Summary
이 작품은 적절한 노출 방법에서 배아 처리 및 에탄올 분석에 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피쉬 배아에서 에탄올 수준을 정량화하는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
태아 알콜 스펙트럼 무질서 (FASD)는 안면 이형성증 및 신경 손상을 포함하여 에탄올 유도한 발달 결함의 높게 변명한 연속체를 기술합니다. 복잡한 병리학으로, FASD는 미국에서 태어난 100명의 아이들에 대하여 대략 1에 매년 영향을 미칩니다. FASD의 매우 가변적인 특성으로 인해 동물 모델은 에탄올로 인한 개발 결함에 대한 현재의 기계적 이해에서 중요한 것으로 입증되었습니다. 점점 더 많은 실험실에서 제브라피시를 사용하여 에탄올로 인한 발달 결함을 검사하는 데 주력하고 있습니다. Zebrafish는 외부에서 수정되고 유전적으로 견인할 수 있는 반투명 배아를 다수 생산합니다. 이를 통해 연구자들은 여러 유전적 맥락에서 에탄올 노출의 타이밍과 복용량을 정확하게 제어하고 라이브 이미징 기술을 통해 배아 에탄올 노출의 영향을 정량화할 수 있습니다. 이것은 유전학과 인간과의 발달의 높은 수준의 보존과 결합되어, 에탄올 기형의 기계적 기초를 연구하는 강력한 모델로 제브라피쉬가 입증되었습니다. 그러나, 에탄올 노출 식이요법은 이 연구 결과에 걸쳐 제브라피시 데이터의 해석을 혼동한 다른 제브라피시 연구 사이에서 변화했습니다. 여기서는 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피시 배아에서 에탄올 농도를 정량화하는 프로토콜이다.
Introduction
태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)는 배아 에탄올 노출과 관련된 광범위한 신경 장애 및 두개안면이상학을1. 에탄올 노출 및 유전적 배경의 타이밍 및 투여량을 포함한 여러 요인이 FASD2,3의변이에 기여한다. 인간에서는, 이 변수의 복잡한 관계는 공부하고 FASD의 병인학을 이해하는 도전을 만듭니다. 동물 모델은 에탄올 기형의 기계적 기초에 대한 우리의 이해를 개발하는 데 중요한 것으로 입증되었습니다. 다양한 동물 모델 시스템이 FASD의 여러 측면을 연구하는 데 사용되었으며 결과는 인간에서 노출에서 발견되는 것과 현저하게 일치했습니다4. 설치류 모델 시스템은 FASD의 많은 측면을 검사하는 데 사용되며 마우스가 가장 일반적인5,6,7입니다. 이 작업의 대부분은 초기 에탄올 노출에 발달 결함에 초점을 맞추고있다8,에탄올에 나중에 노출뿐만 아니라 개발 이상을 일으키는 것으로 나타났다하지만9. 더욱이, 마우스의 유전 적 능력은 FASD10,11의유전 적 기초를 탐구하는 우리의 능력에 크게 도움이되었습니다. 마우스에서 이러한 연구는 강하게 소닉 고슴도치 경로와 유전자 에탄올 상호 작용이 있음을 제안, 레티노산 신호, 수퍼 옥사이드 디스뮤타아제, 산화 산화 신타제 I, Aldh2 및 Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. 이러한 연구는 동물 모델이 FASD와 그 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요하다는 것을 보여줍니다.
제브라피쉬는 에탄올 기형의 여러 측면을 검사하는 강력한 모델 시스템으로 부상하고있다 22,23. 그들의 외부 풍부하게 함, 높은 fecundity, 유전 성 및 살아있는 화상 진찰 기능 때문에, zebrafish는 이상적으로 에탄올 기형의 타이밍, 복용량 및 유전학과 같은 요인을 공부하기 위하여 적당합니다. 에탄올은 정확하게 단계적 배아에 투여될 수 있고 배아는 발달 과정 동안 에탄올의 직접적인 영향을 조사하기 위해 이미지화될 수 있다. 이 연구는 개발의 유전 프로그램이 제브라피시와 인간 사이에서 매우 보존되어 있기 때문에 인간과 직접 관련될 수 있으며 따라서 FASD 인간 연구24를안내하는 데 도움이 될 수 있다. 제브라피쉬가 에탄올 기형 생성을 검사하는 데 사용되었지만, 배아 에탄올 농도보고에 대한 합의가 부족하면 인간과 비교하기가 어렵다25. 포유류 시스템에서, 혈중 알코올 수준은 조직 에탄올 수준과 직접 상관 관계26. 제브라피쉬 연구의 대부분은 순환계가 완전히 형성되기 전에 배아를 치료합니다. 검사할 모계 샘플이 없는 경우, 에탄올 농도를 평가하는 과정이 배아 내의 에탄올 수준을 정량화하는 데 필요합니다. 여기에서 우리는 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 개발 하는 제브라피시 배아에서 에탄올 농도를 정량화하는 과정을 설명합니다.
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Protocol
이 절차에 사용된 모든 제브라피시 배아는 확립된 IACUC 프로토콜27에따라 사육및 사육되었다. 이 프로토콜은 오스틴텍사스 대학과 루이빌 대학에 의해 승인되었습니다.
참고: 제브라피쉬 라인 Tg(fli1:EGFP)y1은 본 연구에서 사용하였다28. 이 절차에 사용되는 모든 물은 멸균 역삼투수입니다. 모든 통계 분석은 그래프패드 프리즘 v8.2.1을 사용하여 수행되었다.
1. 배아 미디어 만들기
- 배아 매체의 20x 스톡을 만들기 위해, NaCl 17.5 g, KCl 0.75 g, CaCl2,K2HPO4의0.41 g, NA2HPO4의0.142 g, MgSO4·7H2O의4.9 g을 물 1L에 용해한다. 형성하는 백색 침전을 무시하십시오. 이는 미디어에 영향을 미치지 않습니다. 필터는 스톡 용액을 살균하고 4 °C에서 보관하십시오.
- 작업 배아 매질 용액을 만들기 위해, 20x 배아 매물 스톡의 1 L에 NaHCO3의 1.2 g을 용해시키고 19 L의 물을 첨가합니다. 28°C에서 작업 배아 용액을 유지한다.
2. 물 변위를 사용하여 배아 부피 측정
참고: 이 프로토콜에서는 24시간 후 유추(hpf) 배아(그림1)가사용된다. 부피 측정에 사용되는 배아는 에탄올 분석에 사용되지 않는다.
- 1.5 mL 미세원원지 튜브에 10개의 배아 및 엑스트라배아액을 250 μL의 부피로 표시하였다(그림2A). 250 μL 충진 라인에 물을 추가합니다(그림 2B의염색된 물이 있는 샘플 참조).
- 2.1단계를 반복하여 조리를 제거한 배아에 대한 리셉터클을 설정합니다.
- 융모를 제거하려면 배아를 100mm 페트리 접시에 실온(RT)에서 배아 매체에 2 mg/mL의 프로테아제 칵테일을 10분 동안 놓습니다. 몇 분마다 배아를 부드럽게 돌리면 융기를 깨십시오.
- 모든 배아가 그들의 융모가 없는 후에, 프로테아제 칵테일/배아 매체에서 dechorionated 배아를 제거하고 배아를 세척하기 위하여 신선한 배아 매체를 가진 새로운 100 mm 페트리 접시에 두는. 이 세척 단계를 1번 더 반복합니다(총 2회 세척). 배아를 신선한 100mm 페트리 접시로 옮김.
- 가능한 가장 작은 팁을 사용하여 배아를 손상시키지 않고 p200 마이크로 피펫(그림 2C)을사용하여 배아 주위의 모든 액체를 조심스럽게 제거하고 <0.1 mg의 정밀도로 물 무게를 측정합니다. 10개의 배아 샘플의 부피를 확인하려면 250 μL에서 제거된 물의 무게/부피(물 1 mL = 물 1g)를 뺍니다. 단일 배아의 부피를 결정하기 위해 250 μL의 차이와 제거된 물의 무게를 10으로 나눕니다.
3. 배아를 에탄올로 치료
- 결합 탱크에서 배아를 수집하고 표준 100mm 페트리 접시에 배치합니다. 단일 페트리 접시당 100개 이하의 배아를 계산하고 28.5°C에서 배양합니다.
참고 : 융기를 제거하려면 (단계 2.2), 에탄올을 추가하기 전에 제거해야합니다. - 6 hpf에서 배아 또는 배아 매체 + 1 % 에탄올 (v / v)를 사용하여 새로운 표준 100mm 페트리 접시에 최대 100 개의 배아를 추가하십시오. 뚜껑을 덮되 되 고 페트리 접시를 밀봉 하지 마십시오. 배아를 18시간 동안 28.5°C로 설정된 저온 인큐베이터에 놓거나, 또는 배아가 24 hpf의 발달 시점에 도달할 때까지.
4. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 위해 배아를 처리하기 전에 워크플로우 준비
- 모든 단백질을 변성시키고 에탄올 대사를 방지하기 위해 5 M NaCl을 물에서 (샘플 튜브 당 450 μL이 필요합니다)의 용액을 만듭니다. 배아 매체에서 2 mg/mL의 농도로 프로테아제 칵테일(재료표)을만듭니다.
- 각 샘플에 대해 1.5 mL 미세 원심 분리튜브와 2 mL 가스 크로마토그래프 바이알을 라벨로 지정합니다. 아래에 설명된 에탄올 표준뿐만 아니라 공기, 물 및 5M NaCl/프로테아제 칵테일 블랭크에 대해 2mL 가스 크로마토그래프 바이알을 추가로 라벨링합니다.
- 3개의 p200 마이크로피클러를 50 μL로 2개 세트, 제3 세트는 200 μL로 설정; p1000 마이크로파이터는 450 μL로 설정하고 p2 마이크로피펫터는 2 μL로 설정합니다. 페트리 접시에서 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브로 배아를 옮기는 데 사용되는 유리 파이펫의 경우, 파이펫 팁을 불꽃을 통해 빠르게 통과하여 파이펫을 파이펫으로 끌어올 때 배아를 손상시키지 않도록 가장자리를 부드럽게 합니다.
5. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피용 배아 처리
참고 : 그들의 chorions에 있는 태아 및 그들의 chorions에서 이전에 제거된 그 둘 다 희석 요인의 계산에 있는 일관성을 위해 동일하게 취급됩니다.
- 50 μL로 설정된 두 개의 p200 마이크로피펫을 사용하여 프로테아제 칵테일 용액 50 μL을 하나로 끌어내고 50 μL의 물을 두 번째로 그립니다.
- 유리 파이펫 및 마이크로파이터를 사용하여, 1.5 mL 미세원심지 튜브에 10개의 배아(단계 3.2로부터)를 신속하게 배치하고 캡을 닫는다(도 2A에설명된 대로). 모든 시료를 검사, 대조군 및 에탄올 처리배아에 대해 반복한다.
- p200 마이크로파이터 세트를 200 μL로 설정하여, 캡을 빠르게 열고 모든 잔류 배아 매체를 제거한다(도 2C에설명된 대로). 50 μL의 물을 함유한 파이펫을 튜브에 빠르게 넣고 (배아를 손상시키지 않도록) 부드럽게 추가한 다음 물을 제거합니다. 대기 파이펫터에서 프로테아제 칵테일 용액의 50 μL을 신속하게 추가하고 튜브 캡을 닫습니다(그림 2D).
참고: 이 프로세스는 한 번에 하나의 샘플을 수행합니다. - 프로테아제 칵테일이 코리온을 저하시킬 수 있도록 샘플을 RT에 10분 동안 앉게 합니다. 그런 다음 5 M NaCl의 450 μL을 신속하게 추가하고 튜브 캡을 닫습니다(그림 2E). 10 분 동안 샘플을 소용돌이. 공정 속도를 높이려면 믹서를 동시에 여러 샘플을 소용돌이로 설정합니다.
참고: 실리카 비드 혼합물(2사이즈, 0.5mm 및 1mm 비드)의 소량(~100 μL)을 24hpf 이상의 배아가 있는 튜브에 추가합니다. 오래된 배아에서는, notochord는 균질화되는 기간에 관계없이 그대로 유지됩니다. - 10 분 동안 균질화 한 후, 균질화 된 배아 상판제 2 μL을 신속하게 제거하고 가스 크로마토 그래피 바이알을 첨가하십시오. 폴리테트라플루오로에틸렌 캡으로 바이알을 빠르게 밀봉합니다.
6. 미디어 및 에탄올 표준 준비
- 미디어 표준을 준비하려면 5M NaCl/프로테아제 칵테일 용액으로 미디어를 10배 씩 희석합니다. 각 시료의 2 μL을 가스 크로마토그래프 바이알에 넣고 폴리테트라플루오로에틸렌 캡으로 밀봉합니다.
- 에탄올 표준을 준비하려면 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40 mM의 농도로 5 M NaCl/protease 칵테일 용액에 100% 에탄올의 직렬 희석을 만듭니다. 가스 크로마토그래프 바이알에 각 표준의 2 μL을 추가하고 폴리테트라플루오로에틸렌 캡으로 밀봉합니다.
7. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래프 준비
참고: 이 설정 및 프로토콜은 사용되는 가스 크로마토그래프에 따라 변경해야 할 수 있습니다. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피는 분리가 아닌 에탄올 수준을 정량화하는 데 사용됩니다.
- 자동 샘플러용 히터를 58°C로 설정하고 켭니다. 히터가 58 °C에 도달하도록 하고 가스 크로마토그래프를 공급하는 공기 및 수소 가스 라인을 켭니다 (에탄올을 정량화하는 데 사용되는 화염 이온화용).
참고: psi는 제조업체의 사양에 따라 크로마토그래프를 올바르게 작동하도록 설정해야 합니다. 헬륨 선이 켜졌는지 확인하고 적절한 psi로 설정하십시오. - 중격의 경우 주입된 샘플 수가 >100이 아닌지 확인하십시오. 사출 섬유의 경우 주입된 샘플 수가 >500이 아닌지 확인하십시오.
참고: 주사량이 초과된 경우 테스트 샘플을 실행하기 전에 변경해야 합니다. - 분석 소프트웨어를 켜고 워크스테이션이 제대로 설정되어 있는지 확인합니다. 실험실/부서 표준에 따라 모든 데이터를 저장합니다. 실행할 샘플에 대한 새 샘플 목록을 만듭니다.
- 시동 방법을 시작하고 샘플을 실행하기 전에 화염 이온화 검출기가 안정화될 때까지 기다립니다. 일단 안정되면, 섬유를 청소하는 소프트웨어 시작 방법을 실행합니다.
8. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용한 시료 측정
- 시작 메서드가 완료되면 샘플 목록에서 샘플당 1개의 새 줄을 만듭니다. 분석 소프트웨어의 방법 메뉴에서 436 전류 spme 에탄올 2013 3min 흡수 2_5min rg 실행을 로드합니다. 샘플 목록의 각 샘플에 대한 메타음.
- 공기, 물, 5 M NaCl / 프로테아제 칵테일 블랭크로 시작하여 샘플 목록을 작성하십시오. 그런 다음 0.3125에서 40mM까지 순서대로 표준을 입력합니다. 공기, 물, 5 M NaCl / 프로테아제 칵테일 블랭크의 두 번째 라운드와 표준을 따르십시오.
- 가장 낮은 예측 에탄올 농도에서 가장 높은 예측 된 에탄올 농도까지 시험할 모든 균질화된 배아 상피 샘플을 입력합니다. 공기, 물, 5 M NaCl / 프로테아제 칵테일 블랭크의 세 번째 및 최종 라운드를 입력하여 종료합니다.
- 샘플을 입력한 순서대로 자동 샘플러에 가스 크로마토그래프 바이알을 추가합니다. 샘플을 10-15분 동안 데우도록 허용합니다.
- 모든 샘플과 최종 공백이 실행된 후 샘플 목록에 최종 샘플을 추가하고 대기를 실행하여 소프트웨어의 종료 방법을 활성화합니다. METH. 샘플 실행 중에 수집된 모든 데이터를 백업합니다. 다음 순서로 장비를 끄십시오 : 자동 샘플러 히터, 수소 탱크 및 크로마토 그래프 온도가 30 °C에 도달 한 후에만 공기 탱크. 왁스 컬럼을 보존하기 위해 헬륨 탱크를 그대로 둡니다.
9. 샘플 에탄올 피크 통합 및 시료 농도 분석
참고: 9.3on의 모든 값은 모든 방정식이 미리 채워진 엑셀 파일에서 계산되었습니다.
- 종료 방법이 완료되면 크로마토그램 열기를 클릭합니다. 결과가 포함된 폴더를 엽니다. 샘플은 이 프로그램에 자동으로 통합됩니다.
- 결과에서 올바른 피크가 통합되었는지 확인합니다(에탄올 피크는 2에서 2.5 사이). 모든 샘플이 확인되면 결과를 인쇄하거나 내보냅니다.
- 그래프에 에탄올 표준의 피크 높이를 플로팅합니다. 에탄올 표준에 대한 경사, Y 절편 및R2 값을 계산합니다(R2는 >0.99여야 합니다).
참고: 이러한 값은 샘플 피크 높이에서 에탄올 농도를 결정하는 데 사용됩니다. - 각 샘플에 대해 에탄올 표준의 Y 절편에서 샘플의 피크 높이를 뺍니다. 이 값을 에탄올 표준의 경사로 나누어 GC 바이알내의 각 샘플에 대한 에탄올 값을 얻습니다.
- 배아의 에탄올 농도를 계산하려면 먼저 각 샘플에 대한 희석 계수를 계산합니다. 이 프로토콜의 2.3단계에서 계산된 볼륨 측정값을 볼륨 측정값과 500 μL로 나눕니다. 이것은 배아 처리 동안 각 샘플에 첨가된 5M NaCl/프로테아제 칵테일 용액을 나타낸다(단계 5.3 및 5.4).
- 이 샘플 희석 계수를 사용하여 각 샘플에 대한 샘플 에탄올 값을 곱합니다. 결과는 mM 농도에 있을 것입니다. 매체 에탄올 값을 희석 계수 10으로 곱하여 미디어 참조 샘플을 계산합니다.
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Representative Results
혈액 에탄올 수준은 완전히 형성된 순환 계통이 부족하기 때문에 초기 배아 제브라피시에서 결정될 수 없습니다. 제브라피쉬 배아에서 에탄올 농도수준을 결정하기 위해 에탄올 수준은 균질화된 배아 조직에서 직접 측정됩니다. 배아 에탄올 농도를 적절하게 측정하려면 배아 량을 고려해야 합니다. 배아 (노른자 부착)는 초원 내부에 앉아 (달걀 껍질) 엑스트라 배아 유체에 둘러싸여(그림 1). 배아의 모든 부피는 배아의 크기가 증가함에 따라 배아의 양이 발달 시간에 걸쳐 변화하기 때문에 노출 시 배아에서 이루어져야 합니다. 또한, 배아처리 방법은 배아 부피뿐만 아니라 배아 의 양을 고려해야 하는데, 이는 이 두 원소가 배아 에탄올 수준을 계산하는 데 사용되는 희석 인자를 생성하기 때문이다.
배아는 완벽한 구체가 아니기 때문에, 특히 10 hpf 후에, 물 변위는 배아 부피를 평가하기 위하여 이용되었다. 이 연구는 24 hpf에서 배아를 사용했습니다. 그들의 융자에서 배아의 양과 그들의 융자에서 제거된 둘 다 측정되었습니다. 이들 부피가 엑스트라배아유체를 가진 배아에 대해 1.97(±0.4 SD) μL, 및 배아 단독에 대해 1.1(±0.22 SD) μL이었다(표1). 배아와 배아 단독의 차이는 배아내부의 배아를 둘러싸고 있는 배아유체의 부피이다(그림1). 이러한 차이는 시료에서 배아단독의 에탄올 농도를 결정하는데 중요하다. 분석으로부터, 배아는 배아의 총 부피의 56%를 융자 내부의 엑스트라배아유체로 구성하였다(표1). 배아가 성장함에 따라, 배아 의 양은 시간이 지남에 따라 증가하여, 엑스트라 배아 유체(25)의부피의 감소로 이어져. 배아의 에탄올 농도를 측정할 때, 배아와 배아 유체 의 수분 함량을 고려해야 합니다.
이전에 발표된 연구는 배아단독의 물분획이 73.6%29인것으로 나타났다. 이 결과는 부피 측정, 전자 스핀 공명 분광법 및 자기 공명 현미경검사법의 조합을 사용하여 수득되었다. 이 결과를 확인하기 위해, 배아는 앞서설명한 바와같이 70°C에서 베이킹 전후에 단독으로 칭량하였다. 이 과정은 배아에서 모든 물을 제거합니다. 무게의 변화는 배아의 물의 양을 나타낸다. 이 분석으로부터, 24hpf 배아에는 ~72%의 물이 함유된 반면 48hpf 배아는 ~76%를 함유하였다. 이들 값 은 모두 이전에 계산된 73.6% 배아수량(29)과매우 유사하다. 이것은 배아의 물 양이 초기 발달내내 거의 변하지 않았다는 것을 건의합니다.
배아의 수질을 계산하기 위해 다중 접근법을 이용한 공표된 작업을 바탕으로, 73.6%는 제시된 모든 분석에 대한 배아 수분 함량으로 사용되었다. 이는 배아 부피의 0.82 μL을 포함하는 물을 초래하였다(표1). 이로부터, 엑스트라배아유체의 부피는 0.86 μL로 계산되었다. 배아의 총 수량 중 49%는 배아에 함유되어 있고 51%는 배아 유체에 함유되어있다(표 1).
가스 크로마토그래피 분석을 위해, 그들의 융모에 아직도 24 hpf 배아만 사용하였다(그림1). 이 에탄올 요법에서, 배아는 6-24 hpf로부터 1% (171 mM) 에탄올 매체 농도로 처리되었지만, 실험 설계에 따라 상이한 에탄올 농도 및 노출 시간 윈도우가 사용될 수 있다. 15개의 샘플(샘플당 10개의 배아)과 2일 동안 처리된 매체의2그룹(표 2)을분석하였다. 미디어 수준은 실험마다 다를 수 있습니다. 이를 고려하여, 미디어 에탄올 수준은 실험군당 5배측정하였다. 이 분석에서, 미디어 수준은 그룹 2에 대한 그룹 1 및 133.6 (± 2.7 SD) mM에 대한 143.6 (± 2.3 SD) mM이었다. 이러한 값은 페어링되지 않은 t 테스트(p = 0.0002)를 사용하여 크게 다릅니다. 배아 외 유체를 가진 배아는 각각 그룹 1과 2에 대해 63.5 (± 17.1 SD) mM 및 53.1 (± 12.6 SD) mM을 평균하였다. 그러나, 농도는 배아 유체를 가진 배아의 2군 사이에서 유의히 다르지 않았다(짝이 없는 t 시험, p=0.07). 치료되지 않은 대조군 배아는 0 mM에서 측정하였다. 매체 수준에 있는 변이 때문에, 각 견본에 대한 배아 에탄올 농도/매체 수준의 비율을 계산하였다. 그룹 1은 미디어 에탄올 수준의 44%를 가졌고, 그룹 2는 미디어 에탄올 수준의 40%를가졌다(도 3 및 표 2).
그림 1: 24시간 후 유추(hpf)에서 배아의 이미지 배아와 노른자는 모두 융기 안에 있는 엑스트라 배아 유체에 의해 포위됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 배아 의정서는 배아의 부피를 측정하고 분석을 위해 배아를 처리한다. (A)10개의 24hpf 배아는 250 μL 부피로 표시된 1.5 mL 마이크로원심지 튜브로 옮겼다. (B)물로 채워진 배아가 있는 미세원심지 튜브(물이 염색되어 250 μL 마크에서 더 쉽게 볼 수 있음). (C)모든 물이 튜브에서 제거되고 계량됩니다. (D)1.5 mL 미세원원지 튜브로 옮겨진 10개의 배아. 물을(C)에서와같이 제거하고 프로테아제 칵테일 50 μL로 대체하였다. (E)10분 후, 450 μL의 5 M NaCl을튜브(D)로부터첨가하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 시료와 매체의 에탄올 농도의 비율의 상자 및 수염 플롯. 각 군별 에탄올 농도를 해당 군의 미디어 샘플의 평균으로 나누었다. 그룹 1은 미디어 레벨의 44%를, 그룹 2는 40%를 포함했습니다. 두 그룹 모두에서, n = 15; 샘플 당 10 배아. 그룹은 Tukey의 포스트 혹 분석(****p < 0.0001)과 단방향 ANOVA를 사용하여 비교하였다. 수염은 최소에서 최대값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 배아 및 배아 + 배아 외 수량 (μL) | ||||||
| 물a | ||||||
| 총 볼륨b | 총 볼륨의 %(V) | 배아 부피 (W) | 엑스트라 배아 볼륨 (X) | 배아의 수 % (Y) | 엑스트라배아닉의 수량 %(Z) | |
| 배아 + 엑스트라배아(EE)c | 1.97 ± 0.4 | |||||
| 배아 24 hpf (E)c | 1.11 ± 0.22 | 56% | 0.82 | 0.86 | 49% | 51% |
| 계산 | ||||||
| V (주)V 총 부피의 배아 비율 = E의 총 부피 EE의 총 부피 | ||||||
| W (주)W 배아 물 부피 = V × 73.6% | ||||||
| X (주) 엑스트라배아 물 량 = W – EE의 총 부피 | ||||||
| 배아의 Y% 물 = (W + X)/W × 100 | ||||||
| 엑스트라배아닉의 Z% 물 = 100 – Y | ||||||
| a. 배아 물 부피는 Hagedorn 외.29로부터 계산되었다. | ||||||
| b 값은 ± 표준 편차(SD)로 보고됩니다. | ||||||
| cn = 13; 샘플당 배아 10개 | ||||||
표 1: 배아 용액을 가진 배아의 물 부피 계산. 부피는 24 hpf 배아에서 13개의 샘플(샘플당 10개의 배아)으로부터 계산되었고, 배아체는 여전히 융모에 있고 배아는 그들의 융모에서 제거되었다. 값은 평균 ± SD로 보고됩니다.
| 배아 및 매개체(mM)의 에탄올농도는 | |||
| 그룹 1 | 그룹 2 | 결합 | |
| 미디어 (M)b | 143.6 ± 2.3 | 133.6 ± 2.7 | 138.6 ± 5.8 |
| 배아 + 엑스트라배아(EE)c | 63.5 ± 17.1 | 53.1 ± 12.6 | 58.3 ± 15.7 |
| 에탄올 비율 - 배아 대 미디어 (1) | 0.44 ± 0.12 | 0.40 ± 0.09 | 0.42 ± 0.11 |
| 계산 | |||
| 1개 에탄올 비율 = EE M | |||
| a. 값은 ± SD로 보고됩니다. | |||
| bn = 5 | |||
| cn = 15; 샘플당 배아 10개 | |||
| d 값은 그룹 1과 2의 평균입니다. | |||
표 2: 배아 유체 및 매체(mM)가 있는 배아에서에 대한 에탄올 농도계산. 미디어 샘플은 미디어로부터의 직접적인 측정(그룹당 n=5)이었다. 배아 에탄올 농도는 엑스트라 배아 유체를 가진 24 hpf 배아로부터 15개의 샘플(샘플당 10개의 배아)으로부터 계산하였다. 배아의 에탄올 농도와 배아 체액의 비율을 매체에 계산하였다. 값은 평균 ± SD로 보고됩니다.
| 배아에 있는 에탄올의 계산a,b | |
| 배아 (Y) | 미디어 비율(Z) |
| 32.7 ± 8.8 mM | 0.24 ± 0.06 |
| 계산 | |
| Y (예: Y 배아 에탄올 = 58.3 mM (표 2) × 56% (표 1) | |
| Z (주)Z 에탄올 비율 = Y 138.6 mM (표 2) | |
| a. 값은 그룹 1과 2의 평균입니다. | |
| b 값은 ± SD로 보고됩니다. | |
표 3: 배아에서 에탄올의 계산. 배아 에탄올 농도는 배아 의 총 에탄올 농도의 56%로 계산되었고, 배아 유체를 가진 배아의 총 에탄올 농도는 56%로 계산되었다. 이것은 그 때 매체에 태아의 비율로 보고되었습니다. 값은 평균 ± SD로 보고됩니다.
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Discussion
개발 모델 시스템인 zebrafish는 환경 요인이 개발에 미치는 영향을 연구하는 데 이상적입니다. 그(것)들은 에탄올 연구 결과에 있는 정확한 타이밍 그리고 복용량 패러다임을 허용하는 외부기름지게 한 태아의 다수를 일으킵니다. 이것은 살아있는 화상 진찰 기능 및 인간을 가진 유전과 발달 보존과 결합하여, zebrafish를 기형학 연구를 위한 강력한 모형 체계를 만듭니다. 기재된 것은 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피시 배아를 개발할 때 배아 에탄올 농도를 측정하기 위한 프로토콜이다.
배아 에탄올 농도를 결정하는 것은 에탄올이 발달 하는 배아에 미치는 영향을 이해하는 데 중요합니다. 설치류 모델에서, 혈액 에탄올 농도는 조직 농도와 상관 관계26. 그러나, 제브라피시의 초기 배아 발달에서 혈액 에탄올 수준을 평가하는 것은 불가능합니다. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피는 제브라피시25,30,31,32,33,34,35를포함한 다양한 실험 패러다임에서 에탄올 수준을 측정하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이 프로토콜은 이러한 다양한 요인의 변동성이 정량적으로 측정할 수 있을 만큼 충분히 높아야 하고 가스 크로마토그래피 컬럼이 문제의 화합물의 극성에 기초하여 선택되어야 함에도 불구하고 많은 다른 환경 적 요인을 측정하는 데 사용될 수 있다. 또한, 제브라피쉬는 소수성 요인에 대한 노출이 물고기에서 분석하기가 매우 어렵기 때문에 수용성 요인의 영향을 연구하는 데 가장 적합합니다.
이 프로토콜은 연구원이 제브라피시 배아의 에탄올 농도를 직접 평가할 수 있게 합니다. 그러나 배아 에탄올 농도의 정확한 측정을 보장하기 위해 여러 가지 요인을 해결해야 합니다. 총 배아 조직에서 에탄올 수준을 측정했기 때문에 배아 양을 고려해야 했습니다. 10 hpf 후에 배아는 소미토 생성 (somite 형성)을 시작하고 더 이상 구체가 아닙니다(그림 1). 배아 부피를 평가하기 위해, 샘플당 10개의 풀화된 배아에 물 변위를 사용하였다. 각 샘플은 두 가지 이유로 10개의 배아로 구성되었습니다: 첫째, 작은 부피의 파이펫팅에서 오차를 줄이고, 둘째, 배아 부피의 작은 변동을 평균화합니다. 배아 부피를 측정할 때 파이펫팅 및 계량의 정밀도를 고려하는 것이 중요합니다. 샘플당 10개의 배아를 사용하는 것조차도 배아를 계량하는 데 사용되는 파이펫과 스케일 모두에 대한 정밀도의 하한선에 있습니다. 장비를 사용할 수 있다면 10개 미만의 배아를 사용하면 분석에 영향을 미쳤을 것입니다. 이것은 장비 정밀도가 고려되는 한 연구원이 견본 당 더 적은 배아를 사용하는 것을 제한하지 않습니다.
배아 부피는 샘플 분석에 영향을 미치는 한 가지 요인입니다. 두 번째 핵심 요소는 에탄올이 휘발성이기 때문에 배아 처리 속도입니다. 또한, 에탄올은 여러 동물 연구에서 빠르게평형화 25,36,37. 당사의 세척 프로토콜은 코리온의 외부 표면에 있는 에탄올을 신속하게 제거하도록 설계되었습니다. 본 연구에서 이 세척 프로토콜은 배아 에탄올 수치에 영향을 미치지 않았지만, 더 길거나 다중 세척이 배아 에탄올 농도25,38에영향을 줄 수 있었다. 그러나 고려해야 할 세 번째 요소는 처리 중에 배아 부피의 희석입니다. 이 프로토콜은 프로테아제 칵테일을 사용하여 코리온뿐만 아니라 5 M NaCl을 사용하여 알코올 처리 효소를 포함한 모든 단백질을 변성시킵니다.
마지막으로, 다양한 제브라피시 연구에서 다양한 분석 및 보고 방법을 설명했습니다. 연구의 다른 샘플 내의 변화로 인해 또는 다른 연구를 비교, 에탄올 농도의 적절한보고는 중요25,38. 간접 (일반적으로 효소 측정)을 사용하는 방법은 보조 대사 산물의 분석에 의존합니다. 이 경우 효소 활성의 속도가 다양하고 에탄올 농도의 정확한 분석을 방해할 수 있습니다. 이 방법은 에탄올 수준을 직접 측정하고, 에탄올 농도는 배아와 매체 농도의 비율로 보고된다. 우리의 결과는 24 hpf 배아의 증가합의와 일치하여 약 30%의 미디어농도(표 3)25,38,39,40을함유한다. 놀랍게도, 이 30% 배아 에탄올 농도는 매체 농도와 무관하며, 이 평형을 만드는 것이 무엇인지 잘 이해되지 않는다25,38. 24 hpf 보다 오래된 배아는 에탄올 농도가 감소하며, 48hpf 배아는 24 hpf 배아25의에탄올 함량의 거의 절반을 함유한다. 그러나, 우리의 결과는 에탄올 - 물 평형을 결정하지 않습니다. 에탄올이 평형화되는 속도와 에탄올의 변동성을 감안할 때, 에탄올 노출로 인한 배아 자체의 물 부피 변화를 평가하는 것은 매우 어렵습니다. 물 변위를 사용하여 처리된 배아 샘플의 부피를 측정하려고 하면 측정 중에 배아로부터 에탄올이 손실됩니다. 전술한 것보다 더 정밀한 현미경 검사법 및 분광학 방법을 사용하여, 배아에서 에탄올-물 평형을 동시에 직접 측정함으로써 확인할 수 있다.
전반적으로, 여기에 기술된 프로토콜은 제브라피시 배아 개발시 배아 에탄올 농도를 평가하는 강력한 도구입니다. 이 정보는 제브라피시를 사용하여 FASD 연구를 표준화하는 데 매우 중요합니다. 에탄올 치료 패러다임을 정밀하게 제어하고 배아 에탄올 농도를 직접 정량화하는 능력은 인간 FASD 연구를 위한 제브라피시 모델의 기능을 강화합니다. 궁극적으로, 이 작품은 FASD에 대한 우리의 이해를 크게 향상시킬 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 문서에 제시된 연구는 J.K.E에 국립 보건원/국립 치과 및 두개안면 연구 (NIH/NIDCR) R01DE020884에서 이전 교부금에 의해 지원되었습니다. 그리고 알코올 남용 및 알코올 중독에 대한 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소 (NIH / NIAAA) F32AA021320 C.B.L.에 알코올 남용에 대한 국립 보건 원 / 국립 연구소의 현재 보조금에 의해 (NIH / NIAAA) R00AA023560 에 C.B.L. 우리는 가스 크로마토그래프 분석을 제공하고 지원해 준 Rueben Gonzales에게 감사드립니다. 티아나 온티베로스와 지나 노블스 박사의 글쓰기 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
References
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
