Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

Published: February 5, 2020 doi: 10.3791/60774
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלים מונומר חלבון על ידי אנזימים היוצרים פולימר פולימרי עם רצף מבוקר ומשתק אותו על פני השטח עבור לימודי מולקולה בודדת של כוח ספקטרוסקופיית.

Abstract

טכניקות כימיות וביו-קוניוגציה פותחו במהירות בשנים האחרונות ומאפשרות לבניית פולימרים של חלבונים. בכל אופן, תהליך של חלבון מבוקר. הוא תמיד אתגר בשלב זה פיתחנו מתודולוגיה אנזימטית לבניית שליטת החלבון צעד אחר צעד ברצף הנשלט באופן רציונלי. בשיטה זו, C-טרמינוס של מונומר חלבון הוא NGL עבור הקוניוגציה חלבון באמצעות OaAEP1 (Oldenlandia נדיה affinis asparaginyl endop) 1) בעוד N-טרמינוס היה tev בקליקל (וירוס איכול טבק) באתר מחשוף ועוד L (ENLYFQ/GL) להגנה זמנית N-terminal. כתוצאה מכך, OaAEP1 הייתה מסוגלת להוסיף רק מונומר חלבון אחד בכל פעם, ואז פרוטאז TEV ביקעה את ה-N-טרמינוס בין Q ו-G כדי לחשוף את NH2-בסדר-Leu. ואז היחידה מוכנה. לOaAEP1 הבאה פוליפרוטאין מהונדס נבדק על ידי מתחם חלבון בודד התפתחות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטום מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה (AFM-SMFS). לכן, מחקר זה מספק אסטרטגיה שימושית עבור הנדסת פוליפרוטאין ו השתק.

Introduction

לעומת פולימרים סינתטיים, טבעי מרובת תחומים חלבונים יש מבנה אחיד עם מספר מבוקרת היטב סוג של תת תחומים1. תכונה זו מובילה בדרך כלל לשיפור תפקוד ביולוגי ויציבות2,3. גישות רבות, כגון מבוססי cysteine קשר קשר דיסולפידי בונד וטכנולוגיית ה-DNA רקומביננטי, פותחו לבניית חלבון כזה פולימרין עם תחומים מרובים4,5,6,7. עם זאת, השיטה הקודמת תמיד גורמת לרצף אקראי ובלתי מבוקר, והאחרון מוביל לבעיות אחרות, כולל הקושי להבעת היתר של חלבונים רעילים בגודל גדול וטיהור של חלבון מורכב עם קופקטור ואנזימים עדינים אחרים.

כדי לענות על האתגר הזה, אנו מפתחים שיטה אנזימטית אשר מעלה באוב חלבון מונומר ביחד עבור פולימר/פוליפרוטאין בצורה מעניינת בעזרת ליגאז חלבון OaAEP1 בשילוב עם פרוטאז tev8,9. OaAEP1 הוא endopeptidase קפדנית ויעילה. שני חלבונים יכולים להיות מקושרים בעקשנות כמו הרצף Asn-לי-Leu (NGL) דרך שני termini על ידי OaAEP1 בתוך פחות מ 30 דקות אם הטרמינוס N-Leu משקעים (GL) והשני שבו C-טרמינוס הוא שאריות NGL10. עם זאת, השימוש OaAEP1 רק כדי לקשר מונומר חלבון מוביל לפולימר חלבון עם רצף בלתי מבוקרת כמו שיטת הזיווג המבוסס cysteine. לכן, אנו לעצב את N-הטרמינוס של יחידת החלבון עם האתר של TEV פרוטאז נשלף בתוספת שאריות לאוצין כמו ENLYFQ/G-L-לפוי. לפני המחשוף של TEV, ה-N-terminal לא ישתתף בOaAEP1. ואז שאריות GL ב-N-טרמינוס, אשר תואמים OaAEP1 ליטל נוסף, נחשף לאחר מחשוף TEV. לפיכך, השגנו שיטה ביוסינתזה אנזימטית רציפה של פוליפרוטאין עם רצף מבוקר יחסית.

כאן, שיטת הסינתזה הצעדיטית שלנו יכולה לשמש בהכנה לדגימת פוליפרוטאין, כולל מבוקרת רצף ובלתי מבוקרת, ומשתק חלבונים גם למחקרים חד-מולקולות, במיוחד למערכת המורכבת כגון מטאלופרוטאין.

יתר על כן, ניסויים AFM מבוססי מאפשר לנו לאשר את הבנייה פולימר חלבון בנייה ויציבות ברמה חד מולקולה. מולקולה בודדת ספקטרוסקופיית כוח, כולל afm, הטוויטר אופטי ו פינצטה מגנטי, הוא כלי כללי בננו-טכנולוגיה כדי לתמרן ביואוכאל מכנית ולמדוד את היציבות שלהם11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. מולקולה בודדת afm כבר בשימוש נרחב במחקר של חלבון (האו ם) קיפול21,22,23,24,25, מדידת כוח של קולטן-ligandאינטראקציה 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, בונד כימי אורגני20,36,37,38,39,40,41,42,43 ו-ligand בונד ב-מטאלופרוטאין44,45,46,47,48, 49,50 . כאן, מולקולה יחידה AFM משמש כדי לאמת את רצף פוליפרוטאין מסונתז מבוסס על האות חלבון התגלגלות המקביל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הפקת חלבון

  1. שיבוט ג'ין
    1. לרכוש גנים קידוד עבור חלבון העניין (פוי): אוביקוויסין, Rubredoxin (RD)51, מודול מחייב תאית (cbm), הפריצה לתחום X (xdoc) ו לכידות מ Ruמינוקוקוס flavefacience, וירוס איכול טבק (tev) פרוטאז, אלסטין כמו פוליפפטידים (elps).
    2. לבצע תגובת שרשרת פולימראז ולהשתמש שלוש הגבלה מערכת האנזים האנזימים Bamhאני-bglII-kpni לשילוב מחדש של הגן משברי חלבונים שונים.
    3. לאשר את כל הגנים על ידי. רצף דנ א ישיר
  2. חלבונים ביטוי וייצור
    1. שינוי הצורה של E. coli BL21 (DE3) עם הביטוי PQE80L-פוי או pET28a פוי.
    2. בחר מושבה אחת לתוך 15 mL של בינונית LB עם אנטיביוטיקה בהתאמה (למשל, 100 μg/mL אמפיצילין נתרן מלח או 50 μg/mL, kanamycin). להמשיך לטלטל את התרבויות ב 200 סל ד ב 37 ° צ' עבור 16-20 h.
    3. לדלל את התרבויות לילה לתוך 800 mL של LB בינונית (1:50 דילול). עבור rubredoxin, צנטריפוגה את התרבות ב 1,800 x g, ואז להשעות מחדש 15 מ ל של M9 בינונית (בתוספת 0.4% גלוקוז, 0.1 MM cacl2, 2 מ"מ mgso4), ולאחר מכן לדלל אותו לתוך 800 mL של M9 medium.
    4. מודאת התרבות ב 37 ° c תוך כדי טלטול ב 200 rpm, עד התרבות מגיע צפיפות אופטית ב 600 nm (OD600) של 0.6. שמור מדגם 100 μL של התרבות כפקד השראה מראש לבדיקת ביטוי חלבון.
    5. לגרום לביטוי חלבון על ידי הוספת IPTG לריכוז הסופי של 1 מ"מ ולנער את התרבות ב 37 ° c עבור 4 h ב 200 rpm. שריין דוגמה 100 μL של התרבות כבקרת פוסט-אינדוקציה לבדיקת ביטוי החלבון.
    6. צנטריפוגה את התרבות ב 13,000 x g עבור 25 דקות ב 4 ° צ' ולאחסן ב-80 ° צ' לפני הטיהור.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  3. טיהור של חלבון מעניין
    1. השהה מחדש את התאים ב -25 מ ל של מאגר הליזה (50 mM Tris, 150 מ"מ הנאקל, pH 7.4 המכילים DNase, RNase, PMSF) ולהשתמש sonicator (15% משרעת) כדי lyse זה עבור 30 דקות על הקרח.
    2. להבהיר את התא ליפוסט ב 19,000 x g עבור 40 דקות ב 4 ° c.
    3. Pack 1 מ ל (נפח מיטה) של שיתוף-ת א או של Ni-נ. ת. א. האהדה עמודה ולשטוף את העמודה עם 10 כרכים העמודה (קורות חיים) של מים אלקטרופורזה ולאחר מכן 10 קורות של מאגר לשטוף (50 mm טריס, 150 מ"מ הנאל, 2 מ"מ הנאזול, pH 7.4) על
    4. להעביר את החלבון על ידי העמוד על ידי זרימת כבידה במשך שלוש פעמים.
    5. יוצקים מאגר כביסה על העמודה עם 50 קורות חיים כדי להרחיק חלבונים זיהום.
    6. החלבון המאוגד עם 3 קורות חיים של מאגר משחרנן לקרח (20 מ"מ Tris, 400 מ"מ היום, 250 מ"מ הנאזול, pH 7.4). כשמדובר בחלבונים rubredoxin, בנוסף אניון החליפין טיהור באמצעות החליפין אניון הטור ב-pH 8.5 ב 4 ° c הוא הכרחי.
    7. לנתח את המדגם על ידי SDS-PAGE.

2. הפונקציונליזציה של משטח הכיסויים והזיז

  1. משטח שמיכות מתפקד בפונקציונליות
    1. התמוססות 20 גרם של אשלגן כרומאט ב 40 מ ל של מים אולטרה טהורים. לאט להוסיף 360 mL של חומצה גופרתית מרוכזת לפתרון כרומט אשלגן עם מוט זכוכית מערבבים בעדינות להכין את חומצה כרומט.
      התראה: הכימיקל המשמש כאן וחומצה כרומאית הסופי הוא מאוד מאכל חומצי. . לעבוד עם ציוד הגנה מתאים הפתרון משחרר חום כאשר מוסיפים חומצה גופרתית מרוכזת, כלומר הוספה איטית והפוגה נכונה לצינון.
    2. לנקות ולהפעיל שמיכות זכוכית ב 80 ° c עבור 30 דקות על ידי טיפול חומצה אנהידריד. לגמרי לטבול את שמיכות ב 1% (v/v) APTES הפתרון במשך 1 h בטמפרטורת החדר תוך הגנה עליהם מפני אור.
    3. לשטוף את שמיכות עם טולואן ואלכוהול אתיל מוחלטים לייבש את שמיכות עם זרם של חנקן.
    4. מודקון את שמיכות ב 80 ° צ' עבור 15 דקות ואז להתקרר לטמפרטורת החדר.
    5. הוסף 200 μL של sulfo-SMCC (1 מ"ג/mL) ב diמתיל סולפוקסיד (DMSO) פתרון בין שני כיסוי קיבוע מחליק ו מודטה עבור 1 h מוגן מפני אור.
    6. לשטוף את כיסוי עם DMSO הראשון ולאחר מכן עם אלכוהול אתיל מוחלט להסיר sulfo-SMCC שיורית.
    7. תייבש את הסרבל. תחת זרם של חנקן
    8. Pipet 60 μL של 200 μM GL-לטפל50nm-C פתרון חלבון על כיסוי הפונקציונליזציה ו הדגירה עבור כ 3 h.
    9. שטוף את הסרבל עם מים טהורים. כדי להסיר את החומר הבלתי מגיב50 ננומטר
      הערה: כיסוי הפונקציונל מסוגל לשבועיים באחסון ב -4 ° c.
  2. הכנה מפני השטח הפונקציונליזציה
    1. נקו את מנוף התלויה ב 80 ° c עבור 10 דקות על ידי טיפול חומצה כרומאית.
    2. הפונקציונליות של הזיז על ידי אמינו-silanization עם 1% (v/v) aptes טולואן הפתרון ולאחר מכן אופים את הזיז ב 80 ° c עבור 15 דקות לפני שעלה באוב ל sulfo-smcc.
    3. לקשר את C-לטפל50nm-ngl אל פני השטח עם הקבוצה maleimide של SULFO-smcc עבור 1.5 h.
    4. שטוף את החומר הבלתי מגיב50 ננומטר-ngl על שמיכות המים.
    5. לטבול שלוחה פונקציונליזציה ב 200 μL של 50 μM GL-CBM-XDoc פתרון חלבון המכיל 200 nM OaAEP1 ב 25 ° צ' עבור 20-30 דקות. לאחר מכן להשתמש במאגר AFM (100 mM טריס, 100 מ"מ הנאל, pH 7.4) כדי לשטוף את החלבון בלתי הגיב.
      הערה: כימיית המשטח של המנופים והכיסויים דומים.

3. הכנה מפוליפוניים עם רצפים מבוקרים

  1. קשר את יחידת החיבור Coh-tev-L-פוי-NGL ל-50 ננומטר לחיטוי על משטח הכיסויים על ידי OaAEP1 עבור 30 דקות.
  2. השתמש 15-20 mL של מאגר AFM (100 mM טריס, 100 mM הנאקל, pH 7.4) כדי לשטוף את כל החלבונים הבלתי הגיבו.
  3. הוסף 100 μL של פרוטאז TEV (0.5 mM EDTA, 75 mM הנאקל, 25 מ"מ טריס-HCl 10% [v/v] גליצרול, pH 8.0) כדי לקליב את יחידת החלבון באתר TEV לזהות עבור 1 h ב 25 ° c.
  4. השתמש 15-20 mL של מאגר AFM לשטוף את שיורית חלבונים.
  5. קשר את יחידת החיבור Coh-tev-L-פוי-NGL ל-GL-רוב-NGL-זכוכית על ידי OaAEP1 עבור 30 דקות.
  6. חזור על שלבים 3.3 כדי 3.5 N-1 פעמים כדי לבנות חלבון מבנה GL-(רוב)n-ngl על משטח הזכוכית. להשמיט את התגובה האחרונה TEV מחשוף לשריין cohesin על חלבון-פולימר כמו Coh-tev-L-(רוב)n-Ngl-זכוכית.

4. AFM ניסוי מדידה וניתוח נתונים

  1. מדידות AFM
    1. הוסף 1 מ ל של מאגר AFM לחדר עם 10 מ"מ CaCl2 ו 5 חומצה אסקורבית מילימטר.
    2. בחר בקצה D של הבדיקה הפונקציונליזציה של AFM לניסוי. השתמש במשפט שווה כדי לכייל את הזיז במאגר afm עם ערך האביב קבוע מדויק (k) לפני כל ניסוי.
    3. הצמד את קצה הזיז למשטח הדגימה כדי ליצור את הזוג Cohesin/הפריצה.
    4. למשוך את הזיז במהירות מתמדת של 400 ננומטר · s-1 מהמשטח. בינתיים, הקלט את עקומת הכוח בקצב מדגם של 4000 Hz.
  2. ניתוח מידע
    1. השתמש בעיבוד נתונים JPK לבחור עקבות הארכת כוח.
    2. השתמש בתוכנה כדי לנתח את העקבות. התאימו את העקומות עם הדגם של השרשרת הדומה לתולעת (WLC) של אלסטיות פולימריות והשיגו כוח התפתחות ותוספת אורך מתאר לפסגת חלבון בודד התגלגלות.
    3. התאימו את היסטגרמות של כוחות התפתחות עם המודל הגאוסיאני כדי להשיג את הערכים הסבירות ביותר של כוח התפתחות (< Fu>) ואת התוספת אורך המתאר (< ΔLc>).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שאריות NGL הציג בין חלבונים סמוכים על ידי OaAEP1 הקשר לא ישפיע על יציבות החלבון מונומר בפולימר כמו כוח התפתחות (< Fu>), ואת אורך מתאר להגדיל (< ΔLc>) הוא דומה למחקר הקודם (איור 1). תוצאת הטיהור של החלבון rubredoxin מוצג באיור 2. כדי להוכיח את החלבון לאחר מחשוף TEV תואם עם OaAEP1 הקשר הבא כדי לבנות פולימר חלבון עם רצף שליטה הבנייה היא יעילות גבוהה, איור 3 מספק תמונה SDS-PAGE כהפניה. השלבים של הכנת הזיז והכיסויים של הפונקציונליזציה מתוארים באיור 4. הביוסינתזה האנזימטית והשתק של פוליפרוטאין על הכיסויים מוצגים באיור 5. השתמש בפרוטוקול זה, פולימר חלבון עם רצף מבוקר ניתן לבנות ומתאים לניסויים SMFS מבוססי AFM.

Figure 1
איור 1: מדידות SMFS מבוססות AFM של פוליפרוטאין שנבנו על ידי OaAEP1. (א) מסורבי אופייני, הארכת כוחות ומאריכים של "ורוב" (עיקול 1 בכחול) הוצגו בΔLc הצפויות של ~ 23 ננומטר. (ב) העלילה פיזור מציג את הקשר בין כוח התגלגלות התפתחות (202 ± 44 pN, ממוצע ± ש גויטיין, n = 198) ו ΔLc (23 ± 2 ננומטר, ממוצע ± ש גויטיין). איור זה השתנה מ-Ref. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הספקטרום האולטרא-סגול לספיגת האור של gl-GB1-Fe (III)-rd-ngl ו-GL-GB1-(Zn)-rd-ngl. Fe (III)-טופס Rd (הספקטרום השמאלי, בצבע חום, הקוד PDB: 1BRF) הציג טיפוסי UV-Vis פסגות הקליטה ב 495 nm ו 579 nm בעוד Zn-טופס לא (הספקטרום הנכון, צבע ביין, PDB code: 1BRF). איור זה השתנה מ-Ref. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ה-SDS-ג'ל לעמוד תוצאות של העיכול והארכה של TEV פרוטאז וOaAEP1 כדי לבנות את רוב dimer. מסלולים 1 – 4 הראו Coh-tev-L-ושוב, התוצאה החלבון תערובת של מחשוף TEV, מאוד sfgfp-tev פרוטאז מוצר מטוהר (GL-ורוב). שבילים 5 – 7 הראו את התערובת הג GL-ווייב ו-Coh-tev-L-ורוב-אל-הקשר (ליין 5) או ללא (ליין 6) OaAEP1 וOaAEP1 טהורים. איור זה השתנה מ-Ref. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תרשים תהליכים המתאר כל צעד לפונקציונל שמיכות זכוכית וזיז. לאחר ניקוי והפעלה על ידי חומצה אנהידריד, coverslip ושיתוף משותף התהליך פונקציונליות דומה, למעט השלב האחרון שבו GL-לירות50nm-c זוגות עם שמיכות בעוד C-לירות50nm-ngl זוגות עם זיז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תרשים תהליכים המתאר כל צעד לצורך השתק חלבונים על פני השטח. זרימת התהליכים השמאליים העליונים מראה את המבנה החורג של פוליפרוטאין עם רצפים מבוקרים על הכיסויים. התרשים הימני העליון מציג את הכנת הזיז הפונקציונלי המשמש במדידות AFM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: עקבות התגלגלות אופייני של פולימרים החלבון עם רצף מבוקר הגיונית על ידי SMFS מבוססי AFM. (א) מסורבי אופייני, הארכת כוחות וכוח מאריך של ורוב הציגו ΔLc של ~ 23 ננומטר כצפוי. (ב) אופייני כוח הארכת עקומות של Rd הציג ΔLc של ~ 13 ננומטר כצפוי. (ג) כוחות מאריכים טיפוסיים של תערובת החלבון (בקירוב-Rd)n , שבה הפסגה הכחולה פירושה האירועים המתרחשים של ורוב בעוד האדום פירושו Rd. איור זה השתנה מ-Ref. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור משלים 1: ה-SDS-ג'ל לעמוד תוצאות היעילות של החלבון ביחס שונה בין שני מגיב. היעילות הליהיעה הייתה 20% כאשר היחס הוא 1 עד 1 והגיע ל-75% ביחס של 10 ל-1. איור זה השתנה מ-Ref. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תיארנו פרוטוקול לביוסינתזה אנזימטית והשתק של פוליפרוטאין ואימת את עיצוב הפוליפרוטאין באמצעות SMFS מבוסס AFM. מתודולוגיה זו מספקת גישה הרומן לבניית חלבון-פולימרים ברצף מעוצב, אשר משלים את השיטות הקודמות עבור הנדסת פוליפרוטאין ומשתק4,6,52,53,54,55,56,57,58,59, 60,61.

בהשוואה למתודולוגיה הקלאסית רקומביננטי DNA עבור בנייה פוליפרוטאין7,62, השיטה שלנו בסיסים על הקשר בין monomers חלבון קטן. לפיכך, היא מאפשרת ביטוי של מולקולות חלבון בגודל גדול או רעיל עבור בנייה פוליפרוטאין. בנוסף, היא מאפשרת טיהור של מונומר חלבון לפני הקוניוגציה.

לעומת השיטה הנפוצה בשימוש bi-cysteine יצירת קשר קשר דיסולפידי מולקולרי עבור חלבון פולימוניזציה4, שיטת אנזימטית שלנו באמצעות OaAEP1 ו-tev פרוטאז התוצאות של פוליפרוטאין עם רצף נשלט יחסית וגיאומטריה חיבור מוגדר. וזה לא משתמש cysteine, שהוא שאריות פונקציונלי חיוני עבור הרבה חלבונים.

השיטה שלנו דומה בעיקר לקונפטאז המבוססת על חלבון59. התכונה הייחודית של השיטה שלנו היא כי הOaAEP1 חלבון מבוסס על החלבונים הוא הרבה יותר יעיל, ובכך מאפשר בניית החלבון פנטמר עם תשואה סבירה10,53. זה גם צריך פחות שאריות לצורך הארכה ותוצאות מקשר שלוש שאריות NGL קצר יותר. כתוצאה מכך, זה לא מראה "אפקט מקשר" כמו מקשר NGL החדש שנוצר אינו משפיע על היציבות של מונומר חלבון בודדים או לגרום לכל האינטראקציה הטבעית חלבונים חלבון. עם זאת, אנו מאמינים כי לכל השיטות יש יתרונות וחסרונות משלהם. לדוגמה, שיטת ה-DNA הקלאסית רקומביננטי לא מוסיפה שום שאריות בין מונומר החלבון ולא דורשים שימוש באנזים כלשהו לצורך הארכה. והשיטה הדו-ציסטאני פשוטה וקלה לחלבונים. לכן, כולם יכולים להיות שימושיים תחת דרישות נסיוניות שונות.

עבור הבנייה שלנו באופן מושלם של polyprotein, זה חיוני כדי להסיר את החלבון הבלתי מגיב לחלוטין. קח מספיק נפח של מאגר AFM ומספיק זמן כדי לנקות את המשטח הגיב בזהירות. אחרת, החלבון השיורי או הפרוטאז ישפיע על תגובות סינתזה נוספות.

היעילות של OaAEP1 הארכה היא מגבלה קריטית לשיטה שלנו כמו יעילות המחשוף TEV הוא כמעט הושלם (96%). זה קריטי להעלות את היחס בין שני מגיב, GL-חלבון, חלבון-NGL, כדי לשפר את היעילות לתקן. המחקר שלנו מראה כי כאשר חלבון-NGL הוא פי עשרה עד GL-חלבון, היעילות עולה מ -20% (היחס הוא 1 עד 1) עד 75% (איור משלים 1). זה קריטי לצרוך את המגיבים, אשר היה מקיבוע על פני השטח כמו המגיבים בחינם יכול להיות מועבר על ידי שטיפת מאגר. בנוסף, האם המסוף N-או C נחשף לפתרון הוא גם גורם מכריע להארכה. זוהי גישה אופציונלית לחשיפת המסוף על-ידי הוספת מקשר המכיל את האתר המזוהה למסוף המתאים.

בסופו של דבר, הפרוטוקול שלנו הוא דרך אנזימטית כדי לקשור חלבונים ברצף מעוצב. כמו-כן, הוא מספק גישה חלופית לזוג ומשתק דגימות חלבונים במחקרים חד-מולקולות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (גרנט No. 21771103, 21977047), הקרן המדע הטבעי של מחוז ג'יאנגסו (גרנט לא. BK20160639) ו Shuangchuang התוכנית של מחוז ג'יאנגסו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8 (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1 (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41 (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10 (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139 (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8 (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13 (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1 (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11 (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12 (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19 (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9 (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11 (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3 (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39 (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. iJ., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134 (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139 (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9 (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52 (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30 (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57 (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29 (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O'Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49 (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27 (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2 (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116 (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).

Tags

ביוכימיה סוגיה 156 ספקטרוסקופיית כוח מולקולה אחת ביו-קוניוגציה הOaAEP1 חלבון ספקטרוסקופיית כוח אטומי הנדסת חלבונים
OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi,… More

Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter