Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Published: February 5, 2020 doi: 10.3791/60774
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

Hier presenteren we een protocol om eiwitmonomeer te vervoegen door enzymen die eiwitpolymeer vormen met een gecontroleerde sequentie en het op het oppervlak immobiliseren voor spectroscopiestudies met één molecuul.

Abstract

Chemische en bio-vervoegingstechnieken zijn de laatste jaren snel ontwikkeld en maken het mogelijk om eiwitpolymeren op te bouwen. Echter, een gecontroleerd eiwit polymerisatie proces is altijd een uitdaging. Hier hebben we een enzymatische methodologie ontwikkeld voor het stapsgewijs construeren van gepolymeriseerde eiwitten in een rationeel gecontroleerde sequentie. Bij deze methode is het C-eindpunt van een eiwitmonomeer NGL voor eiwitvervoeging met oaaep1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1), terwijl het N-terminus een cleavable TEV (tabaksetch virus) decolletésite plus een L (ENLYFQ/GL) voor tijdelijke N-terminal bescherming was. Bijgevolg kon OaAEP1 slechts één eiwitmonomeer tegelijk toevoegen, waarna de TEV protease het N-terminus tussen Q en G afhakte om de NH2-Gly-Leu bloot te leggen. Dan is het apparaat klaar voor de volgende OaAEP1 ligatie. Het gemanipuleerde polyproteïne wordt onderzocht door het ontvouwen van individueel eiwitdomein met behulp van atomaire kracht microscopie-gebaseerde single-molecule kracht spectroscopie (AFM-SMFS). Daarom biedt deze studie een nuttige strategie voor polyproteïnetechniek en immobilisatie.

Introduction

Vergeleken met synthetische polymeren hebben natuurlijke multi-domein eiwitten een uniforme structuur met een goed gecontroleerd aantal en type subdomeinen1. Deze functie leidt meestal tot een verbeterde biologische functie en stabiliteit2,3. Veel benaderingen, zoals cysteïnegebaseerde disulfide bindingkoppeling en recombinante DNA-technologie, zijn ontwikkeld voor het bouwen van een dergelijk gepolymeriseerd eiwit met meerdere domeinen4,5,6,7. Echter, de voormalige methode resulteert altijd in een willekeurige en ongecontroleerde sequentie, en de laatste leidt tot andere problemen, met inbegrip van de moeilijkheid voor de overexpressie van giftige en grote eiwitten en de zuivering van complexe eiwitten met cofactor en andere delicate enzymen.

Om deze uitdaging aan te gaan, ontwikkelen we een enzymatische methode die eiwitmonomeer samenvoegt voor polymeer/polyproteïne op een stapsgewijze manier met behulp van een eiwitligase OaAEP1 gecombineerd met een protease TEV8,9. OaAEP1 is een strikte en efficiënte endopeptidase. Twee eiwitten kunnen in minder dan 30 min als Asn-Gly-Leu-sequentie (NGL) door twee termini van OaAEP1 in minder dan 30 min worden gekoppeld als het N-terminus gly-leuresiduen (GL) en de andere daarvan NGL-residuen10. Het gebruik van OaAEP1 leidt echter alleen om eiwitmonomeer te koppelen tot een eiwitpolymeer met een ongecontroleerde sequentie zoals de op cysteïne gebaseerde koppelingsmethode. Daarom ontwerpen we het N-eindpunt van de eiwiteenheid met een verwijderbare TEV protease site plus een leucine residu als ENLYFQ/G-L-POI. Vóór het TEV-decolleté zou de N-terminal niet deelnemen aan OaAEP1 ligatie. En dan worden de GL-resten bij N-terminus, die compatibel zijn met verdere OaAEP1-ligatie, blootgesteld na het TEV-decolleté. Zo hebben we een sequentiële enzymatische biosynthesemethode van poly-eiwit bereikt met een relatief goed gecontroleerde sequentie.

Hier kan onze stapsgewijze enzymatische synthesemethode worden gebruikt in polyproteïnemonsterbereiding, inclusief sequentiegestuurd en ongecontroleerd, en eiwitimmobilisatie voor enkelmolecuulstudies, vooral voor het complexe systeem zoals metalloproteïne.

Bovendien stellen afm-gebaseerde SMFS-experimenten ons in staat om de constructie en stabiliteit van het eiwitpolymeer op het niveau van één molecuul te bevestigen. Single-molecule krachtspectroscopie, met inbegrip van AFM, optische pincet en magnetische pincet, is een algemeen instrument in nanotechnologie om biomolecule mechanisch te manipuleren en hun stabiliteit te meten11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Single-molecule AFM is veel gebruikt in de studie van eiwit (on)vouwen21,22,23,24,25, de sterkte meting van receptor-ligand interactie26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, anorganische chemische binding20,36,37,38,39,40,41,42,43 en metaalligand binding in metalloproteïne44,45,46,47,48,49,50 . Hier wordt single-molecule AFM gebruikt om de gesynthetiseerde polyproteïnesequentie te verifiëren op basis van het bijbehorende eiwitontvouwende signaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eiwitproductie

  1. Genkloon
    1. Aankoopgenen codering voor het eiwit van belang (POI): Ubiquitine, Rubredoxin (RD)51, de cellulose-bindende module (CBM), dockerin-X domein (XDoc) en cohesie van Ruminococcus flavefacience, tabak etch virus (TEV) protease, elastine-achtige polypeptiden (ELP's).
    2. Voer polymerase kettingreactie uit en gebruik drie-beperking spijsverteringsenzymsysteem BamHI-BglII-KpnI voor het recombineren van het gen uit verschillende eiwitfragmenten.
    3. Bevestig alle genen door directe DNA-sequencing.
  2. Expressie en productie van eiwitten
    1. Transformeer E. coli BL21(DE3) met de pQE80L-POI of pET28a-POI plasmid voor expressie.
    2. Kies één kolonie in 15 mL LB-medium met respectievelijke antibiotica (bijvoorbeeld 100 μg/mL ampicillin natriumzout of 50 μg/mL, kanamycine). Blijf de culturen schudden bij 200 tpm bij 37 °C gedurende 16-20 uur.
    3. Verdun de nachtculturen tot 800 mL LB medium (1:50 verdunning). Centrifugeer de cultuur bij 1.800 x gvoor rubredoxine en verwater vervolgens in 15 mL M9 mm ml M9 medium (aangevuld met 0,4% glucose, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4) en verdun deze vervolgens tot 800 mL ML M9 medium.
    4. Incubeer de cultuur bij 37 °C terwijl u trilt bij 200 tpm, totdat de cultuur een optische dichtheid bereikt bij 600 nm (OD600) van 0,6. Bespaar 100 μL monster van de cultuur als de pre-inductie controle voor het testen van eiwitexpressie.
    5. Induceer eiwitexpressie door IPTG toe te voegen aan een eindconcentratie van 1 mM en schud de cultuur bij 37 °C bij 4 uur bij 200 tpm. Reserveer een monster van 100 μL van de cultuur als de post-inductiecontrole voor het testen van eiwitexpressie.
    6. Centrifugeer de cultuur bij 13.000 x g gedurende 25 minuten bij 4 °C en bewaar bij -80 °C voor zuivering.
      LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
  3. Zuivering van eiwit van belang
    1. Resuspend de cellen in 25 mL lysis buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 met DNase, RNase, PMSF) en gebruik een sonicator (15% amplitude) om het lyse voor 30 min op ijs.
    2. Verduidelijken van het cellysaat bij 19.000 x g voor 40 min bij 4 °C.
    3. Pack 1 mL (bedvolume) van Co-NTA of Ni-NTA affiniteit kolom en was de kolom met 10 kolom volumes (CV) van ultrazuiver water en vervolgens 10 CV's van wasbuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazole, pH 7.4) door zwaartekracht stroom.
    4. Geef het eiwit supernatant door de kolom door de zwaartekracht stroom voor drie keer.
    5. Giet wasbuffer op de kolom met 50 cv's om vervuilende eiwitten weg te brengen.
    6. Elute het gebonden eiwit met 3 cv's van ijskoude elutie buffer (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 7.4). Als het gaat om rubredoxine eiwitten, verdere anion uitwisseling zuivering met behulp van anion uitwisseling kolom op pH 8,5 bij 4 °C is noodzakelijk.
    7. Analyseer het voorbeeld op SDS-PAGE.

2. Functionalisering van coverslip en cantilever oppervlak

  1. Gefunctionaliseerde coverslipoppervlakvoorbereiding
    1. Los 20 g kaliumchromaat op in 40 mL ultrazuiver water. Voeg langzaam 360 mL geconcentreerd zwavelzuur toe aan de kaliumchromaatoplossing met glazen staaf roer voorzichtig en bereid het chroomzuur voor.
      LET OP: De chemische stof die hier wordt gebruikt en het uiteindelijke chroomzuur is sterk corrosief en zuur. Werken met de juiste beschermingsmiddelen. De oplossing geeft warmte vrij bij het toevoegen van geconcentreerd zwavelzuur, wat betekent dat u langzaam toevoegt en de juiste pauze voor het afkoelen.
    2. Maak een glazen dekslip 30 m in 30 min schoon en activeer een glazen dekslip bij 80 °C door chromiczuurbehandeling. Dompel de coverslips volledig onder in 1% (v/v) APTES tolueenoplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur en beschermt ze tegen licht.
    3. Was de coverslip met tolueen en absolute ethylalcohol en droog de coverslip met een stroom stikstof.
    4. Incubeer de coverslip bij 80 °C gedurende 15 min en koel af tot kamertemperatuur.
    5. Voeg 200 μL sulfo-SMCC (1 mg/mL) toe aan dimethylsulfoxide (DMSO) oplossing tussen twee geïmmobiliseerde afdekkingen en uitbroed gedurende 1 uur beschermd tegen licht.
    6. Was eerst de coverslip met DMSO en vervolgens met absolute ethylalcohol om restsulfo-SMCC te verwijderen.
    7. Droog de coverslip onder een stroom stikstof.
    8. Pipet 60 μL van 200 μM GL-ELP50nm-C eiwitoplossing op een gefunctionaliseerde coverslip en uitbroeden voor ongeveer 3 uur.
    9. Was de coverslip met ultrazuiver water om de niet-gereageerde GL-ELP50nm-C te verwijderen.
      OPMERKING: Gefunctionaliseerde afdekkingen zijn ongeveer twee weken onder opslag bij 4 °C.
  2. Gefunctionaliseerde cantilever oppervlaktevoorbereiding
    1. Maak de cantilevers 10 min 10 min schoon bij 80 °C door chromisch zuurbehandeling.
    2. Functionaliseer de cantilever door amino-silanisatie met 1% (v/v) APTES tolueenoplossing en bak de cantilever op 80 °C gedurende 15 min voordat u conjugeert tot sulfo-SMCC.
    3. Koppel de C-ELP50nm-NGL gedurende 1,5 uur aan de oppervlakte met de maleimidegroep sulfo-SMCC.
    4. Was de niet-gereageerde C-ELP50nm-NGL op de coverslip weg met ultrazuiver water.
    5. Dompel een gefunctionaliseerde cantilever onder in 200 μL van 50 μM GL-CBM-XDoc eiwitoplossing met 200 nM OaAEP1 bij 25 °C gedurende 20-30 min. Gebruik dan de AFM buffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) om niet gereageerd eiwit weg te spoelen.
      LET OP: De oppervlaktechemie van de cantilevers en de coverslip zijn vergelijkbaar.

3. Stapsgewijs polyproteïnepreparaat met gecontroleerde sequenties

  1. Koppel de ligatie-eenheid Coh-tev-L-POI-NGL aan de GL-ELP50nm geïmmobiliseerd op het coverslipoppervlak door OaAEP1 gedurende 30 min.
  2. Gebruik 15-20 mL AFM buffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) om niet gereageerde eiwitten weg te spoelen.
  3. Voeg 100 μL TEV protease (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] glycerol, pH 8.0) toe om de eiwiteenheid op de TEV-herkenlocatie voor 1 uur bij 25 °C te splijten.
  4. Gebruik 15-20 mL AFM buffer om resteiwitten weg te spoelen.
  5. Koppel de ligatie-eenheid Coh-tev-L-POI-NGL gedurende 30 min aan de GL-Ub-NGL-Glass van OaAEP1.
  6. Herhaal stap 3,3 tot 3,5 N-1 keer om eiwitconstructie GL-(Ub)n-NGL op het glasoppervlak op te bouwen. Laat de laatste TEV decolletéreactie weg om cohesin eer op het eiwit-polymeer als Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass te reserveren.

4. AFM Experiment meting en data-analyse

  1. METINGEN AFM
    1. Voeg 1 mL AFM buffer toe aan de kamer met 10 mM CaCl2 en 5 mM Ascorbic Acid.
    2. Kies de D-tip van de gefunctionaliseerde AFM-sonde voor het experiment. Gebruik de stelling van de equipartition om de cantilever in AFM-buffer vóór elk experiment te kalibreren met een nauwkeurige veerconstante(k)waarde.
    3. Bevestig de cantilever tip aan het monsteroppervlak om het cohesin/Dockerin-paar te vormen.
    4. Trek de cantilever in met een constante snelheid van 400 nm−s−1 van het oppervlak. Neem ondertussen de kracht-extensiecurve op met een monstersnelheid van 4000 Hz.
  2. Gegevensanalyse
    1. Gebruik JPK-gegevensverwerking en selecteer force-extension traces.
    2. Gebruik software om de sporen te analyseren. Plaats de rondingen met de worm-achtige keten (WLC) model van polymeer elasticiteit en het verkrijgen van ontvouwende kracht en contour lengte toename voor individuele eiwit ontvouwen piek.
    3. Pas de histogrammen van ontvouwende krachten met het Gaussian-model om de meest waarschijnlijke waarden van ontvouwende kracht (u>) en contourlengtetoename (<ΔLc>) te verkrijgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De NGL-residuen die door OaAEP1-ligatie tussen aangrenzende eiwitten worden geïntroduceerd, hebben geen invloed op de eiwitmonomeerstabiliteit in het polymeer, aangezien de uitvouwkracht (u>), en contourlengtetoename (<ΔLc>) vergelijkbaar is met de vorige studie (figuur 1). Het zuiveringsresultaat van het rubredoxine-eiwit wordt weergegeven in figuur 2. Om te bewijzen dat het eiwit na TEV decolleté compatibel is met de volgende OaAEP1 ligatie om eiwitpolymeer te construeren met een controlesequentie en de constructie is hoog-efficiënt, figuur 3 biedt een SDS-PAGE beeld als referentie. De stappen van de gefunctionaliseerde cantilever en coverslipvoorbereiding worden beschreven in figuur 4. De stapsgewijze enzymatische biosynthese en immobilisatie van polyproteïne op de coverslip zijn weergegeven in figuur 5. Gebruik dit protocol, een eiwitpolymeer met de gecontroleerde volgorde kan worden gebouwd en geschikt voor AFM-gebaseerde SMFS experimenten.

Figure 1
Figuur 1: AFM-gebaseerde SMFS metingen van poly-eiwit gebouwd door OaAEP1. (A) Typische zaagtand-achtige kracht-uitbreiding bochten van Ub (curve 1 in blauw) werden getoond met de verwachte ΔLc van ~ 23 nm. (B) Het spreidingsplot vertoont de relatie tussen ub-uitvouwkracht (202 ± 44 pN, gemiddelde ± s.d., n = 198) en ΔLc (23 ± 2 nm, gemiddelde ± s.d.). Dit cijfer is gewijzigd van Ref.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: De UV-Vis absorptiespectra van GL-GB1-Fe(III)-Rd-NGL en GL-GB1-(Zn)-Rd-NGL. De Fe(III)-vorm Rd (Links spectrum, gekleurd in bruin, PDB code: 1BRF) gepresenteerd typische UV-Vis absorptie pieken op 495 nm en 579 nm, terwijl de Zn-vorm niet (Rechts spectrum, gekleurd in wijn, PDB code: 1IRN). Dit cijfer is gewijzigd van Ref.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: SDS-PAGE gel resultaten van stapsgewijze spijsvertering en ligatie met BEHULP van TEV protease en OaAEP1 om de Ub dimer te bouwen. Lanes 1–4 toonde Coh-tev-L-Ub, het resultaat eiwitmengsel van TEV decolleté, pure sfGFP-TEV protease en gezuiverd product (GL-Ub). Rijstroken 5-7 toonde de gespleten GL-Ub en Coh-tev-L-Ub-NGL ligatie mengsel met (Lane 5) of zonder (Lane 6) OaAEP1 en pure OaAEP1. Dit cijfer is gewijzigd van Ref.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Procesgrafiek waarin elke stap wordt beschreven voor het functionaliseren van glascovers en cantilever. Na reiniging en activering door chroomzuur delen coverslip en cantilever vergelijkbaar functionalisatieproces, behalve de laatste stap waarin GL-ELP50nm-C paren met coverslip terwijl C-ELP50nm-NGL paren met cantilever. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Procesgrafiek die elke stap beschrijft voor polyproteïneimmobilisatie op het oppervlak. Linksboven processtroomdiagram toont de stapsgewijze opbouw van polyproteïne met gecontroleerde sequenties op de coverslip. Rechtsboven toont het ontwerp de voorbereiding van de gefunctionaliseerde cantilever die in de AFM-metingen wordt gebruikt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Typische ontvouwende sporen van de eiwitpolymeren met een rationeel gecontroleerde sequentie door AFM-gebaseerde SMFS. (A) Typische zaagtand-achtige kracht-uitbreiding bochten van Ub gepresenteerd ΔLc van ~ 23 nm zoals verwacht. (B) Typische kracht-uitbreiding bochten van Rd gepresenteerd ΔLc van ~ 13 nm zoals verwacht. (C) Typische kracht-extensie bochten van (Ub-Rd)n eiwit mengsel waarin de blauwe piek betekent de zich ontvouwende gebeurtenissen van Ub, terwijl de rode betekent Rd. Dit cijfer is gewijzigd van Ref.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Aanvullende figuur 1: SDS-PAGE gel resultaten van de eiwitligatie-efficiëntie onder verschillende verhouding tussen twee reactanten. De ligatie-efficiëntie was 20% wanneer de verhouding 1 op 1 is en 75% bereikte bij de verhouding van 10 tegen 1. Dit cijfer is gewijzigd van Ref.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben een protocol beschreven voor enzymatische biosynthese en immobilisatie van polyproteïne en geverifieerd de poly-eiwit ontwerp door AFM-gebaseerde SMFS. Deze methodologie biedt een nieuwe benadering voor het bouwen van het eiwitpolymeer in een ontworpen sequentie, die een aanvulling vormt op eerdere methoden voor polyproteïnetechniek en immobilisatie4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61.

Vergeleken met de klassieke recombinante DNA-methodologie voor polyproteïneconstructie7,62,baseert onze methode zich op de ligatie tussen kleine eiwitmonomeren. Zo maakt het de expressie van grote of giftige eiwitmoleculen voor poly-eiwit constructie. Bovendien maakt het de zuivering van de eiwitmonomeer vóór vervoeging mogelijk.

Vergeleken met de veelgebruikte bi-cysteïnemethode die intermoleculaire disulfidebinding vormt voor eiwitpolymerisatie4,resulteert onze enzymatische methode met zowel OaAEP1 als TEV protease in een polyproteïne met een relatief gecontroleerde sequentie en gedefinieerde verbindingsgeometrie. En het maakt geen gebruik van cysteïne, dat is een essentieel functioneel residu voor veel eiwitten.

Onze methode is meestal vergelijkbaar met sortase-gebaseerde eiwitvervoeging59. Het unieke van onze methode is dat de op OaAEP1 gebaseerde eiwitligatie veel efficiënter is, waardoor de bouw van eiwitpentamer met een redelijke opbrengst10,53mogelijk is. Het heeft ook minder residuen nodig voor ligatie en resulteert in een kortere NGL-linker met drie residuen. Als gevolg hiervan toont het geen "linker-effect" omdat de nieuw gevormde NGL-linker de stabiliteit van individuele eiwitmonomeer niet beïnvloedt of een onnatuurlijke eiwit-eiwitinteractie veroorzaakt. Toch zijn wij van mening dat alle methoden hun eigen voor- en nadelen hebben. De klassieke recombinante DNA-methode voegt bijvoorbeeld geen residu tussen eiwitmonomeer toe en vereist niet het gebruik van een enzym voor ligatie. En de bi-cysteïne methode is eenvoudig en gemakkelijk voor eiwitpolymerisatie. Zo kunnen ze allemaal nuttig zijn onder verschillende experimentele vereisten.

Voor onze stapsgewijze constructie van polyproteïne is het cruciaal om het niet-gereageerde eiwit volledig te verwijderen. Neem voldoende volume AFM-buffer en voldoende tijd om het gereageerde oppervlak zorgvuldig schoon te maken. Anders zal het resterende eiwit of protease verdere synthesereacties beïnvloeden.

De efficiëntie van OaAEP1 ligatie is een kritische grens aan onze methode, omdat de TEV-decolleté-efficiëntie bijna voltooid is (96%). Het is van cruciaal belang om de verhouding tussen de twee reactanten, GL-eiwit en eiwit-NGL, te verhogen om de ligatie-efficiëntie te verbeteren. Onze studie toont aan dat wanneer eiwit-NGL is vertienvoudigd tot GL-eiwit, de efficiëntie toeneemt van 20% (de verhouding is 1 tot 1) tot 75% (Aanvullende figuur 1). Het is van cruciaal belang om de reactant te consumeren, die werd geïmmobiliseerd op het oppervlak als de vrije reactant kan worden verwijderd door het wassen met buffer. Bovendien, of de N- of C-terminus is blootgesteld aan de oplossing is ook een cruciale factor voor ligatie. Het is een optionele aanpak om de terminal bloot te leggen door een linker toe te voegen die de erkende site bevat aan de betreffende terminal.

Uiteindelijk is ons protocol een enzymatische manier om eiwitten in een ontworpen volgorde te vervoegen. Het biedt ook een alternatieve benadering van het koppelen en immobiliseren van eiwitmonsters in single-molecule studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) en Shuangchuang Programma van de provincie Jiangsu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8 (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1 (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41 (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10 (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139 (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8 (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13 (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1 (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11 (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12 (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19 (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9 (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11 (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3 (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39 (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. iJ., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134 (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139 (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9 (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52 (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30 (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57 (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29 (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O'Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49 (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27 (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2 (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116 (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).

Tags

Biochemie single-molecule kracht spectroscopie bio-vervoeging eiwit immobilisatie atoomkracht spectroscopie OaAEP1 eiwittechniek
OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi,… More

Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter