Summary
Qui, presentiamo un metodo per visualizzare l'assorbimento di 3 kDa Texas Red-etichetta tono in cellule ciliate uditive con canali di meccanotrazione funzionali. Inoltre, dextrans di 3-10 kDa può essere utilizzato per studiare l'endocitosi nei capelli e le cellule di supporto dell'organo di Corti.
Abstract
Il canale mechanotransduzione delle cellule ciliate (MET) svolge un ruolo importante nell'udito. Tuttavia, l'identità molecolare e le informazioni strutturali del MET rimangono sconosciute. Studi elettrofisiologici sulle cellule ciliate hanno rivelato che il canale MET ha una grande conduttanza ed è permeabile a molecole cazionali fluorescenti relativamente grandi, tra cui alcuni coloranti di stiryl e antibiotici aminoglycoside etichettati con marchio rosso texas. In questo protocollo, descriviamo un metodo per visualizzare e valutare l'assorbimento di dextrans fluorescente nelle cellule ciliate dell'organo di espianti Corti che può essere utilizzato per testare i canali MET funzionali. Abbiamo scoperto che 3 kDa Texas Red-labeld è etichettato specificamente sulle cellule ciliate uditive funzionali dopo l'incubazione di 1-2 h. In particolare, 3 kDa dextran etichetta le due file stereocilia più corte e si accumula nel corpo cellulare in un modello diffuso quando sono presenti canali MET funzionali. Un ulteriore modello vescino-come di etichettatura è stato osservato nel corpo cellulare delle cellule ciliate e circostante le cellule di supporto. I nostri dati suggeriscono che 3 kDa Texas-Red dextran può essere utilizzato per visualizzare e studiare due percorsi per l'assorbimento del coloranti cellulare; un percorso di ingresso specifico per le cellule di capelli attraverso canali MET funzionali e l'endocitosi, un modello disponibile anche per dextran più grandi.
Introduction
Le cellule ciliate dell'orecchio interno sono le cellule sensoriali che rilevano il suono e coprono gli stimoli meccanici nei segnali elettrici, che alla fine vengono interpretati dal nostro cervello. Queste celle hanno un fascio a forma di scala di tre file di filamenti a base di actina, noto come stereocilia, che sporgono dalla loro regione apicale1,2. Gli stimoli meccanici deviano i filamenti di stereocilia verso la fila più lunga e innescano l'apertura della meccanotransduzione (MET) canali3. L'apertura dei canali MET porta ad un afflusso di cations che depolarizza la cellula e di conseguenza segnala il rilascio di vescicoli sinapsi nella regione basale della cellula ciliata.
Le proprietà biofisiche del canale MET essenziali per l'udito sono state ampiamente caratterizzate. Tra le altre proprietà, questi canali sono cationic selettivo e hanno una conduttanza relativamente grande (150-300 pS in basso Ca2 ,)4,5,6,7,8,9,10. Sorprendentemente, grandi molecole fluorescenti come FM1-43 e Texas Red-etichettato aminoglycosides sono permeant bloccanti del canale MET, con conseguente loro accumulo nel corpo delle cellule dei capelli che può essere visualizzato utilizzando la microscopia a fluorescenza11,12,13,14. Al contrario, l'identità molecolare e la struttura del canale MET e il suo percorso di permeazione sono rimasti sfuggentemente. Sempre più prove sperimentali indicano che la proteina del canale transmembrana 1 (TMC1) è un componente del canale MET nelle cellule ciliate mature15,16,17,18,19. Le mutazioni nel canale 1 (TMC1) simile alla transmembrana alterano le proprietà del canale MET19,20,21,22 e causano sordità. Inoltre, TMC1 localizza al sito del canale MET18,23 e interagisce con il tip-link responsabile della trasmissione della forza meccanica al canale MET24,25. Inoltre, una recente analisi bioinformatica ha identificato le proteine TMC come evolutive relative ai canali meccanosensibili tMEM63/OSCA e alle proteine TMEM16, una famiglia di canali di cloruro attivati dal calcio e scramblases lipidici26,27,28. Un modello strutturale di TMC1 basato sulla relazione tra queste proteine ha rivelato la presenza di una grande cavità all'interfaccia proteina-lipidico27. Questa cavità ospita le due mutazioni di TMC1 che causano la perdita dell'udito autosomica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, e la modifica selettiva dei mutanti di cisteina per i residui nelle proprietà del canale MET della cavità28, indicando che potrebbe funzionare come percorso di permeazione del canale MET. Le grandi dimensioni di questa cavità prevista nelle proteine TMC potrebbero spiegare la capacità di molecole di grandi dimensioni di permeare il canale MET. Per testare la previsione che il canale MET contenga un percorso di permeazione insolitamente grande e per spingere i limiti delle dimensioni della cavità osservata in TMC1, abbiamo sviluppato un protocollo per eseguire esperimenti di assorbimento nell'organo di Antipiante di Corti con una molecola più grande, 3 kDa dextran fluorescente etichettata con Texas Red.
Dextran è un complesso polisaccaride ramificato composto da molte molecole di D-glucosio legate da collegamenti alfa-1,6 glicosidici. La sua elevata solubilità nell'acqua, la bassa tossicità cellulare e la bioinertità lo rendono uno strumento versatile per studiare diversi processi cellulari. Inoltre, dextran è disponibile in una vasta gamma di dimensioni e fluorescente etichettato con fluorofori di diversi colori. Fluorescently etichettato dextrans sono comunemente utilizzati nella ricerca di permeabilità cellulare e tessuto33,34, per studiare l'endocitosi in più sistemi cellulari35,36, e per la traccia neurale37,38. Nel campo uditivo, le molecole di dextran sono state utilizzate anche per valutare la rottura della giunzione cellulare-cellula e la perdita dell'integrità dell'epitelio sensoriale uditivo dopo l'esposizione a rumore intenso nell'organo cincillà di Corti39,40.
In questo lavoro, abbiamo sfruttato le proprietà di alcuni dei più piccoli (3 e 10 kDa) dextrans fluorescenti per eseguire esperimenti di assorbimento nelle cellule ciliate dell'orecchio interno murine ed esplorare le dimensioni del percorso di permeazione del canale MET della cellula capelli interna. Inoltre, abbiamo utilizzato un microscopio confocale a scansione laser (LSM) 880 dotato di un rilevatore Airyscan per visualizzare e localizzare dextran fluorescente in stereocilia e nel corpo cellulare delle cellule ciliate uditive.
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Protocol
Le procedure di cura e sperimentazione degli animali sono state eseguite seguendo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, che sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto nazionale di disturbi neurologici e ictus (protocollo animale #1336 a KJS).
1. Topi
- Impostare un paio di coppie riproduttive di tipo C57BL/6J per riprodursi nella struttura animale per controllare la data di nascita delle cucciolate e tenere traccia dell'età dei cuccioli.
2. Dissezione cocleae
- Impostare uno spazio pulito vicino a uno stereoscopio per eseguire le dissezioni (Figura 1A). Utilizzare il 70% di etanolo per pulire lo spazio e l'ambiente circostante e posizionare un panca pulito. Sarebbe necessario un sacchetto di plastica Medical Pathological Waste (MPW) per scartare le carcasse animali.
- Prepara diversi piatti da 35 mm con alcuni supporti L15 di Leibovitz.
NOTA: Il supporto cellulare L-15 di Leibovitz contiene 1-2 mM Ca2,che è necessario per mantenere l'integrità dei collegamenti delle persone, e contiene aminoacidi essenziali, vitamine e pirati di sodio per migliorare la salute e la sopravvivenza delle cellule. Il siero è stato escluso per evitare la variabilità sperimentale a causa della sua composizione mal definita e della potenziale interferenza con il dextran. - Eutanasia i topi postnatali-giorno-6 (P6) per decapitazione.
NOTA: i topi di 6 giorni sono in qualche modo resistenti agli anestetici inalanti. Anche se per l'eutanasia può essere utilizzato un metodo fisico secondario per garantire la morte di isoflurane oco2 prolungata (fino a 50 min), si raccomanda un metodo fisico secondario per garantire la morte. - Utilizzare forbici chirurgiche per rimuovere la pelle del cranio facendo un taglio superficiale dall'estremità anteriore a quella posteriore e attraverso i canale uditivi esterni.
- Piegare la pelle verso il naso per esporre il cranio (Figura 2B).
- Fare un'incisione dalla parte posteriore alla parte anteriore del cranio e attraverso la linea degli occhi (Figura 2B-C).
- Separare il cranio in due metà e rimuovere il cervello con l'uso di una piccola spatola per esporre le ossa temporali (Figura 2C-D).
- Con piccole forbici, tagliare intorno alle ossa temporali, e accisa il tessuto.
- Mettere entrambe le ossa temporali in un piatto da 35 mm e assicurarsi che siano coperte con supporti L15 (Figura 2E).
NOTA: i seguenti passaggi vengono eseguiti sotto lo stereomicroscopio. Uno sfondo nero di solito aiuta a visualizzare il tessuto durante i passaggi di dissezione fine. - Sotto uno stereomicroscopio dotato di un oculare widefield (una potenza di ingrandimento 10X (WF10X) e di una sorgente luminosa alogena a corrente alternata esterna (AC), rimuovere il tessuto cocleare circostante, i canali semicircolari e gli organi vestibolari con pinze chirurgiche (Figura 2F).
- Per consentire al dextran e al supporto L15 di entrare nel condotto cocleare, eseguire due limiti di foratura sulle coclee dissetate, una sulla finestra rotonda e l'altra nella regione cocleare apicale.
- Aggiungere 300 mL di supporto L15 di Leibovitz in ogni pozzo da una piastra di depressione di vetro 9-well.
- Mettere almeno tre coclee sezionate su ogni pozzo.
3. Etichettatura Dextran
- Ricostituire il dextran nella soluzione di sale bilanciato di Hanks senza Ca2 e Mg 2 (HBSS-CFM) ad una concentrazione finale di 10 mg/mL. Questa soluzione di riserva deve essere rivestita in tubi neri opachi (protetti dalla luce) e conservata a -30 gradi centigradi fino all'uso.
NOTA: L'uso di dextran lisina-fixable è fondamentale per un esito positivo di questo protocollo. - Preparare ogni dextran ad una concentrazione finale di 2 mg/mL in 500 mL del supporto L15 di Leibovitz.
- Rimuovere il supporto dalla coclea e aggiungere il supporto L15 di Leibovitz contenente il dextran di interesse ad una concentrazione finale di 2 mg/mL.
NOTA: Anche se una parte dei canali MET è aperta ariposo 41,42, l'incubazione dextran è stata eseguita con una leggera agitazione degli espianti per aumentare la probabilità aperta del canale MET. - Incubare a temperatura ambiente per 2 h con agitazione delicata (25 giri/) utilizzando uno shaker tridimensionale con un angolo inclinato di 25 gradi.
NOTA: dextran fluorescente deve essere protetto dalla luce quando possibile. Per proteggere il dextran durante l'incubazione di 2 h, posizionare la lastra di vetro 9-well all'interno di un piatto P150 coltura cellulare avvolto in un foglio di alluminio.
4. Preparazione del campione per l'imaging
- Dopo l'incubazione con il dextran, lavare il tessuto per 2 min due volte con il supporto e una volta con HBSS.
- Incubare il tessuto a temperatura ambiente per 30 min con 4% paraformaldeide nella soluzione di sale equilibrato di Hanks (HBSS).
DESTRA: L'esposizione alla formaldeide può essere irritante per gli occhi, il naso e il tratto respiratorio superiore. In alcuni individui, l'esposizione ripetuta della pelle alla formaldeide può causare sensibilizzazione che può provocare dermatite allergica. La formaldeide è un noto cancerogeno umano e un sospetto rischio riproduttivo. - Lavare rapidamente e delicatamente il tessuto fisso due volte con HBSS per rimuovere la paraformaldeide.
NOTA: La decalcificazione delle ossa temporali non è necessaria in questa fase di sviluppo della coclea. - Rimuovere il legamento a spirale e la membrana tenziale con pinze di punta fine per sezionare l'organo di Corti (Figura 2G).
- Rimuovere tutti i piccoli pezzi di tessuto e lavare il tessuto con HBSS.
- Permeabilizzare il tessuto nello 0,5% Triton X-100 in PBS contenente phalloidin fluorescente (coniugato al verde o al rosso durante il test dell'assorbimento del dextran con etichetta TR o FITC) a una diluizione di 1:200 per 30 min per etichettare F-actin e visualizzare il stereocilia basata sull'actin.
- Lavare il tessuto 2-3 volte per 2 min ogni volta con il tampone HBSS per rimuovere l'eccesso di triton e phalloidin, e una volta con PBS per rimuovere i sali.
- Montare l'organo dei tessuti Corti su un vetrino al microscopio e coprirlo con supporti di montaggio.
NOTA: Durante il montaggio del tessuto, assicurarsi che il lato del tessuto contenente la stereocilia delle cellule cili sia rivolto verso il coperchio. - Rimuovere eventuali bolle generate durante l'aggiunta del supporto di montaggio e impedire la generazione di nuove bolle durante il posizionamento del coperchio.
NOTA: Aspirate con una pipetta qualsiasi bolla generata durante l'aggiunta del supporto di montaggio. Per evitare che le bolle d'aria rimangano intrappolate sotto la vescosina, posizionare un bordo del coperchio vicino al campione e ridurre attentamente e abbassare lentamente il coperchio sul tessuto utilizzando pinze o una punta pipetta. - Coprire il tessuto in supporti di montaggio con un coperchio di vetro (Figura 2H).
NOTA: Gli obiettivi con un'apertura numerica superiore a 0,4 sono progettati per utilizzare copricoperture #1,5 (spessore di 0,17 mm). L'utilizzo di coverslip sbagliato può avere gravi implicazioni per l'intensità e la qualità delle immagini. - Incubare il tessuto montato durante la notte a temperatura ambiente per far asciugare il supporto di montaggio e conservare i vetrini a 4 gradi centigradi fino all'imaging.
5. Acquisizione di immagini ed elaborazione delle immagini
NOTA: Le immagini confocali sono state scattate con un microscopio confocale LSM 880 dotato di un rilevatore Airyscan a 32 canali in modalità super-risoluzione (SR)43 e un obiettivo 63x.
- Aggiungere una piccola goccia di olio di immersione sull'obiettivo.
- Posizionare il vetrino del microscopio contenente il campione di tessuto montato nello stadio del microscopio con il coperchio di vetro rivolto verso l'olio di immersione.
- Concentrarsi sul campione e impostare i parametri di imaging utilizzando il software di acquisizione delle immagini.
- Usa impostazioni di acquisizione immagini identiche e parametri ottimali per la risoluzione x, y e z per ogni esperimento indipendente. Un sistema di messa a fuoco piezo-driven è necessario per spostare rapidamente e con precisione l'obiettivo quando si acquisisce lo z-stack di immagini.
NOTA: Per immaginare l'intera regione apicale delle cellule ciliate, raccogliere uno z-stack di immagini dalla stereocilia alla metà apicale del corpo delle cellule ciliate utilizzando le impostazioni ottimali. È fondamentale raccogliere una grande z-stack lungo la cellula dei capelli per assicurare l'imaging delle particelle vesciche-like. - Utilizzare il software di acquisizione delle immagini per elaborare le immagini confocalraw utilizzando l'algoritmo di ricostruzione 3D Airyscan con le impostazioni del filtro di deconvoluzione predefinito automatico.
- Aprire le immagini confocali in un software di elaborazione delle immagini per regolare la luminosità e il contrasto, aggiungere la barra di scala ed esportare le immagini per le figure finali.
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Representative Results
Abbiamo osservato un'etichettatura robusta e specifica delle cellule ciliate dopo l'incubazione di 2h di organi di espianti Corti da topi postnatali-giorno-6 (P6) di tipo selvaggio con 3 kDa dextran fluorescente etichettati con Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). L'etichettatura Dextran è stata osservata nelle cellule ciliate interne ed esterne (IHC e OHC) nelle regioni basale, centrale e apicale dell'organo di Corti(Figura 2B).
La phalloidina fluorescente è stata usata per contrastare l'actina filamentosa (F-actin) e visualizzare la stereociglia delle cellule cilia delle cellule cilia delle cellule ciliate a base di actina. Abbiamo anche eseguito esperimenti simili a tempi di incubazione più brevi, e anche se abbiamo osservato l'accumulo di dextran-TR nel corpo delle cellule ciliate, i segnali erano più deboli e più variabili di quelli a 2 h incubazione (Figura 2C).
Successivamente abbiamo immaginato sia stereocilia che corpi cellulari delle cellule ciliate e abbiamo osservato che solo quelle cellule che incorporavano 3 kDa dextran-TR nel loro corpo cellulare mostravano un'etichetta fluorescente della loro stereocilia (Figura 3A). Questa relazione tra stereocilia e l'etichettatura del corpo cellulare era assente nelle cellule ciliate dal tessuto danneggiato, che presentava anche un'etichettatura non specifica del dextran in diversi tipi di cellule dell'epitelio sensoriale (quadrati gialli in Figura 2Be Figura 3B). È importante sottolineare che abbiamo osservato un segnale di fluorescenza uniforme lungo la stereocilia con arricchimento alle punte delle file stereocilia più corte dove si trova il canale MET18,23 (Figura 3C). Inoltre, abbiamo notato strutture vescicle-like nel corpo cellulare delle cellule ciliate e le cellule di supporto vicine. Il modello vescicante di assorbimento in queste cellule suggerisce che dextran-TR può anche essere ripreso dall'endocitosi (Figura 3C).
Il protocollo qui descritto consente anche l'esame dell'assorbimento di dextrans più grandi e combinazioni di dextrans diversi. Più grande dextran di 10 kDa etichettato con Texas Red (dextran-TR) o fluoresceina (dextran-FITC) ha anche prodotto un modello simile a una vescicle nel corpo cellulare delle cellule ciliate e delle cellule di supporto, oltre ad accumularsi intorno alla membrana delle cellule dei capelli in un modello patchy(Figura 4A,B). Il 10 kDa dextran-TR anche superficialmente etichettato le tre file stereocilia di tutte le cellule ciliate (Figura 4A, inset), probabilmente a causa della superficie carica negativamente della membrana plasmatica delle cellule dei capelli44,45,46. Abbiamo poi esaminato l'assorbimento di 3 kDa dextran-TR e 10 kDa dextran-FITC contemporaneamente nell'organo degli espianti Corti. Per il 3 kDa dextran-TR, abbiamo osservato sia un modello diffuso che un modello vescicolo-like. Tuttavia, il 10 kDa dextran-FITC visualizzato solo un modello vescicano -come (Figura 4C). Questi dati suggeriscono che l'assorbimento di dextran avviene con almeno due meccanismi distinti che dipendono dalle dimensioni del dextran.
Successivamente abbiamo valutato se i canali MET funzionali fossero necessari per l'assorbimento di 3 kDa dextran-TR. Per fare questo, abbiamo testato l'incorporazione di dextran nelle cellule ciliate dall'organo di espianti Corti in presenza di bloccanti di canale MET (neomicina e amiloride)13,14,47 o il Ca2o chelator BAPTA, che abolisce le correnti MET rompendo i collegamenti di punta e impedendo l'gating del canale25 ,48,49. In questi esperimenti, gli espianti tissutali sono stati precedentemente incubati per 30 minuti con neomicina (500 mM), amiloride (150 mM) o con BAPTA (5mM) prima dell'aggiunta di 3 kDa dextran-TR in presenza del corrispondente bloccante MET. La presenza di BAPTA o dei bloccanti del canale MET ha impedito l'etichettatura degli stereocili (Figura 5A) e l'assorbimento di 3 kDa dextran-TR nelle cellule ciliate (Figura 5B). Tuttavia, il blocco del canale MET ha mantenuto il modello vescicolo-simile (Figura 5B), indicando che questo modello di assorbimento è indipendente dai canali MET funzionali. Risultati simili sono stati osservati nelle cellule ciliate da topi TMC1/TMC2 doppio knock-out, che mancano DI MET27. Intrigantemente, queste strutture vescicle-like non erano osservabili in presenza di amiloride, che è noto per inibire lo scambiatore di Na-He quindi inibire l'endocitosi50,51. Questi risultati indicano che 3kDa dextran-TR entra nelle cellule ciliate attraverso due percorsi diversi, uno comune a dextrans più grandi che coinvolgono strutture simili a vescicle e un altro che dipende da canali MET funzionali.
Figura 1: Passi della dissezione di un organo murno di Corti. (A) Area pulita e materiali necessari per la dissezione. (B) Cranio di topo esposto. Le pinze tengono la pelle, che si è piegata verso il naso. Le linee nere indicano le due incisioni necessarie per la rimozione del cervello. (C) Cranio inciso e aperto per consentire la rimozione del cervello con una spatola (a destra). (D) Cranio e ossa temporali dopo la rimozione del cervello. (E) Cranio associtato, comprese le ossa temporali (quadrati neri tratteggiati) in una piastra P35 ricoperta di supporti. (F) Cocleae eccitata. (G) Due organi sezionati di Corti sul pozzo di una piastra di depressione di vetro. (H) Campione montato su un coperchio di vetro pronto per l'imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Le cellule dei capelli aumentano 3 kDa dextran-TR. (A) Rappresentazione schematica del dextran texas Red (dextran-TR) contenente sei molecole di glucosio corrispondenti a un peso molecolare di 1,08 kDa. Una reazione succinimidyl ester collega una molecola Texas Red (magenta) a un monomero di glucosio. (B) Immagine confocale rappresentativa che mostra un'etichettatura specifica delle cellule ciliate sensoriali (HC) con 3 kDa dextran-TR su tutto l'organo di Corti da un topo di 6 giorni. Sono indicate le regioni basale (BA), centrale (MD) e apicale (AP). I quadrati gialli indicano regioni danneggiate dai tessuti. (C) 3 kDa dextran-TR fluorescenza dopo 30, 60, 90, o 120 min incubazione con l'organo di espianta Cortiplants è mostrato in magenta fuso con F-actin in verde (immagini in alto) e indipendentemente in scala di grigi (immagini in basso). L'intervallo di visualizzazione dell'immagine è stato regolato linearmente in ciascuna delle immagini grigie in modo indipendente per la visualizzazione della fluorescenza 3 kDa dextran-TR. Barra della scala: 20 mm. Questa cifra è stata modificata a partire da27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Corpo delle cellule dei capelli e etichettatura stereocilia con 3 kDa dextran-TR. (A) Immagini confocali che mostrano 3 kDa dextran-TR fluorescenza (magenta) al corpo cellulare e stereocilia contro-rossoidina per etichettare F-actin (verde) per visualizzare i confini delle cellule di capelli e stereociglia. Sono indicate le tre file di cellule ciliate esterne (OHC) e una fila di cellule ciliate interne (IHC). Barra di scala - 20 mm.(B) Immagini confocali di un'area tissutale danneggiata che mostrano 3 kDa fluorescenza dextran-TR (magenta) sul corpo cellulare e stereocilia. Le frecce gialle indicano l'etichettatura delle celle di supporto non sensoriali. Barra della scala - 20 mm. (C) Vista più ravvicinata della fluorescenza 3 kDa dextran-TR sul corpo cellulare e stereocilia delle cellule ciliate esterne (OHC, superiore) e delle cellule ciliate interne (IHC, fondo). Barra della scala: 5 mm. Questa cifra è stata modificata a partire da27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Etichettatura di più grande 10 kDa dextran e una combinazione di 3 e 10 kDa dextran. (A) Immagine confocale delle cellule ciliate ai livelli delle cellule ciliari (in alto) e stereocilia (in basso) incubate con 10 kDa dextran-TR. Il segnale di fluorescenza dextran è mostrato in magenta fuso con F-actin in verde e in modo indipendente in scala di grigi. Un paio di IHC sono mostrati con maggiore ingrandimento all'insetto per apprezzare l'etichettatura superficiale della stereocilia osservata con il 10 kDa dextran-TR. Barra di scala - 5 mm. (B) Immagine confocale delle cellule ciliate incubate con 10 kDa dextran-FITC rappresentati come in A. (C) Immagine confocale delle cellule ciliate al corpo delle cellule di capelli (in alto) e stereocilia (in basso) livelli incubati contemporaneamente con 3 kDa dextran-TR e 10 kDa dextran-FITC e immagini con canali indipendenti e raffigurate separatamente in grigio. Nel pannello di destra, F-actin (blu), 10 kDa dextran-FITC (verde) e 3 kDa dextran-TR (magenta) sono mostrati insieme insieme a phalloidin (blu). Barra di scala: 20 mm, e il modello vescino di assorbimento è indicato con frecce gialle. Questa cifra è stata modificata a partire da27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: I canali MET funzionali sono necessari per l'assorbimento di 3 kDa dextran-TR. Rappresentativo immagini confocali di cellule ciliate a livello stereocilia (A) o corpo cellulare (B) dopo l'incubazione con 3 kDa dextran-TR in assenza (controllo) o presenza di BAPTA o il canale bloccanti MET amiloride e neomicina. 3 kDa dextran-TR fluorescenza è mostrato in magenta. Il tessuto è stato contrastato con falange per etichettare F-actin per la visualizzazione della stereocilia delle cellule dei capelli e dei confini (verde). Le frecce bianche indicano strutture simili a vescicle. Sono indicate le tre file di cellule ciliate esterne (OHC) e una riga di cellule ciliate interne (IHC), barra della scala - 20 mm. Questa cifra è stata modificata a partire da27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive come eseguire esperimenti di assorbimento nell'organo murno degli esoti di Corti con 3 kDa dextran Texas Red. L'obiettivo di questo metodo è quello di verificare se le molecole più grandi di altre precedentemente testate sono state anche in grado di etichettare specificamente le cellule ciliate uditive e permeare attraverso il canale MET. Protocolli sperimentali simili sono stati precedentemente utilizzati per valutare la permeabilità delle cellule ciliate ad altri coloranti fluorescenti come FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 e Texas Red-labeled aminoglycosides (1.29–1.43 kDa)13,52. Il tempo necessario per etichettare le cellule ciliate utilizzando queste molecole fluorescenti varia a seconda delle loro dimensioni. L'etichettatura massima richiede alcuni minuti per FM1-4313,53, 30-60 min per gli amminoglisti con etichetta Texas Red13e 1,5 h per Texas Red etichettato 3 kDa dextran. Così, lunghi tempi di incubazione sono cruciali per questo esperimento come abbiamo visto solo minima etichettatura del corpo delle cellule ciliate a tempi di incubazione brevi (Figura 2C). Abbiamo scelto di studiare i topi P6 per questi esperimenti perché, a questa età, la maggior parte delle cellule ciliate apicali e basali trasportano correnti di trasduzione ed esprimono proteine TMC1 e TMC212,18,54,55. Dovrebbe essere possibile studiare gli animali più giovani in quanto le correnti MET sono presenti prima della P6, in particolare vicino alla base della coclea12. Studiare gli animali più anziani può essere più difficile perché la dissezione della coclea ossea diventa più difficile man mano che questa struttura continua ad ossificare56.
In questo protocollo sono previsti diversi passaggi critici. Il più importante è il successo dissezione e preparazione dell'organo del tessuto Corti(Figura 1). La delicata struttura dell'organo di Corti e l'incapsulamento nella coclea ostratta rappresentano una sfida per l'analisi istologica e biochimica. Diversi protocolli dettagliati per la dissezione di successo di questo tessuto sono stati precedentemente pubblicati in questa rivista56,57,58 e altri59. L'interruzione della giunzione cellulare-cellula e la perdita dell'integrità dell'epitelio sensoriale uditivo possono portare all'assorbimento di dextran fino a 40 kDa e all'etichettatura delle cellule colpite39,40. In accordo con questo, abbiamo osservato l'etichettatura non specifica delle cellule ciliate e delle cellule di supporto circostanti quando il tessuto è stato involontariamente danneggiato con le pinze durante la dissezione prima dell'incubazione di dextran (Figura 2B e Figura 3B). Non ci sono trucchi o linee guida per raggiungere la competenza a sezionare un organo intatto di Corti diverso dalla pratica e pazienza. Tuttavia, la presenza di 1-2 mM Ca2 o durante gli esperimenti di dissezione dei tessuti e assorbimento è fondamentale per mantenere l'integrità del collegamento a punta che trasmette la forza meccanica al canale MET e quindi preservare la funzione del canale MET. Una volta che il tessuto è fissato con il 4% di PFA, la presenza di calcio nel buffer o nei supporti diventa banale.
Uno dei limiti di questo studio risiede nella natura eterogenea delle molecole di dextran. Il dextran elaborato dai batteri Leuconostoc è un polimero di anhydroglucose composto da circa il 95% di xalfa-(1–6) d-linkages (Figura 2A). I collegamenti rimanenti tengono conto della ramificazione del dextran, che è correlato alla sua lunghezza, quindi i dextran di peso molecolare inferiore sono più simili a aste e hanno una distribuzione di dimensioni più strette, mentre i dextrans più grandi sonopolidispersioni 60. Pertanto, il peso molecolare effettivo delle molecole in ogni preparazione del dextran 3 kDa varia da 1,5 a 3,0 kDa, compresa la molecola fluorescente61. Inoltre, il dextran fluorescente si differenzia per il numero di molecole rosse del Texas attaccate al dextran (grado di etichettatura). Si consiglia di utilizzare dextran con un grado di etichettatura di almeno 0,4 poiché un grado inferiore di etichettatura ostacolerà la capacità di rilevare il dextran fluorescente dalla microscopia. Il tinrito fluorescente accoppiato al dextran e i residui di lisina nelle versioni fissabili, determinerà la carica complessiva del dextran. Questa è una considerazione importante poiché la selettività cationica del canale MET sarebbe preferibilmente uptake cationic dextran27. Infine, è necessario un dextran risolvibile alla lisina per raggiungere la risoluzione visualizzata in questi esperimenti. Un dextran non fissabile continuerà a diffondersi nel tessuto ostacolando la sua localizzazione e visualizzazione accurate.
Il microscopio confocale LSM 880 dotato di un rilevatore Airyscan utilizzato per l'immagine dell'organo di campioni Corti ci ha fornito una risoluzione doppia e un migliore rapporto segnale-rumore (SNR) rispetto a un microscopio confocale convenzionale62. Pertanto, questo microscopio ci ha permesso non solo di osservare il robusto accumulo di dextran nel corpo cellulare, ma anche di individuare l'accumulo del dextran alle punte stereocilia e il modello vescino-like al corpo cellulare. Un microscopio confocale convenzionale consentirebbe la visualizzazione e la quantificazione dell'accumulo di dextrana fluorescente nel corpo cellulare, ma sarebbe difficile distinguere le tre file di stereocilia e la localizzazione precisa del dextran alle punte delle file stereocilia più brevi. Una risoluzione simile a quella raggiunta con l'LSM 880 Airyscan confocal potrebbe essere raggiunta utilizzando un microscopio confocale convenzionale con sovracampionamento e deconvoluzione, anche se la SNR sarebbe inferiore a quella raggiunta con il rivelatore Airyscan.
Oltre all'uso di 3 kDa dextran-TR per testare i canali MET funzionali, questo protocollo potrebbe essere ulteriormente utilizzato per studiare i processi endocitici nelle cellule ciliate poiché tutti i dextrans testati rivelano un pattern vesicle-simile all'intracellulare simile all'endocitosi. Questo processo non è stato al centro del nostro lavoro, e sarebbero stati necessari ulteriori studi per caratterizzare pienamente questo fenomeno.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Vincent Schram del nucleo di microscopia e imaging NICHD per aver aiutato nell'acquisizione di immagini confocali, e Tsg-Hui Chang per un aiuto inestimabile con la gestione delle cozioni e la cura dei topi. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale del NINDS, NIH, Bethesda, MD, a K.J.S. A.B. è stata supportata dal Programma di Ricerca Intramurale del NINDS, NIH, e da una Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship del programma di ricerca intramurale del NIDCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
| C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
| Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
| Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
| Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
| Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
| Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
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