esquerda), enquanto os EPSPs foram bloqueados por 10 μM NBQX e 50 μM D-AP5. Os IPSPs foram abolidos pela gabazina (à direita). (B) EPS EPS optogeneticamente evocados foram evocados por flashes de luz azul de 2-5 ms (esquerda), enquanto os IPSPs foram bloqueados com 1 μM de estricnina e 5 μM gabazina. A lavagem de 50 μM D-AP5 reduziu significativamente a meia largura e a constante de tempo de decomposição de EPSPs (médio). A lavagem de 10 μM NBQX aboliu o EPSP restante (à direita). Traços originais em A e B são mostrados em cinza claro, e médias de até 50 traços individuais são mostrados em preto. De Goyer et al., 2019. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

X (lateral) Y (caudal) Z (profundidade)
Penetração de IC direito 1 1.000 μm -900 μm 2.250-1500 μm
(incrementos de 250 μm)
Penetração de IC direito 2 1.250 μm -900 μm 2.250-1750 μm
(incrementos de 250 μm)
Direito DCN 2.155 μm -1325 μm 4.750 μm, 4.550 μm

Tabela 1: Coordenadas estereotaxicas para injeções de rAAV em IC e DCN. Todas as coordenadas são relativas à lambda em μm. Coordenadas Z são medidas da superfície dorsal do crânio em lambda.

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Discussion

Descobrimos que o CRACM é uma técnica poderosa para identificar e caracterizar entradas sinápticas de longo alcance aos neurônios no IC do camundongo. Seguindo o protocolo detalhado aqui, alcançamos uma transição robusta de neurônios no DCN e no IC, bem como o tráfico axonal confiável de Chronos e ChrimsonR para terminais sinápticos no IC. Além disso, demonstramos que essa técnica permite a medição e análise de eventos postinapticos, incluindo amplitude PSP, meia largura, tempo de decomposição e farmacologia receptora. Nossa experiência sugere que essa abordagem pode ser prontamente adaptada para realizar experimentos funcionais de mapeamento de circuitos em todo o tronco auditivo e além.

No geral, a especificidade do mapeamento de circuitos optogenéticos fornece uma vantagem distinta sobre a estimulação elétrica dos axôlos. Transfecções virais fornecem a capacidade de restringir espacial e molecularmente a expressão de canaldopsinas a uma população direcionada de neurônios presinápticos. Em contraste, a estimulação elétrica não pode diferenciar entre axônses originários de diferentes núcleos pré-nápticos quando esses axôndeitos são misturados, como é o caso na maioria das regiões cerebrais. A estimulação elétrica também pode iniciar espinhos ordrômicos e antidrômicos, complicando ainda mais as coisas quando um local de estimulação distal contém axôlos originários de neurônios localizados perto do local de gravação.

Para garantir a expressão estável e o bom tráfico axonal de uma canaldopsina, escolher o vetor viral certo e o sorotipo é primordial. Descobrimos que a expressão estável de Chronos em neurônios IC foi alcançada com um rAAV sorotipo 1, incluindo uma construção cronos ou ChrimsonR combinada com um elemento regulatório pós-transcricional de hepatite de lenha (WPRE) e hormônio de crescimento bovino (BGH) sinal de poliadenylation. rAAV sorotipo 5 não conseguiu produzir opsinas funcionais no IC, mas foi funcional no DCN (dados não mostrados). A rigorosa validação das coordenadas de injeção para cada experimento e garantir que a expressão de opsina seja restrita à região cerebral direcionada é igualmente importante. Uma identificação significativa de insumos só é possível se a expressão da opsina for cuidadosamente verificada e documentada para cada experimento.

A construção rAAV1.ChrimsonR utilizada no protocolo acima rendeu expressão estável e bom tráfico axonal da proteína, mesmo em projeções de longo alcance da DCN ao IC (Figura 3). Isso faz de ChrimsonR uma opsina adequada para mapeamento de circuito (de longo alcance). Uma opsina de mudança vermelha como ChrimsonR pode ser útil se os parâmetros experimentais requerem penetração de luz profunda no tecido, mas o experimentador deve estar ciente de que todas as opsinas atualmente disponíveis em mudança vermelha mostram alguma ativação cruzada com luz azul. Embora alguns estudos tenham argumentado que ChrimsonR e Chronos podem ser ativados separadamente6,14,16,nossos dados sugerem que deve ser tomado um grande cuidado com essa abordagem. Um relatório recente detalha métodos adicionais que devem ser usados se tentar separar opsinas de mudança vermelha de Chronos13. Portanto, ao usar ChrimsonR e Chronos em duas cores experimentos CRACM, experimentos de controle cuidadosamente projetados precisam ser executados para garantir a clara separação da ativação de opsina azul e vermelho.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, projeto número 401540516, para DG) e Bolsa Nacional de Saúde R56 DC016880 (MTR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH Addgene 59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Addgene 59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) Jackson Laboratory stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-B4
Carproject (carprofen) Henry Schein Animal Health 59149
Drummond glas capillaries Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3 Drummond Scientific Company 3-300-207
Electrode beveler Sutter Instrument FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures Ethicon local pharmacy
Fixed stage microscope any n/a
Gas anesthesia head holder David Kopf Instruments 933-B
General surgery tools Fine Science Tools N/A
Golden A5 pet clipper Oster 078005-010-003
Heating pad Custom build N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system Patterson Scientific 78917760
Hot bead sterilizer Steri 250 Inotech IS-250
Iodine solution 10% MedChoice local pharmacy
Isoflurane vaporizer Patterson Scientific 07-8703592
Lidocain topical jelly 2% Akorn local pharmacy
Micro motor drill 1050 Henry Schein Animal Health 7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm Fine Science Tools 19007-05
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears Akorn local pharmacy
P-1000 electrode puller Sutter Instrument P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software any n/a
Portable anethesia machine Patterson Scientific 07-8914724
Small animal steroetaxic frame David Kopf Instruments 930-B
Standard chemicals local vendors N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes Dynarex 4410
Surgical marker Fine Science Tools 18000-30
Temperature controller Custom build N/A
Vibratome any n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) Jackson Laboratory stock #010908
Water bath any n/a

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References

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Neurociência Edição 156 mapeamento de circuito assistido pela Canaldopsina optogenética Chronos ChrimsonR coláculo inferior cérebros auditivos
Mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina de longo alcance de neurônios de coláculo inferior com canaldopsinas de mudança azul e vermelha
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Goyer, D., Roberts, M. T. Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (156), e60760, doi:10.3791/60760 (2020).

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