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Biochemistry

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Published: February 5, 2020 doi: 10.3791/60774
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour conjuguer le monomère de protéine par des enzymes formant le polymère de protéine avec une séquence commandée et l'immobiliser sur la surface pour des études de spectroscopie de force d'une molécule simple.

Abstract

Les techniques chimiques et de bioconjugation ont été développées rapidement ces dernières années et permettent la construction de polymères protéiques. Cependant, un processus de polymérisation des protéines contrôlée est toujours un défi. Ici, nous avons développé une méthodologie enzymatique pour construire des protéines polymérisées étape par étape dans une séquence rationnellement contrôlée. Dans cette méthode, le c-terminus d'un monomère de protéine est NGL pour la conjugaison de protéine utilisant OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) tandis que le N-terminus était un site de clivage cleavable de TEV (virus d'etch de tabac) plus un L (ENLYFQ/GL) pour la protection temporaire de N-terminal. Par conséquent, OaAEP1 a été en mesure d'ajouter un seul monomère de protéines à la fois, puis la protéase TEV clivé le N-terminus entre Q et G pour exposer le NH2-Gly-Leu. Ensuite, l'unité est prête pour la prochaine ligature OaAEP1. La polyprotéine modifiée est examinée en dépliant le domaine de protéine individuelle utilisant la spectroscopie de force unique à base de microscopie atomique (AFM-SMFS). Par conséquent, cette étude fournit une stratégie utile pour l'ingénierie et l'immobilisation des polyprotéines.

Introduction

Comparéaux aux polymères synthétiques, les protéines multi-domaines naturelles ont une structure uniforme avec un nombre et un type bien contrôlés de sous-domaines1. Cette caractéristique conduit généralement à l'amélioration de la fonction biologique et la stabilité2,3. Beaucoup d'approches, telles que le couplage disulfure à base de cystéine et la technologie recombinante d'ADN, ont été développées pour construire une telle protéine polymérisée avec les domaines multiples4,5,6,7. Cependant, la première méthode aboutit toujours à une séquence aléatoire et incontrôlée, et la seconde conduit à d'autres problèmes, y compris la difficulté pour la surexpression des protéines toxiques et de grande taille et la purification de protéines complexes avec cofactor et d'autres enzymes délicates.

Pour relever ce défi, nous développons une méthode enzymatique qui combine monomère de protéines ensemble pour polymère / polyprotéine d'une manière progressive en utilisant une ligase de protéines OaAEP1 combiné avec une protéase TEV8,9. OaAEP1 est un endopeptidase strict et efficace. Deux protéines peuvent être reliées de façon covalente comme séquence Asn-Gly-Leu (NGL) à travers deux termini par OaAEP1 en moins de 30 min si le terminus N est résidus Dely-Leu (GL) et l'autre dont le c-terminus est résidus NGL10. Cependant, l'utilisation d'OaAEP1 seulement pour lier le monomère de protéine mène à un polymère de protéine avec une séquence incontrôlée comme la méthode de couplage cystéine-basée. Par conséquent, nous concevons le N-terminus de l'unité protéique avec un site amovible de protéase TEV plus un résidu de leucine comme ENLYFQ/G-L-POI. Avant le clivage TEV, le N-terminal ne participerait pas à la ligature OaAEP1. Et puis les résidus de GL à N-terminus, qui sont compatibles avec d'autres ligature OaAEP1, est exposé après le clivage TEV. Ainsi, nous avons réalisé une méthode de biosynthèse enzymatique séquentielle de polyprotéine avec une séquence relativement bien contrôlée.

Ici, notre méthode de synthèse enzymatique progressive peut être utilisée dans la préparation d'échantillons de polyprotéines, y compris la séquence contrôlée et incontrôlée, et l'immobilisation des protéines pour les études monomolécules ainsi, en particulier pour le système complexe tel que métalloprotéine.

De plus, les expériences SMFS basées sur l'AFM nous permettent de confirmer la construction et la stabilité des polymères protéiques au niveau d'une seule molécule. La spectroscopie de force d'une seule molécule, y compris l'AFM, la pince optique et la pince magnétique, est un outil général en nanotechnologie pour manipuler mécaniquement la biomolécule et mesurer leur stabilité11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. AFM monomolécule a été largement utilisé dans l'étude des protéines (non)pliage21,22,23,24,25, la mesure de la force de l'interaction récepteur-ligand26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, liaison chimique inorganique20,36,37,38,39,40,41,42,43 et métal-ligand bond en metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Ici, l'AFM monomolécule est utilisé pour vérifier la séquence de polyprotéine synthétisée basée sur le signal de progression de la protéine correspondante.

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Protocol

1. Production de protéines

  1. Clone génétique
    1. Acheter des gènes codant pour la protéine d'intérêt (POI) : Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, le module de cellulose-contraignant (CBM), le domaine de dockerin-X (XDoc) et la cohésion de Ruminococcus flavefacience, le virus de l'etch de tabac (TEV), les polypeptides d'élastine-like (ELPs).
    2. Effectuer la réaction en chaîne de polymérase et utiliser le système d'enzymes de digestion à trois restrictions BamHI-BglII-KpnI pour recombiner le gène de différents fragments de protéines.
    3. Confirmer tous les gènes par le séquençage direct de l'ADN.
  2. Expression et production de protéines
    1. Transformez E. coli BL21(DE3) avec le plasmide pQE80L-POI ou pET28a-POI pour l'expression.
    2. Choisissez une seule colonie dans 15 ml de milieu LB avec des antibiotiques respectifs (p. ex., 100 g/mL de sel de sodium ampicilline ou 50 g/mL, kanamycine). Continuez à secouer les cultures à 200 tr/min à 37 oC pendant 16-20 h.
    3. Diluer les cultures de nuit en 800 ml de lb-moyen (1:50 dilution). Pour la rubredoxine, centrifuger la culture à 1 800 x g, puis le resuspendre en 15 ml de m9 moyen (complété par 0,4 % de glucose, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4), puis le diluer en 800 ml de m9 moyen.
    4. Incuber la culture à 37 oC tout en secouant à 200 tr/min, jusqu'à ce que la culture atteigne une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,6. Enregistrez un échantillon de 100 L de la culture comme contrôle pré-induction pour tester l'expression des protéines.
    5. Induire l'expression des protéines en ajoutant iPTG à une concentration finale de 1 mM et secouer la culture à 37 oC pour 4 h à 200 tr/min. Réservez un échantillon de 100 L de la culture comme contrôle post-induction pour tester l'expression des protéines.
    6. Centrifuger la culture à 13 000 x g pendant 25 min à 4 oC et conserver à -80 oC avant la purification.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
  3. Purification des protéines d'intérêt
    1. Resuspendre les cellules dans 25 ml de tampon de lyse (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4 contenant de La DNase, RNase, PMSF) et utiliser un sonicator (15% d'amplitude) pour le lyser pendant 30 min sur la glace.
    2. Clarifier le lysate cellulaire à 19 000 x g pendant 40 min à 4 oC.
    3. Emballez 1 mL (volume de lit) de la colonne d'affinité Co-NTA ou Ni-NTA et lavez la colonne avec 10 volumes de colonnes (CV) d'eau ultrapure, puis 10 CV de tampon de lavage (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazole, pH 7,4) par débit gravitationnel.
    4. Passer le supernatant de protéines à travers la colonne par flux de gravité pendant trois fois.
    5. Verser le tampon de lavage sur la colonne avec 50 CV pour éloigner les protéines contaminantes.
    6. Élifier la protéine liée avec 3 CV de tampon d'élution glacée (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 7,4). Quand il s'agit de protéines rubredoxin, la purification d'échange d'anion plus loin utilisant la colonne d'échange d'anion au pH 8.5 à 4 oC est nécessaire.
    7. Analyser l'échantillon par SDS-PAGE.

2. Fonctionnalisation de la surface de couverture et de porte-à-faux

  1. Préparation fonctionnelle de la surface de couverture
    1. Dissoudre 20 g de chromate de potassium dans 40 ml d'eau ultrapure. Ajouter lentement 360 ml d'acide sulfurique concentré à la solution de chromate de potassium avec une tige de verre remuer doucement et de préparer l'acide chromique.
      CAUTION: Le produit chimique utilisé ici et l'acide chromique final est fortement corrosif et acide. Travaillez avec un équipement de protection approprié. La solution libère de la chaleur lorsqu'on ajoute de l'acide sulfurique concentré, ce qui signifie une mise en valeur lente et une pause appropriée pour refroidir.
    2. Nettoyez et activez un bordereau en verre à 80 oC pendant 30 min par traitement à l'acide chromique. Immerger complètement les rémaquillles dans une solution de toluène APTES de 1 % (v/v) pendant 1 h à température ambiante tout en les protégeant de la lumière.
    3. Laver la feuille de couverture avec du toluène et de l'alcool éthylique absolu et sécher la feuille de couverture avec un jet d'azote.
    4. Incuber la couverture à 80 oC pendant 15 min, puis refroidir à température ambiante.
    5. Ajouter 200 l de sulfo-SMCC (1 mg/mL) dans la solution de sulfoxide de diméthyle (DMSO) entre deux feuilles de couverture immobilisées et incuber pendant 1 h à l'abri de la lumière.
    6. Laver la feuille de couverture avec DMSO d'abord, puis avec de l'alcool éthylique absolu pour enlever sulfo-SMCC résiduel.
    7. Séchez la couverture sous un jet d'azote.
    8. Pipet 60 'L de 200 'M GL-ELP50nm-Csolution de protéine sur un coverslip fonctionnalisé et incuber pendant environ 3 h.
    9. Laver le bordereau avec de l'eau ultrapure pour enlever le GL-ELP50nm-C non réagi.
      REMARQUE : Les fiches de couverture fonctionnalisées sont capables pendant environ deux semaines de stockage à 4 oC.
  2. Préparation fonctionnelle de surface en porte-à-faux
    1. Nettoyez les cantilevers à 80 oC pendant 10 min par traitement à l'acide chromique.
    2. Fonctionnaliser le porte-à-faux par amino-silanisation avec 1% (v/v) solution de toluène APTES, puis cuire le porte-à-faux à 80 oC pendant 15 min avant de conjuguer à sulfo-SMCC.
    3. Reliez le C-ELP50nm-NGLà la surface avec le groupe de mâleimide de sulfo-SMCC pendant 1,5 h.
    4. Laver le C-ELP50nm-NGLnon réagi sur le bordereau d'eau ultrapure.
    5. Immerger un porte-à-faux fonctionnalisé dans 200 oL de 50 m GL-CBM-XDoc, une solution protéique contenant 200 nM OaAEP1 à 25 oC pendant 20 à 30 min. Ensuite, utilisez un tampon AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,4) pour éliminer les protéines non réagies.
      REMARQUE : La chimie de surface des cantilevers et le coverslip sont semblables.

3. Préparation progressive de polyprotéines avec séquences contrôlées

  1. Reliez l'unité de ligature Coh-tev-L-POI-NGL au GL-ELP50nm immobilisé sur la surface de couverture par OaAEP1 pendant 30 min.
  2. Utilisez 15-20 ml de tampon AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,4) pour laver les protéines non réagies.
  3. Ajouter 100 l de protéase TEV (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10 % [v/v] glycérol, pH 8,0) pour couper l'unité protéique du site de reconnaissance tEV pendant 1 h à 25 oC.
  4. Utilisez 15-20 ml de tampon AFM pour laver les protéines résiduelles.
  5. Reliez l'unité de ligature Coh-tev-L-POI-NGL au GL-Ub-NGL-Glass par OaAEP1 pendant 30 min.
  6. Répétez les étapes 3.3 à 3.5 N-1 foispour construire la construction de protéine GL-(Ub) n-NGL sur la surface de verre. Omettre la dernière réaction de clivage TEV pour réserver la cohésine sur la protéine-polymère comme Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass.

4. Mesure et analyse des données de l'expérience AFM

  1. Mesures AFM
    1. Ajouter 1 ml de tampon AFM dans la chambre avec 10 mm CaCl2 et 5 mm d'acide ascorbique.
    2. Choisissez la pointe D de la sonde AFM fonctionnalisée pour l'expérience. Utilisez le théorème d'équipartition pour calibrer le porte-à-faux dans le tampon AFM avec une constante de ressort précise (k) valeur avant chaque expérience.
    3. Fixez la pointe en porte-à-faux à la surface de l'échantillon pour former la paire Cohesin/Dockerin.
    4. Retirez le porte-à-faux à une vitesse constante de 400nm's 1 de la surface. Entre-temps, enregistrez la courbe force-extension à un taux d'échantillon de 4000 Hz.
  2. Analyse des données
    1. Utilisez le traitement des données JPK sélectionnez les traces d'extension de force.
    2. Utilisez un logiciel pour analyser les traces. Adiez les courbes avec le modèle d'élasticité des polymères (WLC) et obtenez la force de déploiement et l'incrément de longueur de contour pour le pic de déploiement individuel de protéine.
    3. Adaptez les histogrammes des forces de déploiement avec le modèle gaussien pour obtenir les valeurs les plus probables de la force de déploiement (lt;Fu-gt;) et l'incrément de longueur de contour (lt;ll c'.

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Representative Results

Les résidus de NGL introduits entre les protéines adjacentes par la ligature OaAEP1 n'affecteront pas la stabilité du monomère protéique dans le polymère, car la force qui se déroule (lt;Fuet l'augmentation de la longueur du contour (lt;Lc'estcomparable à l'étude précédente (Figure 1). Le résultat de purification de la protéine rubredoxine est montré dans la figure 2. Pour prouver la protéine après clivage TEV est compatible avec la ligature OaAEP1 suivante pour construire des polymères protéiques avec une séquence de contrôle et la construction est à haut rendement, Figure 3 fournit une image SDS-PAGE comme une référence. Les étapes de la préparation fonctionnelle du porte-à-faux et de la couverture sont décrites dans la figure 4. La biosynthèse enzymatique progressive et l'immobilisation de la polyprotéine sur le bordereau sont montrées dans la figure 5. Utilisez ce protocole, un polymère protéique avec la séquence contrôlée peut être construit et adapté aux expériences SMFS basées sur l'AFM.

Figure 1
Figure 1 : Mesures SMFS à base d'AFM de polyprotéines construites par OaAEP1. (A) Des courbes typiques de force-extension en dents de scie de ub (courbe 1 en bleu) ont été montrées avec l'on s'attendait à un Taux d'appui de 23 nm. (B) L'intrigue de dispersion présente la relation entre la force de déploiement d'Ub (202 à 44 pN, moyenne s.d., n - 198) et 'Lc (23 '2 nm, moyenne 's.d.). Ce chiffre a été modifié à partir de Ref.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Les spectres d'absorption UV-Vis de GL-GB1-Fe(III)-Rd-NGL et GL-GB1-(Zn)-Rd-NGL. Le Fe(III)-form Rd (spectre gauche, coloré en brun, code PDB:1BRF) a présenté des pics typiques d'absorption UV-Vis à 495 nm et 579 nm tandis que le Zn-forme n'a pas (spectre droit, coloré dans le vin, code PDB: 1IRN). Ce chiffre a été modifié à partir de Ref.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Le gel SDS-PAGE résulte d'une digestion et d'une ligature progressives à l'aide de la protéase TEV et de l'OaAEP1 pour construire le dimère Ub. Les voies 1-4 montraient Coh-tev-L-Ub, le mélange de protéines de résultat du clivage TEV, de la protéase Pure SfGFP-TEV et du produit purifié (GL-Ub). Les voies 5 à 7 montraient le mélange de ligature GL-Ub et Coh-tev-L-Ub-NGL avec (Lane 5) ou sans (Lane 6) OaAEP1 et oaAEP1 pur. Ce chiffre a été modifié à partir de Ref.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Graphique de processus décrivant chaque étape pour la fonctionnalisation des couvertures en verre et du porte-à-faux. Après le nettoyage et l'activation par l'acide chromique, coverslip et porte-à-faux partagent le processus de fonctionnalisation semblable, excepté la dernière étape dans laquelle GL-ELP50nm-C couples avec coverslip tandis que C-ELP50nm-NGL couples avec le levier de levier. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Graphique de processus décrivant chaque étape pour l'immobilisation de polyprotéine sur la surface. Le diagramme de flux de processus supérieur gauche montre la construction progressive de polyprotéines avec des séquences contrôlées sur le bordereau. Le diagramme en haut à droite montre la préparation du porte-à-faux fonctionnalisé utilisé dans les mesures AFM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Traces typiques des polymères protéiques avec une séquence rationnellement contrôlée par SMFS à base d'AFM. (A) Les courbes typiques de force-extension de dent de scie de ub ont présenté 'Lc de '23 nm comme prévu. (B) Les courbes typiques d'extension de force de Rd ont présenté 'Lc de '13 nm comme prévu. (C) Courbes typiques d'extension de force de (Ub-Rd)n mélange de protéines dans lequel le pic bleu signifie les événements de déroulement de ub tandis que le rouge signifie Rd. Ce chiffre a été modifié à partir de Ref.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure supplémentaire 1 : Le gel SDS-PAGE résulte de l'efficacité de la ligation des protéines selon un rapport différent entre deux réactifs. L'efficacité de la ligature était de 20 % lorsque le ratio est de 1 pour 1 et a atteint 75 % au ratio de 10 pour 1. Ce chiffre a été modifié à partir de Ref.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Nous avons décrit un protocole pour la biosynthèse enzymatique et l'immobilisation de la polyprotéine et vérifié la conception de polyprotéine par SMFS AFM-basé. Cette méthodologie fournit une nouvelle approche à la construction de la protéine-polymère dans une séquence conçue, qui complète les méthodes précédentes pour l'ingénierie et l'immobilisation des polyprotéines4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61.

Comparé à la méthodologie classique d'ADN recombinant pour la construction de polyprotéine7,62,notre méthode se base sur la ligature entre les petits monomères de protéine. Ainsi, il permet l'expression de molécules de protéines toxiques ou de grande taille pour la construction de polyprotéines. En outre, il permet la purification du monomère de protéine avant conjugaison.

Comparée à la méthode de bicystéine largement utilisée formant le lien intermoléculaire de disulfure pour la polymérisation de protéine4,notre méthode enzymatique utilisant la protéase d'OaAEP1 et de TEV a comme conséquence une polyprotéine avec une séquence relativement commandée et la géométrie définie de connexion. Et il n'utilise pas de cystéine, qui est un résidu fonctionnel essentiel pour de nombreuses protéines.

Notre méthode est la plupart du temps semblable à la conjugaison de protéine de sort-basée59. La caractéristique unique de notre méthode est que la lignation de protéines à base d'OaAEP1 est beaucoup plus efficace, permet ainsi la construction de protéines pentamer avec un rendement raisonnable10,53. Il a également besoin de moins de résidus pour la ligature et se traduit par un lien NGL plus court à trois résidus. En conséquence, il ne montre aucun « effet de liaison » car le lien NGL nouvellement formé n'affecte pas la stabilité du monomère individuel de protéine ou n'induit aucune interaction anormale de protéine-protéine. Néanmoins, nous croyons que toutes les méthodes ont leurs propres avantages et inconvénients. Par exemple, la méthode classique de l'ADN recombinant n'ajoute aucun résidu entre le monomère de protéine et ne nécessite pas l'utilisation d'une enzyme pour la ligature. Et la méthode de bi-cystéine est simple et facile pour la polymérisation de protéine. Ainsi, ils peuvent tous être utiles en vertu d'exigences expérimentales différentes.

Pour notre construction progressive de polyprotéine, il est crucial d'enlever complètement la protéine non réagie. Prenez suffisamment de volume de tampon AFM et assez de temps pour nettoyer la surface réagie avec soin. Sinon, la protéine résiduelle ou la protéase affectera d'autres réactions de synthèse.

L'efficacité de la ligature OaAEP1 est une limite critique à notre méthode car l'efficacité de clivage TEV est presque complète (96%). Il est essentiel d'augmenter le rapport entre les deux réactifs, GL-protéine, et protéine-NGL, pour améliorer l'efficacité de ligature. Notre étude montre que lorsque les protéines-NGL sont décuplées par rapport à la protéine GL, l'efficacité passe de 20 % (le rapport est de 1 à 1) à 75 %(figure supplémentaire 1). Il est essentiel de consommer le réactif, qui a été immobilisé sur la surface que le réactif libre peut être déplacé loin en se lavant avec tampon. En outre, si le terminus N ou C-est exposé à la solution est également un facteur crucial à la ligature. Il s'agit d'une approche facultative pour exposer le terminal en ajoutant un lien contenant le site reconnu au terminal respectif.

En fin de compte, notre protocole est une façon enzymatique de conjuguer les protéines dans une séquence conçue. Il offre également une approche alternative aux échantillons de protéines de couple et d'immobilisation dans des études à molécule unique.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) et Shuangchuang De la province du Jiangsu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

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