Summary
Hier presenteren we een methode voor het visualiseren van de opname van 3 kDa Texas Red-gelabelde dextran in auditieve haarcellen met functionele mechanotransductiekanalen. Daarnaast kan dextrans van 3-10 kDa worden gebruikt om endocytose in haar en ondersteunende cellen van het orgaan van Corti te bestuderen.
Abstract
Het haarcel mechanotransduct (MET) kanaal speelt een belangrijke rol bij het horen. De moleculaire identiteit en structurele informatie van de met a.r.v. Elektrofysiologische studies van haarcellen bleek dat de MET kanaal heeft een grote geleiding en is doorlaatbaar om relatief grote fluorescerende kationische moleculen, waaronder sommige styryl kleurstoffen en Texas Red-gelabeldaminoglycoside antibiotica. In dit protocol beschrijven we een methode om de opname van fluorescerende dextrans in haarcellen van het orgaan van Corti-explants te visualiseren en te evalueren, die kunnen worden gebruikt om te zien voor functionele MET-kanalen. We vonden dat 3 kDa Texas Red-gelabeldd dextran specifiek labels functionele auditieve haarcellen na 1-2 uur incubatie. In het bijzonder labelt 3 kDa dextran de twee kortere stereociliarijen en hoopt zich op in het cellichaam in een diffuus patroon wanneer functionele MET-kanalen aanwezig zijn. Een extra blaasachtig patroon van etikettering werd waargenomen in het cellichaam van haarcellen en omringende ondersteunende cellen. Onze gegevens suggereren dat 3 kDa Texas-Red dextran kan worden gebruikt om te visualiseren en te bestuderen twee trajecten voor cellulaire kleurstof opname; een haarcelspecifieke toegangsroute via functionele MET-kanalen en endocytose, een patroon dat ook beschikbaar is voor grotere dextran.
Introduction
De haarcellen van het binnenoor zijn de sensorische cellen die geluid detecteren en de mechanisch stimuli in elektrische signalen bedekken, die uiteindelijk door onze hersenen worden geïnterpreteerd. Deze cellen hebben een trapvormige bundel van drie rijen actine-gebaseerde filamenten, bekend als stereocilia, die uitsteken uit hun apicale gebied1,2. De mechanische stimuli buigen de stereocilia filamenten naar de langste rij en leiden tot de opening van de mechanotransductie (MET) kanalen3. De opening van de MET-kanalen leidt tot een toestroom van kationen die de cel depolariseert en dus het vrijkomen van synapsblaasjes in het basale gebied van de haarcel signaleert.
De biofysische eigenschappen van het MET-kanaal dat essentieel is voor het gehoor zijn uitgebreid gekarakteriseerd. Deze kanalen zijn onder andere selectief en hebben een relatief grote geleiding (150-300 pS in lage Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Opmerkelijk is dat grote fluorescerende moleculen zoals FM1-43 en Texas Red-gelabelde aminoglycosiden permeant blockers van het MET-kanaal zijn, wat resulteert in hun accumulatie in het haarcellichaam dat kan worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie11,12,13,14. Omgekeerd zijn de moleculaire identiteit en de structuur van het MET-kanaal en het permeatietraject ongrijpbaar gebleven. Steeds meer experimenteel bewijs wijst erop dat het transmembraanachtige kanaaleiwit 1 (TMC1) een onderdeel is van het MET-kanaal in volwassen haarcellen15,16,17,18,19. Mutaties in het transmembraanachtige kanaal 1 (TMC1) veranderen de EIGENSCHAPPEN van het MET-kanaal19,20,21,22 en veroorzaken doofheid. Daarnaast lokaliseert TMC1 naar de site van het MET-kanaal18,23 en werkt hij samen met de tip-link die verantwoordelijk is voor het overbrengen van de mechanische kracht naar het MET-kanaal24,25. Bovendien heeft de recente bio-informaticaanalyse de TMC-eiwitten geïdentificeerd als evolutionair gerelateerd aan de mechanogevoelige kanalen TMEM63/OSCA-eiwitten en de TMEM16-eiwitten, een familie van calciumgeactiveerde chloridekanalen en lipidescramblases26,27,28. Een structureel model van TMC1 op basis van de relatie tussen deze eiwitten bleek de aanwezigheid van een grote holte op de eiwit-lipide interface27. Deze holte herbergt de twee TMC1-mutaties die autosomal dominant gehoorverlies veroorzaken (DFNA36)27,29,30,31,32, en selectieve modificatie van cysteïnemutanten voor residuen in de holte veranderen MET-kanaaleigenschappen28, wat aangeeft dat het zou kunnen functioneren als het permeatietraject van het MET-kanaal. De grote omvang van deze voorspelde holte in TMC-eiwitten kan het vermogen van grote moleculen om het MET-kanaal door te dringen verklaren. Om de voorspelling te testen dat het MET-kanaal een ongewoon groot permeatietraject bevat en om de grenzen van de grootte van de holte in TMC1 te verleggen, ontwikkelden we een protocol om opname-experimenten uit te voeren in het orgaan van Corti-explants met een groter molecuul, 3 kDa dextran fluorescerend gelabeld met Texas Red.
Dextran is een complexe vertakte polysaccharide bestaande uit vele D-glucose moleculen gebonden door alfa-1,6 glycosidische koppelingen. De hoge oplosbaarheid in water, lage celtoxiciteit en bioinertiteit maken het een veelzijdig hulpmiddel om verschillende cellulaire processen te bestuderen. Daarnaast is dextran verkrijgbaar in een breed scala van maten en fluorescerend gelabeld met fluorophores van verschillende kleuren. Fluorescerend gelabeldde dextrans worden vaak gebruikt in cel- en weefseldoorlaatbaarheidsonderzoek33,34, om endocytose te bestuderen in meerdere cellulaire systemen35,36, en voor neurale tracering37,38. In het auditieve veld zijn ook dextran moleculen gebruikt om de verstoring van de celcelverbinding en het verlies van de auditieve sensorische epitheelintegriteit te beoordelen na blootstelling aan intens geluid in het chinchilla-orgaan van Corti39,40.
In dit werk, we benut de eigenschappen van enkele van de kleinste (3 en 10 kDa) fluorescerende dextrans om opname-experimenten uit te voeren in murine binnenoor haarcellen en verken de grootte van de permeatie pad van het binnenste oor haarcel MET kanaal. Daarnaast gebruikten we een laser-scanning confocale microscoop (LSM) 880 uitgerust met een Airyscan detector te visualiseren en lokaliseren fluorescerende dextran op de stereocilia en de cel lichaam van auditieve haarcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierverzorging en experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, die werden goedgekeurd door het Comité voor dierenverzorging en -gebruik van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Beroerte (Dierprotocol #1336 kJS).
1. Muizen
- Stel een paar broedparen van C57BL/6J wild-type om te fokken in de dierlijke faciliteit om de geboortedatum van de nesten te controleren en bijhouden van de leeftijd van de pups.
2. Cochleaire dissectie
- Stel een schone ruimte in de buurt van een stereomicroscoop om de dissecties uit te voeren(figuur 1A). Gebruik 70% ethanol om de ruimte en omgeving schoon te maken en plaats een schone bankpad. Een plastic zak voor medisch pathologisch afval (MPW) zou nodig zijn om de karkassen van het dier te verwijderen.
- Bereid verschillende 35 mm gerechten met enkele Leibovitz's L15 media.
OPMERKING: Leibovitz's L-15 celmedia bevat 1-2 mM Ca2 +, die nodig is om de integriteit van de tip-links te behouden, en bevat essentiële aminozuren, vitaminen en natriumpyruvaat om de gezondheid en overleving van de cellen te verbeteren. Serum werd uitgesloten om experimentele variabiliteit te vermijden vanwege de slecht gedefinieerde samenstelling en mogelijke interferentie met de dextran. - Euthanaseer postnatale dag-6 (P6) muizen door onthoofding.
LET OP: 6 dagen oude muizen zijn enigszins bestand tegen inhalant verdoving. Hoewel isoflurane of langdurige CO2-blootstelling (tot 50 min) kan worden gebruikt voor euthanasie, wordt een secundaire fysieke methode aanbevolen om de dood te garanderen. - Gebruik chirurgische schaar om de huid van de schedel te verwijderen door het maken van een oppervlakkige snede van de voorste naar het achterste einde en over de externe gehoorgang.
- Vouw de huid naar de neus om de schedel bloot te leggen(figuur 2B).
- Maak een incisie van de achterkant naar de voorkant van de schedel en over de ooglijn(figuur 2B-C).
- Scheid de schedel in twee helften en verwijder de hersenen met behulp van een kleine spatel om de temporele botten bloot te leggen(figuur 2C-D).
- Met kleine schaar, snijd rond de temporele botten, en accijns het weefsel.
- Plaats beide temporele botten in een schotel van 35 mm en zorg ervoor dat ze zijn bedekt met L15-media (figuur 2E).
OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd onder de stereomicroscoop. Een zwarte achtergrond helpt meestal om het weefsel te visualiseren tijdens de fijne dissectie stappen. - Onder een stereomicroscoop uitgerust met een breedveldoculair oogstuk (een vergrotingsvermogen van 10X (WF10X) en een externe wisselstroom (AC) halogeenlichtbron) verwijder u het omringende slakkenhuis, halfronde kanalen en vestibulaire organen met chirurgische tangen(figuur 2F).
- Om de dextran- en L15-media in het cochleair kanaal te laten komen, voert u twee lekgrenzen uit op het ontleede cochleaire, een op het ronde venster en een op het apicale cochleair gebied.
- Voeg 300 mL van Leibovitz's L15 media in elke put van een 9-goed glas depressie plaat.
- Plaats ten minste drie ontleed cochleaire op elke put.
3. Dextran Labeling
- Reconstrueren de dextran in Hanks' uitgebalanceerde zoutoplossing zonder Ca2+ en Mg2+ (HBSS-CFM) bij een eindconcentratie van 10 mg/mL. Deze voorraadoplossing moet worden opgeslagen in ondoorzichtige zwarte buizen (beschermd tegen licht) en tot aan het gebruik bij -30 °C worden opgeslagen.
LET OP: Het gebruik van lysine-fixable dextran is van cruciaal belang voor een succesvolle uitkomst van dit protocol. - Bereid elke dextran bij een definitieve concentratie van 2 mg/mL in 500 mL van Leibovitz's L15 media.
- Verwijder de media uit het slakkenhuis en voeg Leibovitz's L15-media toe die de dextran van belang bevatten bij een eindconcentratie van 2 mg/mL.
OPMERKING: Hoewel een deel van de MET-kanalen open zijn in rust41,42, werd de dextran incubatie uitgevoerd met een zachte schudden van de explants om de open waarschijnlijkheid van het MET-kanaal te vergroten. - Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur met zacht schudden (25 rpm) met behulp van een 3-dimensionale shaker met een gekantelde hoek van 25°.
OPMERKING: Fluorescerend gelabelde dextran moet waar mogelijk tegen licht worden beschermd. Om de dextran te beschermen tijdens de incubatie van 2 uur, plaats je de 9-goed glasplaat in een celkweek P150-schaal verpakt in aluminiumfolie.
4. Monstervoorbereiding voor beeldvorming
- Na incubatie met de dextran, was het weefsel twee keer met 2 min met media en één keer met HBSS.
- Incubeer het weefsel bij kamertemperatuur gedurende 30 min met 4% paraformaldehyde in Hanks' uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS).
LET OP: Blootstelling aan formaldehyde kan irriterend zijn voor de ogen, neus en bovenste luchtwegen. Bij bepaalde personen kan herhaalde blootstelling van de huid aan formaldehyde sensibilisatie veroorzaken die kan leiden tot allergische dermatitis. Formaldehyde is een bekende kankerverwekkende stof voor de mens en een vermoedelijk reproductief gevaar. - Snel en voorzichtig wassen het vaste weefsel twee keer met HBSS om de paraformaldehyde te verwijderen.
OPMERKING: Ontkalking van de temporele botten is niet nodig in dit ontwikkelingsstadium van het slakkenhuis. - Verwijder het spiraalligament en het tectorial membraan met fijne tiptangen om het orgaan van Corti (figuur 2G) te ontleden.
- Verwijder alle kleine stukjes weefsel en was het weefsel met HBSS.
- Permeabilize het weefsel in 0,5% Triton X-100 in PBS met fluorescerend gelabelde fallalloïdine (geconjugeerd tot groen of rood bij het testen van de opname van TR- of FITC-gelabelde dextran, respectievelijk) bij een 1:200 verdunning voor 30 min om F-actin te etiketteren en de actin-based stereocilia.
- Was het weefsel 2-3 keer gedurende 2 min elke keer met HBSS buffer om de overmaat van triton en falloidin te verwijderen, en eenmaal met PBS om de zouten te verwijderen.
- Monteer het orgel van Corti weefsels op een microscoop dia en bedek het met montage media.
OPMERKING: Bij het monteren van het weefsel, zorg ervoor dat de zijkant van het weefsel met de haarcel stereocilia is naar de coverslip. - Verwijder eventuele bellen die tijdens de toevoeging van de montagemedia worden gegenereerd en voorkom het ontstaan van nieuwe bellen tijdens de plaatsing van de coverslip.
OPMERKING: Aanzuigen met een pipet een bel gegenereerd tijdens de toevoeging van de montage media. Om te voorkomen dat luchtbellen onder de coverslip vast komen te zitten, plaatst u een rand van de coverslip dicht bij het monster en laat u de afdeklep voorzichtig en langzaam over het weefsel zakken met behulp van tangen of een pipettip. - Bedek het weefsel in montagemedia met een glazen coverslip(figuur 2H).
OPMERKING: Doelstellingen met een numeriek diafragma boven 0,4 zijn ontworpen om #1,5 afdekkingen (0,17 mm dikte) te gebruiken. Het gebruik van de verkeerde coverslip kan ernstige gevolgen hebben voor de intensiteit en kwaliteit van de beelden. - Incubeer het gemonteerde weefsel 's nachts bij kamertemperatuur om de montagemedia te laten drogen en bewaar de glijbanen op 4 °C tot de beeldvorming.
5. Beeldverwerving en beeldverwerking
OPMERKING: De confocale beelden zijn gemaakt met een LSM 880 confocale microscoop uitgerust met een 32-kanaals Airyscan detector in de super-resolutie (SR) modus43 en een 63x doelstelling.
- Voeg een kleine druppel onderdompeling olie op het doel.
- Plaats de microscoopplaat met het gemonteerde weefselmonster in de microscoopfase met de glazen coverslip tegenover de onderdompelingsolie.
- Focus op het voorbeeld en stel de beeldparameters in met behulp van de software voor het verkrijgen van afbeeldingen.
- Gebruik identieke instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen en optimale parameters voor x-, y- en z-resolutie voor elk onafhankelijk experiment. Een piëzo-gedreven focussysteem is nodig om de doelstelling snel en nauwkeurig te verplaatsen bij het verkrijgen van de z-stack van afbeeldingen.
OPMERKING: Om het hele apicale gebied van de haarcellen in beeld te brengen, verzamelt u een z-stack van beelden van de stereocilia tot de apicale helft van het haarcellichaam met behulp van de optimale instellingen. Het is cruciaal om een grote z-stack langs de haarcel te verzamelen om de beeldvorming van de blaasachtige deeltjes te verzekeren. - Gebruik de software voor het verkrijgen van afbeeldingen om de ruwe confocale afbeeldingen te verwerken met behulp van het Airyscan 3D-reconstructiealgoritme met de automatische standaarddeconvolutiefilterinstellingen.
- Open de confocale afbeeldingen in een beeldverwerkingssoftware om de helderheid en het contrast aan te passen, voeg de schaalbalk toe en exporteer de afbeeldingen voor de uiteindelijke cijfers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We zagen robuuste en specifieke etikettering van haarcellen na 2 uur incubatie van orgaan van Corti explants van wilde postnatale-dag-6 (P6) muizen met 3 kDa dextran fluorescerend gelabeld met Texas Red (dextran-TR) (Figuur 2A-B). Dextran labeling werd waargenomen in zowel binnen- als buitenhaarcellen (IHC en OHC) in de basale, middelste en apicale gebieden van het orgaan van Corti(figuur 2B).
Fluorescerend gelabelde fallain werd gebruikt om filamenteuze actine (F-actine) tegen te gaan en de actine-gebaseerde haarcelstereocilia te visualiseren. We hebben ook soortgelijke experimenten uitgevoerd op kortere incubatietijden, en hoewel we dextran-TR accumulatie in het haarcellichaam waarnamen, waren de signalen zwakker en variabeler dan die op 2 uur incubatie (figuur 2C).
We vervolgens beeld zowel stereocilia en cellichamen van de haarcellen en merkte op dat alleen die cellen die 3 kDa dextran-TR opgenomen in hun cel lichaam fluorescerende etikettering van hun stereocilia toonde (Figuur 3A). Deze relatie tussen stereocilia en celbodylabeling was afwezig in haarcellen van beschadigd weefsel, dat ook onspecifieke etikettering van dextran presenteerde in verschillende celtypen van het sensorische epitheel (gele vierkanten in figuur 2B, en figuur 3B). Belangrijk is dat we een uniform fluorescentiesignaal langs de stereocilia met verrijking hebben waargenomen aan de uiteinden van de kortere stereociliarijen waar het MET-kanaalzich bevindt 18,23 ( figuur3C). Ook merkten we blaasachtige structuren in het cellichaam van de haarcellen en de naburige ondersteunende cellen. Het vesicle-achtige opnamepatroon in deze cellen suggereert dat dextran-TR ook kan worden opgenomen door endocytose (figuur 3C).
Het hier beschreven protocol maakt het ook mogelijk om de opname van grotere dextrans en combinaties van verschillende dextrans te onderzoeken. Grotere dextran van 10 kDa gelabeld met Texas Red (dextran-TR) of fluoresceine (dextran-FITC) produceerde ook een blaasachtig patroon in het cellichaam van haarcellen en ondersteunende cellen, naast het accumuleren rond het haarcelmembraan in een fragmentarisch patroon (figuur 4A,B). De 10 kDa dextran-TR ook oppervlakkig gelabeld de drie stereocilia rijen van alle haarcellen (Figuur 4A, begin), waarschijnlijk te wijten aan de negatief geladen oppervlak van de haarcel plasma membraan44,45,46. Vervolgens hebben we de opname van 3 kDa dextran-TR en 10 kDa dextran-FITC gelijktijdig onderzocht in het orgel van Corti explants. Voor de 3 kDa dextran-TR zagen we zowel een diffuus als een vesicle-achtig patroon. De 10 kDa dextran-FITC vertoonde echter alleen een vesicle-achtig patroon(figuur 4C). Deze gegevens suggereren dat dextran opname optreedt door ten minste twee verschillende mechanismen die afhankelijk zijn van de grootte van de dextran.
Vervolgens hebben we beoordeeld of functionele MET-kanalen nodig waren voor de opname van 3 kDa dextran-TR. Om dit te doen, testten we dextran integratie in haarcellen van het orgaan van Corti explants in aanwezigheid van MET kanaalblokkers (neomycine en amiloride)13,14,47 of de Ca 2+ chelator BAPTA, die met stromen afschaft door het breken van de tip-links en het voorkomen van de gating van het kanaal25,48,49. In deze experimenten werden de weefselexplants eerder voor 30 min geïncubeerd met neomycine (500 mM), amiloride (150 mM) of met BAPTA (5mM) vóór de toevoeging van 3 kDa dextran-TR in aanwezigheid van de overeenkomstige MET-blokker. De aanwezigheid van BAPTA of de MET-kanaalblokkers verhinderde de stereocilia-etikettering (figuur 5A) en de opname van 3 kDa dextran-TR in haarcellen (figuur 5B). De blokkade van het MET-kanaal behield echter het blaasachtige patroon(figuur 5B),wat aangeeft dat dit opnamepatroon onafhankelijk is van functionele MET-kanalen. Vergelijkbare resultaten zijn waargenomen in haarcellen van TMC1/TMC2 dubbele knock-out muizen, die geen MET27. Intrigerend, deze blaasachtige structuren waren niet waarneembaar in de aanwezigheid van amiloride, waarvan bekend is dat de Na+-H+ wisselaar remmen en daarmee remmen endocytose50,51. Deze resultaten geven aan dat 3kDa dextran-TR de haarcellen binnenkomt via twee verschillende trajecten, een gemeenschappelijk voor grotere dextrans waarbij blaasachtige structuren betrokken zijn en een andere die afhankelijk is van functionele MET-kanalen.
Figuur 1: Stappen van de dissectie van een murineorgaan van Corti. (A) Schone oppervlakte en materialen die nodig zijn voor de dissectie. (B) Blootgestelde muisschedel. Tangen houden de huid vast, die naar de neus is gevouwen. Zwarte lijnen geven de twee incisies aan die nodig zijn voor het verwijderen van de hersenen. (C) Ingesneden en geopende schedel mogelijk te maken voor verwijdering van de hersenen met een spatel (aan de rechterkant). (D) Cranium en temporele botten na het verwijderen van de hersenen. (E) Accijnsschedel, met inbegrip van de tijdelijke beenderen (gestreepte zwarte vierkanten) in een plaat P35 die met media wordt behandeld. f) Accijnsslakken. (G) Twee ontleed organen van Corti op de put van een glazen depressie plaat. (H) Gemonteerd monster op een glazen coverslip klaar voor beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Haarcellen nemen 3 kDa dextran-TR. (A) Schematische weergave van Texas Red-gelabelde dextran (dextran-TR) met zes glucosemoleculen die overeenkomen met een moleculair gewicht van 1,08 kDa. Een succinimidyl ester reactie verbindt een Texas Red molecuul (magenta) met een glucose monomeer. (B) Representatief confocale beeld met specifieke etikettering van sensorische haarcellen (HC) met 3 kDa dextran-TR over het hele orgaan van Corti van een 6 dagen oude muis. De ba,midden (MD) en apicale (AP) gebieden van het orgel worden aangegeven. Gele vierkantjes geven weefsel beschadigde gebieden aan. (C) 3 kDa dextran-TR fluorescentie na 30, 60, 90, of 120 min incubatie met het orgaan van Corti explants wordt weergegeven in magenta samengevoegd met F-actin in het groen (bovenste beelden) en onafhankelijk in grijswaarden (onderste beelden). Het beeldweergavebereik werd lineair aangepast in elk van de grijze beelden onafhankelijk voor visualisatie van de 3 kDa dextran-TR fluorescentie. Schaalbalk = 20 mm. Dit cijfer is gewijzigd van27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Haarcel lichaam en stereocilia etikettering met 3 kDa dextran-TR. (A) Confocale beelden met 3 kDa dextran-TR fluorescentie (magenta) op het cellichaam en stereocilia tellerstained met falloidin om F-actin (groen) label om haarcel grenzen en stereocilia visualiseren. De drie rijen buitenste haarcellen (OHC) en een rij van binnenste haarcellen (IHC) zijn aangegeven. Schaalbalk = 20 mm. (B) Confocale beelden van een beschadigd weefselgebied met 3 kDa dextran-TR fluorescentie (magenta) op het cellichaam en stereocilia. Gele pijlen geven de etikettering van niet-sensorische ondersteunende cellen aan. Schaalbalk = 20 mm. (C) Closer view of 3 kDa dextran-TR fluorescentie at the cell body and stereocilia of outer hair cells (OHC, top) and inner hair cells (IHC, bottom). Schaalbalk = 5 mm. Dit cijfer is gewijzigd van27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Etikettering van grotere 10 kDa dextran en een combinatie van 3 en 10 kDa dextran. (A) Confocale beeld van haarcellen op de haarcel lichaam (boven) en stereocilia (bodem) niveaus geïncubeerd met 10 kDa dextran-TR. Het dextran fluorescentiesignaal wordt getoond in magenta samengevoegd met F-actin in groen en onafhankelijk in grijswaarden. Een paar IHC worden getoond bij hogere vergroting in het begin om de oppervlakkige etikettering van stereocilia waargenomen met de 10 kDa dextran-TR waarderen. Schaalbalk = 5 mm. (B) Confocale afbeelding van haarcellen geïncubeerd met 10 kDa dextran-FITC vertegenwoordigd als in A. (C) Confocale beeld van haarcellen op het haarcellichaam (boven) en stereocilia (onder) niveaus gelijktijdig geïncubeerd met 3 kDa dextran-TR en 10 kDa dextran-FITC en afgebeeld met behulp van onafhankelijke kanalen en afzonderlijk afgebeeld in grijs. In het rechterpaneel worden F-actin (blauw), 10 kDa dextran-FITC (groen) en 3 kDa dextran-TR (magenta) samen met falloïde (blauw) getoond. Schaalbalk = 20 mm en het blaasachtige opnamepatroon wordt aangegeven met gele pijlen. Dit cijfer is gewijzigd van27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Functionele MET-kanalen zijn vereist voor 3 kDa dextran-TR opname. Representatieve confocale beelden van haarcellen op het stereocilia(A)of cellichaam(B)niveau na incubatie met 3 kDa dextran-TR in de afwezigheid (controle) of aanwezigheid van BAPTA of de MET-kanaalblokkers amiloride en neomycine. 3 kDa dextran-TR fluorescentie wordt getoond in magenta. Weefsel werd tellerstained met falloidin om F-actin label voor visualisatie van de haarcel stereocilia en grenzen (groen). Witte pijlen wijzen op blaasachtige structuren. De drie rijen buitenste haarcellen (OHC) en een rij van binnenste haarcellen (IHC) zijn aangegeven, Schaal bar = 20 mm. Dit cijfer is gewijzigd van27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe opname-experimenten uit te voeren in murine orgaan van Corti explants met 3 kDa dextran Texas Red. Het doel van deze methode is om te testen of moleculen groter dan anderen eerder getest waren ook in staat om specifiek label auditieve haarcellen en doordringen door de MET kanaal. Soortgelijke experimentele protocollen zijn eerder gebruikt om de doorlaatbaarheid van haarcellen te evalueren naar andere fluorescerende kleurstoffen zoals FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 en Texas Red-gelabeldaminoglycosides (1.29-1.43 kDa)13,52. De tijd die nodig is voor het labelen van haarcellen met behulp van deze fluorescerende moleculen varieert met hun grootte. De maximale etikettering vereist een paar minuten voor FM1-4313,53, 30-60 min voor Texas Red-label aminoglycosides13, en 1,5 uur voor Texas Red-gelabeld 3 kDa dextran. Zo zijn lange incubatietijden cruciaal voor dit experiment, omdat we slechts minimale etikettering van het haarcellichaam zagen op korte incubatietijd(figuur 2C). We kozen ervoor om P6 muizen te bestuderen voor deze experimenten, omdat, op deze leeftijd, de meeste apicale en basale haarcellen transductie stromen dragen en uitdrukken zowel TMC1 en TMC2 eiwitten12,18,54,55. Jongere dieren moeten kunnen worden onderzocht, aangezien er eerder dan P6 als marktgericht bedrijf aanwezig is, met name in de buurt van de basis van het slakkenhuis12. Het bestuderen van oudere dieren kan uitdagender zijn omdat dissectie van het benige slakkenhuis moeilijker wordt omdat deze structuur 56 blijftverbeenen.
Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol. De meest cruciale is de succesvolle dissectie en voorbereiding van het orgaan van Corti weefsel (figuur 1). De delicate structuur van het orgaan van Corti en de ingekapseldheid in het botachtige slakkenhuis vormt een uitdaging voor histologische en biochemische analyse. Verschillende gedetailleerde protocollen voor de succesvolle dissectie van dit weefsel zijn eerder gepubliceerd in dit tijdschrift56,57,58 en anderen59. Verstoring van de cel-celverbinding en verlies van de auditieve sensorische epitheelintegriteit kan leiden tot de opname van dextran van maximaal 40 kDa en de etikettering van de aangetaste cellen39,40. In overeenstemming hiermee hebben we onspecifieke etikettering van haarcellen en de omringende ondersteunende cellen waargenomen wanneer het weefsel onbedoeld werd beschadigd met de tangen tijdens dissectie vóór dextran incubatie (figuur 2B en figuur 3B). Er zijn geen trucs of richtlijnen om vaardigheid te bereiken bij het ontleden van een intact orgaan van Corti anders dan de praktijk en geduld. Echter, de aanwezigheid van 1-2 mM Ca2 + tijdens weefseldissectie en opname experimenten is van cruciaal belang om de integriteit van de tip-link die de mechanische kracht overbrengt naar de MET kanaal te behouden en daarmee behouden MET kanaal functie. Zodra het weefsel is vastgesteld met 4% PFA, wordt de aanwezigheid van calcium in de buffer of media triviaal.
Een van de beperkingen van deze studie bevindt zich in de heterogene aard van de dextran moleculen. De dextran uitgewerkt door de Leuconostoc bacterie is een polymeer van waterhydroglucose bestaat uit ongeveer 95% alfa-(1–6) D-verbindingen (Figuur 2A). De resterende koppelingen zijn verantwoordelijk voor de vertakking van dextran, die correleert met zijn lengte, dus dextran van lager moleculair gewicht zijn meer staaf-achtige en hebben een smallere grootte distributie, terwijl grotere dextrans zijn polydisperse60. Daarom varieert het werkelijke molecuulgewicht van de moleculen in elk preparaat van de 3 kDa dextran van 1,5 tot 3,0 kDa, inclusief het fluorescerende molecuul61. Bovendien verschillen de fluorescerende gelabelde dextran in het aantal Texas Red moleculen die aan de dextran zijn bevestigd (mate van etikettering). Het is raadzaam om dextran te gebruiken met een zekere mate van etikettering van ten minste 0,4, omdat een lagere mate van etikettering de mogelijkheid zal belemmeren om de fluorescerende gelabelde dextran door microscopie te detecteren. De fluorescerende kleurstof gekoppeld aan de dextran en de lysine residuen in de fixeerbare versies, zal de algehele lading van de dextran te bepalen. Dit is een belangrijke overweging, aangezien de kationische selectiviteit van het B-kanaal bij voorkeur zou opnemen cationic dextran27. Ten slotte is een lysine-fixable dextran nodig om de resolutie te bereiken die in deze experimenten wordt weergegeven. Een niet-fixeerbare dextran zal blijven verspreiden in het weefsel belemmeren de nauwkeurige lokalisatie en visualisatie.
De LSM 880 confocale microscoop uitgerust met een Airyscan detector gebruikt om het orgaan van Corti monsters beeld gaf ons met twee keer de resolutie, en een betere signaal-ruis verhouding (SNR) in vergelijking met een conventionele confocale microscoop62. Daarom stelde deze microscoop ons niet alleen in staat om de robuuste dextran accumulatie in het cellichaam te observeren, maar ook om de accumulatie van de dextran aan te wijzen bij de stereocilia tips en het blaasachtige patroon in het cellichaam. Een conventionele confocale microscoop zou zorgen voor de visualisatie en kwantificering van de accumulatie van fluorescerende dextran op het cellichaam, maar het zou moeilijk zijn om de drie rijen stereocilia en de precieze lokalisatie van de dextran te onderscheiden aan de uiteinden van de kortere stereocilia rijen. Een gelijkaardige resolutie aan die met LSM 880 Luchtyscan confocal efocale kan worden bereikt gebruikend een conventionele confocale microscoop met oversampling en deconvolution, hoewel SNR lager zou zijn dan die welke met de detector Airyscan wordt bereikt.
Naast het gebruik van 3 kDa dextran-TR om te testen voor functionele MET-kanalen, kan dit protocol verder worden gebruikt om endocytische processen in haarcellen te bestuderen, omdat alle geteste dextrans een intracellulair blaasachtig patroon onthullen dat lijkt op endocytose. Dit proces was niet de focus van ons werk, en aanvullende studies nodig zou zijn om dit fenomeen volledig te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Vincent Schram van de NICHD microscopie en beeldvorming kern voor het helpen bij de confocale beeld verwerving, en Tsg-Hui Chang voor onschatbare hulp bij kolonie management en muizen zorg. Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramural Research Program van de NINDS, NIH, Bethesda, MD, naar K.J.S. A.B. werd ondersteund door het Intramural Research Program van de NINDS, NIH, en door een Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship uit het intramurale onderzoeksprogramma van de NIDCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
| C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
| Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
| Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
| Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
| Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
| Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
- Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
- Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
- Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
- Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
- Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
- Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
- Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
- Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
- Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
- Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
- Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
- Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
- Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
- Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
- Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
- Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
- Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
- Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
- Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
- Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
- Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
- Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
- Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
- Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
- Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
- Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
- Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
- Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
- Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
- Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
- Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
- Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
- Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
- Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
- Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
- Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
- Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
- Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
- Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
- Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
- Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
- Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
