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Developmental Biology

हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके जेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल के स्तर का परिमाणीकरण

Published: February 11, 2020 doi: 10.3791/60766
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville

Summary

यह काम भ्रूण प्रसंस्करण और इथेनॉल विश्लेषण के लिए उचित जोखिम विधियों से सिर अंतरिक्ष गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करएक ज़ेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Abstract

भ्रूण अल्कोहल स्पेक्ट्रम विकार (एफएएसडी) चेहरे के डिस्मॉर्फोनी और न्यूरोलॉजिकल हानि सहित इथेनॉल-प्रेरित विकासात्मक दोषों के अत्यधिक परिवर्तनीय सातत्य का वर्णन करते हैं। एक जटिल विकृति के साथ, FASD हर साल संयुक्त राज्य अमेरिका में पैदा हुए 100 बच्चों में लगभग 1 को प्रभावित करता है। FASD की अत्यधिक चर प्रकृति के कारण, पशु मॉडल इथेनॉल-प्रेरित विकास दोषों की हमारी वर्तमान मशीनी समझ में महत्वपूर्ण साबित हुए हैं। प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या ने इथेनॉल-प्रेरित विकासात्मक दोषों की जांच करने के लिए जेब्राफिश का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित किया है। जेब्राफिश बाहरी रूप से निषेचित, आनुवंशिक रूप से पथीय, पारदर्शी भ्रूण की बड़ी संख्या का उत्पादन करता है। यह शोधकर्ताओं को कई आनुवंशिक संदर्भों में इथेनॉल एक्सपोजर के समय और खुराक को ठीक से नियंत्रित करने और लाइव इमेजिंग तकनीकों के माध्यम से भ्रूण इथेनॉल एक्सपोजर के प्रभाव की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। यह, आनुवंशिकी और मनुष्यों के साथ विकास दोनों के संरक्षण के उच्च स्तर के साथ संयुक्त, जेब्राफिश को एक शक्तिशाली मॉडल साबित किया है जिसमें इथेनॉल टेराटोजेनिकिटी के मशीनिस्ट आधार का अध्ययन करना है। हालांकि, इथेनॉल एक्सपोजर रेजिस्टेंस विभिन्न जेब्राफिश अध्ययनों के बीच भिन्न हैं, जिसने इन अध्ययनों में जेब्राफिश डेटा की व्याख्या को चकित कर दिया है। यहां हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके जेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल सांद्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है।

Introduction

भ्रूण अल्कोहल स्पेक्ट्रम विकार (एफएएसडी) भ्रूण इथेनॉल एक्सपोजर1से जुड़े न्यूरोलॉजिकल हानि और क्रैनियोफेशियल डिस्मोर्फोलोजी की एक विस्तृत सरणी का वर्णन करता है। इथेनॉल एक्सपोजर और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के समय और खुराक सहित कई कारक, FASD2,3की भिन्नता में योगदान करते हैं। मनुष्यों में, इन चरों का जटिल संबंध फाएसडी के एटिजियोलॉजी का अध्ययन और समझबनाता है। पशु मॉडल इथेनॉल टेराटोजेनिकिटी के यंत्रवादी आधार के बारे में हमारी समझ विकसित करने में महत्वपूर्ण साबित हुए हैं। FASD के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार की पशु मॉडल प्रणालियों का उपयोग किया गया है और परिणाम मनुष्यों में एक्सपोजर में पाए जाने वाले परिणामउल्लेखनीय रूप से सुसंगत रहे हैं4. कृंतक मॉडल सिस्टम का उपयोग एफएएसडी के कई पहलुओं की जांच करने के लिए किया जाता है, जिसमें चूहे सबसे आम5,6,7हैं। इस कार्य का अधिकांश हिस्सा विकासात्मक दोषों पर ध्यान केंद्रित कर 8,हालांकि बाद में इथेनॉल के संपर्क में आने से विकासात्मक विसंगतियों के साथ - साथ9को भी दिखाया गया है । इसके अलावा, चूहों की आनुवंशिक क्षमताओं ने एफएएसडी10,11के आनुवंशिक आधार की जांच करने की हमारी क्षमता में काफी सहायता की है। चूहों में इन अध्ययनों से दृढ़ता से पता चलता है कि ध्वनि हेजहोग मार्ग, रेटिनोइक एसिड सिग्नलिंग, सुपरऑक्साइड डिमुटेस, नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथास I, Aldh2 और Fancd28,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,के साथ जीन-इथेनॉल बातचीत कर रहेहैं, 19,20,21. इन अध्ययनों से पता चलता है कि पशु मॉडल FASD और उसके अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

जेब्राफिश इथेनॉल टेराटोजेनेसिस22,23के कई पहलुओं की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है . उनके बाहरी निषेचन, उच्च फेकंडिटी, आनुवंशिक ट्रैक्टेबिलिटी और लाइव इमेजिंग क्षमताओं के कारण, जेब्राफिश आदर्श रूप से इथेनॉल टेराटोजेनेसिस के समय, खुराक और आनुवंशिकी जैसे कारकों का अध्ययन करने के लिए अनुकूल हैं। इथेनॉल को भ्रूण का ठीक मंचन करने के लिए प्रशासित किया जा सकता है और भ्रूण को विकास प्रक्रियाओं के दौरान इथेनॉल के प्रत्यक्ष प्रभाव की जांच करने के लिए चित्रित किया जा सकता है। यह काम सीधे मनुष्यों से संबंधित हो सकता है, क्योंकि विकास के आनुवंशिक कार्यक्रम जेब्राफिश और मनुष्यों के बीच अत्यधिक संरक्षित हैं और इसलिए24एफएएसडी मानव अध्ययन का मार्गदर्शन करने में मदद कर सकते हैं। जबकि ज़ेब्राफिश का उपयोग इथेनॉल टेराटोजेनेसिस की जांच करने के लिए किया गया है, भ्रूण इथेनॉल सांद्रता की रिपोर्टकरने में आम सहमति की कमी मनुष्यों की तुलनामुश्किल 25बनाती है। स्तनधारी प्रणालियों में, रक्त-अल्कोहल का स्तर ऊतक इथेनॉल स्तर26से सीधे संबंधित है। जेब्राफिश अध्ययन के कई अपने संचार प्रणाली के पूर्ण गठन से पहले भ्रूण का इलाज। जांच करने के लिए कोई मातृ नमूना के साथ, भ्रूण के भीतर इथेनॉल के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए इथेनॉल सांद्रता का आकलन करने की प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। यहां हम हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके एक विकासशील जेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल सांद्रता की मात्रा निर्धारित करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।

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Protocol

इस प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले सभी जेब्राफिश भ्रूण ों को स्थापित आईएसयूसी प्रोटोकॉल27के बाद उठाया गया और पैदा किया गया । इन प्रोटोकॉलको ऑस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय और लुइसविल विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

नोट: जेब्राफिश लाइन टीजी (fli1:EGFP)y1 इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था28। इस प्रक्रिया में उपयोग किया जाने वाला सभी पानी बाँझ रिवर्स ऑस्मोसिस पानी है। ग्राफपैड चश्मे v8.2.1 का उपयोग करके सभी सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे।

1. भ्रूण मीडिया बनाना

  1. भ्रूण मीडिया का 20x स्टॉक बनाने के लिए, नैल के 17.5 ग्राम, केसीएल के 0.75 ग्राम, सीएसीएल2के 2.9 ग्राम, के2एचएमओ4के 0.41 ग्राम, एएएनए 2एचएमओ4के 0.142 ग्राम और 1 एल पानी में एमजीएसओ4·7एच2ओ का 4.9 ग्राम भंग करें। सफेद वर्षा है कि रूपों पर ध्यान न दें; इससे मीडिया पर कोई असर नहीं पड़ेगा। फिल्टर स्टॉक सॉल्यूशन को स्टरलाइज करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. काम कर रहे भ्रूण मीडिया समाधान बनाने के लिए, 20x भ्रूण मीडिया स्टॉक के 1 एल में NaHCO3 के १.२ ग्राम भंग और पानी के 19 एल जोड़ें । काम कर रहे भ्रूण मीडिया समाधान 28 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।

2. पानी विस्थापन का उपयोग कर भ्रूण की मात्रा को मापने

नोट: इस प्रोटोकॉल में, 24 घंटे पोस्टफर्टिलाइजेशन (एचपीएफ) भ्रूण(चित्रा 1)का उपयोग किया जाता है। मात्रा माप में उपयोग किए जाने वाले भ्रूण का उपयोग इथेनॉल विश्लेषण में नहीं किया जाता है।

  1. 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 10 भ्रूण और बाह्य तरल पदार्थ 250 μL(चित्रा 2ए)की मात्रा में चिह्नित रखें। 250 माइक्रोन फिल लाइन में पानी जोड़ें (चित्रा 2बीमें रंगे पानी के साथ नमूना देखें)।
  2. उन भ्रूणों के लिए गोदाम स्थापित करने के लिए चरण 2.1 दोहराएं जिन्होंने उनके चोरों को हटा दिया है।
    1. चोरियों को दूर करने के लिए, भ्रूण को 10 मीटर के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर भ्रूण मीडिया में 2 मिलीग्राम/mL के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण रखें। हर कुछ मिनटों में, धीरे-धीरे भ्रूण को चोरन को तोड़ने के लिए भंवर करें।
    2. एक बार सभी भ्रूण अपने chorion से मुक्त कर रहे हैं, प्रोटीज़ कॉकटेल से dechorionated भ्रूण को दूर/ इस वॉश स्टेप को 1 और बार (कुल 2 वॉश के लिए) दोहराएं। भ्रूण को एक ताजा 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  3. सबसे छोटी टिप का उपयोग करना संभव है और भ्रूण को नुकसान पहुंचाए बिना, ध्यान से एक p200 माइक्रोपाइपेटर(चित्रा 2सी)का उपयोग कर भ्रूण के आसपास से सभी तरल को हटा दें और <0.1 मिलीग्राम परिशुद्धता के साथ एक पैमाने के साथ पानी वजन । 10 भ्रूणों के नमूने की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 250 माइक्रोन से हटाया गया पानी का वजन/मात्रा घटाएं (1 किलोपानी = 1 ग्राम पानी।) । एक भ्रूण की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 250 μL और 10 द्वारा हटाए गए पानी के वजन के बीच अंतर को विभाजित करें।

Equation 1

Equation 2

3. इथेनॉल के साथ भ्रूण का इलाज

  1. संभोग टैंक से भ्रूण इकट्ठा करें और एक मानक 100 मिमी पेट्री डिश में रखें। एक पेट्री डिश प्रति 100 से अधिक भ्रूण की गणना करें और 28.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि चोराने को हटाया जाना है (चरण 2.2), तो इसे इथेनॉल जोड़ने से पहले हटाने की आवश्यकता है।
  2. 6 एचपीएफ में, एक नए मानक 100 मिमी पेट्री डिश में 100 भ्रूण ों को जोड़ें या तो भ्रूण मीडिया या भ्रूण मीडिया + 1% इथेनॉल (v/v) के साथ। कवर करें, लेकिन पेट्री डिश को सील न करें। भ्रूण को 18 घंटे के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए कम अस्थायी इनक्यूबेटर में रखें, या जब तक भ्रूण 24 एचपीएफ के विकासात्मक समय बिंदु तक न पहुंच जाए।

4. हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी के लिए भ्रूण को संसाधित करने से पहले कार्यप्रवाह तैयार करना

  1. सभी प्रोटीन ों को विकृत करने और इथेनॉल चयापचय को रोकने के लिए पानी में 5 एम एनसीएल (प्रति नमूना ट्यूब 450 माइक्रोन की आवश्यकता होगी) का समाधान करें। भ्रूण मीडिया में 2 मिलीग्राम/mL की एकाग्रता पर प्रोटीज़ कॉकटेल(सामग्रीकी तालिका) बनाओ ।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए 1.5 एमएल माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब और 2 एमएल गैस क्रोमेटोग्राफ शीशी लेबल करें। नीचे वर्णित इथेनॉल मानकों के साथ-साथ हवा, पानी, और 5 एम NaCl/प्रोटीज़ कॉकटेल रिक्त स्थान के लिए अतिरिक्त 2 mL गैस क्रोमेटोग्राफ शीशियों लेबल ।
  3. तीन p200 माइक्रोपाइप्टर दो सेट से 50 माइक्रोनल की स्थापना करें, और तीसरा सेट 200 माइक्रोन एल तक; एक p1000 माइक्रोपाइपेटर 450 माइक्रोनल और एक पी 2 माइक्रोपाइपेटर सेट टू 2 माइक्रोनल के लिए सेट किया गया है। पेट्री व्यंजनों से भ्रूण को 1.5 मिलीएम माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास पिपेट के लिए, जल्दी से किनारों को चिकनी करने के लिए एक लौ के माध्यम से पिपेट टिप को पारित करें ताकि उन्हें पिपेट में खींचते समय भ्रूण को नुकसान न हो।

5. हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी के लिए भ्रूण प्रसंस्करण

नोट: उनके chorions में दोनों भ्रूण और उन पहले से अपने chorions से हटा दिया कमजोर पड़ने कारकों की गणना में निरंतरता के लिए एक ही इलाज कर रहे हैं ।

  1. 50 माइक्रोपाइप्टर सेट को 50 माइक्रोपाइप्टर का उपयोग करके, प्रोटीज़ कॉकटेल समाधान के 50 माइक्रोन को एक में आकर्षित करें और दूसरे में 50 माइक्रोन पानी आकर्षित करें।
  2. ग्लास पिपेट और माइक्रोपाइपेटर का उपयोग करके, 1.5 मिलील माइक्रोसेन्ट्रेफ्यूज ट्यूब में 10 भ्रूण (चरण 3.2 से) जल्दी रखें और टोपी को बंद करें (जैसा कि चित्रा 2एमें वर्णित है)। सभी नमूनों का परीक्षण, नियंत्रण और इथेनॉल इलाज भ्रूण के लिए दोहराएं।
  3. 200 माइक्रोपाइपेटर सेट का उपयोग करके 200 माइक्रोनल को सेट करें, जल्दी से टोपी खोलें और सभी अवशिष्ट भ्रूण मीडिया को हटा दें (जैसा कि चित्रा 2सीमें वर्णित है)। जल्दी से ट्यूब में पानी के 50 μL युक्त पिपेट रखें और तेजी से लेकिन धीरे से (भ्रूण को नुकसान नहीं पहुंचाने के लिए) जोड़ें, फिर पानी को हटा दें। जल्दी से वेटिंग पाइपेटर से प्रोटीज़ कॉकटेल समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें और ट्यूब कैप(चित्रा 2डी)को बंद करें।
    नोट: इस प्रक्रिया को एक समय में एक नमूना प्रदर्शन करें।
  4. नमूना 10 मेंस के लिए आरटी पर बैठने के लिए प्रोटीज़ कॉकटेल chorion नीचा करने के लिए अनुमति देते हैं । इसके बाद जल्दी से 5 एम एनसीएल के 450 माइक्रोन डालें और ट्यूब कैप(फिगर 2ई)को बंद कर दें। भंवर 10 मिन के लिए नमूने । प्रक्रिया को गति देने के लिए मिक्सर को एक ही समय में कई नमूने भंवर में स्थापित करें ।
    नोट: एक सिलिका बीन मिश्रण (2 आकार, 0.5 मिमी और 1 मिमी माक) की एक छोटी राशि (~ 100 μL) 24 एचपीएफ से पुराने भ्रूण के साथ किसी भी ट्यूब में जोड़ें। पुराने भ्रूण में, नोटोकॉर्ड बरकरार रहेगा चाहे वे कब तक समरूप हों।
  5. 10 मिन के लिए समरूपता के बाद, जल्दी से समरूप भ्रूण अधिनात के 2 μL को हटा दें और एक गैस क्रोमेटोग्राफ शीशी में जोड़ें। पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन कैप के साथ शीशी को जल्दी से सील करें।

6. मीडिया और इथेनॉल मानकों को तैयार करना

  1. मीडिया मानकों को तैयार करने के लिए, एक 5 एम NaCl के साथ 10 के एक कारक से मीडिया को कमजोर/ प्रत्येक नमूने का 2 माइक्रोन गैस क्रोमेटोग्राफ शीशी में जोड़ें और पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन कैप के साथ सील करें।
  2. इथेनॉल मानकों को तैयार करने के लिए, निम्नलिखित सांद्रता के लिए 5 एम NaCl/protease कॉकटेल समाधान में 100% इथेनॉल का एक धारावाहिक कमजोर बनाने: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, और 40 मीटर। एक गैस क्रोमेटोग्राफ शीशी में प्रत्येक मानक के 2 μL जोड़ें और एक पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन टोपी के साथ सील करें।

7. हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफ तैयार करना

नोट: इस सेटअप और प्रोटोकॉल को इस्तेमाल किए गए गैस क्रोमेटोग्राफ के आधार पर बदलने की आवश्यकता हो सकती है। हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग इथेनॉल के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, न कि अलगाव के लिए।

  1. ऑटोसैंपलर के लिए हीटर को 58 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें और चालू करें। हीटर को 58 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने की अनुमति दें, और गैस क्रोमेटोग्राफ (इथेनॉल की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लौ आयनीकरण के लिए) को खिलाने वाली हवा और हाइड्रोजन गैस लाइनों को चालू करें।
    नोट: साई को निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार क्रोमेटोग्राफ को ठीक से संचालित करने के लिए सेट किया जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि हीलियम लाइन चालो और उचित साई के लिए सेट है।
  2. पट के लिए, सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन नमूनों की संख्या और 100 नहीं है। इंजेक्शन फाइबर के लिए, सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन नमूनों की संख्या >500 नहीं है।
    नोट: यदि या तो इंजेक्शन की मात्रा से अधिक है, वे परीक्षण के नमूनों को चलाने से पहले बदलने की आवश्यकता होगी ।
  3. विश्लेषण सॉफ्टवेयर चालू करें और सुनिश्चित करें कि वर्कस्टेशन ठीक से स्थापित है। लैब/विभाग के मानकों के अनुसार सभी डेटा स्टोर करें। नमूनों को चलाने के लिए एक नई नमूना सूची बनाएं।
  4. स्टार्टअप विधि शुरू करें और नमूनों को चलाने से पहले लौ आयनीकरण डिटेक्टर को स्थिर करने के लिए प्रतीक्षा करें। एक बार स्थिर होने के बाद, फाइबर को साफ करने के लिए सॉफ्टवेयर स्टार्टअप विधि चलाएं।

8. हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके नमूना माप

  1. एक बार स्टार्टअप विधि पूरी हो जाने के बाद सैंपल लिस्ट में प्रति सैंपल 1 नई लाइन बनाएं। विश्लेषण सॉफ्टवेयर में तरीकों मेनू से, लोड 436 वर्तमान स्मे इथेनॉल 2013 3min आरजी रन 2_5min अवशोषित करें। नमूना सूची में प्रत्येक नमूने के लिए METH।
    1. नमूना सूची भरें, हवा, पानी, 5 एम NaCl/प्रोटीज़ कॉकटेल रिक्त स्थान के साथ शुरू । फिर 0.3125 से 40 एमएम तक मानकों में प्रवेश करें। हवा, पानी, और 5 एम NaCl के एक दूसरे दौर के साथ मानकों का पालन करें/
    2. सभी समरूप भ्रूण अलौकिक नमूनों का परीक्षण किया जा करने के लिए दर्ज करें, सबसे कम से उच्चतम भविष्यवाणी इथेनॉल एकाग्रता के लिए । हवा, पानी, और 5 एम NaCl के एक तिहाई और अंतिम दौर में प्रवेश करके अंत/
  2. जिस क्रम में नमूनों में प्रवेश किया गया था, उसक्रम में ऑटोसैंपलर में गैस क्रोमेटोग्राफ शीशियों को जोड़ें। नमूने को 10-15 सीन के लिए गर्म करने दें। सॉफ्टवेयर में सैंपल चलाना शुरू करें।
  3. सभी नमूनों और अंतिम रिक्त स्थान ों के चलने के बाद, नमूना सूची में एक अंतिम नमूना जोड़कर और स्टैंडबाय चलाकर सॉफ्टवेयर में शटडाउन विधि को सक्रिय करें। मुझेटीएच। नमूना रन के दौरान प्राप्त सभी डेटा का बैकअप करें। निम्नलिखित क्रम में उपकरण बंद करें: ऑटोसैंपलर हीटर, हाइड्रोजन टैंक और क्रोमेटोग्राफ तापमान 30 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के बाद ही, हवा टैंक। मोम स्तंभ को संरक्षित करने के लिए हीलियम टैंक को छोड़ दें।

9. नमूना इथेनॉल पीक एकीकरण और नमूना एकाग्रता विश्लेषण

नोट: 9.3 से सभी मूल्यों की गणना एक एक्सेल फ़ाइल में की गई थी जो सभी समीकरणों को पहले से भरा हुआ था।

  1. शटडाउन विधि पूरी होने के बाद ओपन क्रोमेटोग्राम पर क्लिक करें। परिणाम वाले फ़ोल्डर खोलें। इस कार्यक्रम में नमूने स्वचालित रूप से एकीकृत होते हैं।
  2. परिणामों में, सुनिश्चित करें कि सही चोटियों को एकीकृत किया गया है (इथेनॉल चोटियों 2 और 2.5 के बीच)। एक बार सभी नमूनों की पुष्टि हो जाने के बाद, परिणामों को प्रिंट या निर्यात करें।
  3. एक ग्राफ पर इथेनॉल मानकों की चोटी की ऊंचाई प्लॉट। इथेनॉल मानकों के लिए ढलान, वाई इंटरसेप्ट और आर2 मूल्यों की गणना करें (आर2 और 0.99 होना चाहिए)।
    नोट: इन मूल्यों का उपयोग नमूना चोटी ऊंचाई से इथेनॉल एकाग्रता निर्धारित करने के लिए किया जाएगा।
  4. प्रत्येक नमूने के लिए, इथेनॉल मानकों के वाई अवरोधन से नमूने की चोटी की ऊंचाई घटाना। जीसी शीशियों में प्रत्येक नमूने के लिए इथेनॉल मूल्य प्राप्त करने के लिए इथेनॉल मानकों की ढलान से इस मूल्य को विभाजित करें।

Equation 3

  1. भ्रूण में इथेनॉल एकाग्रता की गणना करने के लिए, पहले प्रत्येक नमूने के लिए कमजोर पड़ने के कारक की गणना करें। इस प्रोटोकॉल के चरण 2.3 में गणना की गई मात्रा उपाय लें और इसे वॉल्यूम उपाय प्लस 500 माइक्रोन द्वारा विभाजित करें। यह भ्रूण प्रसंस्करण (चरण 5.3 और 5.4) के दौरान प्रत्येक नमूने में जोड़े गए 5 एम एनसीएल/प्रोटीज़ कॉकटेल समाधान का प्रतिनिधित्व करता है।

Equation 4

  1. इस नमूना कमजोर पड़ने वाले कारक का उपयोग करके, प्रत्येक नमूने के लिए नमूना इथेनॉल मूल्य से गुणा करें। परिणाम एमएम एकाग्रता में रहेंगे। 10 के कमजोर पड़ने कारक द्वारा मीडिया इथेनॉल मूल्य गुणा करके मीडिया संदर्भ नमूनों की गणना करें।

Equation 5

Equation 6

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Representative Results

रक्त इथेनॉल का स्तर प्रारंभिक भ्रूणीय जेब्राफिश में निर्धारित नहीं किया जा सकता है, क्योंकि उनमें पूरी तरह से गठित परिसंचरण प्रणाली की कमी है। जेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल एकाग्रता के स्तर को निर्धारित करने के लिए, इथेनॉल के स्तर को सीधे समरूप भ्रूण ीय ऊतक से मापा जाता है। भ्रूण इथेनॉल सांद्रता को ठीक से मापने के लिए, भ्रूण की मात्रा को ध्यान में रखना होगा। भ्रूण (जर्दी संलग्न) कोरिऑन (अंडे के नरक) के अंदर बैठता है जो विवाहाय द्रव(चित्रा 1)से घिरा हुआ है। भ्रूण के किसी भी मात्रा उपाय जोखिम के समय भ्रूण पर किया जाना है, क्योंकि भ्रूण की मात्रा विकास के समय में बदल जाएगा के रूप में भ्रूण आकार में बढ़ जाती है । इसके अलावा, भ्रूण को कैसे संसाधित किया जाता है, इसपर ध्यान दिया जाना चाहिए और साथ ही भ्रूणीय मात्रा को भी ध्यान में रखना होगा, क्योंकि ये दोनों तत्व भ्रूणीय इथेनॉल के स्तर की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कमजोर पड़ने वाले कारक पैदा करते हैं।

क्योंकि भ्रूण एक आदर्श क्षेत्र नहीं है, विशेष रूप से 10 एचपीएफ के बाद, भ्रूण की मात्रा का आकलन करने के लिए पानी विस्थापन का उपयोग किया गया था। इस अध्ययन में 24 एचपीएफ पर भ्रूण का इस्तेमाल किया गया। भ्रूण की मात्रा दोनों अपने chorion में और उनके chorion से हटा दिया गया । ये मात्राएं वनस्पति तरल पदार्थ के साथ भ्रूण के लिए 1.97 (± 0.4 एसडी) माइक्रोन थीं, और अकेले भ्रूण के लिए 1.1 (± 0.22 एसडी) माइक्रोन(टेबल 1)। भ्रूण के साथ भ्रूण और अकेले भ्रूण के बीच यह अंतर विवाहावक्त तरल पदार्थ की मात्रा है, जो चोरन के अंदर भ्रूण को घेर लेता है(चित्रा 1)। यह अंतर नमूनों में अकेले भ्रूण की इथेनॉल एकाग्रता का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है। विश्लेषण से, भ्रूण में कोरिऑन(टेबल 1)के अंदर विवाहावक्त तरल पदार्थ के साथ भ्रूण की मात्रा का कुल 56% शामिल था। जैसे-जैसे भ्रूण बढ़ता गया, समय के साथ भ्रूणकी मात्रा बढ़ती गई, जिसके परिणामस्वरूप25बाहरी तरल पदार्थ की मात्रा में कमी आई। भ्रूण से इथेनॉल सांद्रता को मापते समय अभी भी उनके चोराव में, भ्रूण और विवाहाचारतरल तरल पदार्थ दोनों में पानी की मात्रा को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

पहले प्रकाशित कार्य से पता चला है कि अकेले भ्रूण में पानी का अंश 73.6%29है । यह परिणाम मात्रा उपायों, इलेक्ट्रॉन स्पिन अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी, और चुंबकीय अनुनाद माइक्रोस्कोपी के संयोजन का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। इस परिणाम की पुष्टि करने के लिए, भ्रूण को पहले और 70 डिग्री सेल्सियस पर बेकिंग के बाद अकेले तौला गया था, जैसा कि पहले25वर्णित था। यह प्रक्रिया भ्रूण से सभी पानी निकाल ती है। वजन में परिवर्तन भ्रूण में पानी की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है। इस विश्लेषण से, एक 24 एचपीएफ भ्रूण में ~ 72% पानी था जबकि 48 एचपीएफ भ्रूण में ~ 76% था। ये दोनों मूल्य 73.6% भ्रूणीय जल मात्रा के समान हैं जो पहले29की गणना करते थे । यह पता चलता है कि भ्रूण के पानी की मात्रा जल्दी विकास के दौरान थोड़ा बदलता है ।

भ्रूण में पानी की मात्रा की गणना करने के लिए कई दृष्टिकोणों का उपयोग करके प्रकाशित कार्य के आधार पर, 73.6% प्रस्तुत विश्लेषणों के सभी के लिए भ्रूणीय पानी की सामग्री के रूप में उपयोग किया गया था। इसके परिणामस्वरूप पानी में भ्रूण की मात्रा(तालिका 1)के 1.1 माइक्रोन का 0.82 माइक्रोन शामिल था। इससे, बट्टेहुए तरल पदार्थ की मात्रा 0.86 माइक्रोन के रूप में गणना की गई थी। भ्रूण के कुल पानी की मात्रा में से 49% भ्रूण में निहित है और 51% विवाहेतर तरल पदार्थ(तालिका 1)में है।

गैस क्रोमेटोग्राफी विश्लेषण के लिए, केवल 24 एचपीएफ भ्रूण अभी भी उनके चोरियन में इस्तेमाल किया गया(चित्रा 1)। इस इथेनॉल आहार में, भ्रूण को 6-24 एचपीएफ से 1% (171 mM) इथेनॉल मीडिया एकाग्रता के साथ इलाज किया गया था, हालांकि प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर विभिन्न इथेनॉल सांद्रता और एक्सपोजर टाइम खिड़कियों का उपयोग किया जा सकता है। 15 नमूनों के दो समूहों (प्रति नमूना 10 भ्रूण) और मीडिया जिसके साथ वे 2 अलग प्रयोगात्मक दिनों(तालिका 2)से अधिक इलाज किया गया विश्लेषण किया गया । मीडिया का स्तर प्रयोग से प्रयोग तक भिन्न हो सकता है। इसके लिए, मीडिया इथेनॉल का स्तर प्रति प्रायोगिक समूह 5x मापा गया था। इस विश्लेषण में, समूह 1 के लिए मीडिया का स्तर 143.6 (± 2.3 एसडी) एमएम और समूह 2 के लिए 133.6 (± 2.7 एसडी) एमएम था। ये मान एक अनपेयर टी टेस्ट (पी = 0.0002) का उपयोग करके काफी अलग हैं। बहिर्भ्रूणीय द्रव वाले भ्रूण क्रमशः समूह 1 और 2 के लिए औसतन 63.5 (± 17.1 एसडी) एमएम और 53.1 (± 12.6 एसडी) एमएम थे। हालांकि, मात्रा में भ्रूण के 2 समूहों के बीच असाधारण तरल पदार्थ (अपेयर टी परीक्षण, पी = 0.07) के साथ काफी अलग नहीं था। अनुपचारित नियंत्रण भ्रूण 0 mM पर मापा गया । मीडिया के स्तर में भिन्नता के कारण, प्रत्येक नमूने के लिए भ्रूणीय इथेनॉल एकाग्रता/इथेनॉल के मीडिया स्तर के अनुपात की गणना की गई थी । ग्रुप 1 में मीडिया इथेनॉल का 44% स्तर था, जबकि ग्रुप 2 में मीडिया इथेनॉल का 40% स्तर था(चित्रा 3 और तालिका 2)।

Figure 1
चित्रा 1: चोरोन के अंदर 24 घंटे पोस्टफर्टिलाइजेशन (एचपीएफ) पर भ्रूण की छवि। भ्रूण और जर्दी बहिर्भ्रूणीय तरल पदार्थ से घिरे हुए हैं, सभी चोरियन के अंदर स्थित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: भ्रूण की मात्रा को मापने और विश्लेषण के लिए भ्रूण की प्रक्रिया के लिए प्रोटोकॉल । (क)1.5 मिलील माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित किए गए दस 24 एचपीएफ भ्रूण 250 माइक्रोनिल मात्रा में चिह्नित हैं। (ख)पानी से भरे भ्रूण के साथ माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब (पानी रंगे हुए है इसलिए 250 माइक्रोन मार्क पर देखना आसान है)। (ग)सभी पानी को ट्यूब से निकालकर तौला जाता है। (D)दस भ्रूण एक १.५ मिलीस माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब को हस्तांतरित । पानी में(सी)के रूप में हटा दिया गया था और प्रोटीज़ कॉकटेल के ५० μL के साथ प्रतिस्थापित किया गया था । (ई)10 मिन के बाद, 5 एम एनसीएल के 450 माइक्रोन(डी)से ट्यूब में जोड़ा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: बॉक्स और मूंछ साजिश मीडिया के लिए नमूनों के इथेनॉल एकाग्रता के अनुपात का । प्रत्येक समूह के लिए इथेनॉल एकाग्रता उस समूह के मीडिया नमूनों के औसत से विभाजित किया गया था। समूह 1 में मीडिया के स्तर का 44% था, जबकि समूह 2 में 40% थे। दोनों समूहों में, एन = 15; प्रति नमूना 10 भ्रूण। समूहों की तुलना एक तरह से ANOVA का उपयोग करके एक टकी के पोस्ट हॉक विश्लेषण (**** पी एंड एलटी; 0.0001) के साथ की गई थी। मूंछ अधिकतम करने के लिए न्यूनतम प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

भ्रूण और भ्रूण + विवाहावतर पानी की मात्रा (μL)
पानीएक
कुल वॉल्यूमबी कुल मात्रा का% (V) भ्रूण मात्रा (डब्ल्यू) विवाहावक्ता मात्रा (एक्स) भ्रूण में % पानी (वाई) % पानी में असाधारण (जेड)
भ्रूण + असाधारण (ईई)सी 1.97 ± 0.4
भ्रूण 24 एचपीएफ (ई)सी 1.11 ± 0.22 56% 0.82 0.86 49% 51%
गणना
वी कुल मात्रा का भ्रूण % = ई की कुल मात्रा ─ ईई की कुल मात्रा
डब्ल्यू भ्रूणीय जल मात्रा = V × 73.6%
एक्स असाधारण जल मात्रा = डब्ल्यू - ईई की कुल मात्रा
Y%भ्रूण में पानी = (डब्ल्यू + एक्स)/डब्ल्यू × 100
एक्स्ट्राभ्रूणीय = 100 में Z%पानी - वाई
एक भ्रूणीय पानी की मात्रा की गणना हाजेडोर एट अल.29 से की गई थी।
ख मानों को ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में सूचित किया जाता है।
cn = 13; प्रति नमूना 10 भ्रूण

तालिका 1: भ्रूण तरल पदार्थ के साथ भ्रूण के लिए पानी की मात्रा की गणना। मात्रा 13 नमूनों (प्रति नमूना 10 भ्रूण) से 24 एचपीएफ भ्रूण से विवाहाधवक तरल पदार्थ के साथ अभी भी chorion और भ्रूण उनके chorion से हटा से गणना की गई थी । मूल्यों का मतलब ± एसडी के रूप में सूचित कर रहे हैं ।

भ्रूण और मीडिया (एमएम) की इथेनॉल एकाग्रताएक
ग्रुप 1 ग्रुप 2 संयुक्त
मीडिया (एम)बी 143.6 ± 2.3 133.6 ± 2.7 138.6 ± 5.8
भ्रूण + असाधारण (ईई)सी 63.5 ± 17.1 53.1 ± 12.6 58.3 ± 15.7
इथेनॉल का अनुपात - मीडिया के लिए भ्रूण (1) 0.44 ± 0.12 0.40 ± 0.09 0.42 ± 0.11
गणना
1 इथेनॉल का अनुपात = ईई = एम
एक मानों ± एसडी के रूप में सूचित कर रहे हैं।
खएन = 5
cn = 15; प्रति नमूना 10 भ्रूण
द मान समूह 1 और 2 का औसत है।

तालिका 2: भ्रूण में इथेनॉल एकाग्रता की गणना, जिसमें भ्रूणीय तरल पदार्थ और मीडिया (एमएम) होता है। मीडिया के नमूनों मीडिया से प्रत्यक्ष उपाय थे (n = 5 प्रति समूह) । भ्रूण इथेनॉल एकाग्रता की गणना 15 नमूनों (प्रति नमूने 10 भ्रूण) से 24 एचपीएफ भ्रूण से विवाहाचारी तरल पदार्थ के साथ की गई थी । मीडिया के लिए विवाहावविज्ञान तरल पदार्थ के साथ भ्रूण के इथेनॉल सांद्रता के अनुपात की गणना की गई । मूल्यों का मतलब ± एसडी के रूप में सूचित कर रहे हैं ।

भ्रूणए, बी में इथेनॉल की गणना
भ्रूण (वाई) मीडिया के लिए अनुपात (जेड)
32.7 ± 8.8 एमएम 0.24 ± 0.06
गणना
वाई भ्रूण इथेनॉल = 58.3 mM (तालिका 2) × 56% (तालिका 1)
जेड इथेनॉल का अनुपात = वाई = 138.6 mM (तालिका 2)
एक मान समूह 1 और 2 का औसत है।
ख मानों ± एसडी के रूप में सूचित कर रहे हैं।

तालिका 3: भ्रूण में इथेनॉल की गणना। भ्रूणइथेनइथेन इथेनॉल एकाग्रता की गणना भ्रूण की कुल इथेनॉल एकाग्रता के 56% के रूप में की गई थी, जिसमें विवाहावचारिक तरल पदार्थ था। इसके बाद इसे मीडिया को भ्रूण के अनुपात के रूप में बताया गया । मूल्यों का मतलब ± एसडी के रूप में सूचित कर रहे हैं ।

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Discussion

एक विकासात्मक मॉडल प्रणाली के रूप में, जेब्राफिश विकास पर पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल हैं। वे बाहरी रूप से निषेचित भ्रूण की बड़ी संख्या का उत्पादन करते हैं, जो इथेनॉल अध्ययन में सटीक समय और खुराक प्रतिमान के लिए अनुमति देता है। यह, जीवित इमेजिंग क्षमताओं और मनुष्यों के साथ आनुवंशिक और विकासात्मक संरक्षण के साथ संयुक्त, जेब्राफिश को टेराटोलॉजी अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली बनाते हैं। वर्णित सिर अंतरिक्ष गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करजेब्राफिश भ्रूण विकसित करने में भ्रूण इथेनॉल सांद्रता को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल है।

भ्रूण इथेनॉल एकाग्रता का निर्धारण विकासशील भ्रूण के लिए इथेनॉल के प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। कृंतक मॉडल में, रक्त इथेनॉल सांद्रता ऊतक सांद्रता26से संबंधित है। हालांकि, जेब्राफिश में प्रारंभिक भ्रूणीय विकास में रक्त इथेनॉल के स्तर का आकलन करना संभव नहीं है। हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग विभिन्न प्रायोगिक प्रतिमानों में इथेनॉल के स्तर को मापने के लिए किया गया है, जिसमें जेब्राफिश25,30 ,31,32,33,34,35शामिल हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग कई विभिन्न पर्यावरणीय कारकों को मापने के लिए किया जा सकता है, भले ही इन विभिन्न कारकों की अस्थिरता मात्रात्मक रूप से मापने के लिए पर्याप्त उच्च होने की आवश्यकता है और प्रश्न में यौगिकों के ध्रुवीकरण के आधार पर गैस क्रोमेटोग्राफ कॉलम को चुना जाना चाहिए। इसके अलावा, जेब्राफिश पानी में घुलनशील कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त हैं, क्योंकि हाइड्रोफोबिक कारकों के संपर्क में मछली में विश्लेषण करना बेहद मुश्किल है।

यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को सीधे जेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल सांद्रता का आकलन करने की अनुमति देगा। हालांकि, भ्रूण इथेनॉल सांद्रता के सटीक माप सुनिश्चित करने के लिए कई कारकों को संबोधित करना होगा। क्योंकि कुल भ्रूण ऊतकों में इथेनॉल के स्तर को मापा गया था, भ्रूण की मात्रा पर विचार किया जाना था । 10 एचपीएफ के बाद भ्रूण सोमिटोजेनेसिस (सोमाइट गठन) शुरू होता है और अब एक गोला नहीं है(चित्रा 1)। भ्रूण की मात्रा का आकलन करने के लिए, पानी विस्थापन प्रति नमूने 10 पूल भ्रूण पर इस्तेमाल किया गया था । प्रत्येक नमूना दो कारणों के लिए 10 भ्रूण के शामिल: पहले, छोटे संस्करणों pipetting से त्रुटि को कम करने के लिए, और दूसरा, भ्रूण की मात्रा में छोटे उतार चढ़ाव औसत के लिए । भ्रूण की मात्रा को मापते समय, पाइपटिंग और वजन की सटीकता पर विचार करना महत्वपूर्ण है। यहां तक कि प्रति नमूना 10 भ्रूण का उपयोग दोनों पिपेट और भ्रूण वजन के लिए इस्तेमाल किया पैमाने के लिए परिशुद्धता की निचली सीमा पर है । उपलब्ध उपकरणों के साथ, 10 से कम भ्रूण का उपयोग विश्लेषण प्रभावित होता । यह शोधकर्ताओं को नमूने के प्रति कम भ्रूण का उपयोग करने से सीमित नहीं करता है जब तक उपकरण परिशुद्धता पर विचार किया जाता है ।

भ्रूण की मात्रा नमूना विश्लेषण को प्रभावित करने वाला एक कारक है। एक दूसरा प्रमुख कारक भ्रूण प्रसंस्करण गति है, क्योंकि इथेनॉल अस्थिर है। इसके अलावा, इथेनॉल25,36,37में कई पशु अध्ययनों में जल्दी से समान हो जाता है। हमारा वॉश प्रोटोकॉल को चोरियन की बाहरी सतह का पालन करने वाले किसी भी इथेनॉल को जल्दी से हटाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इस अध्ययन में इस वॉश प्रोटोकॉल ने भ्रूण इथेनॉल के स्तर को प्रभावित नहीं किया, हालांकि लंबे समय तक या कई वॉश भ्रूण इथेनॉल सांद्रता25,38को प्रभावित कर सकते हैं। फिर भी ध्यान में रखने के लिए एक तीसरा कारक प्रसंस्करण के दौरान भ्रूण की मात्रा को कमजोर करना है। यह प्रोटोकॉल शराब प्रसंस्करण एंजाइमों सहित सभी प्रोटीन को विकृत करने के लिए चोरन के साथ-साथ 5 एम नैक को नीचा दिखाने के लिए एक प्रोटीज़ कॉकटेल का उपयोग करता है।

अंत में, जेब्राफिश अध्ययनों की एक विस्तृत विविधता में विश्लेषण और रिपोर्टिंग विधियों की एक श्रृंखला का वर्णन किया गया है। अध्ययन के विभिन्न नमूनों के भीतर भिन्नता या विभिन्न अध्ययनों की तुलना करने के कारण, इथेनॉल एकाग्रता की उचित रिपोर्टिंगमहत्वपूर्ण 25,38है। अप्रत्यक्ष (आमतौर पर एंजाइमैटिक उपाय) का उपयोग करने वाले तरीके माध्यमिक मेटाबोलाइट के विश्लेषण पर भरोसा करते हैं। उस मामले में, एंजाइमैटिक गतिविधि की दर भिन्न हो सकती है और इथेनॉल एकाग्रता के सटीक विश्लेषण में बाधा डाल सकती है। यह विधि सीधे इथेनॉल के स्तर को मापता है, और इथेनॉल सांद्रता को मीडिया सांद्रता के लिए भ्रूण के अनुपात के रूप में सूचित किया जाता है। हमारे परिणाम 24 एचपीएफ भ्रूण की बढ़ती सहमति के अनुरूप हैं जिसमें मीडिया सांद्रता का ~30%(तालिका 3)25,38,39,40है . आश्चर्य की बात है, यह 30% भ्रूण इथेनॉल एकाग्रता मीडिया एकाग्रता से स्वतंत्र है, और यह अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है कि यह संतुलन25,38क्या बनाता है। 24 एचपीएफ शो से पुराने भ्रूण इथेनॉल सांद्रता में कम हो जाते हैं, ४८ एचपीएफ भ्रूण के साथ एक 24 एचपीएफ भ्रूण25के इथेनॉल सामग्री का लगभग आधा युक्त । हालांकि, हमारे परिणाम इथेनॉल-पानी संतुलन निर्धारित नहीं करते हैं। जिस गति से इथेनॉल समान रूप से, साथ ही इथेनॉल की अस्थिरता को देखते हुए, इथेनॉल एक्सपोजर के कारण भ्रूण में पानी की मात्रा में परिवर्तन का आकलन करना अविश्वसनीय रूप से मुश्किल है। पानी विस्थापन का उपयोग कर एक इथेनॉल का इलाज भ्रूण नमूने की मात्रा को मापने की कोशिश कर माप के दौरान भ्रूण से इथेनॉल की हानि में परिणाम होगा । ऊपर वर्णित लोगों की तुलना में अधिक सटीक माइक्रोस्कोपी और स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों का उपयोग करना, एक भ्रूण में इथेनॉल-पानी संतुलन को सीधे एक ही समय में मापने से निर्धारित करना संभव हो सकता है।

कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक शक्तिशाली उपकरण है जिसके साथ जेब्राफिश भ्रूण विकसित करने में भ्रूण इथेनॉल सांद्रता का आकलन करने के लिए है। यह जानकारी जेब्राफिश का उपयोग करके एफएएसडी अध्ययनों के मानकीकरण में महत्वपूर्ण है। इथेनॉल उपचार प्रतिमान को ठीक से नियंत्रित करने और भ्रूणीय इथेनॉल सांद्रता को सीधे निर्धारित करने की क्षमता मानव एफएएसडी अध्ययनों के लिए जेब्राफिश मॉडल की कार्यक्षमता को मजबूत करती है। अंतत, इस काम से FASD के बारे में हमारी समझ में काफी सुधार होगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस लेख में प्रस्तुत शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान/नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनिओफेशियल रिसर्च (एनआईएच/एनआईडीसीआर) R01DE020884 से जेकेई को पिछले अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था । और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान/शराब के दुरुपयोग और शराब पर राष्ट्रीय संस्थान (NIH/NIAAA) F32AA021320 C.B.L. और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से वर्तमान अनुदान/शराब के दुरुपयोग पर राष्ट्रीय संस्थान (NIH/NIAAA) R00AA023560 से C.B.L. हम गैस क्रोमेटोग्राफ विश्लेषण प्रदान करने और सहायता करने के लिए रुएबेन गोंजालेस को धन्यवाद देते हैं। हम तियाहना ओंटिवरोस और डॉ जीना नोबल्स लेखन सहायता का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 156 जेब्राफिश विकास इथेनॉल भ्रूण अल्कोहल स्पेक्ट्रम विकार हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी भ्रूण इथेनॉल एकाग्रता पशु मॉडल
हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके जेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल के स्तर का परिमाणीकरण
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Lovely, C. B. Quantification of… More

Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

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