Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Published: February 5, 2020 doi: 10.3791/60774
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

Burada, protein monomerini kontrollü bir dizi ile protein polimeri oluşturan enzimler tarafından biraraya getirmek ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışmaları için yüzeyde hareketsiz hale getirmek için bir protokol sokuyoruz.

Abstract

Kimyasal ve biyo-konjugasyon teknikleri son yıllarda hızla geliştirilmiş ve protein polimerlerinin oluşturulmasına olanak sağlar. Ancak, kontrollü bir protein polimerizasyon süreci her zaman bir meydan okumadır. Burada, polimerize proteini adım adım rasyonel olarak kontrol edilen bir dizide oluşturmak için enzimatik bir metodoloji geliştirdik. Bu yöntemde, bir protein monomer C-terminus OaAEP1 kullanarak protein çekimi için NGL(Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) N-terminus bir dekolte TEV iken (tütün etch virüs) dekolte sitesi artı bir L (ENLYFQ / GL) geçici N-terminal koruma için. Sonuç olarak, OaAEP1 bir seferde sadece bir protein monomer eklemek başardı, ve sonra TEV proteaz NH2-Gly-Leu ortaya çıkarmak için Q ve G arasındaki N-terminus cleaved. Sonra birim sonraki OaAEP1 ligasyon için hazırdır. Tasarlanmış poliprotein atomik kuvvet mikroskobu tabanlı tek moleküllü kuvvet spektroskopisi (AFM-SMFS) kullanılarak bireysel protein etki alanı açılarak incelenir. Bu nedenle, bu çalışma poliprotein mühendisliği ve immobilizasyon için yararlı bir strateji sağlar.

Introduction

Sentetik polimerler ile karşılaştırıldığında, doğal çok etki alanı proteinleri iyi kontrollü bir sayı ve subdomains1türü ile tek düze bir yapıya sahip. Bu özellik genellikle gelişmiş biyolojik fonksiyon ve kararlılık yol açar2,3. Sistein bazlı disülfür bağı bağlantısı ve rekombinantDNA teknolojisi gibi birçok yaklaşım, birden fazla etki alanı4,5,6,7ile böyle bir polimerize protein oluşturmak için geliştirilmiştir. Ancak, eski yöntem her zaman rasgele ve kontrolsüz bir dizi sonuçlanır, ve ikincisi toksik ve büyük boyutlu proteinlerin aşırı ekspresyonu ve kofaktör ve diğer hassas enzimler ile karmaşık protein saflaştırılması için zorluk da dahil olmak üzere diğer sorunlara yol açar.

Bu zorluğu aşmak için, protein monomerini polimer/poliprotein için adım adım bir şekilde bir protein ligaz OaAEP1 ile proteaz TEV8,9ile birleştiren enzimatik bir yöntem geliştiriyoruz. OaAEP1 sıkı ve etkili bir endopeptidazdır. N-terminus Gly-Leu kalıntısı (GL) ise iki protein Kovalent Olarak Asn-Gly-Leu dizisi (NGL) OaAEP1 tarafından iki termini ile 30 dakikadan daha az ve c-terminus NGL kalıntıları10ise bağlanabilir. Ancak, OaAEP1'in sadece protein monomerini bağlamak için kullanılması, sistein bazlı kaplin yöntemi gibi kontrolsüz bir diziye sahip bir protein polimerine yol açar. Bu nedenle, protein ünitesinin N-terminus'unu çıkarılabilir bir TEV proteaz alanı ve enlyfq/G-L-POI olarak bir lösin kalıntısı ile tasarlıyoruz. TEV bölünmesinden önce, N-terminali OaAEP1 ligasyonuna katılmaz. Ve daha sonra N-terminus gl artıkları, hangi daha fazla OaAEP1 ligasyon ile uyumludur, TEV bölünme sonra maruz kalır. Böylece, nispeten iyi kontrol edilen bir dizi ile poliproteinin sıralı enzimatik biyosentez yöntemini elde ettik.

Burada, adım adım enzimatik sentez yöntemimiz, sekans kontrollü ve kontrolsüz dahil olmak üzere poliprotein numune hazırlamada ve özellikle karmaşık sistem için tek moleküllü çalışmalar için protein immobilizasyonunda kullanılabilir. metalloprotein.

Ayrıca, AFM tabanlı SMFS deneyleri bize tek molekül düzeyinde protein polimer inşaat ve istikrar onaylamak için izin verir. AFM, optik cıvık ve manyetik cıvık da dahil olmak üzere tek moleküllü kuvvet spektroskopisi, biyomolekülü mekanik olarak manipüle etmek ve stabilitelerini ölçmek için nanoteknolojide genel bir araçtır11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Tek moleküllü AFM yaygın protein çalışmasında kullanılmıştır (un)katlama21,22,23,24,25, reseptör-ligandetkileşimininmukavemet ölçümü 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, inorganik kimyasal bağ20,36,37,38,39,40,41,42,43 ve metal-ligand bond metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Burada, tek moleküllü AFM, sentezlenen poliprotein dizisini ilgili protein açılma sinyaline göre doğrulamak için kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Protein üretimi

  1. Gen klonu
    1. Satın alma genleri ilgi protein için kodlama (POI): Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, selüloz bağlayıcı modül (CBM), dockerin-X etki alanı (XDoc) ve Ruminococcus flavefaciencegelen uyum , tütün etch virüs (TEV) protease, elastin-likepeptids (ELP).
    2. Polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirin ve farklı protein parçalarından geni yeniden birleştirmek için üç restriksiyonsindirim enzim sistemi BamHI-BglII-KpnI kullanın.
    3. Tüm genleri doğrudan DNA dizilimi ile doğrulayın.
  2. Proteinlerin ekspresyonu ve üretimi
    1. E. coli BL21(DE3) pQE80L-POI veya pET28a-POI plazmid ile ifade için dönüştürün.
    2. 15 mL LB orta sına tek bir koloni seçin ve ilgili antibiyotikler (örn. 100 μg/mL ampisilin sodyum tuzu veya 50 g/mL, kanamisin). 16-20 saat için 37 °C'de 200 rpm kültürleri sallayarak tutun.
    3. Bir gecede kültürleri 800 mL LB orta (1:50 seyreltme) içine seyreltin. Rubredoxin için, 1.800 x gkültür santrifüj , sonra M9 orta 15 mL yeniden askıya (0.4% glikoz ile takviye, 0.1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4), ve sonra 800 mL M9 orta içine seyreltmek.
    4. Kültür 0,6 000 nm (OD600)optik yoğunluğa ulaşana kadar, 200 rpm sallayarak 37 °C'de kültür kuluçka. Protein ekspresyonunu test etmek için kültürün 100 μL'lik örneğini indüksiyon öncesi kontrol olarak kaydedin.
    5. 1 mM'lik son konsantrasyona IPTG ekleyerek protein ekspresyonunu teşvik edin ve 200 rpm'de 4 saat için 37 °C'de kültürü salla. Protein ekspresyonunu test etmek için indüksiyon sonrası kontrol olarak kültürün 100 μL'lik bir örneğini ayırın.
    6. 4 °C'de 25 dakika için 13.000 x g'de kültürü santrifüj edin ve arınmadan önce -80 °C'de saklayın.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
  3. İlgi proteininin saflaştırılması
    1. 25 mL lysis tampon (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 dNase, RNase, PMSF içeren) hücreleri yeniden askıya alın ve 30 dakika buz üzerinde 30 dakika boyunca lyse için bir sonicator (%15 genlik) kullanın.
    2. 4 °C'de 40 dk için 19.000 x g'de hücre lisatını netleştirin.
    3. Co-NTA veya Ni-NTA yakınlık sütununun 1 mL'sini (yatak hacmi) paketleyin ve kolonu 10 kolon hacmi (CV) ultrasaf su ve ardından 10 CV'lik yıkama tamponu (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazol, pH 7.4) yerçekimi akışı ile yıkayın.
    4. Protein supernatant üç kez yerçekimi akışı ile sütun üzerinden geçirin.
    5. Kirletici proteinleri uzaklaştırmak için 50 CV ile kolon üzerine yıkama tampon dökün.
    6. 3 CV buz gibi elüsyon tamponu (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 7.4) ile bağlı proteini eute. Rubredoksin proteinleri söz konusu olduğunda, 4 °C'de pH 8.5'te aniyon değişim sütunu kullanılarak daha fazla anion değişimi arınması gereklidir.
    7. Örneği SDS-PAGE ile analiz edin.

2. Kapak ve kantil yüzeyinin işlevselleştirilmesi

  1. İşlevli kapak yüzey hazırlığı
    1. 20 g potasyum kromatı 40 mL ultra saf suda çözün. Yavaşça cam çubuk ile potasyum kromat çözeltisi konsantre sülfürik asit 360 mL ekleyin yavaşça karıştırın ve kromik asit hazırlamak için.
      DİkKAT: Burada kullanılan kimyasal ve son kromik asit güçlü aşındırıcı ve asidiktir. Uygun koruyucu ekipmanla çalışın. Çözelti konsantre sülfürik asit eklediğinizde ısı bültenleri, hangi soğutma için yavaş ekleme ve uygun duraklama anlamına gelir.
    2. Kromik asit tedavisi ile 80 °C'de 30 dakika boyunca cam kapaklı bir sıvıyı temizleyin ve çalıştırın. Kapakları %1 (v/v) APTES toluen çözeltisine oda sıcaklığında 1 saat batırırken ışıktan tamamen koruyun.
    3. Coverslip'i toluen ve mutlak etil alkolle yıkayın ve kapağı bir nitrojen akışı yla kurulayın.
    4. Coverslip'i 80 °C'de 15 dk kuluçkaya yatırın ve oda sıcaklığına kadar soğutun.
    5. İki immobilize kapak ve inkübatör arasına dimetil sülfoksit (DMSO) çözeltisi içinde 200 μL sulfo-SMCC (1 mg/mL) ekleyin.
    6. Artık sulfo-SMCC'yi çıkarmak için önce DMSO ve ardından mutlak etil alkol ile kapak kaymasını yıkayın.
    7. Bir azot deresi altında kapak kayma kuru.
    8. Pipet 60 μL 200 μM GL-ELP50nm-C protein çözeltisi üzerine fonksiyonel coverslip ve kuluçka yaklaşık 3 saat.
    9. Reaksiyona girilmemiş GL-ELP50nm-C'yi çıkarmak için coverslip'i ultra saf suyla yıkayın.
      NOT: İşlevselleştirilmiş kapaklar 4 °C'de yaklaşık iki hafta boyunca depolanır.
  2. İşlevselleştirilmiş cantilever yüzey hazırlığı
    1. Konisi kromik asit tedavisi ile 10 dk boyunca 80 °C'de temizleyin.
    2. % 1 (v/v) APTES toluen çözeltisi ile amino-silanizasyon ile cantilever fonksiyonel ve daha sonra sulfo-SMCC konjugating önce 15 dakika boyunca 80 °C'de kantili pişirin.
    3. C-ELP50nm-NGL'yi 1,5 saat boyunca sulfo-SMCC'nin maleimid grubu ile yüzeye bağla.
    4. Reaksiyona yanmamış C-ELP50nm-NGL'yi ultra saf su yla kapak üzerinde yıkayın.
    5. 20-30 dk boyunca 200 nM OaAEP1 içeren 50 μM GL-CBM-XDoc protein çözeltisinin 200 μL'lik işlevselleştirilmiş bir kantilini 25 °C'de batırın. Daha sonra reaksiyona girilmemiş proteini temizlemek için AFM tamponunu (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) kullanın.
      NOT: Kantinlerin yüzey kimyası ve kapak kayması benzerdir.

3. Kontrollü dizili stepwise poliprotein preparatı

  1. OaAEP1 tarafından 30 dakika boyunca kapak yüzeyinde hareketsiz hale getirilen GL-ELP50nm'ye ligasyon ünitesi Coh-tev-L-POI-NGL bağlayın.
  2. Tepkimeyen proteinleri temizlemek için 15-20 mL AFM tampon (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) kullanın.
  3. TEV'deki protein ünitesini 25 °C'de 1 saat süreyle ayırmak için 100 μL TEV proteaz (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl %10 [v/v] gliserol, pH 8.0) ekleyin.
  4. Artık proteinleri temizlemek için 15-20 mL AFM tampon kullanın.
  5. Ligasyon ünitesi Coh-tev-L-POI-NGL'yi OaAEP1'in GL-Ub-NGL-Glass'ına 30 dakika boyunca bağlayın.
  6. Cam yüzeyinde GL-(Ub) n-NGL protein ibaratınıoluşturmak için 3,3 ila 3,5 N-1 kez adımları tekrarlayın. Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass olarak protein-polimer üzerinde rezerv kohesin için son TEV dekolte reaksiyonu atlayın.

4. AFM Deney ölçümü ve veri analizi

  1. AFM ölçümleri
    1. 10 mM CaCl2 ve 5 mM Askorbik Asit ile hazneye 1 mL AFM tampon ekleyin.
    2. Deneme için işlevselleştirilmiş AFM sondasının D ucunu seçin. Her denemeden önce afm arabelleğindeki kantili(k)değeriyle kalibre etmek için eşitlik teoremini kullanın.
    3. Cohesin/Dockerin çiftini oluşturmak için kantilever ucunu numune yüzeyine takın.
    4. Kantili yüzeyden sabit bir hızda 400 nm·s−1'den geri çekin. Bu arada, kuvvet uzatma eğrisini 4000 Hz'lik bir örneklem hızında kaydedin.
  2. Veri analizi
    1. JPK veri işleme seçme kuvvet uzantısı izlemelerini kullanın.
    2. İzleri analiz etmek için yazılımı kullanın. Polimer elastikiyetinin solucan benzeri zincir (WLC) modeliyle eğrileri sığdırın ve bireysel protein iniştirme zirvesi için açılma kuvveti ve kontur uzunluğu artışını elde edin.
    3. Açılma kuvvetinin (u>) ve kontur uzunluğu artışını (<ΔLc>) en olası değerleri elde etmek için Gaussian modeliile açılma kuvvetlerinin histogramlarını sığdırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

OaAEP1 ligasyonu ile komşu proteinler arasında tanıtılan NGL artıkları polimerdeki protein monomer stabilitesini etkilemez, zira açılma kuvveti (u>) ve kontur uzunluğu artış (<ΔLc>) önceki çalışmayla karşılaştırılabilir(Şekil 1). Rubredoksin proteininin arınma sonucu Şekil 2'degösterilmiştir. TEV dekoltesi sonrası proteini kanıtlamak için aşağıdaki OaAEP1 ligasyonu ile uyumlu durarak protein polimerini kontrol sırası ile oluşturmak ve yapıyüksek verimli dir, Şekil 3 referans olarak Bir SDS-PAGE görüntüsü sağlar. İşlevselleştirilmiş kantilever ve coverslip hazırlama adımları Şekil 4'teaçıklanmıştır. Poliproteinin kapak kaymasında adım adım enzimatik biyosentez imal edilmesi ve immobilizasyonu Şekil 5'tegösterilmiştir. Bu protokolü kullanın, kontrollü dizili bir protein polimeri oluşturulabilir ve AFM tabanlı SMFS deneyleri için uygundur.

Figure 1
Şekil 1: OaAEP1 tarafından üretilen poliproteinin AFM tabanlı SMFS ölçümleri. (A) Ub'un tipik testere dişi benzeri kuvvet uzatma eğrileri (mavi eğri 1) beklenen ΔLc ~23 nm ile gösterilmiştir. (B) Dağılım çizimi Ub açma kuvveti (202 ± 44 pN, ortalama ± s.d., n = 198) ve ΔLc (23 ± 2 nm, ortalama ± s.d.) arasındaki ilişkiyi sunar. Bu rakam Ref.8'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: GL-GB1-Fe(III)-Rd-NGL ve GL-GB1-(Zn)-Rd-NGL UV-Vis emici spektrumları. Fe(III)-form Rd (Sol spektrum, kahverengi renkli, PDB kodu:1BRF) zn formu (Sağ spektrum, şarap renkli, PDB kodu: 1IRN) iken 495 nm ve 579 nm tipik UV-Vis emilim zirveleri sundu. Bu rakam Ref.8'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Ub dimer oluşturmak için TEV proteaz ve OaAEP1 kullanarak adım adım sindirim ve ligasyon SDS-PAGE jel sonuçları. Lanes 1-4 Coh-tev-L-Ub gösterdi, TEV dekolte sonucu protein karışımı, saf sfGFP-TEV proteaz ve saflaştırılmış ürün (GL-Ub). Lanes 5-7 (Lane 5) veya olmadan (Lane 6) OaAEP1 ve saf OaAEP1 ile yarık GL-Ub ve Coh-tev-L-Ub-NGL ligasyon karışımı gösterdi. Bu rakam Ref.8'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Cam kapakları ve kantilever'i işlevselleştirmek için her adımı açıklayan proses grafiği. Kromik asit ile temizlik ve aktivasyon dan sonra, coverslip ve cantilever benzer işlevselleştirme işlemi paylaşmak, hangi gl-ELP50nm-C coverslip ile çiftler son adım hariç, C-ELP50nm-NGL çiftler cantilever ile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Yüzeydeki poliprotein immobilizasyonu için her adımı açıklayan proses grafiği. Sol üst proses akış diyagramı, kapak kaymasında kontrollü diziler bulunan poliproteinin adım adım sallanırken, Sağ üst diyagram, AFM ölçümlerinde kullanılan işlevselleştirilmiş kantilin hazırlanmasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: AFM tabanlı SMFS tarafından rasyonel olarak kontrol edilen bir dizi ile protein polimerlerinin tipik açılma izleri. (A) Ub'un tipik testere dişi benzeri kuvvet uzatma eğrileri beklendiği gibi ~23 nm ΔLc sundu. (B) Rd'nin tipik kuvvet uzatma eğrileri beklendiği gibi ~13 nm ΔLc'yi sundu. (C) Tipik kuvvet uzatma eğrileri (Ub-Rd)n protein karışımı hangi mavi tepe Ub açılma olayları anlamına gelir ise kırmızı Rd anlamına gelir. Bu rakam Ref.8'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Ek Şekil 1: SDS-PAGE jel sonuçları protein ligasyon verimliliği iki reaktan arasında farklı bir oran altında. Oran 1'e 1 olduğunda ligasyon verimi %20 idi ve 10-1 oranında %75'e ulaştı. Bu rakam Ref.8'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Enzimatik biyosentez ve poliproteinimmobilizasyonu için bir protokol tanımladık ve afm tabanlı SMFS tarafından poliprotein tasarımını doğruladık. Bu metodoloji, poliprotein mühendisliği ve immobilizasyon4,6,52, 53,54,55,56,57,58,59,60,61için önceki yöntemleri tamamlayan tasarlanmış bir dizi, protein-polimer bina için yeni bir yaklaşım sağlar.

Poliprotein konstrüksiyonu için klasik rekombinant DNA metodolojisi ile karşılaştırıldığında7,62, bizim yöntem küçük protein monomerler arasındaki ligasyon bazlar. Böylece, poliprotein yapımı için büyük boyutlu veya toksik protein moleküllerinin ifade sağlar. Ayrıca, konjugasyon önce protein monomer saflaştırma sağlar.

Protein polimerizasyonu için moleküler disülfür bağı oluşturan yaygın olarak kullanılan bi-sistein yöntemi ile karşılaştırıldığında4,hem OaAEP1 hem de TEV proteazı kullanarak enzimatik yöntemimiz nispeten kontrollü bir dizi ve tanımlanmış bağlantı geometrisi ile bir poliprotein ile sonuçlanır. Ve sistein kullanmaz, birçok protein için gerekli bir fonksiyonel kalıntı.

Yöntemimiz çoğunlukla sortaz bazlı protein çekimi59benzer. Yöntemimizin benzersiz özelliği, OaAEP1 bazlı protein ligasyonunun çok daha verimli olması, böylece makul bir verim10,53ile protein pentamer yapımına olanak sağlamasıdır. Ayrıca ligasyon için daha az kalıntı ihtiyacı ve daha kısa bir üç kalıntı NGL bağlayıcı sonuçları. Sonuç olarak, yeni oluşan NGL bağlayıcı bireysel protein monomer istikrarını etkilemez veya herhangi bir doğal olmayan protein-protein etkileşimini neden olarak hiçbir "bağlayıcı etkisi" gösterir. Yine de, tüm yöntemlerin kendi avantajları ve dezavantajları olduğuna inanıyoruz. Örneğin, klasik rekombinant DNA yöntemi protein monomer arasında herhangi bir kalıntı eklemez ve ligasyon için herhangi bir enzim kullanımını gerektirmez. Ve bi-sistein yöntemi basit ve protein polimerizasyonu için kolaydır. Böylece, hepsi farklı deneysel gereksinimleri altında yararlı olabilir.

Poliproteinbizim adım adım yapı için, tamamen tepkisiz protein kaldırmak için çok önemlidir. AFM arabelleği yeterli hacim ve dikkatle tepki yüzeyi temizlemek için yeterli zaman alın. Aksi takdirde, artık protein veya proteaz daha fazla sentez reaksiyonları etkileyecektir.

TEV dekolte verimi neredeyse tamamlandıkça OaAEP1 ligasyonunun etkinliği metodumuz için kritik bir sınırdır (%96). Ligasyon verimliliğini artırmak için iki reaktan gl-protein ve protein-NGL arasındaki oranı yükseltmek için önemlidir. Çalışmamız protein-NGL GL-protein on kat olduğunda, verimlilik% 20 (oran 1-1) için% 75(Ek Şekil 1)artar göstermektedir. Serbest reaktan tamponla yıkanarak hareket ettirebildiği için yüzeye hareketsiz hale getirilen reaktanı tüketmek çok önemlidir. Ayrıca, N- veya C- terminus çözeltisine maruz olup olmadığını da ligasyon için önemli bir faktördür. Tanınan siteyi içeren bir bağlayıcıyı ilgili terminale ekleyerek terminali ortaya çıkarmak isteğe bağlı bir yaklaşımdır.

Sonuç olarak, protokolümüz proteinleri tasarlanmış bir dizide biraraya getirmek için enzimatik bir yoldur. Ayrıca çift için alternatif bir yaklaşım sağlar ve tek moleküllü çalışmalarda protein örnekleri immobilize.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 21771103, 21977047), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No) tarafından desteklenmiştir. BK20160639) ve Jiangsu Eyaleti Shuangchuang Programı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8 (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1 (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41 (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10 (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139 (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8 (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13 (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1 (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11 (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12 (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19 (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9 (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11 (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3 (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39 (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. iJ., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134 (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139 (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9 (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52 (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30 (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57 (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29 (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O'Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49 (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27 (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2 (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116 (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).

Tags

Biyokimya Sayı 156 tek moleküllü kuvvet spektroskopisi biyo-konjugasyon protein immobilizasyonu atomik kuvvet spektroskopisi OaAEP1 protein mühendisliği
OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi,… More

Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter