Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Dextran Mærkning og optagelse i levende og funktionelle Murine Cochlear hårceller

Published: February 8, 2020 doi: 10.3791/60769
Automatic Translation
1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Her præsenterer vi en metode til visualisering af udbredelsen af 3 kDa Texas Rød-mærket dextran i auditive hårceller med funktionelle mechanotransduction kanaler. Desuden kan dextrans af 3-10 kDa bruges til at studere endocytose i hår og støtte celler i orglet corti.

Abstract

Hårcellemechanotransduction (MET) kanal spiller en vigtig rolle i hørelsen. Den molekylære identitet og de strukturelle oplysninger om markedsøkonomisk behandling er dog fortsat ukendt. Elektrofysiologiske undersøgelser af hårceller viste, at MET-kanalen har en stor ledningsevne og er gennemtrængelig for relativt store fluorescerende kationiske molekyler, herunder nogle styrylfarvestoffer og Texas Rød-mærket aminoglycoside antibiotika. I denne protokol beskriver vi en metode til at visualisere og evaluere udbredelsen af fluorescerende dextrans i hårceller i orglet i Corti explants, der kan bruges til at assay for funktionelle MET kanaler. Vi fandt, at 3 kDa Texas Rød-mærket dextran specifikt etiketter funktionelle auditive hårceller efter 1-2 h inkubation. Især 3 kDa dextran etiketter de to kortere stereocilia rækker og ophobes i cellekroppen i et diffust mønster, når funktionelle MET kanaler er til stede. En yderligere vesicle-lignende mønster af mærkning blev observeret i cellekroppen af hårceller og omkringliggende støtteceller. Vores data tyder på, at 3 kDa Texas-Red dextran kan bruges til at visualisere og studere to veje til cellulære farvestof optagelse; en hårcellespecifik indgangsrute gennem funktionelle MET-kanaler og endocytose, et mønster, der også er tilgængeligt for større dextran.

Introduction

Hårcellerne i det indre øre er de sensoriske celler, der registrerer lyd og skjulte de mekanisk stimuli i elektriske signaler, som i sidste ende fortolkes af vores hjerne. Disse celler har en trappe-formet bundt af tre rækker af actin-baserede filamenter, kendt som stereocilia, som stikker ud fra deres apical region1,2. De mekaniske stimuli afleder stereocilia-glødetrådene mod den længste række og udløser åbningen af mechanotransduction (MET)kanaler3. Åbningen af MET-kanalerne fører til en tilstrømning af kationer, der depolariserer cellen og dermed signalerer frigivelsen af synapse vesikler på de basale region af hårcelle.

De biofysiske egenskaber af MET kanal afgørende for hørelse naster. Disse kanaler er bl.a. Bemærkelsesværdigt, store fluorescerende molekyler såsom FM1-43 og Texas Rød-mærket aminoglycosides er permeant blokkere af MET kanal, hvilket resulterer i deres ophobning i hårcellekroppen, der kan visualiseres ved hjælp af fluorescens mikroskopi11,12,13,14. Omvendt er den molekylære identitet og strukturen af MET-kanalen og dens gennemtrængelsesvej forblevet undvigende. Stigende eksperimentelle beviser viser , at transmembrane-lignende kanal protein 1 (TMC1) er en del af MET kanal i modne hårceller15,16,17,18,19. Mutationer i transmembrane-lignende kanal 1 (TMC1) ændre MET kanal egenskaber19,20,21,22 og forårsage døvhed. Desuden lokaliserer TMC1 til det sted, hvor MET kanal18,23 og interagerer med tip-link ansvarlig for at overføre den mekaniske kraft til MET kanal24,25. Desuden har de seneste bioinformatik analyse identificeret TMC proteiner som evolutionære relateret til mechanosensitive kanaler TMEM63/OSCA proteiner og TMEM16 proteiner, en familie af calcium-aktiverede chlorid kanaler og lipid scramblases26,27,28. En strukturel model af TMC1 baseret på forholdet mellem disse proteiner afslørede tilstedeværelsen af et stort hulrum på protein-lipid interface27. Dette hulrum huser de to TMC1 mutationer, der forårsager autosomal dominerende høretab (DFNA36)27,29,30,31,32, og selektiv ændring af cystein mutanter for rester i hulrummet ændre MET kanal egenskaber28, hvilket indikerer, at det kunne fungere som gennemfarvning vej met kanal. Den store størrelse af denne forudsagte hulrum i TMC proteiner kunne forklare evnen af store molekyler til at gennemsyre MET kanal. For at teste forudsigelsen om, at MET-kanalen indeholder en usædvanlig stor gennemtrængelsesvej og for at skubbe grænserne for størrelsen af hulrummet observeret i TMC1, udviklede vi en protokol til at udføre optagelseeksperimenter i Corti-explants organ med et større molekyle, 3 kDa dextran fluorescerende mærket med Texas Red.

Dextran er en kompleks forgrenet polysaccharid består af mange D-glukose molekyler bundet af alfa-1,6 glycosidiske forbindelser. Dens høje opløselighed i vand, lav celle toksicitet, og bioinertity gør det til et alsidigt værktøj til at studere flere cellulære processer. Desuden er dextran fås i en bred vifte af størrelser og fluorescerende mærket med fluorophores i flere farver. Fluorescerende mærket dextrans er almindeligt anvendt i celle og væv permeabilitet forskning33,34, at studere endocytose i flere cellulære systemer35,36, og for neurale sporing37,38. På det auditive område er dextranmolekyler også blevet brugt til at vurdere afbrydelsen af cellecellekrydset og tabet af den auditive sensoriske epitelintegritet efter udsættelse for intens støj i chinchillaorgelet i Corti39,40.

I dette arbejde udnyttede vi egenskaberne for nogle af de mindste (3 og 10 kDa) fluorescerende dextrans til at udføre optagelsesforsøg i murine indre ørehårceller og udforske størrelsen af permeationsvejen for den indre ørehårscelle MET-kanal. Derudover brugte vi en laser-scanning konfokale mikroskop (LSM) 880 udstyret med en Airyscan detektor til at visualisere og lokalisere fluorescerende dextran på stereocilia og cellekroppen af auditive hårceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrepleje- og forsøgsprocedurerne blev udført i følger retningslinjerne for pleje og anvendelse af laboratoriedyr, som blev godkendt af Animal Care and Use Committee fra National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Animal protocol #1336 til KJS).

1. Mus

  1. Indstil et par ynglende par C57BL/6J vildtype til at yngle i dyreanlægget for at kontrollere datoen for nedløbets fødsel og holde styr på hvalpenes alder.

2. Cochleae Dissektion

  1. Indstil et rent rum tæt på et stereomikroskop til at udføre dissektionerne (Figur 1A). Brug 70% ethanol til at rense rummet og omgivelserne og placere en ren bænk pad. En medicinsk patologisk affald (MPW) plastpose ville være forpligtet til at kassere dyrekroppe.
  2. Forbered flere 35 mm retter med nogle Leibovitz's L15 medier.
    BEMÆRK: Leibovitz's L-15 celle medier indeholder 1-2 mM Ca2 +, som er nødvendig for at opretholde integriteten af tip-links, og indeholder essentielle aminosyrer, vitaminer og natriumpyruvat for at forbedre celle sundhed og overlevelse. Serum blev udelukket for at undgå eksperimentel variation på grund af dets dårligt definerede sammensætning og potentielle interferens med dextran.
  3. Euthanize postnatal-dag-6 (P6) mus ved halshugning.
    BEMÆRK: 6 dage gamle mus er noget modstandsdygtige over for inhalant bedøvelsesmiddel. Selv om isofluran eller langvarig CO2 eksponeringer (op til 50 min) kan anvendes til dødshjælp, en sekundær fysisk metode anbefales at sikre døden.
  4. Brug kirurgisk saks til at fjerne huden af kraniet ved at gøre en overfladisk snit fra den bageste til den bageste ende og på tværs af de eksterne auditive kanaler.
  5. Fold huden mod næsen for at eksponere kraniet (figur 2B).
  6. Lav et snit fra bagsiden til forsiden af kraniet og over øjenlinjen (Figur 2B-C).
  7. Adskil kraniet i to halvdele og fjern hjernen med brug af en lille spatel for at afsløre de tidsmæssige knogler (Figur 2C-D).
  8. Med små saks, skæres omkring de tidsmæssige knogler, og punktafgifter vævet.
  9. Placer begge tidsmæssige knogler i en 35 mm skål og sørg for, at de er dækket med L15 medier (Figur 2E).
    BEMÆRK: Følgende trin udføres under stereomikroskopet. En sort baggrund hjælper normalt til at visualisere vævet under de fine dissektionstrin.
  10. Under et stereomikroskop udstyret med et widefield okular (en 10X forstørrelseseffekt (WF10X) og en ekstern vekselstrøm (AC) halogen lyskilde), skal du fjerne det omgivende cochleae væv, halvcirkelformede kanaler, og vestibulære organer med kirurgiskpincier (Figur 2F).
  11. For at gøre det muligt for dextran og L15 medier at komme ind i cochlear kanalen, udføre to punktering grænser på dissekeret cochleae, en på det runde vindue og andre på den apical cochlear regionen.
  12. Tilføj 300 ml Leibovitz's L15 medier i hver brønd fra en 9-brønd glas depression plade.
  13. Placer mindst tre dissekeret cochleae på hver brønd.

3. Dextran Mærkning

  1. Rekonstituere dextran i Hanks ' afbalancerede saltopløsning uden Ca2 + og Mg2 + (HBSS-CFM) ved en endelig koncentration på 10 mg/ml. Denne stamopløsning skal være aliciteret i uigennemsigtige sorte rør (beskyttet mod lys) og opbevares ved -30 °C indtil brug.
    BEMÆRK: Brugen af lysin-fixable dextran er afgørende for et vellykket resultat af denne protokol.
  2. Forbered hver dextran ved en endelig koncentration på 2 mg/ml i 500 ml leibovitz's L15 medier.
  3. Fjern mediet fra cochlea og tilsæt Leibovitz's L15 medier, der indeholder dextran af interesse ved en endelig koncentration på 2 mg/ml.
    BEMÆRK: Selv om en del af markedskanalerne er åbne i hvile41,42, blev dextran inkubationen udført med en blid rysten af explanterne for at øge den åbne sandsynlighed for MET-kanalen.
  4. Inkuberved stuetemperatur i 2 timer med skånsom omrystning (25 omdr./min.) ved hjælp af en 3-dimensionel shaker med en vippet vinkel på 25°.
    BEMÆRK: Fluorescerende mærket dextran skal være beskyttet mod lys, når det er muligt. For at beskytte dextran under 2 h inkubation, placere 9-godt glasplade inde i en celle kultur P150 fad pakket ind i aluminiumsfolie.

4. Prøveforberedelse til billedbehandling

  1. Efter inkubation med dextran vaskes vævet i 2 min to gange med medier og en gang med HBSS.
  2. Inkubervævet ved stuetemperatur i 30 minutter med 4% paraformaldehyd i Hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS).
    FORSIGTIG: Udsættelse for formaldehyd kan være irriterende for øjne, næse og øvre luftveje. Hos visse personer, gentagen hud eksponering for formaldehyd kan forårsage sensibilisering, der kan resultere i allergisk dermatitis. Formaldehyd er et kendt kræftfremkaldende stof hos mennesker og en formodet forplantningsfare.
  3. Vask hurtigt og forsigtigt det faste væv to gange med HBSS for at fjerne paraformaldehyd.
    BEMÆRK: Dekalkning af de tidsmæssige knogler er ikke nødvendig på dette udviklingsstadie af cochlea.
  4. Fjern spiralledbånd og den tectorialmembran med fine spids pincet til at dissekere orglet i Corti (Figur 2G).
  5. Fjern alle de små stykker væv og vask vævet med HBSS.
  6. Permeabilisere vævet i 0,5% Triton X-100 i PBS indeholdende fluorescerende-mærket phalloidin (konjugeret til grøn eller rød, når du tester optagelse af TR- eller FITC-mærket dextran, henholdsvis) på en 1:200 fortynding i 30 min at mærke F-actin og visualisere actin-baseret stereocilia.
  7. Vask vævet 2-3 gange i 2 minutter hver gang med HBSS buffer for at fjerne det overskydende triton og falloidin, og en gang med PBS at fjerne salte.
  8. Monter corti-vævets organ på et mikroskopdias, og dæk det med monteringsmedier.
    BEMÆRK: Når vævet monteres, skal du sørge for, at den side af vævet, der indeholder hårcellestereocilien, vender mod dækstrækket.
  9. Fjern eventuelle bobler, der genereres under tilsætning af monteringsmediet, og forhindrer generering af nye bobler under placeringen af dækstrækket.
    BEMÆRK: Aspirere med en pipette enhver boble genereret under tilsætning af monteringsmediet. For at forhindre, at luftbobler ne fanges under dæksslip, skal du placere en kant af dækselet tæt på prøven og forsigtigt og langsomt sænke dækselen over vævet ved hjælp af pincet eller en pipettespids.
  10. Dæk vævet i monteringsmedier med en glasdæksel (Figur 2H).
    BEMÆRK: Mål med en numerisk blænde åbning over 0,4 er designet til at bruge #1,5 dæksedler (0,17 mm tykkelse). Brug af den forkerte dæksel kan have alvorlige konsekvenser for intensiteten og kvaliteten af billederne.
  11. Inkuber det monterede væv natten over ved stuetemperatur for at lade monteringsmediet tørre og opbevare diasene ved 4 °C indtil billeddannelse.

5. Billederhvervelse og billedbehandling

BEMÆRK: Konfokale billeder blev taget med en LSM 880 konfokale mikroskop udstyret med en 32 kanal Airyscan detektor i super-opløsning (SR) mode43 og en 63x mål.

  1. Tilsæt en lille dråbe nedsænkningsolie på målet.
  2. Anbring mikroskopets slide, der indeholder den monterede vævsprøve, i mikroskopfasen med glasdækselvendt mod nedsænkningsolien.
  3. Fokuser på prøven, og angiv billedparametrene ved hjælp af billedanskaffelsessoftwaren.
  4. Brug identiske indstillinger for billedoptagning og optimale parametre for x, y og z-opløsning for hvert uafhængigt eksperiment. En piezo-drevet fokus system er forpligtet til hurtigt og præcist at flytte målet, når erhverve z-stack af billeder.
    BEMÆRK: For at forestille sig hele den apiske region af hårceller, indsamle en z-stak af billeder fra stereocilia til den apical halvdelen af hårcelle kroppen ved hjælp af de optimale indstillinger. Det er afgørende at indsamle en stor z-stack langs hårcellen for at sikre billeddannelse af vesicle-lignende partikler.
  5. Brug billedanskaffelsessoftwaren til at behandle de rå konfokale billeder ved hjælp af Airyscan 3D-rekonstruktionsalgoritmen med de automatiske standarddeconvolutionsfilterindstillinger.
  6. Åbn konfokale billeder i en billedbehandlingssoftware for at justere lysstyrken og kontrasten, tilføje skaleringslinjen og eksportere billederne til de endelige tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi observerede robust og specifik mærkning af hårceller efter 2 h inkubation af orglet af Corti explants fra vilde-type postnatal-dag-6 (P6) mus med 3 kDa dextran fluorescerende mærket med Texas Red (dextran-TR)(Figur 2A-B). Dextran mærkning blev observeret i både indre og ydre hårceller (IHC og OHC) på basale, midterste og apiske regioner af orglet Corti(Figur 2B).

Fluorescerende mærket phalloidin blev brugt til at imødegå pletten filamentous actin (F-actin) og visualisere actin-baserede hårcelle stereocilia. Vi har også udført lignende eksperimenter på kortere inkubationstider, og selv om vi observerede dextran-TR ophobning i hårcellekroppen, signalerne var svagere og mere varierende end dem på 2 h inkubation (Figur 2C).

Vi næste afbildet både stereocilia og celle organer i hårceller og observerede, at kun de celler, der inkorporerede 3 kDa dextran-TR i deres celle krop viste fluorescerende mærkning af deres stereocilia(Figur 3A). Denne sammenhæng mellem stereocilia og cellekrop mærkning var fraværende i hårceller fra beskadiget væv, som også præsenterede uspecifik mærkning af dextran i flere celletyper af sensoriske epitel (gule firkanter i figur 2B, og figur 3B). Vigtigere er det, vi observerede en ensartet fluorescens signal langs stereocilia med berigelse på spidsen af de kortere stereocilia rækker, hvor MET kanal er placeret18,23 (Figur 3C). Også, vi bemærket vesicle-lignende strukturer i cellekroppen af hårceller og de omkringliggende støtteceller. Det vesikellignende optagelsesmønster i disse celler tyder på, at dextran-TR også kan tages op ved endocytose (figur 3C).

Den protokol, der er beskrevet her, giver også mulighed for at undersøge udbredelsen af større dextrans og kombinationer af forskellige dextrans. Større dextran af 10 kDa mærket med Texas Red (dextran-TR) eller fluorescein (dextran-FITC) også produceret en vesikel-lignende mønster i cellekroppen af hårceller og støtteceller, ud over at akkumulere omkring hårcellemembranen i et fragmentarisk mønster (Figur 4A,B). De 10 kDa dextran-TR også overfladisk mærket de tre stereocilia rækker af alle hårceller (Figur 4A, indsat), sandsynligvis på grund af den negativt ladede overflade af hårcelleplasmamembran44,45,46. Vi undersøgte derefter udbredelsen af 3 kDa dextran-TR og 10 kDa dextran-FITC samtidig tast i corti explants organ. For de 3 kDa dextran-TR observerede vi både et diffust og et vesikellignende mønster. Men de 10 kDa dextran-FITC kun vises en vesikel-lignende mønster (Figur 4C). Disse data tyder på, at dextran optagelse sker ved mindst to forskellige mekanismer, der er afhængige af størrelsen af dextran.

Vi vurderede dernæst, om der var behov for funktionelle markedsøkonomiske kanaler til optagelse af 3 kDa dextran-TR. For at gøre dette testede vi dextran inkorporering i hårceller fra orglet af Corti explants i overværelse af MET kanal blokkere (neomycin og amiloride)13,14,47 eller Ca2 + chelator BAPTA, som afskaffer MET strømme ved at bryde tip-links og forhindre gating af kanalen25,48,49. I disse forsøg blev vævsgraveplanterne tidligere inkuberet i 30 min med neomycin (500 mM), amiloride (150 mM) eller med BAPTA (5mM) før tilsætning af 3 kDa dextran-TR i nærværelse af den tilsvarende MET-blokker. Tilstedeværelsen af BAPTA eller blokkerne af markedsøkonomisk behandling forhindrede stereociliamærkningen (figur 5A) og udbredelsen af 3 kDa dextran-TR i hårceller (figur 5B). Blokaden af met-kanalen bevarede imidlertid det vesikellignende mønster (figur 5B),hvilket indikerer, at dette optagelsesmønster er uafhængigt af funktionelle markedsøkonomiske kanaler. Lignende resultater er blevet observeret i hårceller fra TMC1/TMC2 dobbelt knock-out mus, som mangler MET27. Interessant, disse vesicle-lignende strukturer var ikke observerbare i overværelse af amiloride, som er kendt for at hæmme Na+-H+ veksler og dermed hæmme endocytose50,51. Disse resultater viser, at 3kDa dextran-TR kommer ind i hårcellerne gennem to forskellige veje, en fælles for større dextrans involverer vesikel-lignende strukturer og en anden, der afhænger af funktionelle MET kanaler.

Figure 1
Figur 1: Trin af dissektion af et murineorgan i Corti. A) Rent areal og materialer, der kræves til dissektion. (B) Udsat musekraniet. Pincet holder huden, som har foldet mod næsen. Sorte linjer angiver de to snit, der er nødvendige for fjernelse af hjernen. (C) Incised og åbnet kraniet for at give mulighed for fjernelse af hjernen med en spatel (til højre). (D) Kranium og tidsmæssige knogler efter fjernelse af hjernen. (E) Punktafgifter kraniet, herunder tidsmæssige knogler (stiplede sorte firkanter) i en P35 plade dækket med medier. F) Punktafgifter cochleae. (G) To dissekeret organer Corti på brønden af en glasdepression plade. (H) Monteret prøve på en glasdæksel klar til billeddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Hårceller optagelse 3 kDa dextran-TR. (A) Skematisk repræsentation af Texas Rød-mærket dextran (dextran-TR) indeholder seks molekyler af glukose svarende til en molekylvægt på 1,08 kDa. En kortfattet ester reaktion forbinder en Texas Red molekyle (magenta) til en glukose monomer. (B) Repræsentativt konfokalbillede, der viser specifik mærkning af sensoriske hårceller (HC) med 3 kDa dextran-TR på tværs af hele Corti-organet fra en 6 dage gammel mus. De basale (BA), midten (MD) og det apiske (AP) af organeter er angivet. Gule firkanter indikerer vævsskadede områder. C) 3 kDa dextran-TR fluorescens efter 30, 60, 90 eller 120 min inkubation med Corti-explants organ er vist i magenta fusioneret med F-actin i grøn (topbilleder) og uafhængigt i gråtoneskala (bundbilleder). Billedvisningsområdet blev lineært justeret i hvert af de grå billeder uafhængigt for visualisering af 3 kDa dextran-TR fluorescens. Skalabjælke = 20 mm. Dette tal er blevet ændret fra27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Hårcellekrop og stereocilia mærkning med 3 kDa dextran-TR. (A) Konfokale billeder med 3 kDa dextran-TR fluorescens (magenta) ved cellelegemet og stereocilia-tællere, der er fremstillet med phalloidin, for at mærke F-actin (grøn) for at visualisere hårcellegrænser og stereocilia. De tre rækker af ydre hårceller (OHC) og en række indre hårceller (IHC) er angivet. Skalabar = 20 mm. (B) Konfokale billeder af et beskadiget vævsområde med 3 kDa dextran-TR fluorescens (magenta) ved cellekroppen og stereocilien. Gule pile angiver mærkningen af ikke-sensoriske understøttende celler. Skalabjælke = 20 mm. (C) Nærmere udsyn af 3 kDa dextran-TR fluorescens ved cellekroppen og stereocilien af ydre hårceller (OHC, top) og indre hårceller (IHC, bund). Skalabjælke = 5 mm. Dette tal er blevet ændret fra27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Mærkning af større 10 kDa dextran og en kombination af 3 og 10 kDa dextran. (A) Konfokal billede af hårceller på hårcelle kroppen (top) og stereocilia (nederst) niveauer inkuberet med 10 kDa dextran-TR. Dextran fluorescenssignalet vises i magenta fusioneret med F-actin i grøn og uafhængigt i gråtoneskala. Et par IHC er vist ved højere forstørrelse i starten at sætte pris på den overfladiske mærkning af stereocilia observeret med 10 kDa dextran-TR. Skalabar = 5 mm. (B) Konfokalbillede af hårceller inkuberet med 10 kDa dextran-FITC repræsenteret som i A. (C) Konfokal billede af hårceller på hårcellekroppen (øverst) og stereocilia (nederst) niveauer inkuberet samtidig med 3 kDa dextran-TR og 10 kDa dextran-FITC og afbildet ved hjælp af uafhængige kanaler og afbildet separat i grå. I højre panel vises F-actin (blå), 10 kDa dextran-FITC (grøn) og 3 kDa dextran-TR (magenta) sammen med phalloidin (blå). Skalabjælke = 20 mm, og det vesikellignende optagelsesmønster er angivet med gule pile. Dette tal er blevet ændret fra27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Der kræves funktionelle MET-kanaler til 3 kDa dextran-TR-optagelse. Repræsentative konfokale billeder af hårceller ved stereocilien (A) eller cellekroppen(B)niveau efter inkubation med 3 kDa dextran-TR i fravær (kontrol) eller tilstedeværelsen af BAPTA eller MET kanalblokkere amiloride og neomycin. 3 kDa dextran-TR fluorescens er vist i magenta. Væv blev imødegås med phalloidin at mærke F-actin til visualisering af hårcelle stereocilia og grænser (grøn). Hvide pile peger på vesicle-lignende strukturer. De tre rækker af ydre hårceller (OHC) og en række indre hårceller (IHC) er angivet, Skalabar = 20 mm. Dette tal er blevet ændret fra27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver, hvordan man udfører optagelse eksperimenter i murine organ Corti explants med 3 kDa dextran Texas Red. Formålet med denne metode er at teste, om molekyler større end andre tidligere testede var også i stand til specifikt at mærke auditive hårceller og gennemsyre gennem MET kanal. Lignende eksperimentelle protokoller er tidligere blevet brugt til at vurdere gennemtrængeligheden af hårceller til andre fluorescerende farvestoffer såsom FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 og Texas Rød-mærket aminoglycosides (1,29-1,43 kDa)13,52. Den tid, der er nødvendig for mærkning af hårceller ved hjælp af disse fluorescerende molekyler varierer med deres størrelse. Den maksimale mærkning kræver et par minutter for FM1-4313,53, 30-60 min for Texas Rød-mærket aminoglycosides13, og 1,5 timer for Texas Rød-mærket 3 kDa dextran. Således lange inkubationstider er afgørende for dette eksperiment, da vi så kun minimal mærkning af hårcellekroppen på korte inkubationstider (Figur 2C). Vi valgte at studere P6 mus for disse eksperimenter, fordi, i denne alder, mest apikale og basale hårceller bære transduktionstrømme og udtrykke både TMC1 og TMC2 proteiner12,18,54,55. Det bør være muligt at studere yngre dyr, da der er markedsøkonomisk e-kanaler til stede tidligere end P6, navnlig i nærheden af bunden af cochlea12. Undersøgelse af ældre dyr kan være mere udfordrende, fordi dissektion af den knoklede cochlea bliver vanskeligere, da denne struktur fortsætter med at ossify56.

Der er flere kritiske trin i denne protokol. Den mest afgørende er den vellykkede dissektion og forberedelse af orglet af Corti væv(figur 1). Den delikate struktur af orglet corti og indkapsling i boney cochlea udgør en udfordring for histologisk og biokemisk analyse. Flere detaljerede protokoller for vellykket dissektion af dette væv er tidligere blevet offentliggjort i dette tidsskrift56,57,58 og andre59. Afbrydelse af cellecellekrydset og tab af den auditive sensoriske epitelintegritet kan føre til optagelse af dextran på op til 40 kDa og mærkning af de berørte celler39,40. I overensstemmelse hermed observerede vi uspecifik mærkning af hårceller og de omkringliggende støtteceller, da vævet utilsigtet blev beskadiget med pincet under dissektion før dextran inkubation (figur 2B og figur 3B). Der er ingen tricks eller retningslinjer for at nå færdigheder på dissekere en intakt organ Corti andre end praksis og tålmodighed. Tilstedeværelsen af 1-2 mM Ca2+ under vævsdissektion og optagelsesforsøg er imidlertid afgørende for at opretholde integriteten af tip-link, der overfører den mekaniske kraft til MET-kanalen og dermed bevare MET-kanalfunktionen. Når vævet er fastgjort med 4% PFA, tilstedeværelsen af calcium i bufferen eller medierne bliver trivielt.

En af begrænsningerne i denne undersøgelse ligger i den heterogene karakter af dextran molekyler. Den dextran udarbejdet af Leuconostoc bakterier er en polymer af vandfriglucose består af ca 95% alpha-(1-6) D-forbindelser(figur 2A). De resterende forbindelser tegner sig for forgrening af dextran, som korrelerer med dens længde, så dextran af lavere molekylvægt er mere stang-lignende og har en smallere størrelse fordeling, mens større dextrans er polydisperse60. Derfor varierer den faktiske molekylvægt af molekylerne i hvert præparat af 3 kDa dextran fra 1,5 til 3,0 kDa, herunder fluorescerende molekyle61. Derudover fluorescerende mærket dextran adskiller sig i antallet af Texas Røde molekyler knyttet til dextran (graden af mærkning). Det er tilrådeligt at bruge dextran med en grad af mærkning på mindst 0,4, da en lavere grad af mærkning vil hindre evnen til at detektere fluorescerende mærket dextran ved mikroskopi. Fluorescerende farvestof koblet til dextran og lysin rester i fixable versioner, vil bestemme den samlede ladning af dextran. Dette er en vigtig overvejelse , da met-kanalens kationiske selektivitet helst ville kunne tage27. Endelig er en lysin-fixable dextran nødvendig for at nå den opløsning, der vises i disse eksperimenter. En ikke-fixable dextran vil fortsætte med at diffuse ind i vævet hæmmer dens nøjagtige lokalisering og visualisering.

LSM 880 konfokale mikroskop udstyret med en Airyscan detektor bruges til at afbilledet orglet af Corti prøver gav os dobbelt opløsning, og bedre signal-til-støj-forhold (SNR) i forhold til en konventionel konfokale mikroskop62. Derfor dette mikroskop tillod os ikke kun at observere den robuste dextran ophobning på cellekroppen, men også at lokalisere ophobning af dextran på stereocilia tips og vesikel-lignende mønster på cellekroppen. En konventionel konfokal mikroskop ville give mulighed for visualisering og kvantificering af ophobning af fluorescerende dextran på cellekroppen, men det ville vanskeligt at skelne de tre rækker af stereocilia og den præcise lokalisering af dextran på spidsen af de kortere stereocilia rækker. En lignende opløsning som den, der blev opnået med LSM 880 Airyscan-konfokaler, kunne nås ved hjælp af et konventionelt konfokalmikroskop med oversampling og deconvolution, selv om SNR ville være lavere end den, der blev indgået med Airyscan-detektoren.

Ud over brugen af 3 kDa dextran-TR til analyse for funktionelle MET kanaler, denne protokol kunne yderligere bruges til at studere endocytiske processer i hårceller, da alle dextrans testet afslører en intracellulær vesikel-lignende mønster ligner endocytose. Denne proces var ikke i fokus for vores arbejde, og yderligere undersøgelser ville være nødvendige for fuldt ud at karakterisere dette fænomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Vincent Schram fra NICHD mikroskopi og billeddannelse kerne for at bistå i konfokale billede erhvervelse, og Tsg-Hui Chang for uvurderlig hjælp med koloniforvaltning og mus pleje. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program af NINDS, NIH, Bethesda, MD, til KJA A.B. blev støttet af Intramural Research Program af NINDS, NIH, og af en Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship fra intramural forskningsprogram af NIDCD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 glass coverslips 18mm Warner Instruments 64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin ThermoFisher A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective Carl Zeiss 420780-9970-000
Amiloride hydrochloride EMD MILLIPORE 129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker Benchmarks scientific B3D5000
C57BL/6J wild-type mice strain 000664 The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt ThermoFisher B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade Electron microscopy science 15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red ThermoFisher 14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher 14170
Image J or FIJI NIH http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media Carl Zeiss 444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 31415029
neomycin trisulfate salt hydrate Sigma N6386
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011069
Phalloidin-CF405M Biotium 00034
ProLong Diamond antifade mounting media ThermoFisher P36970
superfrost plus microscope slide Fisherbrand 22-037-246
Triton X-100 Sigma T8787
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).

Tags

Bioengineering Dextran indre øre hårceller mechanotransduction kanal farvestof optagelse endocytose intracellulære vesikler konfokal mikroskopi
Dextran Mærkning og optagelse i levende og funktionelle Murine Cochlear hårceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ballesteros, A., Swartz, K. J.… More

Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells. J. Vis. Exp. (156), e60769, doi:10.3791/60769 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter