Summary
Здесь мы представляем метод визуализации поглощения 3 kDa Техас Красная маркировка dextran в слуховых волосяных клеток с функциональными каналами механотрансдукции. Кроме того, декстран т 3-10 кДа может быть использован для изучения эндоцитоза волос и поддерживающих клеток органа Корти.
Abstract
Канал механотрансдукции волосковых клеток (MET) играет важную роль в слухе. Тем не менее, молекулярная идентичность и структурная информация MET остаются неизвестными. Электрофизиологические исследования волосковых клеток показали, что канал MET имеет большую проводимость и проницаем к относительно большим флуоресцентным катионным молекулам, включая некоторые красители из стирила и техасские антибиотики аминогликозид. В этом протоколе мы описываем метод визуализации и оценки поглощения флуоресцентного декстранта в волосяных клетках органа корти-эксрастенив, которые могут быть использованы для оценки функциональных каналов MET. Мы обнаружили, что 3 kDa Техас Красная маркировка dextran специально этикетки функциональных слуховых волосяных клеток после 1-2 ч инкубации. В частности, 3 kDa dextran маркирует два коротких стереоционных ряда и накапливается в клеточном теле в диффузном рисунке при появке функциональных каналов MET. Дополнительная везикум-подобная картина маркировки наблюдалась в клеточном теле волосковых клеток и окружающих поддерживающих клеток. Наши данные показывают, что 3 kDa Техас-Красный dextran может быть использован для визуализации и изучения двух путей для клеточного поглощения красителя; волосяных клеток конкретных входных маршрутов через функциональные каналы MET и эндоцитоза, шаблон также доступны для больших dextran.
Introduction
Волосковые клетки внутреннего уха являются сенсорными клетками, которые обнаруживают звук и скрытые механически стимулы в электрических сигналах, которые в конечном счете интерпретируются нашим мозгом. Эти клетки имеют лестницу формы пучок из трех рядов actin основе нити, известный как стереосциты, которые выступают из их apical области1,2. Механические стимулы отклонять стереоцильные нити к длинному ряду и вызвать открытие механотрансдукции (MET) каналов3. Открытие каналов MET приводит к притоку катионов, которые деполяризуют клетку и, следовательно, сигнализирует о высвобождении синепсных пузырьков в базальной области волосяной клетки.
Биофизические свойства канала MET, необходимые для слуха, были широко охарактеризованы. Среди других свойств, эти каналы катионные селективного и имеют относительно большую проводимость (150-300 рС в низких Ca2 "4,5,6,7,8,9,10. Примечательно, что большие флуоресцентные молекулы, такие как FM1-43 и Техас Красной маркировкой аминогликозиды являются permeant блокаторы канала MET, в результате чего их накопление в теле волосяных клеток, которые могут быть визуализированы с помощью флуоресценции микроскопии11,12,13,14. И наоборот, молекулярная идентичность и структура канала МЕТ и его проницаемый путь остаются неуловимыми. Все больше экспериментальных данных указывает на то, что трансмембранно-подобный канал белка 1 (TMC1) является компонентом канала MET в зрелых волосковых клетках15,16,17,18,19. Мутации в трансмемембранном канале 1 (TMC1) изменяют свойства канала MET19,20,21,22 и вызывают глухоту. Кроме того, TMC1 локализуется на сайте канала MET18,23 и взаимодействует с наконечником-ссылкой, ответственной за передачу механической силы на канал MET24,25. Кроме того, недавний анализ биоинформатики определил белки TMC как эволюционные, связанные с механочувствительными каналами TMEM63/OSCA белков и TMEM16 белков, семейство кальциевых каналов хлорида и липидных скремблазов26,27,28. Структурная модель TMC1, основанная на взаимосвязи между этими белками, выявила наличие большой полости при белково-липидном интерфейсе27. Эта полость гавани две мутации TMC1, которые вызывают аутосомно-доминантной потери слуха (DFNA36)27,29,30,31,32, и селективной модификации цистеина мутантов для остатков в полости изменить СВОЙСТВА канала МЕТ28, указывая, что он может функционировать как пермяцкий путь канала MET. Большой размер этой предсказанной полости в белках TMC может объяснить способность больших молекул проникать в канал MET. Чтобы проверить предсказание о том, что канал MET содержит необычайно большой проницательный путь и раздвинуть пределы размера полости, наблюдаемые в TMC1, мы разработали протокол для проведения экспериментов по поглощению в органе Эксплансов Корти с более крупной молекулой, 3 kDa dextran флуоресцентно помечены Техас Красный.
Dextran представляет собой сложный разветвленный полисахарид, состоящий из многих молекул D-глюкозы, связанных альфа-1,6 гликозидными связями. Его высокая растворимость в воде, низкая токсичность клеток и биоинертность делают его универсальным инструментом для изучения нескольких клеточных процессов. Кроме того, dextran доступен в широком диапазоне размеров и флуоресцентно помечены флюорофорами нескольких цветов. Флуоресцентно помечены dextrans обычно используются в клетках и ткани проницаемости исследований33,34, для изучения эндоцитоза в нескольких клеточных систем35,36, и для нервной трассировки37,38. В слуховой области, dextran молекулы также были использованы для оценки нарушения клеточного соединения и потери слуховой сенсорной целостности эпителия после воздействия интенсивного шума в органе шиншиллы Корти39,40.
В этой работе мы использовали свойства некоторых из самых маленьких (3 и 10 kDa) флуоресцентных dextrans для выполнения экспериментов поглощения в мурин внутренних волосковых клеток уха и изучить размер проницательного пути внутреннего уха волос ячеек MET канала. Кроме того, мы использовали лазерный сканирование конфокального микроскопа (LSM) 880, оснащенного детектором Airyscan для визуализации и локализации флуоресцентного декесцентного декесцентного на стереосилиях и клеточном теле слуховых волосковых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными и экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных, которые были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Национального института неврологических расстройств и инсульта (#1336 протокола животных в KJS).
1. Мыши
- Установите пару племенных пар Дикого типа C57BL/6J для размножения на животном объекте, чтобы контролировать дату рождения пометов и следить за возрастом щенков.
2. Рассечение лахли
- Установите чистое пространство рядом со стереомикроскопом для выполнения вскрытий(рисунок 1А). Используйте 70% этанола для очистки пространства и окружения и место чистой скамейке площадку. Медицинские патологические отходы (MPW) полиэтиленовый пакет будет необходимо отказаться от туш животных.
- Приготовьте несколько 35-мм посуды с помощью l15-носителей Leibovitz.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лейбовиц L-15 клеточные носители содержит 1-2 мМ Ca2 ",который необходим для поддержания целостности наконечник-ссылки, и содержит незаменимые аминокислоты, витамины и пируват натрия для улучшения здоровья клеток и выживания. Сыворотка была исключена, чтобы избежать экспериментальной изменчивости из-за ее плохо определенного состава и потенциального вмешательства в декстран. - Эвтаназия послеродового дня-6 (P6) мышей путем обезглавливания.
ПРИМЕЧАНИЕ: 6-дневные мыши несколько устойчивы к ингаляционным анестетике. Хотя изофлуран или длительное воздействие CO2 (до 50 мин) может быть использовано для эвтаназии, вторичный физический метод рекомендуется для обеспечения смерти. - Используйте хирургические ножницы, чтобы удалить кожу черепа, сделав поверхностный разрез от передней части к задней части и через внешние слуховые каналы.
- Сложите кожу к носу, чтобы разоблачить череп(Рисунок 2B).
- Сделайте разрез со спины к передней части черепа и через линию глаз(рисунок 2B-C).
- Разделите череп на две половинки и удалите мозг с помощью небольшого шпателя, чтобы разоблачить височные кости(рисунок 2C-D).
- С небольшими ножницами, вырезать вокруг височных костей, и акциз ткани.
- Поместите обе височные кости в 35-мм тарелку и убедитесь, что они покрыты L15 СМИ(Рисунок 2E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются под стереомикроскопом. Черный фон обычно помогает визуализировать ткани во время тонкого вскрытия шагов. - Под стереомикроскоп оснащен широкоугольным окуляром (мощность юга 10X (WF10X) и внешним переменным током (AC) галогенным источником света), удалите окружающую ткань улитки, полукруглые каналы и вестибулярные органы с хирургическими щипчинками(рисунок 2F).
- Чтобы позволить средствам диспреда и L15 войти в кохлеарный проток, выполните два прокола на расчлененных уликах, один на круглом окне, а другой в апикальной кохлеарной области.
- Добавьте 300 мл L15 носителей Leibovitz в каждом колодце из 9-колодца стеклянной пластины депрессии.
- Поместите по крайней мере три вскрытых улик на каждом колодце.
3. Dextran маркировки
- Восстановите декектин в сбалансированном солейном растворе Хэнкса без Ca2 и Mg 2 (HBSS-CFM) при конечной концентрации 10 мг/мл. Это стоковое решение должно быть опосредовано в непрозрачных черных трубках (защищенных от света) и храниться при -30 градусов до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование лизин-фиксируемых dextran имеет решающее значение для успешного результата этого протокола. - Подготовьте каждый экстран при конечной концентрации 2 мг/мл в 500 мл L L15 носителей Лейбовица.
- Удалите средства массовой информации из улички и добавьте L15 lebovitz средств массовой информации, содержащие dextran интереса в окончательной концентрации 2 мг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя часть каналов MET открыты в покое41,42, деквенин инкубации была выполнена с нежной встряхивания explants увеличить открытую вероятность канала MET. - Инкубировать при комнатной температуре 2 ч с нежной тряской (25 об/мин) с помощью трехмерного шейкера с наклонным углом 25 градусов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентно помечены dextran должны быть защищены от света, когда это возможно. Для защиты декеспна во время инкубации 2 ч поместите 9-ну хорошую стеклянную тарелку внутри тарелки p150 клеточной культуры, завернутой в алюминиевую фольгу.
4. Подготовка образца для визуализации
- После инкубации с декекном, мыть ткани в течение 2 минут дважды со средствами массовой информации и один раз с HBSS.
- Инкубировать ткани при комнатной температуре в течение 30 мин с 4% параформальдегида в цидерное солевой раствор Хэнкса (HBSS).
ВНИМАНИЕ: Воздействие формальдегида может раздражать глаза, нос и верхние дыхательные пути. У некоторых людей, повторное воздействие кожи на формальдегид может вызвать сенсибилизацию, которая может привести к аллергическому дерматиту. Формальдегид является известным канцерогеном человека и предполагаемой репродуктивной опасности. - Быстро и осторожно мыть фиксированной ткани дважды с HBSS для удаления параформальдегида.
ПРИМЕЧАНИЕ: Декальциация височных костей не требуется на этом этапе развития улиты. - Удалите спиральную связку и текториальную мембрану с тонкими щипцы мигами наконечника, чтобы вскрыть орган Корти(Рисунок 2G).
- Удалите все мелкие кусочки ткани и промыть ткань hBSS.
- Пермяки ткани в 0,5% Triton X-100 в PBS, содержащий флуоресцентно-маркированный фаллоидный (конъюгированный зеленый или красный при тестировании поглощения TR- или FITC-маркированный декрон, соответственно) в 1:200 разбавления в течение 30 мин для обозначения F-актина и визуализации actin основе стереоцитов.
- Вымойте ткань 2-3 раза в течение 2 мин каждый раз с буфером HBSS, чтобы удалить избыток тритона и фаллоидина, и один раз с PBS, чтобы удалить соли.
- Смонтировать орган тканей Корти на слайд микроскопа и покрыть его монтажом средств массовой информации.
ПРИМЕЧАНИЕ: При монтаже ткани, убедитесь, что сторона ткани, содержащей стереоциты волосяных клеток сталкивается с крышкой. - Удалите любые потенциальные пузырьки, генерируемые во время добавления монтажных носителей и предотвратите генерацию новых пузырьков во время размещения крышки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аспир с пипеткой любой пузырь, генерируемый во время добавления монтажа носителя. Для предотвращения пузырьков воздуха от ловушки под крышкой, место края coverslip близко к образцу и тщательно и медленно опустите coverslip над тканью с помощью щипцы или пипетка отзыв. - Обложка ткани в монтаже средств массовой информации со стеклянным крышкой(Рисунок 2H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Цели с числовой диафрагмой выше 0,4 предназначены для использования #1,5 крышки (0,17 мм толщиной). Использование неправильного покрытия может иметь серьезные последствия для интенсивности и качества изображений. - Инкубировать установленную ткань на ночь при комнатной температуре, чтобы монтаж ные сушки и хранить слайды при температуре 4 градусов по Цельсию до изображения.
5. Приобретение изображений и обработка изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальные изображения были сделаны с помощью конфокального микроскопа LSM 880, оснащенного 32-канальным детектором Airyscan в режиме супер-разрешения (SR)43 и 63x.
- Добавить небольшую каплю масла погружения на цель.
- Поместите слайд микроскопа, содержащий установленный образец ткани в стадии микроскопа со стеклянным крышкой перед маслом погружения.
- Сосредоточьтесь на образце и установите параметры изображения с помощью программного обеспечения для приобретения изображений.
- Используйте идентичные настройки приобретения изображений и оптимальные параметры для разрешения x, y и z для каждого независимого эксперимента. Пьезо-управляемая система фокусировки необходима для быстрого и точного перемещения цели при приобретении z-стек изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изображения всей апкальной области волосковых клеток, собирать z-стек изображений из стереоцити до актической половины тела волосяных клеток, используя оптимальные настройки. Очень важно собрать большой z-стек вдоль волосяной клетки, чтобы обеспечить изображение везикулоподобных частиц. - Используйте программное обеспечение для приобретения изображений для обработки необработанных конфокальных изображений с помощью алгоритма 3D-реконструкции Airyscan с автоматическими настройками фильтра деконволюации по умолчанию.
- Откройте конфокальные изображения в программном обеспечении для обработки изображений, чтобы настроить яркость и контрастность, добавить панель масштаба и экспортировать изображения для окончательных цифр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы наблюдали надежную и специфическую маркировку волосковых клеток после 2h инкубации органа Корто высаженных растений из диких типа послеродового дня-6 (P6) мышей с 3 kDa dextran флуоресцентно помечены Техас Красный (dextran-TR) (Рисунок 2A-B). Dextran маркировки наблюдалась как во внутренних и внешних волосковых клеток (IHC и OHC) в базальных, средних и акических областях органа Корти(рисунок 2B).
Флуоресцентно помеченный фаллоидилин был использован для противодействия нитерезного актина (F-актина) и визуализации этин-клеток волосяных клеток стереоцити. Мы также проводили аналогичные эксперименты в более короткие сроки инкубации, и хотя мы наблюдали накопление декек-TR в теле волосяных клеток, сигналы были слабее и более изменчивы, чем на 2 ч инкубации (Рисунок 2C).
Далее мы изображения как стереосционы и клеточные тела волосковых клеток и отметил, что только те клетки, которые включены 3 kDa dextran-TR в их клеточном теле показали флуоресцентные маркировки их стереосилии (Рисунок 3A). Эта связь между стереосцитиями и маркировкой тела клетки отсутствовала в волосковых клетках из поврежденной ткани, которая также представляла неспецифическую маркировку декрен в нескольких типах клеток сенсорного эпителия (желтые квадраты на рисунке 2B, и Рисунок 3B). Важно отметить, что мы наблюдали единый сигнал флуоресценции вдоль стереосцитии с обогащением на кончиках коротких строк стереоцити, где канал MET расположен18,23 (Рисунок 3C). Кроме того, мы заметили везикулоподобные структуры в клеточном теле волосковых клеток и соседних поддерживающих клеток. Везикл-как картина поглощения в этих клетках предполагает, что dextran-TR также может быть рассмотрен эндоцитоз(Рисунок 3C).
Описанный здесь протокол также позволяет изучить поглощение более крупных декстрантора и комбинаций различных декстран. Большой dextran 10 kDa помечены Техас Красный (dextran-TR) или флуоресцейн (dextran-FITC) также производится везикл-подобный узор в клеточном теле волосковых клеток и поддерживающих клеток, в дополнение к накоплению вокруг мембраны волосяных клеток в пятнистой шаблон(Рисунок 4A, B). 10 kDa dextran-TR также поверхностно помечены три стереосции строк всех волосковых клеток(Рисунок 4A, всетр), вероятно, из-за отрицательно заряженной поверхности плазменной мембраны волосяных клеток44,45,46. Затем мы рассмотрели поглощение 3 kDa dextran-TR и 10 kDa dextran-FITC одновременно в органе Explants Corti. Для 3 kDa dextran-TR, мы наблюдали как диффузный и везикл-как шаблон. Тем не менее, 10 kDa dextran-FITC отображается только везикул-подобный узор(рисунок 4C). Эти данные свидетельствуют о том, что поглощение декнен происходит, по крайней мере, двумя различными механизмами, которые зависят от размера декепрона.
Затем мы оценили, были ли функциональные каналы MET необходимы для поглощения 3 kDa dextran-TR. Для этого мы протестировали dextran включение в волосковые клетки из органа Corti explants в присутствии блокаторов каналов MET (неомицин и амилорид)13,14,47 или Ca 2" chelator BAPTA, который отменяет метки, нарушая кончик ссылки и предотвращения gating канала25,48,49. В этих экспериментах ткани экскубаций ранее инкубировали в течение 30 мин с неомицином (500 мМ), амилоридом (150 мМ), или с BAPTA (5мМ) до добавления 3 kDa dextran-TR в присутствии соответствующего блокатора MET. Присутствие BAPTA или блокаторы канала MET предотвратить стереосцитов маркировки(Рисунок 5A) и поглощение 3 kDa dextran-TR в волосяных клетках(Рисунок 5B). Тем не менее, блокада канала MET сохранила везикулообразную модель(рисунок 5B),указывая, что эта модель поглощения не зависит от функциональных каналов MET. Аналогичные результаты наблюдались в волосковых клетках от TMC1/TMC2 двойных нокаут мышей, которым не хватает MET27. Интригующе, эти везикул-подобные структуры не были наблюдаемы в присутствии амилорида, который, как известно, подавляетНа-H-Hобменный и тем самым подавлять эндоцитоз50,51. Эти результаты показывают, что 3kDa dextran-TR входит в волосковые клетки через два разных пути, один общий для больших dextrans с участием везикул-подобных структур, а другой, который зависит от функциональных каналов MET.
Рисунок 1: Шаги вскрытия руинового органа Корти. (A) Чистая область и материалы, необходимые для вскрытия. (B) Разоблаченный череп мыши. Оспоросты держат кожу, которая сложилась к носу. Черные линии указывают на два разреза, которые необходимы для удаления мозга. (C)Incised и открыл черепа, чтобы для удаления мозга с помощью шпателя (справа). (D) Кран и височные кости после удаления мозга. (E) Вырезанный череп, в ключая височные кости (разбитые черные квадраты) в пластине P35, покрытой средствами массовой информации. (F) Акцизные улички. (G) Два расчлененных органов Корти на колодце стеклянной пластины депрессии. (H) Конный образец на стеклянном крышке готов к визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Волосяные клетки поглощение 3 kDa dextran-TR. (A) Схематическое представление Техас красно-маркированного dextran (dextran-TR), содержащего шесть молекул глюкозы, соответствующие молекулярного веса 1,08 кДа. Реакция секвинимидилового эфира связывает молекулу Texas Red (magenta) с мономером глюкозы. (B) Представитель confocal изображение, показывающее конкретные маркировки сенсорных волосковых клеток (HC) с 3 kDa dextran-TR через весь орган Корти от 6-дневной мыши. Обозначены базальные (BA), средние (MD) и атические (AP) области органа. В желтых квадратах указываются поврежденные ткани области. (C) 3 kDa dextran-TR флуоресценции после 30, 60, 90, или 120 мин инкубации с органом Корти explants показано в пурпурный слитый с F-actin в зеленом цвете (верхние изображения) и независимо в greyscale (нижние изображения). Диапазон отображения изображения был линейно отрегулирован в каждом из серых изображений независимо для визуализации 3 kDa dextran-TR флуоресценции. Шкала бар 20 мм. Эта цифра была изменена с27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Тело клетки волос и маркировка стереоцитов с 3 kDa dextran-TR. (A) Конфокальные изображения, отображающие 3 kDa dextran-TR флуоресценции (magenta) на клеточном теле и стереосцитов противопоказаны фаллоидина для обозначения F-актина (зеленый) для визуализации границ клеток волос и стереоцитов. Показаны три ряда наружных волосковых клеток (OHC) и один ряд внутренних волосковых клеток (IHC). Шкала бар 20 мм. (B) Confocal изображения поврежденной области ткани отображения 3 kDa dextran-TR флуоресценции (магента) на клеточном теле и стереосцитов. Желтые стрелки указывают на маркировку несенсорных поддерживающих клеток. Шкала бар 20 мм. (C) Ближе зрения 3 kDa dextran-TR флуоресценции на клеточном теле и стереосции наружных волосковых клеток (OHC, сверху) и внутренних волосковых клеток (IHC, дно). Шкала бар 5 мм. Эта цифра была изменена с27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Маркировка больше 10 kDa dextran и сочетание 3 и 10 kDa dextran. (A) Конфокальный образ волосковых клеток на теле волосяных клеток (вверху) и стереосцитов (внизу) уровнях инкубируется с 10 kDa dextran-TR. Сигнал декреновой флуоресценции показан в пурпурном, слитом с F-актином в зеленом цвете и независимо в сером масштабе. Пара IHC показаны на более высоком увеличении в входе, чтобы оценить поверхностную маркировку стереоцитов наблюдается с 10 kDa dextran-TR. Шкала бар 5 мм. (B) Confocal изображение волосковых клеток инкубируется с 10 kDa dextran-FITC представлены как в A. (C) Конфокальный образ волосковых клеток на волосковом теле (вверху) и стереосцитов (внизу) уровни инкубируются одновременно с 3 kDa dextran-TR и 10 kDa dextran-FITC изображения отдельно. В правой панели, F-актин (синий), 10 kDa dextran-FITC (зеленый), и 3 kDa dextran-TR (magenta) показаны вместе с фаллоидином (синим). Шкала бар 20 мм, и везикул-подобный узор поглощения указывается желтыми стрелками. Эта цифра была изменена с27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Функциональные каналы MET необходимы для поглощения 3 kDa dextran-TR. Представитель confocal изображения волосковых клеток на стереосцитии (A) или клеточного тела (B) уровне после инкубации с 3 kDa dextran-TR в отсутствие (контроль) или наличие BAPTA или блокаторы канала MET амилорид и неомицин. 3 kDa dextran-TR флуоресценция показана в пурпурном. Ткань была противопоставлена фаллоидина для обозначения F-актина для визуализации стереоцитов волосковых клеток и границ (зеленый). Белые стрелки указывают на везикулоподобные структуры. Три ряда наружных волосковых клеток (OHC) и один ряд внутренних волосковых клеток (IHC) указаны, шкала бар 20 мм. Эта цифра была изменена с27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает, как выполнять эксперименты поглощения в мурин органа Корти explants с 3 kDa dextran Texas Red. Цель этого метода состоит в том, чтобы проверить, были ли молекулы больше, чем другие ранее протестированные, также способными специально маркировать слуховые волосковые клетки и проникать через канал MET. Аналогичные экспериментальные протоколы ранее использовались для оценки проницаемости волосковых клеток к другим флуоресцентным красителям, таким как FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 и Техас красно-маркированные аминогликозиды (1.29-1.43 kDa)13,52. Время, необходимое для маркировки волосковых клеток с помощью этих флуоресцентных молекул варьируется в зависимости от их размера. Максимальная маркировка требует нескольких минут для FM1-4313,53, 30-60 мин для Техаса Красная маркировка aminoglycosides13, и 1,5 ч для Техаса Красная этикетка 3 kDa dextran. Таким образом, долгое время инкубации имеют решающее значение для этого эксперимента, как мы видели только минимальное обозначение тела волосяных клеток в короткие сроки инкубации (Рисунок 2C). Мы решили изучить P6 мышей для этих экспериментов, потому что, в этом возрасте, большинство apical и базальных волосковых клеток нести трансдукционные токи и выразить как TMC1 и TMC2 белков12,18,54,55. Следует иметь возможность изучать молодых животных, как MET токи присутствуют раньше, чем P6, в частности, вблизи основания улиты12. Изучение пожилых животных может быть более сложным, потому что вскрытие костной улики становится все труднее, как эта структура продолжает ossify56.
В этом протоколе есть несколько важных шагов. Наиболее важным из них является успешное вскрытие и подготовка органа ткани Корти(рисунок 1). Тонкая структура органа Корти и корпус в костной улике представляет собой проблему для гистологического и биохимического анализа. Несколько подробных протоколов для успешного вскрытия этой ткани были ранее опубликованы в этом журнале56,57,58 и другие59. Нарушение клеточного соединения и потеря зрительной сенсорной целостности эпителия может привести к поглощению декекта на срок до 40 кДа и маркировке пораженных клеток39,40. В согласии с этим, мы наблюдали неспецифическую маркировку волосковых клеток и окружающих поддерживающих клеток, когда ткань была непреднамеренно повреждена щипцы во время вскрытия перед dextran инкубации (Рисунок 2B и Рисунок 3B). Есть никаких трюков или руководящих принципов для достижения мастерства при вскрытии нетронутыми орган Корти, кроме практики и терпения. Тем не менее, наличие 1-2 мМ Ca2 "во время вскрытия тканей и поглощения экспериментов имеет решающее значение для поддержания целостности наконечник-ссылка, которая передает механическую силу на канал MET и тем самым сохранить функцию канала MET. После того, как ткань фиксируется с 4% PFA, наличие кальция в буфере или носителя становится тривиальным.
Одно из ограничений этого исследования заключается в неоднородной природе молекул декепромов. Декексн, разработанный бактериями Leuconostoc, представляет собой полимер ангидроглюкозы, состоящий примерно из 95% альфа-(1-6) D-связей(рисунок 2А). Остальные связи приходится на ветвление декстран, который коррелирует с его длиной, так dextran более низкого молекулярного веса более стержня, как и имеют более узкое распределение размера в то время как большие dextrans полидисперсис60. Таким образом, фактический молекулярный вес молекул в каждом препарате 3 kDa dextran колеблется от 1,5 до 3,0 kDa, в ключая флуоресцентную молекулу61. Кроме того, флуоресцентно помеченный dextran отличается количеством молекул Texas Red, прикрепленных к dextran (степень маркировки). Целесообразно использовать dextran с степенью маркировки по крайней мере 0.4 в виду того что более низкая степень маркировки будет препятствовать способности обнаружить флуоресцентно обозначенный dextran микроскопией. Флуоресцентный краситель в сочетании с декесцентом и остатками лизин в поправимых версиях, будет определять общий заряд декремонта. Это важное соображение, поскольку катионная избирательность канала MET предпочтительно поглощение катионный dextran27. Наконец, лизин-фиксируемый декектин необходим для достижения разрешения, отображаемого в этих экспериментах. Непоправимый декстран будет продолжать распространяться в ткани, препятствуя его точной локализации и визуализации.
Конфокальный микроскоп LSM 880, оснащенный детектором Airyscan, используемым для изображения органа образцов Корти, предоставил нам в два раза больше разрешения, и лучшее соотношение сигнала к шуму (SNR) по сравнению с обычным конфоковым микроскопом62. Таким образом, этот микроскоп позволил нам не только наблюдать надежное накопление декекна в клеточном теле, но и определить накопление декстран на кончиках стереоцитов и визикулоподобном узоре в клеточном теле. Обычный конфокальный микроскоп позволил бы визуализировать и количественно ездовые накопления флуоресцентного декесцента в клеточном теле, но было бы трудно различить три ряда стереоцитов и точную локализацию декеспна на кончиках более коротких стереоционных рядов. Аналогичное разрешение, достигнутое с LSM 880 Airyscan confocal может быть достигнуто с помощью обычного конфокального микроскопа с перевыборой и деконволюцией, хотя SNR будет ниже, чем тот, достигнутый с детектором Airyscan.
В дополнение к использованию 3 kDa dextran-TR для проверки функциональных каналов MET, этот протокол может быть дополнительно использован для изучения эндоцитарных процессов в волосяных клетках, так как все dextrans испытания выявить внутриклеточные везикулы, как картина, напоминающая эндоцитоз. Этот процесс не был в центре нашей работы, и для полной характеристики этого явления потребуются дополнительные исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Винсента Шрама (Vincent Schram) из nicHD микроскопии и ядра изображений за помощь в приобретении конфокальных изображений, а Tsg-Hui Chang за неоценимую помощь в управлении колониями и по уходу за мышами. Это исследование было поддержано Intramural исследовательской программы NINDS, NIH, Bethesda, MD, к K.J.S. A.B. была поддержана Программа интрамуральных исследований NINDS, NIH, и Роберт Wenthold Postdoctoral стипендию от программы интрамуральных исследований NIDCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
| C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
| Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
| Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
| Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
| Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
| Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
- Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
- Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
- Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
- Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
- Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
- Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
- Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
- Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
- Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
- Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
- Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
- Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
- Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
- Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
- Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
- Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
- Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
- Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
- Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
- Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
- Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
- Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
- Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
- Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
- Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
- Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
- Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
- Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
- Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
- Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
- Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
- Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
- Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
- Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
- Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
- Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
- Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
- Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
- Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
- Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
- Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
- Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
