Summary
Hier präsentieren wir eine Methode zur Visualisierung der Aufnahme von 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditiven Haarzellen mit funktionellen Mechanotransduktionskanälen. Darüber hinaus kann Dextrans von 3–10 kDa verwendet werden, um Endozytose im Haar und unterstützenden Zellen des Organs von Corti zu studieren.
Abstract
Der Haarzell-Mechanotransduktionskanal (MET) spielt beim Hören eine wichtige Rolle. Die molekulare Identität und die strukturellen Informationen der ME bleiben jedoch unbekannt. Elektrophysiologische Untersuchungen von Haarzellen ergaben, dass der MET-Kanal eine große Leitfähigkeit hat und für relativ große fluoreszierende kationische Moleküle durchlässig ist, darunter einige Styrylfarbstoffe und Texas Rot-markierte Aminoglykosid-Antibiotika. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung und Bewertung der Aufnahme von fluoreszierender Dextrans in Haarzellen des Organs der Corti-Explants, die verwendet werden können, um funktionelle MET-Kanäle zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass 3 kDa Texas Red-labeled dextran speziell funktionelle auditive Haarzellen nach 1-2 h Inkubation kennzeichnet. Insbesondere beschriftet 3 kDa dextran die beiden kürzeren Stereocilia-Reihen und sammelt sich im Zellkörper in einem diffusen Muster an, wenn funktionelle MET-Kanäle vorhanden sind. Ein zusätzliches vesikelartiges Etikettierungsmuster wurde im Zellkörper von Haarzellen und umgebenden stützenden Zellen beobachtet. Unsere Daten deuten darauf hin, dass 3 kDa Texas-Red Dextran verwendet werden kann, um zwei Wege für die Aufnahme von zellulären Farbstoffen zu visualisieren und zu untersuchen; eine haarzellspezifische Einstiegsroute durch funktionelle MET-Kanäle und Endozytose, ein Muster, das auch für größere Dextran verfügbar ist.
Introduction
Die Haarzellen des Innenohrs sind die Sinneszellen, die Schall erkennen und die mechanischen Reize in elektrischen Signalen verdeckt, die letztlich von unserem Gehirn interpretiert werden. Diese Zellen haben ein treppenförmiges Bündel von drei Reihen von actinbasierten Filamenten, bekannt als Stereocilia, die aus ihrer apikalen Region1,2hervorragen. Die mechanischen Reize lenken die Stereocilia-Filamente in Richtung der längsten Reihe ab und lösen die Öffnung der Mechanotransduktionskanäle (MET)3aus. Die Öffnung der MET-Kanäle führt zu einem Zustrom von Kationen, die die Zelle depolarisieren und folglich die Freisetzung von Synapsenbläschen im Basalbereich der Haarzelle signalisieren.
Die biophysikalischen Eigenschaften des für das Hören wesentlichen MET-Kanals wurden extensiv charakterisiert. Unter anderen Eigenschaften sind diese Kanäle kationisch selektiv und haben eine relativ große Leitfähigkeit (150–300 pS in niedrigen Ca2+) 4,5,6,7,8,9,10. Bemerkenswert ist, dass große fluoreszierende Moleküle wie FM1-43 und Texas Rotmarkierte Aminoglykoside permeant Blocker des MET-Kanals sind, was zu ihrer Ansammlung im Haarzellkörper führt, die mit Fluoreszenzmikroskopie11,12,13,14visualisiert werden kann. Umgekehrt sind die molekulare Identität und die Struktur des MET-Kanals und sein Permeationsweg schwer fassbar geblieben. Zunehmende experimentelle Belege deuten darauf hin, dass das transmembranartige Kanalprotein 1 (TMC1) ein Bestandteil des MET-Kanals in reifen Haarzellen15,16,17,18,19ist. Mutationen im transmembranartigen Kanal 1 (TMC1) verändern die MET-Kanaleigenschaften19,20,21,22 und verursachen Taubheit. Darüber hinaus lokalisiert TMC1 auf die Stelle des MET-Kanals18,23 und interagiert mit dem Tip-Link, der für die Übertragung der mechanischen Kraft an den MET-Kanal24,25verantwortlich ist. Darüber hinaus hat eine kürzlich durchgeführte Bioinformatik-Analyse die TMC-Proteine als evolutionär identifiziert, die mit den mechanosensitiven Kanälen TMEM63/OSCA-Proteinen und den TMEM16-Proteinen zusammenhängen, einer Familie von Calcium-aktivierten Chloridkanälen und Lipid-Scramblases26,27,28. Ein Strukturmodell von TMC1, das auf der Beziehung zwischen diesen Proteinen basiert, zeigte das Vorhandensein eines großen Hohlraums an der Protein-Lipid-Schnittstelle27. Dieser Hohlraum enthält die beiden TMC1-Mutationen, die autosomal dominanten Hörverlust (DFNA36)27,29,30,31,32, und selektive Modifikation von Cysteinmutanten für Rückstände in der Kavität verändern MET-Kanaleigenschaften28, was darauf hindeutet, dass es als Permeationsweg des MET-Kanals funktionieren könnte. Die große Größe dieser vorhergesagten Kavität in TMC-Proteinen könnte die Fähigkeit großer Moleküle erklären, den MET-Kanal zu durchdringen. Um die Vorhersage zu testen, dass der MET-Kanal einen ungewöhnlich großen Permeationsweg enthält, und um die Grenzen der Größe der in TMC1 beobachteten Kavität zu überschreiten, haben wir ein Protokoll entwickelt, um Aufnahmeexperimente im Organ von Corti-Explants mit einem größeren Molekül durchzuführen, 3 kDa Dextran fluoreszierend mit Texas Red beschriftet.
Dextran ist ein komplexes verzweigtes Polysaccharid, das aus vielen D-Glucose-Molekülen besteht, die durch alpha-1,6 glykodidische Verbindungen gebunden sind. Seine hohe Löslichkeit in Wasser, geringe Zelltoxizität und Bioinertity machen es zu einem vielseitigen Werkzeug, um mehrere zelluläre Prozesse zu studieren. Darüber hinaus ist dextran in einer Vielzahl von Größen erhältlich und fluoreszierend mit Fluorophoren in verschiedenen Farben gekennzeichnet. Fluoreszierend beschriftet dextrans werden häufig in der Zell- und Gewebedurchlässigkeitsforschung33,34, zur Untersuchung der Endozytose in mehreren zellulären Systemen35,36, und für die neuronale Tracing37,38. Im hörbaren Bereich wurden dextran Moleküle auch verwendet, um die Störung der Zell-Zell-Kreuzung und den Verlust der auditiven sensorischen Epithelintegrität nach Exposition gegenüber intensivem Rauschen im Chinchilla-Organ von Corti39,40zu bewerten.
In dieser Arbeit nutzten wir die Eigenschaften einiger der kleinsten (3 und 10 kDa) fluoreszierenden Dextrans, um Aufnahmeexperimente in murinen Innenohrhaarzellen durchzuführen und die Größe des Permeationswegs des Met-Kanals der Inneren Ohrhaarzelle zu untersuchen. Darüber hinaus verwendeten wir ein Laserscanning Konfokalmikroskop (LSM) 880 mit einem Airyscan-Detektor, um fluoreszierende Dextran an der Stereocilia und dem Zellkörper von auditiven Haarzellen zu visualisieren und zu lokalisieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die Tierpflege und die experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, die vom Animal Care and Use Committee des National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Animal Protocol #1336 to KJS) genehmigt wurden.
1. Mäuse
- Legen Sie ein paar Brutpaare von C57BL/6J Wildtyp in der Tieranlage zu brüten, um das Geburtsdatum der Würfe zu kontrollieren und das Alter der Welpen zu verfolgen.
2. Cochleae-Sektion
- Stellen Sie einen Randbereich in der Nähe eines Stereomikroskops ein, um die Sezierungen durchzuführen (Abbildung 1A). Verwenden Sie 70% Ethanol, um den Raum und die Umgebung zu reinigen und legen Sie eine saubere Bank Pad. Eine Plastiktüte medical Pathological Waste (MPW) wäre erforderlich, um die Tierkadaver zu entsorgen.
- Bereiten Sie mehrere 35 mm Gerichte mit einigen Leibovitz L15 Medien.
HINWEIS: Leibovitz' L-15-Zellmedium enthält 1–2 mM Ca2+,das erforderlich ist, um die Integrität der Tip-Links zu erhalten, und enthält essentielle Aminosäuren, Vitamine und Natriumpyruvat, um die Gesundheit und das Überleben der Zellen zu verbessern. Serum wurde ausgeschlossen, um experimentelle Variabilität aufgrund seiner schlecht definierten Zusammensetzung und potenziellen Interferenzen mit dem Dextran zu vermeiden. - Euthanisieren Postnatal-Day-6 (P6) Mäuse durch Enthauptung.
HINWEIS: 6 Tage alte Mäuse sind etwas resistent gegen inhalative Anästhetika. Obwohl Isofluran oder verlängerteCO2-Expositionen (bis zu 50 min) zur Euthanasie verwendet werden können, wird eine sekundäre physikalische Methode empfohlen, um den Tod zu gewährleisten. - Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Haut des Schädels zu entfernen, indem Sie einen oberflächlichen Schnitt vom vorderen zum hinteren Ende und über die äußeren Gehörkanäle machen.
- Falten Sie die Haut in Richtung der Nase, um den Schädel auszusetzen (Abbildung 2B).
- Machen Sie einen Schnitt von der Rückseite nach vorne des Schädels und über die Augenlinie (Abbildung 2B-C).
- Trennen Sie den Schädel in zwei Hälften und entfernen Sie das Gehirn mit einem kleinen Spachtel, um die zeitlichen Knochen zu belichten (Abbildung 2C-D).
- Mit einer kleinen Schere, um die zeitlichen Knochen schneiden, und verbrauchen das Gewebe.
- Legen Sie beide temporalen Knochen in eine 35-mm-Schale und stellen Sie sicher, dass sie mit L15-Medien bedeckt sind (Abbildung 2E).
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden unter dem Stereomikroskop ausgeführt. Ein schwarzer Hintergrund hilft in der Regel, das Gewebe während der feinen Sezierschritte zu visualisieren. - Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop, das mit einem Weitfeld-Okular (10X Vergrößerungsleistung (WF10X) und einer externen Wechselstrom-Halogen-Lichtquelle ausgestattet ist, das umgebende Cochlea-Gewebe, halbkreisförmige Kanäle und vestibuläre Organe mit chirurgischen Zangen (Abbildung 2F).
- Damit die Dextran- und L15-Medien in den Cochlea-Kanal gelangen, führen Sie zwei Punktionsgrenzen an der sezierten Cochleae durch, eine am runden Fenster und eine andere im apikalen Cochlea-Bereich.
- Fügen Sie 300 ml Leibovitz L15 Medien in jedem Brunnen von einer 9-Well-Glas-Depressionplatte.
- Legen Sie mindestens drei sezierte Cochleae auf jeden Brunnen.
3. Dextran Etikettierung
- Stellen Sie das Dextran in der ausgewogenen Salzlösung von Hanks ohne Ca2+ und Mg2+ (HBSS-CFM) in einer Endkonzentration von 10 mg/ml wieder her. Diese Lagerlösung muss in undurchsichtigen schwarzen Rohren (lichtgeschützt) angeboten und bis zur Verwendung bei -30 °C gelagert werden.
HINWEIS: Die Verwendung von Lysin-fixierbarem Dextran ist entscheidend für ein erfolgreiches Ergebnis dieses Protokolls. - Bereiten Sie jeden Dextran in einer Endkonzentration von 2 mg/ml in 500 ml von Leibovitz' L15-Medien vor.
- Entfernen Sie die Medien aus der Cochlea und fügen Sie Leibovitz L15-Medien, die den Dextran von Interesse in einer endigen Konzentration von 2 mg/ml enthalten.
HINWEIS: Obwohl ein Teil der MET-Kanäle in Ruhe41,42offen ist, wurde die Dextran-Inkubation mit einem sanften Schütteln der Expflanzen durchgeführt, um die offene Wahrscheinlichkeit des MET-Kanals zu erhöhen. - Bei Raumtemperatur für 2 h mit sanftem Schütteln (25 Umdrehungen pro Minute) mit einem dreidimensionalen Shaker mit einem Neigungswinkel von 25° bebrüten.
HINWEIS: Fluoreszierend dextran muss nach Möglichkeit vor Licht geschützt werden. Um den Dextran während der 2 h Inkubation zu schützen, legen Sie die 9-Well-Glasplatte in eine Zellkultur P150 Schale in Aluminiumfolie gewickelt.
4. Probenvorbereitung für die Bildgebung
- Nach der Inkubation mit dem Dextran das Gewebe zweimal mit Medien und einmal mit HBSS waschen.
- Inkubieren Sie das Gewebe bei Raumtemperatur 30 min mit 4% Paraformaldehyd in Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS).
VORSICHT: Die Exposition gegenüber Formaldehyd kann die Augen, die Nase und die oberen Atemwege reizen. Bei bestimmten Personen kann eine wiederholte Exposition der Haut gegenüber Formaldehyd zu Einer Sensibilisierung führen, die zu allergischer Dermatitis führen kann. Formaldehyd ist ein bekanntes menschliches Karzinogen und eine vermutete Fortpflanzungsgefahr. - Waschen Sie das fixierte Gewebe zweimal mit HBSS, um das Paraformaldehyd zu entfernen.
HINWEIS: Eine Entkalkung der zeitlichen Knochen ist in dieser Entwicklungsphase der Cochlea nicht erforderlich. - Entfernen Sie das Spiralband und die tektoriale Membran mit feinen Spitzenzangen, um das Organ von Corti zu sezieren (Abbildung 2G).
- Entfernen Sie alle kleinen Gewebestücke und waschen Sie das Gewebe mit HBSS.
- Permeabilisieren Sie das Gewebe in 0,5% Triton X-100 in PBS, das fluoreszentrisch markiertes Phalloidin (konjugiert zu grün oder rot, wenn die Aufnahme von TR- oder FITC-markiertem Dextran getestet wird) bei einer Verdünnung von 1:200 für 30 min enthält, um F-Actin zu kennzeichnen und die aktinbasierte Stereocilia.
- Waschen Sie das Gewebe 2–3 Mal für 2 min jedes Mal mit HBSS Puffer, um den Überschuss an Triton und Phalloidin zu entfernen, und einmal mit PBS, um die Salze zu entfernen.
- Montieren Sie das Organ von Corti-Geweben auf einem Mikroskopschlitten und bedecken Sie es mit Montagemedien.
HINWEIS: Achten Sie bei der Montage des Gewebes darauf, dass die Seite des Gewebes, die die Stereocilia der Haarzelle enthält, dem Deckelzuschlag zugewandt ist. - Entfernen Sie mögliche Blasen, die beim Hinzufügen der Montagemedien entstehen, und verhindern Sie die Erzeugung neuer Blasen während der Platzierung des Deckblatts.
HINWEIS: Aspirieren Sie mit einer Pipette jede Blase, die während der Zugabe des Montagemediums erzeugt wird. Um zu verhindern, dass Luftblasen unter dem Deckelschlupf gefangen werden, legen Sie eine Kante des Deckels in der Nähe der Probe und senken Sie vorsichtig und langsam den Deckelrutsch über dem Gewebe mit Zangen oder einer Pipettespitze. - Bedecken Sie das Gewebe in Montagemedien mit einem Glasdeckel (Abbildung 2H).
HINWEIS: Objektive mit einer numerischen Blende über 0,4 sind für die Verwendung von #1,5 Abdeckungen (0,17 mm Dicke) ausgelegt. Die Verwendung des falschen Deckzettels kann schwerwiegende Auswirkungen auf die Intensität und Qualität der Bilder haben. - Inkubieren Sie das montierte Gewebe über Nacht bei Raumtemperatur, um die Montagemedien trocknen zu lassen und die Dias bis zur Bildgebung bei 4 °C zu lagern.
5. Bildaufnahme und Bildverarbeitung
HINWEIS: Die konfokalen Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop LSM 880 aufgenommen, das mit einem 32-Kanal Airyscan-Detektor im Superauflösungsmodus (SR)43 und einem 63-fachen Objektiv ausgestattet ist.
- Fügen Sie einen kleinen Tropfen Tauchöl auf das Ziel.
- Platzieren Sie den Mikroskopschlitten mit der montierten Gewebeprobe in der Mikroskopstufe mit dem Glasdeckel, der auf das Tauchöl gerichtet ist.
- Konzentrieren Sie sich auf das Beispiel und legen Sie die Bildparameter mit der Bildaufnahmesoftware fest.
- Verwenden Sie für jedes unabhängige Experiment identische Bildaufnahmeeinstellungen und optimale Parameter für die X-, Y- und Z-Auflösung. Ein piezogesteuertes Fokussystem ist erforderlich, um das Ziel beim Erfassen des Z-Stacks von Bildern schnell und präzise zu bewegen.
HINWEIS: Um den gesamten apikalen Bereich der Haarzellen abzubilden, sammeln Sie einen Z-Stack von Bildern von der Stereocilia zur apikalen Hälfte des Haarzellkörpers mit den optimalen Einstellungen. Es ist wichtig, einen großen Z-Stack entlang der Haarzelle zu sammeln, um die Bildgebung der vesikelartigen Partikel zu gewährleisten. - Verwenden Sie die Bildaufnahmesoftware, um die rohen konfokalen Bilder mit dem Airyscan 3D-Rekonstruktionsalgorithmus mit den automatischen Standard-Dekonvolution-Filtereinstellungen zu verarbeiten.
- Öffnen Sie die konfokalen Bilder in einer Bildverarbeitungssoftware, um Helligkeit und Kontrast anzupassen, die Maßstabsleiste hinzuzufügen und die Bilder für die endgültigen Zahlen zu exportieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir beobachteten eine robuste und spezifische Kennzeichnung von Haarzellen nach 2h Inkubation von Organen von Corti-Explants von wildtypen postnatalen Tagesmäusen (P6) mit 3 kDa Dextran fluoreszierend mit Texas Red (dextran-TR)(Abbildung 2A-B). Die Dextran-Etikettierung wurde sowohl in inneren als auch äußeren Haarzellen (IHC und OHC) an den basalen, mittleren und apikalen Bereichen des Corti-Organs beobachtet (Abbildung 2B).
Fluoreszierend beschriftetes Phalloidin wurde verwendet, um fadenförmiges Aktin (F-Actin) zu vereisten und die aktinbasierte Haarzellstereocilia zu visualisieren. Wir führten auch ähnliche Experimente zu kürzeren Inkubationszeiten durch, und obwohl wir dextran-TR Akkumulation im Haarzellkörper beobachteten, waren die Signale schwächer und variabler als die bei 2 h Inkubation (Abbildung 2C).
Als nächstes stellten wir sowohl Stereocilia als auch Zellkörper der Haarzellen vor und beobachteten, dass nur die Zellen, die 3 kDa dextran-TR in ihren Zellkörper einbauten, eine fluoreszierende Kennzeichnung ihrer Stereocilia zeigten (Abbildung 3A). Diese Beziehung zwischen Stereocilia und Zellkörperbeschriftung fehlte in Haarzellen aus geschädigtem Gewebe, die auch eine unspezifische Kennzeichnung von Dextran in mehreren Zelltypen des sensorischen Epithels darstellten (gelbe Quadrate in Abbildung 2Bund Abbildung 3B). Wichtig ist, dass wir ein gleichmäßiges Fluoreszenzsignal entlang der Stereocilia mit Anreicherung an den Spitzen der kürzeren Stereocilia-Reihen beobachtet haben, in denen sich der MET-Kanalbefindet 18,23 ( Abbildung3C). Außerdem bemerkten wir vesikelartige Strukturen im Zellkörper der Haarzellen und der benachbarten Stützzellen. Das vesikelartige Aufnahmemuster in diesen Zellen legt nahe, dass Dextran-TR auch durch Endozytose aufgenommen werden kann (Abbildung 3C).
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht auch die Untersuchung der Aufnahme größerer Dextrans und Kombinationen verschiedener Dextrans. Größere Dextran von 10 kDa mit Texas Red (dextran-TR) oder Fluorescein (dextran-FITC) beschriftet produziert auch ein vesikelartiges Muster im Zellkörper von Haarzellen und unterstützenden Zellen, zusätzlich zu akkumulieren um die Haarzellmembran in einem fleckigen Muster (Abbildung 4A,B). Der 10 kDa dextran-TR beschriftete auch oberflächlich die drei Stereocilia-Reihen aller Haarzellen(Abbildung 4A, eingesteckt), wahrscheinlich aufgrund der negativ geladenen Oberfläche der Haarzellenplasmamembran44,45,46. Als nächstes untersuchten wir die Aufnahme von 3 kDa dextran-TR und 10 kDa dextran-FITC gleichzeitig im Organ der Corti-Explants. Für den 3 kDa dextran-TR beobachteten wir sowohl ein diffuses als auch ein vesikelartiges Muster. Der 10 kDa dextran-FITC zeigte jedoch nur ein vesikelartiges Muster (Abbildung 4C). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Dextran-Aufnahme durch mindestens zwei unterschiedliche Mechanismen erfolgt, die von der Größe des Dextrans abhängen.
Als nächstes haben wir geprüft, ob funktionelle ME-Kanäle für die Aufnahme von 3 kDa dextran-TR erforderlich sind. Dazu testeten wir die Dextran-Einbindung in Haarzellen aus dem Organ der Corti-Explants in Gegenwart von MET-Kanalblockern (Neomycin und Amilorid)13,14,47 oder den Ca2+ Chelator BAPTA, der MET-Ströme abschafft, indem die Spitzenverbindungen gebrochen und das Gating des Kanals25,48,49verhindert wird. In diesen Experimenten wurden die Gewebeexplantationen zuvor 30 min mit Neomycin (500 mM), Amilorid (150 mM) oder mit BAPTA (5mM) vor der Zugabe von 3 kDa dextran-TR in Gegenwart des entsprechenden MET-Blockers inkubiert. Das Vorhandensein von BAPTA oder den MET-Kanalblockern verhinderte die Stereocilia-Beschriftung (Abbildung 5A) und die Aufnahme von 3 kDa dextran-TR in Haarzellen (Abbildung 5B). Die Blockade des MET-Kanals bewahrte jedoch das vesikelartige Muster (Abbildung 5B), was darauf hindeutet, dass dieses Aufnahmemuster unabhängig von funktionalen MET-Kanälen ist. Ähnliche Ergebnisse wurden in Haarzellen von TMC1/TMC2 Doppel-Knock-out-Mäusen beobachtet, denen MET27fehlt. Faszinierenderweise waren diese vesikelartigen Strukturen in Gegenwart von Amilorid, das bekanntermaßen den Na+-H+ Austauscher hemmt und dadurch die Endozytose50,51hemmt, nicht beobachtbar. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass 3kDa dextran-TR durch zwei verschiedene Bahnen in die Haarzellen eindringt, einen, der größeren Dextrans mit vesikelähnlichen Strukturen gemeinsam ist, und einen anderen, der von funktionellen MET-Kanälen abhängt.
