Summary
Ce travail décrit un protocole pour quantifier les niveaux d’éthanol dans un embryon de poisson zèbre à l’aide de la chromatographie de gaz de l’espace de la tête à partir de méthodes d’exposition appropriées au traitement des embryons et à l’analyse de l’éthanol.
Abstract
Les troubles du spectre de l’alcoolisation fœtale (ETCAF) décrivent un continuum très variable de défauts développementaux induits par l’éthanol, y compris les dysmorphologies faciales et les déficiences neurologiques. Avec une pathologie complexe, l’ETCAF touche environ 1 enfant sur 100 né aux États-Unis chaque année. En raison de la nature très variable de l’ETCAF, les modèles animaux se sont avérés essentiels dans notre compréhension mécaniste actuelle des défauts de développement induits par l’éthanol. Un nombre croissant de laboratoires se sont concentrés sur l’utilisation du poisson zèbre pour examiner les défauts de développement induits par l’éthanol. Les poissons zèbres produisent un grand nombre d’embryons fécondés, génétiquement traitables et translucides. Cela permet aux chercheurs de contrôler avec précision le moment et la posologie de l’exposition à l’éthanol dans de multiples contextes génétiques et de quantifier l’impact de l’exposition à l’éthanol embryonnaire grâce à des techniques d’imagerie en direct. Ceci, combiné avec le degré élevé de conservation de la génétique et du développement avec l’homme, s’est avéré le poisson zèbre pour être un modèle puissant dans lequel étudier la base mécaniste de la tératogénicité d’éthanol. Cependant, les schémas d’exposition à l’éthanol ont varié entre les différentes études sur le poisson zèbre, ce qui a confondu l’interprétation des données sur le poisson zèbre dans ces études. Voici un protocole pour quantifier les concentrations d’éthanol dans les embryons de poissons zèbres à l’aide de la chromatographie de gaz de l’espace de la tête.
Introduction
Les troubles du spectre de l’alcoolisation fœtale (ETCAF) décrivent un large éventail de déficiences neurologiques et de dysmorphologies craniofaciales associées à l’exposition à l’éthanol embryonnaire1. De multiples facteurs, y compris le moment et la posologie de l’exposition à l’éthanol et le bagage génétique, contribuent à la variation de l’ETCAF2,3. Chez l’homme, la relation complexe de ces variables rend difficile l’étude et la compréhension de l’étiologie de l’ETCAF. Les modèles animaux se sont avérés cruciaux dans le développement de notre compréhension de la base mécaniste de la tératogénicité de l’éthanol. Une grande variété de systèmes de modèles animaux a été utilisé pour étudier de multiples aspects de l’ETCAF et les résultats ont été remarquablement compatibles avec ce qui se trouve dans l’exposition chez l’homme4. Les systèmes modèles de rongeurs sont utilisés pour examiner de nombreux aspects de l’ETCAF, avec des souris étant les plus communs5,6,7. La majorité de ces travaux ont porté sur les défauts de développement à l’exposition précoce à l’éthanol8, bien que l’exposition ultérieure à l’éthanol a été montré pour causer des anomalies du développement ainsi9. En outre, les capacités génétiques des souris ont grandement aidé dans notre capacité à sonder les fondements génétiques de l’ETCAF10,11. Ces études chez la souris suggèrent fortement qu’il existe des interactions gènes-éthanol avec la voie du hérisson sonore, la signalisation acide rétinoïque, Superoxide dismutase, oxyde nitrique synthase I, Aldh2 et Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Ces études montrent que les modèles animaux sont essentiels pour faire progresser notre compréhension de l’ETCAF et de ses mécanismes sous-jacents.
Le poisson zèbre a émergé comme un système modèle puissant pour examiner de nombreux aspects de la tératogenèse de l’éthanol22,23. En raison de leur fécondation externe, de leur fécondité élevée, de leur région génétique et de leurs capacités d’imagerie vivante, le poisson zèbre est idéal pour étudier des facteurs tels que le moment, la posologie et la génétique de la tératogénèse à l’éthanol. L’éthanol peut être administré à des embryons mis en scène avec précision et les embryons peuvent ensuite être représentés pour examiner l’impact direct de l’éthanol pendant les processus de développement. Ce travail peut être directement lié à l’homme, parce que les programmes génétiques de développement sont fortement conservés entre le poisson zèbre et l’homme et peuvent donc aider à guider les études humaines de l’ETCAF24. Alors que le poisson zèbre a été utilisé pour examiner la tératogénèse à l’éthanol, un manque de consensus dans la déclaration des concentrations d’éthanol embryonnaire rend la comparaison avec les humains difficile25. Dans les systèmes de mammifères, les niveaux d’alcool dans le sang sont directement corrélés aux niveaux d’éthanol tissulaire26. Bon nombre des études sur le poisson zèbre traitent les embryons avant la formation complète de leur système circulatoire. En l’absence d’échantillon maternel à examiner, un processus d’évaluation des concentrations d’éthanol est nécessaire pour quantifier les niveaux d’éthanol à l’intérieur de l’embryon. Ici nous décrivons un processus pour quantifier des concentrations d’éthanol dans un embryon en développement de poisson zèbre utilisant la chromatographie de gaz d’espace de tête.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tous les embryons de poissons zèbres utilisés dans cette procédure ont été élevés et élevés selon les protocoles établis de l’IACUC27. Ces protocoles ont été approuvés par l’Université du Texas à Austin et l’Université de Louisville.
REMARQUE: La ligne de poisson zèbre Tg(fli1:EGFP)y1 a été utilisée dans cette étude28. Toute l’eau utilisée dans cette procédure est stérile eau d’osmose inverse. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de Graphpad Prism v8.2.1.
1. Faire des médias d’embryon
- Pour faire un stock 20x de médias embryonnaires, dissoudre 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl2, 0,41 g de K2HPO4, 0,142 g de NA2HPO4, et 4,9 g de MgSO47H2O en 1 L d’eau. Ignorer le précipité blanc qui se forme; cela n’aura pas d’impact sur les médias. Filtrer la stérilisation de la solution de stock et le stocker à 4 oC.
- Pour créer la solution de support embryonnaire de travail, dissoudre 1,2 g de NaHCO3 en 1 L de 20x stock de médias embryonnaires et ajouter 19 L d’eau. Maintenir la solution de support embryonnaire de travail à 28 oC.
2. Mesurer le volume embryonnaire à l’aide du déplacement de l’eau
REMARQUE : Dans ce protocole, 24 h d’embryons postfertilisation (hpf)(figure 1) sont utilisés. Les embryons utilisés dans les mesures de volume ne sont pas utilisés dans l’analyse de l’éthanol.
- Placez 10 embryons et du liquide extraembryonnaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml marqué à un volume de 250 l(figure 2A). Ajouter de l’eau à la ligne de remplissage de 250 l (voir l’échantillon avec de l’eau teintée à la figure 2B).
- Répétez l’étape 2.1 pour mettre en place des réceptacles pour les embryons qui ont eu leurs chorions enlevés.
- Pour enlever le chorion, placer les embryons dans leurs chorions dans un plat Petri de 100 mm avec 2 mg/ml de cocktail de protéase dans le support embryonnaire à température ambiante (RT) pendant 10 min. Toutes les quelques minutes, faites tourbillonner doucement les embryons pour briser le chorion.
- Une fois que tous les embryons sont exempts de leur chorion, retirer les embryons déchorions du cocktail de protéase/gène et le placer dans un nouveau plat Petri de 100 mm avec des supports d’embryons frais pour laver les embryons. Répétez cette étape de lavage 1 fois de plus (pour un total de 2 lavages). Transférer les embryons dans un plat Petri frais de 100 mm.
- En utilisant la plus petite pointe possible et sans endommager les embryons, retirez soigneusement tout le liquide autour des embryons à l’aide d’un micropipettor p200(figure 2C) et pesez l’eau avec une balance avec une précision de 0,1 mg. Pour déterminer le volume de l’échantillon de 10 embryons, soustrayez le poids/volume de l’eau (1 ml d’eau et 1 g d’eau. Pour déterminer le volume d’un seul embryon, divisez la différence entre 250 L et le poids de l’eau enlevée par 10.
3. Traiter les embryons avec de l’éthanol
- Rassemblez les embryons des réservoirs d’accouplement et placez-les dans un plat Petri standard de 100 mm. Comptez pas plus de 100 embryons par plat Petri unique et incuber à 28,5 oC.
REMARQUE : Si le chorion doit être enlevé (étape 2.2), il doit être enlevé avant d’ajouter de l’éthanol. - À 6 hpf, ajouter jusqu’à 100 embryons à une nouvelle norme de 100 mm Petri plat soit avec le média embryonnaire ou le média embryonnaire - 1% d’éthanol (v/v). Couvrir, mais NE PAS sceller le plat Petri. Placer les embryons dans un incubateur à basse température réglé à 28,5 oC pendant 18 h, ou jusqu’à ce que les embryons atteignent le point de temps de développement de 24 hpf.
4. Préparation du flux de travail avant le traitement des embryons pour la chromatographie de gaz de l’espace de la tête
- Faire une solution de 5 M NaCl dans l’eau (450 L sera nécessaire par tube d’échantillon) pour dénaturer toutes les protéines et prévenir le métabolisme de l’éthanol. Faire le cocktail de protéase (Table of Materials) à une concentration de 2 mg/mL dans les médias embryonnaires.
- Étiqueter un tube microcentrifuge de 1,5 ml et une flacon de chromatographe gazeux de 2 ml pour chaque échantillon. Étiquetez des flacons de chromatographe stéatographe sérogaz supplémentaires de 2 ml pour les normes d’éthanol décrites ci-dessous ainsi que l’air, l’eau et les blancs de cocktail NaCl/protéase de 5 M.
- Mettre en place trois micropipettors p200 deux ensemble à 50 L, et le troisième ensemble à 200 l; un micropipettor p1000 réglé à 450 L et un micropipettor p2 réglé à 2 ll. Pour les pipettes en verre utilisées pour transférer les embryons de la vaisselle Petri aux tubes microcentrifuges de 1,5 ml, passez rapidement la pointe de la pipette à travers une flamme pour lisser les bords pour ne pas endommager les embryons lors de leur dessin dans la pipette.
5. Traitement des embryons pour la chromatographie de gaz de l’espace de la tête
REMARQUE : Les deux embryons dans leurs chorions et ceux précédemment retirés de leurs chorions sont traités de la même manière pour la cohérence dans le calcul des facteurs de dilution.
- À l’aide des deux micropipettors p200 réglés sur 50 l, puisez 50 l de la solution de cocktail de protéase en une et puisez 50 l’eau dans la seconde.
- À l’aide de la pipette en verre et du micropipettor, placez rapidement 10 embryons (à partir de l’étape 3.2) dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml et fermez le bouchon (tel que décrit à la figure 2A). Répétez l’essai pour tous les échantillons à tester, les contrôles et les embryons traités à l’éthanol.
- À l’aide du micropipettor p200 réglé sur 200 l, ouvrez rapidement le bouchon et retirez tous les supports embryonnaires résiduels (tels que décrits dans la figure 2C). Placez rapidement la pipette contenant 50 ll d’eau dans le tube et rapidement mais doucement (pour ne pas endommager les embryons) ajouter, puis retirer l’eau. Ajouter rapidement 50 l de la solution de cocktail de protéase du pipettor d’attente et fermer le bouchon du tube (Figure 2D).
REMARQUE : Effectuez ce processus un échantillon à la fois. - Laisser l’échantillon s’asseoir à RT pendant 10 min pour permettre au cocktail de protéase de dégrader le chorion. Ensuite, ajoutez rapidement 450 l de 5 M NaCl et fermez le bouchon du tube (Figure 2E). Vortex les échantillons pendant 10 min. Pour accélérer le processus, configurez le mélangeur pour vortexr plusieurs échantillons en même temps.
REMARQUE : Ajouter une petite quantité (100 l) d’un mélange de perles de silice (2 tailles, 0,5 mm et 1 mm de perle) à n’importe quel tube dont les embryons de plus de 24 hpf. Chez les embryons plus âgés, le notochord restera intact indépendamment de combien de temps ils sont homogénéisés. - Après homogénéisation pendant 10 min, retirer rapidement 2 l de supernatant d’embryon homogénéisé et ajouter à un flacon de chromatographe gazeux. Scellez rapidement le flacon avec le bouchon de polytétrafluoroéthylène.
6. Préparation des normes sur les médias et l’éthanol
- Pour préparer les normes des médias, diluer les médias par un facteur de 10 avec une solution de cocktail NaCl/protéase de 5 M. Ajouter 2 ll de chaque échantillon à un flacon de chromatographe à gaz et sceller avec un bouchon de polytétrafluoroéthylène.
- Pour préparer les normes d’éthanol, créez une dilution sérielle de 100 % d’éthanol dans une solution de cocktail NaCl/protéase de 5 M à des concentrations suivantes : 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 et 40 mm. Ajouter 2 ll de chaque norme à un flacon de chromatographe à gaz et sceller avec un bouchon de polytétrafluoroéthylène.
7. Préparation du chromatographe de gaz de l’espace de tête
REMARQUE : Cette configuration et ce protocole peuvent devoir être modifiés en fonction du chromatographe à gaz utilisé. La chromatographie de gaz de l’espace de tête est utilisée pour quantifier les niveaux d’éthanol, et non pour la séparation.
- Fixer le chauffe-eau de l’autosampler à 58 oC et allumer. Laisser le chauffe-eau atteindre 58 oC et allumer les conduites d’air et d’hydrogène alimentant le chromatographe à gaz (pour l’ionisation des flammes utilisée pour quantifier l’éthanol).
REMARQUE : Le psi doit être réglé pour fonctionner correctement le chromatographe selon les spécifications du fabricant. Assurez-vous que la ligne d’hélium est allumée et réglé sur le psi approprié. - Pour le septum, assurez-vous que le nombre d’échantillons injectés n’est pas le numéro de 100. Pour la fibre d’injection, assurez-vous que le nombre d’échantillons injectés n’est pas 'gt;500.
REMARQUE : Si l’une ou l’autre est au-dessus de la quantité d’injections, elles devront être changées avant d’exécuter les échantillons d’essai. - Activez le logiciel d’analyse et assurez-vous que le poste de travail est correctement installé. Stockez toutes les données selon les normes du laboratoire et du département. Créez une nouvelle liste d’échantillons pour les échantillons à exécuter.
- Lancez la méthode de démarrage et attendez que le détecteur d’ionisation des flammes se stabilise avant d’exécuter les échantillons. Une fois stable, exécutez la méthode de démarrage du logiciel pour nettoyer la fibre.
8. Mesures d’échantillon utilisant la chromatographie de gaz d’espace de tête
- Une fois la méthode de démarrage terminée, créez 1 nouvelle ligne par échantillon dans la liste d’échantillons. À partir du menu des méthodes du logiciel d’analyse, chargez 436 Current spme éthanol 2013 3min absorber 2_5min rg run. METH pour chaque échantillon de la liste d’échantillons.
- Remplissez la liste d’échantillons, en commençant par l’air, l’eau, 5 M NaCl /protéase cocktail blanc. Ensuite, entrez dans les normes dans l’ordre, de 0.3125 à 40 mM. Suivez les normes avec un deuxième tour de l’air, de l’eau, et 5 M NaCl / blanc cocktail de protéase.
- Entrez tous les échantillons de supernatants d’embryons homogénéisés à tester, de la plus faible à la plus élevée concentration prévue d’éthanol. Terminez par entrer dans un troisième et dernier tour de l’air, de l’eau, et 5 M NaCl / blanc cocktail de protéase.
- Ajouter les flacons de chromatographe à gaz à l’autosampler dans l’ordre dans lequel les échantillons ont été entrés. Laisser les échantillons se réchauffer pendant 10 à 15 min. Démarrer l’échantillon s’exécute dans le logiciel.
- Après que tous les échantillons et les blancs finaux ont exécuté, activez la méthode d’arrêt dans le logiciel en ajoutant un échantillon final dans la liste d’échantillons et en cours d’exécution en attente. METH. Sauvegarder toutes les données acquises lors des exécutions de l’échantillon. Éteignez l’équipement dans l’ordre suivant : chauffe-autosampler, réservoir d’hydrogène et, seulement après que la température du chromatographe atteigne 30 oC, le réservoir d’air. Laissez le réservoir d’hélium pour préserver la colonne de cire.
9. Échantillon d’analyse maximale de l’éthanol et de concentration de l’échantillon
REMARQUE : Toutes les valeurs à partir de 9,3 sur ont été calculées dans un fichier Excel que toutes les équations préremplies.
- Une fois la méthode d’arrêt terminée, cliquez sur Le chromatogramme ouvert. Ouvrez le dossier contenant les résultats. Les échantillons sont automatiquement intégrés dans ce programme.
- Dans les résultats, assurez-vous que les pics corrects ont été intégrés (les pics d’éthanol entre 2 et 2,5). Une fois que tous les échantillons ont été confirmés, imprimez ou exportez les résultats.
- Tracer la hauteur maximale des normes d’éthanol sur un graphique. Calculez la pente, l’interception Y et les valeurs R2 pour les normes d’éthanol (R2 devrait être 'gt;0.99).
REMARQUE : Ces valeurs seront utilisées pour déterminer la concentration d’éthanol à partir de la hauteur de pointe de l’échantillon. - Pour chaque échantillon, soustrayez la hauteur maximale de l’échantillon de l’interception Y des normes d’éthanol. Divisez cette valeur par la pente des normes d’éthanol pour obtenir la valeur de l’éthanol pour chaque échantillon dans les flacons GC.
- Pour calculer la concentration d’éthanol dans les embryons, calculez d’abord le facteur de dilution pour chaque échantillon. Prenez la mesure de volume calculée à l’étape 2.3 de ce protocole et divisez-la par la mesure de volume plus 500 L. Il s’agit de la solution de cocktail NaCl/protease de 5 M ajoutée à chaque échantillon pendant le traitement de l’embryon (étapes 5.3 et 5.4).
- À l’aide de ce facteur de dilution de l’échantillon, multipliez la valeur de l’éthanol de l’échantillon pour chaque échantillon. Les résultats seront dans la concentration mM. Calculez les échantillons de référence des médias en multipliant la valeur de l’éthanol média par le facteur de dilution de 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les niveaux d’éthanol dans le sang ne peuvent pas être déterminés chez les poissons zèbres embryonnaires précoces, car ils n’ont pas de système circulatoire entièrement formé. Pour déterminer le niveau de concentration d’éthanol dans les embryons de poissons zèbres, les niveaux d’éthanol sont mesurés directement à partir de tissus embryonnaires homogénéisés. Pour bien mesurer les concentrations embryonnaires d’éthanol, il faut tenir compte du volume embryonnaire. L’embryon (jaune attaché) se trouve à l’intérieur du chorion (coquille d’œuf) entouré de liquide extraembryonnaire (figure 1). Toute mesure de volume de l’embryon doit être faite sur des embryons au moment de l’exposition, parce que le volume embryonnaire changera au cours du temps de développement à mesure que l’embryon augmente en taille. En outre, la façon dont l’embryon est traité doit être prise en compte ainsi que le volume embryonnaire, parce que ces deux éléments créent des facteurs de dilution utilisés pour calculer les niveaux d’éthanol embryonnaire.
Parce que l’embryon n’est pas une sphère parfaite, surtout après 10 hpf, le déplacement de l’eau a été utilisé pour évaluer le volume embryonnaire. Cette étude a utilisé des embryons à 24 hpf. Le volume d’embryons dans leur chorion et ceux retirés de leur chorion ont été mesurés. Ces volumes étaient de 1,97 (0,4 SD) ll pour l’embryon avec du liquide extraembryonnaire, et de 1,1 (0,22 SD) pour l’embryon seul(tableau 1). Cette différence entre l’embryon avec un liquide extraembryonnaire et l’embryon seul est le volume du liquide extraembryonnaire, qui entoure l’embryon à l’intérieur du chorion (Figure 1). Cette différence est essentielle pour déterminer la concentration d’éthanol de l’embryon seul dans les échantillons. De l’analyse, l’embryon représentait 56 % du volume total de l’embryon avec du liquide extraembryonnaire à l’intérieur du chorion (tableau 1). Au fur et à mesure que l’embryon grandissait, le volume embryonnaire augmentait avec le temps, ce qui a entraîné une diminution du volume du liquide extraembryonnaire25. Lors de la mesure des concentrations d’éthanol provenant d’embryons encore dans leur chorion, la teneur en eau de l’embryon et du liquide extraembryonnaire doit être prise en compte.
Des travaux publiés précédemment ont montré que la fraction d’eau dans l’embryon seul est de 73,6%29. Ce résultat a été obtenu à l’aide d’une combinaison de mesures de volume, de spectroscopie de résonance de rotation d’électron, et de microscopie de résonance magnétique. Pour confirmer ce résultat, les embryons ont été pesés seuls avant et après la cuisson à 70 oC, comme décrit précédemment25. Ce processus élimine toute l’eau de l’embryon. Le changement de poids représente la quantité d’eau dans l’embryon. De cette analyse, un embryon de 24 hpf contenait 72 % d’eau, tandis qu’un embryon de 48 hpf contenait 76 %. Ces deux valeurs sont extrêmement similaires au volume embryonnaire d’eau de 73,6 % précédemment calculé29. Ceci suggère que le volume d’eau de l’embryon change peu tout au long du développement précoce.
D’après les travaux publiés à l’aide de multiples approches pour calculer le volume d’eau de l’embryon, 73,6 % ont été utilisés comme teneur en eau embryonnaire pour toutes les analyses présentées. Il en est résulté de l’eau comprenant 0,82 l sur les 1,1 L de volume embryonnaire (tableau 1). De là, le volume du liquide extraembryonnaire a été calculé comme 0,86 L. Sur le volume total d’eau de l’embryon avec du liquide extraembryonnaire, 49% est contenu dans l’embryon et 51% dans le liquide extraembryonnaire (tableau 1).
Pour l’analyse de la chromatographie gazeuse, seulement 24 embryons de hpf encore dans leur chorion ont été utilisés (Figure 1). Dans ce régime d’éthanol, les embryons ont été traités avec 1% (171 mM) de concentration de l’éthanol de 6 à 24 hpf, bien que différentes concentrations d’éthanol et fenêtres de temps d’exposition peuvent être utilisées selon la conception expérimentale. Deux groupes de 15 échantillons (10 embryons par échantillon) et les médias avec lesquels ils ont été traités sur 2 jours expérimentaux différents (tableau 2) ont été analysés. Les niveaux de médias peuvent varier d’une expérience à l’autre. Pour tenir compte de cela, les niveaux d’éthanol des médias ont été mesurés 5 fois par groupe expérimental. Dans cette analyse, les niveaux de médias étaient de 143,6 mM (2,3 SD) pour le groupe 1 et de 133,6 mM (2,7 SD) pour le groupe 2. Ces valeurs sont significativement différentes à l’aide d’un test t non apparié (p 0,0002). Les embryons avec le fluide extraembryonnaire ont été en moyenne 63,5 mM (17,1 SD) et 53,1 mM (12,6 SD) pour les groupes 1 et 2, respectivement. Cependant, la concentration n’était pas significativement différente entre les 2 groupes d’embryons avec le fluide extraembryonique (essai non apparié de t, p - 0,07). Les embryons témoins non traités ont été mesurés à 0 mM. En raison de la variation des niveaux des médias, on a calculé un rapport entre la concentration embryonnaire d’éthanol et les niveaux de médias d’éthanol pour chaque échantillon. Le groupe 1 avait 44 % des niveaux d’éthanol des médias, tandis que le groupe 2 avait 40 % des niveaux d’éthanol des médias(figure 3 et tableau 2).
Figure 1 : Image d’un embryon à 24 h postfertilisation (hpf) à l’intérieur du chorion. L’embryon et le jaune sont entourés par le liquide extraembryonnaire, tous situés à l’intérieur du chorion. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Protocole visant à mesurer le volume embryonnaire et à traiter les embryons aux fins d’analyse. (A) Dix embryons de 24 hpf transférés dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml marqué à un volume de 250 ll. (B) Le tube de microcentrifuge avec des embryons remplis d’eau (l’eau est teint de sorte qu’il est plus facile à voir à la marque de 250 L). (C) Toute l’eau est retirée du tube et pesée. (D) Dix embryons transférés dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. L’eau a été enlevée comme dans (C) et remplacée par 50 l de cocktail de protéase. (E) Après 10 min, 450 l de 5 M NaCl a été ajouté au tube de (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Parcelle de boîte et de moustaches du rapport de concentration d’éthanol des échantillons aux médias. La concentration d’éthanol pour chaque groupe a été divisée par la moyenne des échantillons médiatiques de ce groupe. Le groupe 1 contenait 44 % des niveaux de médias, tandis que le groupe 2 en contenait 40 %. Dans les deux groupes, n ' 15; 10 embryons par échantillon. Les groupes ont été comparés à l’aide d’un ANOVA à sens unique avec une analyse post hoc de Tukey (lt; 0,0001). Les moustaches représentent un minimum au maximum. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Volumes d’embryons et d’embryons d’eau extraembryo (L) | ||||||
| L’eaua | ||||||
| Volume totalb | % du volume total (V) | Volume embryonnaire (W) | Volume extraembryonnaire (X) | % d’eau dans l’embryon (Y) | % d’eau en extraembryonnaire (Z) | |
| Embryon et extraembryonnaire (EE)c | 1,97 à 0,4 | |||||
| Embryon 24 hpf (E)c | 1,11 à 0,22 | 56% | 0.82 | 0.86 | 49% | 51% |
| Calculs | ||||||
| V (en) Embryon % du volume total ' Volume total d’E ' Volume total de l’EE | ||||||
| W (en) Volume d’eau embryonnaire ' V ' 73,6% | ||||||
| X X (en) Volume d’eau extraembryonnaire - W - Volume total de l’EE | ||||||
| Y% D’eau dans l’embryon (W et X)/W 100 | ||||||
| Z% D’eau en extraembryonnaire 100 et Y | ||||||
| a (en) Le volume embryonnaire de l’eau a été calculé à partir de Hagedorn et coll.29. | ||||||
| b (en) Les valeurs sont déclarées comme une déviation type (DD). | ||||||
| cn '13; 10 embryons par échantillon | ||||||
Tableau 1 : Calcul du volume d’eau des embryons avec du liquide extraembryonnaire. Le volume a été calculé à partir de 13 échantillons (10 embryons par échantillon) à partir d’embryons de 24 hpf avec du liquide extraembryonnaire encore dans le chorion et des embryons retirés de leur chorion. Les valeurs sont déclarées comme la moyenne de SD.
| Éthanol Concentration d’embryons et de médias (mM)a | |||
| Groupe 1 | Groupe 2 | Combiné | |
| Médias (M)b | 143,6 à 2,3 | 133,6 à 2,7 | 138,6 à 5,8 |
| Embryon et extraembryonnaire (EE)c | 63,5 à 17,1 | De 53,1 à 12,6 | 58,3 à 15,7 |
| Ratio de l’éthanol - embryon à média (1) | 0,44 à 0,12 | 0,40 à 0,09 | 0,42 à 0,11 |
| Calculs | |||
| 1 Fois Ratio d’éthanol et d’EE et M | |||
| a (en) Les valeurs sont déclarées comme étant des DD. | |||
| bn 5 | |||
| cn 15; 10 embryons par échantillon | |||
| d (en) Les valeurs sont la moyenne des groupes 1 et 2. | |||
Tableau 2 : Calculs de la concentration d’éthanol chez les embryons avec du liquide extraembryonnaire et des médias (mM). Les échantillons des médias étaient des mesures directes provenant des médias (n ' 5 par groupe). La concentration d’éthanol embryonnaire a été calculée à partir de 15 échantillons (10 embryons par échantillon) à partir d’embryons de 24 hpf avec du liquide extraembryonnaire. Le rapport des concentrations d’éthanol des embryons avec du liquide extraembryonnaire aux médias a été calculé. Les valeurs sont déclarées comme la moyenne de SD.
| Calcul de l’éthanol dans l’embryona,b | |
| Embryon (Y) | Ratio aux médias (Z) |
| 32,7 à 8,8 mm | 0,24 à 0,06 |
| Calculs | |
| Y (y) Éthanol embryonnaire 58,3 mm (tableau 2) - 56 % (tableau 1) | |
| Z Z Ratio d’éthanol et Y à 138,6 mm (tableau 2) | |
| a (en) Les valeurs sont la moyenne des groupes 1 et 2. | |
| b (en) Les valeurs sont déclarées comme étant des DD. | |
Tableau 3 : Calcul de l’éthanol dans l’embryon. La concentration embryonnaire d’éthanol a été calculée comme 56% de la concentration totale d’éthanol de l’embryon avec le fluide extraembryonnaire. Ceci a ensuite été rapporté comme un rapport de l’embryon au média. Les valeurs sont déclarées comme la moyenne de SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En tant que modèle de développement, le poisson zèbre est idéal pour étudier l’impact des facteurs environnementaux sur le développement. Ils produisent un grand nombre d’embryons fécondés à l’extérieur, ce qui permet un moment précis et des paradigmes de dosage dans les études sur l’éthanol. Ceci, combiné avec les capacités d’imagerie en direct et la conservation génétique et développementale avec les humains, font du poisson zèbre un puissant système modèle pour les études de tératologie. Décrit est un protocole pour mesurer les concentrations embryonnaires d’éthanol dans le développement d’embryons de poissons zèbres en utilisant la chromatographie de gaz de l’espace de la tête.
Il est essentiel de déterminer la concentration d’éthanol embryonnaire pour comprendre l’impact de l’éthanol sur l’embryon en développement. Dans les modèles de rongeurs, les concentrations d’éthanol dans le sang sont corrélées aux concentrations tissulaires26. Cependant, il n’est pas possible d’évaluer les niveaux d’éthanol dans le sang au début du développement embryonnaire chez un poisson zèbre. Chromatographie de gaz d’espace de tête a été employée pour mesurer des niveaux d’éthanol dans divers paradigmes expérimentaux, y compris le poisson zèbre25,30,31,32,33,34,35. Cependant, ce protocole peut être utilisé pour mesurer de nombreux facteurs environnementaux différents, même si la volatilité de ces différents facteurs doit être suffisamment élevée pour mesurer quantitativement et une colonne de chromatographe stérographique de gaz doit être choisie en fonction de la polarité des composés en question. En outre, le poisson zèbre est le mieux placé pour étudier l’impact des facteurs solubles dans l’eau, car l’exposition à des facteurs hydrophobes est extrêmement difficile à analyser chez les poissons.
Ce protocole permettra aux chercheurs d’évaluer directement les concentrations d’éthanol dans les embryons de poissons zèbres. Cependant, plusieurs facteurs doivent être pris en compte pour assurer des mesures précises des concentrations d’éthanol embryonnaire. Étant donné que les niveaux d’éthanol dans le total des tissus embryonnaires ont été mesurés, il a dû tenir compte du volume embryonnaire. Après 10 hpf l’embryon commence la somitogénèse (formation somite) et n’est plus une sphère (Figure 1). Pour évaluer le volume embryonnaire, le déplacement de l’eau a été utilisé sur 10 embryons mis en commun par échantillon. Chaque échantillon se composait de 10 embryons pour deux raisons : premièrement, réduire l’erreur de la pipetage de petits volumes, et deuxièmement, pour faire la moyenne de petites fluctuations des volumes d’embryons. Lors de la mesure du volume embryonnaire, il est important de tenir compte de la précision du tuyautrage et de la pesée. Même l’utilisation de 10 embryons par échantillon est à la limite inférieure de précision pour les pipettes et la balance utilisée pour peser les embryons. Avec l’équipement disponible, l’utilisation de moins de 10 embryons aurait eu un impact sur les analyses. Cela n’empêche pas les chercheurs d’utiliser moins d’embryons par échantillon tant que la précision de l’équipement est prise en considération.
Le volume embryonnaire est l’un des facteurs ayant une incidence sur l’analyse de l’échantillon. Un deuxième facteur clé est la vitesse de traitement embryonnaire, car l’éthanol est volatil. En outre, l’éthanol équilibre rapidement dans plusieurs études animales25,36,37. Notre protocole de lavage est conçu pour éliminer rapidement tout éthanol adhérant à la surface extérieure du chorion. Dans cette étude, ce protocole de lavage n’a pas eu d’impact sur les niveaux d’éthanol embryonnaire, bien que des lavages plus longs ou multiples aient pu avoir un impact sur les concentrations d’éthanol embryonnaire25,38. Pourtant, un troisième facteur à prendre en compte est la dilution du volume embryonnaire pendant le traitement. Ce protocole utilise un cocktail de protéase pour dégrader le chorion ainsi que 5 M NaCl pour dénaturer toutes les protéines, y compris les enzymes de traitement de l’alcool.
Enfin, une gamme d’analyses et de méthodes de déclaration ont été décrites dans une grande variété d’études sur le poisson zèbre. En raison de la variation dans différents échantillons d’une étude ou en comparant différentes études, une déclaration appropriée de la concentration d’éthanol est critique25,38. Les méthodes utilisant des mesures indirectes (généralement enzymatiques) reposent sur l’analyse d’un métabolite secondaire. Dans ce cas, le taux d’activité enzymatique peut varier et entraver l’analyse précise de la concentration d’éthanol. Cette méthode mesure directement les niveaux d’éthanol, et les concentrations d’éthanol sont signalées comme un rapport entre les concentrations d’embryons et de médias. Nos résultats sont en ligne avec un consensus croissant d’un embryon de 24 hpf contenant 30% des concentrations médiatiques (tableau 3)25,38,39,40. Étonnamment, cette concentration de 30% d’éthanol embryonnaire est indépendante de la concentration des médias, et on ne comprend pas bien ce qui crée cet équilibre25,38. Les embryons de plus de 24 hpf montrent une diminution des concentrations d’éthanol, avec 48 embryons hpf contenant près de la moitié de la teneur en éthanol d’un embryon de 24 hpf25. Cependant, nos résultats ne déterminent pas l’équilibre éthanol-eau. Compte tenu de la vitesse à laquelle l’éthanol est equilibrate, ainsi que la volatilité de l’éthanol, il est incroyablement difficile d’évaluer les changements de volume d’eau dans l’embryon lui-même en raison de l’exposition à l’éthanol. Essayer de mesurer le volume d’un échantillon d’embryon traité à l’éthanol à l’aide du déplacement de l’eau entraînera la perte d’éthanol de l’embryon pendant la mesure. En utilisant des méthodes de microscopie et de spectroscopie plus précises que celles décrites ci-dessus, il peut être possible de déterminer l’équilibre éthanol-eau dans un embryon en mesurant directement les deux en même temps.
Dans l’ensemble, le protocole décrit ici est un outil puissant pour évaluer les concentrations d’éthanol embryonnaire dans le développement d’embryons de poissons zèbres. Cette information est essentielle pour normaliser les études sur l’ETCAF à l’aide du poisson zèbre. La capacité de contrôler précisément les paradigmes de traitement de l’éthanol et de quantifier directement les concentrations embryonnaires d’éthanol renforce la fonctionnalité du modèle de poisson zèbre pour les études humaines sur l’ETCAF. En fin de compte, ce travail améliorera grandement notre compréhension de l’ETCAF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
La recherche présentée dans cet article a été soutenue par des subventions antérieures des National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 à J.K.E. et National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. et par la subvention actuelle des National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Nous remercions Rueben Gonzales d’avoir fourni et aidé à l’analyse des chromatographes à gaz. Nous remercions Tiahna Ontiveros et la Dre Gina Nobles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
References
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