Abbildung 1: Schritte der Zerlegung eines murinen Organs von Corti. (A) Reinigen Sie den Bereich und die für die Zerlegung erforderlichen Materialien. (B) Belichtete Maus Schädel. Zangen halten die Haut, die sich zur Nase gefaltet hat. Schwarze Linien zeigen die beiden Einschnitte an, die für die Entfernung des Gehirns erforderlich sind. (C) Eingeschnittener und geöffneter Schädel, um die Entfernung des Gehirns mit einem Spachtel (rechts) zu ermöglichen. (D) Cranium und temporale Knochen nach Hirnentfernung. (E) Zersteinter Schädel, einschließlich der zeitlichen Knochen (gestrichelte schwarze Quadrate) in einer P35-Platte, die mit Medien bedeckt ist. (F) Verbrauchete Cochleae. (G) Zwei sezierte Organe von Corti auf dem Brunnen einer glasenden Depressionsplatte. (H) Montierte Probe auf einem Glasdeckel, der für die Bildgebung bereit ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Haarzellen aufnehmen 3 kDa dextran-TR. (A) Schematische Darstellung von Texas Red-labeled dextran (dextran-TR) mit sechs Glucosemolekülen, die einem Molekulargewicht von 1,08 kDa entsprechen. Eine Succinimidylester-Reaktion verbindet ein Texas Red Molekül (Magenta) mit einem Glukosemonomer. (B) Repräsentatives konfokales Bild mit spezifischer Kennzeichnung sensorischer Haarzellen (HC) mit 3 kDa dextran-TR über das gesamte Corti-Organ einer 6 Tage alten Maus. Die basalen (BA), mittleren (MD) und apikalen (AP) Regionen des Organs sind angegeben. Gelbe Quadrate weisen auf gewebegeschädigte Regionen hin. (C) 3 kDa dextran-TR Fluoreszenz nach 30, 60, 90 oder 120 min Inkubation mit dem Organ der Corti-Explants wird in Magenta gezeigt, das mit F-Actin in Grün (obere Bilder) und unabhängig in Graustufen (untere Bilder) verschmolzen ist. Der Bildanzeigebereich wurde in jedem der Grauen Bilder unabhängig voneinander zur Visualisierung der 3 kDa dextran-TR Fluoreszenz linear angepasst. Skalenstange = 20 mm. Diese Zahl wurde von27geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Haarzellenkörper und Stereocilia-Etikettierung mit 3 kDa dextran-TR. (A) Konfokale Bilder mit 3 kDa dextran-TR Fluoreszenz (Magenta) am Zellkörper und Stereocilia mit Phalloidin kontrakariert, um F-Actin (grün) zu kennzeichnen, um Haarzellgrenzen und Stereocilia zu visualisieren. Die drei Reihen der äußeren Haarzellen (OHC) und eine Reihe von inneren Haarzellen (IHC) sind angezeigt. Skala bar = 20 mm. (B) Konfokale Bilder eines beschädigten Gewebebereichs mit 3 kDa dextran-TR Fluoreszenz (Magenta) am Zellkörper und Stereocilia. Gelbe Pfeile zeigen die Beschriftung nichtsensorischer stützender Zellen an. Scale bar = 20 mm. (C) Nähere Ansicht der 3 kDa dextran-TR Fluoreszenz am Zellkörper und Stereocilia der äußeren Haarzellen (OHC, oben) und der inneren Haarzellen (IHC, unten). Skalenstange = 5 mm. Diese Zahl wurde von27geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beschriftung von größeren 10 kDa dextran und einer Kombination aus 3 und 10 kDa dextran. (A) Konfokales Bild von Haarzellen am Haarzellkörper (oben) und Stereocilia (unten) mit 10 kDa dextran-TR inkubiert. Das Dextran-Fluoreszenzsignal wird in Magenta gezeigt, das mit F-Actin in Grün und unabhängig in Graustufen verschmolzen ist. Ein paar IHC werden bei höherer Vergrößerung im Einset gezeigt, um die oberflächliche Etikettierung von Stereocilia zu schätzen, die mit dem 10 kDa dextran-TR beobachtet wurde. Skala bar = 5 mm. (B) Konfokales Bild von Haarzellen, die mit 10 kDa dextran-FITC dargestellt werden, dargestellt wie in A. (C) Konfokales Bild von Haarzellen am Haarzellkörper (oben) und Stereocilia (unten) gleichzeitig mit 3 kDa dextran-TR und 10 kDa dextran-FITC inkubiert und mit unabhängigen Kanälen getrennt dargestellt und getrennt dargestellt. Im rechten Bereich werden F-Actin (blau), 10 kDa dextran-FITC (grün) und 3 kDa dextran-TR (Magenta) zusammen mit Phalloidin (blau) gezeigt. Maßstabsleiste = 20 mm, und das vesikelartige Aufnahmemuster wird mit gelben Pfeilen angezeigt. Diese Zahl wurde von27geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Für die Aufnahme von 3 kDa dextran-TR sind funktionale MET-Kanäle erforderlich. Repräsentative konfokale Bilder von Haarzellen am Stereozil (A) oder Zellkörper (B) Ebene nach inkubation mit 3 kDa dextran-TR in Abwesenheit (Kontrolle) oder Vorhandensein von BAPTA oder der MET-Kanalblocker Amilorid und Neomycin. 3 kDa dextran-TR Fluoreszenz wird in Magenta gezeigt. Gewebe wurde mit Phalloidin gegengefärbt, um F-Actin zur Visualisierung der Haarzellstereocilia und -grenzen (grün) zu kennzeichnen. Weiße Pfeile weisen auf vesikelartige Strukturen hin. Die drei Reihen der äußeren Haarzellen (OHC) und eine Reihe von inneren Haarzellen (IHC) sind angezeigt, Scale bar = 20 mm. Diese Zahl wurde von27geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie Aufnahmeexperimente in murinen Organ von Corti-Explants mit 3 kDa dextran Texas Red durchzuführen. Ziel dieser Methode ist es zu testen, ob Moleküle, die größer als andere zuvor getestetwurden, auch in der Lage waren, auditive Haarzellen gezielt zu kennzeichnen und durch den MET-Kanal zu durchdringen. Ähnliche experimentelle Protokolle wurden bisher verwendet, um die Durchlässigkeit von Haarzellen zu anderen fluoreszierenden Farbstoffen wie FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 und Texas rot markierte Aminoglykoside (1,29–1,43 kDa)13,52zu bewerten. Die Zeit, die für die Kennzeichnung von Haarzellen mit diesen fluoreszierenden Molekülen benötigt wird, variiert je nach Größe. Die maximale Etikettierung erfordert ein paar Minuten für FM1-4313,53, 30-60 min für Texas Rot-markierte Aminoglykoside13und 1,5 h für Texas Rot-markiert 3 kDa dextran. Daher sind lange Inkubationszeiten für dieses Experiment entscheidend, da wir bei kurzen Inkubationszeiten nur eine minimale Kennzeichnung des Haarzellkörpers sahen(Abbildung 2C). Wir haben uns entschieden, P6-Mäuse für diese Experimente zu untersuchen, weil in diesem Alter die meisten apikalen und basalen Haarzellen Transduktionsströme tragen und sowohl TMC1- als auch TMC2-Proteine12,18,54,55ausdrücken. Es sollte möglich sein, jüngere Tiere zu untersuchen, da MET-Ströme früher als P6 vorhanden sind, insbesondere in der Nähe der Basis der Cochlea12. Das Studium älterer Tiere kann schwieriger sein, weil die Zerlegung der knöchernen Cochlea schwieriger wird, da diese Struktur weiterhinverknöchert 56.
Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll. Die wichtigste ist die erfolgreiche Zerlegung und Vorbereitung des Organs von Corti Gewebe (Abbildung 1). Die zarte Struktur des Organs von Corti und die Einhüllung in der knochenhaften Cochlea stellen eine Herausforderung für die histologische und biochemische Analyse dar. Mehrere detaillierte Protokolle für die erfolgreiche Zerlegung dieses Gewebes wurden bereits in dieser Zeitschrift56,57,58 und andere59veröffentlicht. Eine Störung der Zell-Zell-Kreuzung und der Verlust der auditiven sensorischen Epithelintegrität können zur Aufnahme von Dextran von bis zu 40 kDa und zur Kennzeichnung der betroffenen Zellen39,40führen. In Übereinstimmung damit beobachteten wir eine unspezifische Kennzeichnung von Haarzellen und den umgebenden Stützzellen, wenn das Gewebe während der Zerlegung vor der Dextran-Inkubation unbeabsichtigt mit den Zangen geschädigt wurde (Abbildung 2B und Abbildung 3B). Es gibt keine Tricks oder Richtlinien, um Fähigkeiten bei der Sezieren eines intakten Organs von Corti außer Übung und Geduld zu erreichen. Das Vorhandensein von 1–2 mM Ca2+ während Gewebesektions- und Aufnahmeexperimenten ist jedoch entscheidend, um die Integrität des Spitzengliedes zu erhalten, der die mechanische Kraft an den MET-Kanal überträgt und dadurch die MET-Kanalfunktion erhält. Sobald das Gewebe mit 4% PFA fixiert ist, wird das Vorhandensein von Kalzium im Puffer oder Medium trivial.
Eine der Einschränkungen dieser Studie liegt in der Heterogenität der Dextran-Moleküle. Das von den Leuconostoc-Bakterien hergestellte Dextran ist ein Polymer aus Anhydroglucose, das aus etwa 95% Alpha-(1-6) D-Verbindungen besteht (Abbildung 2A). Die übrigen Verbindungen sind für die Verzweigung von Dextran, die mit seiner Länge korreliert, so dextran von geringerem Molekulargewicht sind mehr Stab-like und haben eine engere Größenverteilung, während größere dextrans sind polydisperse60. Daher liegt das tatsächliche Molekulargewicht der Moleküle bei jeder Zubereitung des 3 kDa Dextran zwischen 1,5 und 3,0 kDa, einschließlich des fluoreszierenden Moleküls61. Darüber hinaus unterscheiden sich die fluoreszierend markierten Dextraninins in der Anzahl der Texas Red Moleküle, die an der Dextran (Grad der Kennzeichnung) befestigt sind. Es ist ratsam, Dextran mit einem Etikettierungsgrad von mindestens 0,4 zu verwenden, da ein niedrigerer Etikettierungsgrad die Fähigkeit behindert, den fluoreszierend markierten Dextran durch Mikroskopie zu erkennen. Der mit dem Dextran gekoppelte Fluoreszenzfarbstoff und die Lysinrückstände in den fixierbaren Versionen bestimmen die Gesamtladung des Dextrans. Dies ist eine wichtige Überlegung, da die kationische Selektivität des MET-Kanals vorzugsweise kationische Dextran27aufnehmen würde. Schließlich ist ein Lysin-fixierbarer Dextran erforderlich, um die in diesen Experimenten angezeigte Auflösung zu erreichen. Ein nicht fixierbarer Dextran wird weiterhin in das Gewebe diffundieren, was seine genaue Lokalisierung und Visualisierung behindert.
Das konfokale Mikroskop LSM 880, das mit einem Airyscan-Detektor ausgestattet ist, mit dem das Organ von Corti-Proben abgebildet wird, lieferte uns die doppelte Auflösung und ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Vergleich zu einem herkömmlichen Konfokalmikroskop62. Daher ermöglichte uns dieses Mikroskop nicht nur, die robuste Dextranakkumulation am Zellkörper zu beobachten, sondern auch die Ansammlung des Dextrans an den Stereocilia-Spitzen und das vesikelartige Muster am Zellkörper zu lokalisieren. Ein herkömmliches konfokales Mikroskop würde die Visualisierung und Quantifizierung der Ansammlung von fluoreszierendem Dextran am Zellkörper ermöglichen, aber es wäre schwierig, die drei Reihen der Stereokilia und die genaue Lokalisierung des Dextrans an den Spitzen der kürzeren Stereocilia-Reihen zu unterscheiden. Eine ähnliche Auflösung wie beim LSM 880 Airyscan confocal konnte mit einem konventionellen konfokalen Mikroskop mit Oversampling und Dekonvolution erreicht werden, obwohl der SNR niedriger wäre als der mit dem Airyscan-Detektor erreichte.
Neben der Verwendung von 3 kDa dextran-TR zum Assay für funktionelle MET-Kanäle könnte dieses Protokoll weiter verwendet werden, um endozytische Prozesse in Haarzellen zu untersuchen, da alle getesteten Dextrans ein intrazelluläres vesikelähnliches Muster aufweisen, das endozytosis ähnelt. Dieser Prozess stand nicht im Mittelpunkt unserer Arbeit, und es wären zusätzliche Studien erforderlich, um dieses Phänomen vollständig zu charakterisieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Vincent Schram vom NICHD-Mikroskopie- und Bildgebungskern für die Unterstützung bei der konfokalen Bildaufnahme und Tsg-Hui Chang für die unschätzbare Hilfe bei der Verwaltung von Kolonien und der Mäusepflege. Diese Forschung wurde unterstützt durch das Intramural Research Program des NINDS, NIH, Bethesda, MD, an K.J.S. A.B. wurde durch das Intramural Research Program des NINDS, NIH, und durch ein Robert Wenthold Postdoktorandenstipendium aus dem intramurarischen Forschungsprogramm unterstützt. der NIDCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
| C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
| Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
| Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
| Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
| Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
| Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
- Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
- Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
- Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
- Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
- Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
- Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
- Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
- Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
- Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
- Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
- Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
- Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
- Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
- Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
- Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
- Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
- Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
- Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
- Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
- Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
- Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
- Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
- Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
- Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
- Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
- Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
- Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
- Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
- Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
- Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
- Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
- Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
- Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
- Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
- Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
- Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
- Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
- Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
- Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
- Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
- Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
- Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
