Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

Published: February 5, 2020 doi: 10.3791/60774
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para conjugar o monômero proteico por enzimas que formam polímero de proteína com uma sequência controlada e imobilizá-lo na superfície para estudos de espectroscopia de força de molécula única.

Abstract

Técnicas químicas e de bioconjugação foram desenvolvidas rapidamente nos últimos anos e permitem a construção de polímeros proteicos. No entanto, um processo controlado de polimerização proteica é sempre um desafio. Aqui, desenvolvemos uma metodologia enzimática para a construção de proteína polimerizada passo a passo em uma sequência racionalmente controlada. Neste método, o C-terminus de um monomer proteico é NGL para conjugação de proteínas usando o oaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) enquanto o N-terminus foi um site de decote tev (vírus etch de tabaco) cleavable mais um L (ENLYFQ/GL) para proteção temporária n-terminal. Consequentemente, o OaAEP1 foi capaz de adicionar apenas um monomer de proteína de cada vez, e então o TEV protease cedeu o N-terminus entre Q e G para expor o NH2-Gly-Leu. Em seguida, a unidade está pronta para a próxima ligadura OaAEP1. A poliproteína projetada é examinada por um uso do domínio proteico individual usando espectroscopia de força única baseada em microscopia atômica (AFM-SMFS). Portanto, este estudo fornece uma estratégia útil para a engenharia de poliproteínas e a imobilização.

Introduction

Em comparação com polímeros sintéticos, proteínas naturais multidomínios têm uma estrutura uniforme com um número bem controlado e tipo de subdomínios1. Esse recurso geralmente leva a uma melhor função biológica e estabilidade2,3. Muitas abordagens, como acoplamento de ligação de dimisina à base de cisínea e tecnologia de DNA recombinante, foram desenvolvidas para a construção de uma proteína polimerizada com múltiplos domínios4,5,6,7. No entanto, o método anterior sempre resulta em uma sequência aleatória e descontrolada, e o último leva a outros problemas, incluindo a dificuldade para a superexpressão de proteínas tóxicas e de grande porte e a purificação de proteínas complexas com cofator e outras enzimas delicadas.

Para enfrentar esse desafio, desenvolvemos um método enzimático que conjuga monomer proteático em conjunto para polímero/poliproteína de forma stepwise usando uma proteína ligase OaAEP1 combinada com um TEV 8protease,9. OaAEP1 é uma endopeptidase rigorosa e eficiente. Duas proteínas podem ser ligadas covalentemente como sequência Asn-Gly-Leu (NGL) através de dois termini por OaAEP1 em menos de 30 min se o N-terminus for resíduos Gly-Leu (GL) e a outra do qual o terminal C é resíduos NGL10. No entanto, o uso do OaAEP1 apenas para ligar o monômero de proteína leva a um polímero proteico com uma sequência descontrolada como o método de acoplamento à base de cisteína. Portanto, projetamos o N-terminus da unidade proteica com um local protease TEV removível mais um resíduo de leucina como ENLYFQ/G-L-POI. Antes do decote TEV, o n-terminal não participaria da ligadura OaAEP1. E então os resíduos GL no N-terminus, que são compatíveis com a ligadura OaAEP1, são expostos após o decote TEV. Assim, alcançamos um método sequencial de biosíntese enzimática de poliproteína com uma sequência relativamente bem controlada.

Aqui, nosso método de síntese enzimática stepwise pode ser usado na preparação de amostras de poliproteína, incluindo controlado por sequência e descontrolado, e imobilização proteica para estudos de moléculaúnica também, especialmente para o sistema complexo, como metaloproteína.

Além disso, os experimentos de SMFS baseados em AFM nos permitem confirmar a construção e estabilidade do polímero de proteína no nível de uma única molécula. A espectroscopia de força de molécula única, incluindo AFM, pinça óptica e pinça magnética, é uma ferramenta geral na nanotecnologia para manipular a biomolécula mecanicamente e medir sua estabilidade11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. A AFM de molécula única tem sido amplamente utilizada no estudo da proteína (un)dobrável21,22,23,24,25, a medida de força do receptor-ligand interação26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, ligação química inorgânica20,36,37,38,39,40,41,42,43e metal-ligand vínculo em metaloproteína44,45,46,47,48,49, 50 . Aqui, a AFM de uma única molécula é usada para verificar a sequência de poliproteína sintetizada com base no sinal de desdobramento da proteína correspondente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produção de proteínas

  1. Clone genético
    1. Compre genes codificando para a proteína de interesse (POI): Ubiquitina, Rubredoxina (RD)51, o módulo de ligação de celulose (CBM), o domínio dockerin-X (XDoc) e coesão de Ruminococcus flavefacience,protease do vírus da gravação de tabaco (TEV), polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs).
    2. Realize a reação da cadeia de polimerase e use o sistema de enzimas de digestão de três restrições BamHI-BglII-KpnI para recombinar o gene de diferentes fragmentos de proteína.
    3. Confirme todos os genes por sequenciamento de DNA direto.
  2. Expressão e produção de proteínas
    1. Transforme E. coli BL21(DE3) com o pQE80L-POI ou pET28a-POI plasmid para expressão.
    2. Escolha uma única colônia em 15 mL de meio LB com respectivos antibióticos (por exemplo, 100 μg/mL ampicillin sódio sal ou 50 μg/mL, kanamicina). Continue agitando as culturas a 200 rpm a 37 °C por 16-20 h.
    3. Diluir as culturas durante a noite em 800 mL de meio LB (1:50 diluição). Para rubdoxina, centrífuga da cultura a 1.800 x g, depois resuspender em 15 mL de m9 médio (complementado com 0,4% de glicose, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4), e depois diluí-la em 800 mL de m9 médio.
    4. Incuba r$ 37 °C enquanto treme a 200 rpm, até que a cultura atinja uma densidade óptica de 600 nm (OD600) de 0,6. Economize 100 μL amostra da cultura como o controle pré-indução para testar a expressão proteica.
    5. Induzir a expressão proteica adicionando IPTG a uma concentração final de 1 mM e agitar a cultura a 37 °C por 4h a 200 rpm. Reserve uma amostra de 100 μL da cultura como o controle pós-indução para testar a expressão proteica.
    6. Centrífuga a cultura a 13.000 x g por 25 min a 4 °C e armazenar a -80 °C antes da purificação.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
  3. Purificação da proteína de interesse
    1. Resuspender as células em 25 mL de tampão de lise (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 contendo DNase, RNase, PMSF) e usar um sônico (15% amplitude) para lyse-lo por 30 min no gelo.
    2. Esclareça o lysato celular em 19.000 x g por 40 min a 4 °C.
    3. Embalar 1 mL (volume de cama) da coluna de afinidade Co-NTA ou Ni-NTA e lavar a coluna com 10 volumes de coluna (CV) de água ultrapura e, em seguida, 10 CVs de tampão de lavagem (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazol, pH 7.4) por fluxo de gravidade.
    4. Passe a proteína supernatante através da coluna pelo fluxo de gravidade por três vezes.
    5. Despeje o tampão de lavagem na coluna com 50 CVs para afastar proteínas contaminantes.
    6. Elute a proteína vinculada com 3 CVs de tampão de elusão gelada (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 7.4). Quando se trata de proteínas de rubredoxina, é necessário mais purificação de troca de aniô sussura utilizando coluna de troca de aniôon em pH 8,5 a 4 °C.
    7. Analise a amostra pelo SDS-PAGE.

2. Funcionalidade de deslizamento de cobertura e superfície cantilever

  1. Preparação da superfície do deslizamento de cobertura funcional
    1. Dissolva 20 g de cromador de potássio em 40 mL de água ultrapura. Adicione lentamente 360 mL de ácido sulfúrico concentrado à solução cromador de potássio com haste de vidro mexa suavemente e prepare o ácido cromômico.
      ATENÇÃO: O produto químico usado aqui e o ácido cromômico final é fortemente corrosivo e ácido. Trabalhe com equipamentos de proteção adequados. A solução libera calor quando adiciona ácido sulfúrico concentrado, o que significa adição lenta e pausa adequada para resfriamento.
    2. Limpe e ative um deslizamento de cobertura de vidro a 80 °C por 30 min por tratamento de ácido cromômico. Mergulhe completamente os deslizamentos de cobertura em 1% (v/v) Solução de toluea APTES por 1h à temperatura ambiente, protegendo-os da luz.
    3. Lave o deslizamento de cobertura com tolueno e álcool etílico absoluto e seque o deslizamento de cobertura com um fluxo de nitrogênio.
    4. Incubar o deslizamento de cobertura a 80 °C por 15 min e depois esfriar até a temperatura ambiente.
    5. Adicione 200 μL de sulfo-SMCC (1 mg/mL) na solução de sulfoxida de dimetil (DMSO) entre dois coverslips imobilizados e incubar por 1 h protegido da luz.
    6. Lave o deslizamento de cobertura com DMSO primeiro e depois com álcool etílico absoluto para remover sulfo-sMCC residual.
    7. Seque o deslizamento um fluxo de nitrogênio.
    8. Tubo de 60 μL de 200 μM GL-ELP50nm-C solução de proteína em um deslizamento de cobertura funcional e incubar por cerca de 3 h.
    9. Lave o deslizamento de cobertura com água ultrapura para remover o GL-ELP50nm-C não reagido.
      NOTA: Os coverslips funcionais são capazes por cerca de duas semanas armazenamento a 4 °C.
  2. Preparação da superfície cantilever funcionalizada
    1. Limpe os cantilevers a 80 °C por 10 min por tratamento de ácido cromômico.
    2. Funcionalize o cantilever por amino-silanização com 1% (v/v) Solução de tolueno APTES e, em seguida, asse o cantilever a 80 °C por 15 min antes de conjugar para sulfo-SMCC.
    3. Ligue o C-ELP50nm-NGL à superfície com o grupo maleimida do sulfo-SMCC por 1,5 h.
    4. Lave o C-ELP50nm-NGL não reagido no deslizamento de cobertura por água ultrapura.
    5. Mergulhe um cantilever funcional em 200 μL de 50 μM solução de proteína GL-CBM-XDoc contendo 200 nM OaAEP1 a 25 °C por 20-30 min. Em seguida, use buffer AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) para lavar proteína não reagida.
      NOTA: A química superficial dos cantilevers e o deslizamento de cobertura são semelhantes.

3. Preparação de poliproteína stepwise com sequências controladas

  1. Conecte a unidade de ligação Coh-tev-L-POI-NGL ao GL-ELP50nm imobilizado na superfície do deslizamento de cobertura pela OaAEP1 por 30 min.
  2. Use 15-20 mL de tampão AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) para lavar quaisquer proteínas não reagidas.
  3. Adicione 100 μL de PROTEase TEV (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] glicerol, pH 8.0) para cortar a unidade proteica no TEV reconhecer o local por 1h a 25 °C.
  4. Use 15-20 mL de tampão AFM para lavar proteínas residuais.
  5. Conecte a unidade de ligação Coh-tev-L-POI-NGL ao GL-Ub-NGL-Glass da OaAEP1 por 30 min.
  6. Repita os passos 3,3 a 3,5 N-1 vezes para construir proteínas construa GL-(Ub)n-NGL na superfície do vidro. Omita a última reação do decote TEV à reserva de coesão no polímero de proteína supor como Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass.

4. Medição do experimento AFM e análise de dados

  1. Medições de AFM
    1. Adicione 1 mL de tampão AFM à câmara com 10 mM CaCl2 e 5 mM Ácido Ascórbico.
    2. Escolha a ponta D da sonda AFM funcionalizada para o experimento. Use o teorema da equipartição para calibrar o cantilever no buffer AFM com um valor de constante de mola precisa(k)antes de cada experimento.
    3. Conecte a ponta cantilever à superfície da amostra para formar o par Coeoso/Dockerin.
    4. Retraia o cantilever a uma velocidade constante de 400 nm·s−1 da superfície. Enquanto isso, registre a curva de extensão de força a uma taxa amostral de 4000 Hz.
  2. Análise de dados
    1. Use o processamento de dados JPK selecione traços de extensão de força selecionados.
    2. Use software para analisar os traços. Encaixe as curvas com o modelo de corrente de verme (WLC) de elasticidade do polímero e obtenha força desdobrada e incremento de comprimento de contorno para o pico de desdobramento da proteína individual.
    3. Encaixe os histogramas das forças desdobradas com o modelo gaussiano para obter os valores mais prováveis de força desdobrada (u>) e incremento de comprimento de contorno (<ΔLc>).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Os resíduos ngl introduzidos entre proteínas adjacentes pela ligadura OaAEP1 não afetarão a estabilidade do monômero de proteína sonímero no polímero como a força desdobrada (u>), e o incremento de comprimento de contorno (<ΔLc>) é comparável com o estudo anterior (Figura 1). O resultado purificatório da proteína rubredoxina é mostrado na Figura 2. Para provar a proteína após o decote TEV ser compatível com a seguinte ligadura OaAEP1 para construir polímero de proteína com uma sequência de controle e a construção é de alta eficiência, a Figura 3 fornece uma imagem SDS-PAGE como referência. As etapas da preparação do cantilever funcional e do deslizamento de cobertura são descritas na Figura 4. A biosíntese enzimática stepwise e a imobilização da poliproteína no deslizamento de cobertura são mostrados na Figura 5. Use este protocolo, um polímero proteico com a sequência controlada pode ser construído e adequado para experimentos sMFS baseados em AFM.

Figure 1
Figura 1: Medições sMFS baseadas em AFM de poliproteína construídas pela OaAEP1. (A) Curvas típicas de extensão de força semelhante a dente-de-serra de Ub (curva 1 em azul) foram mostradas com δLc esperado de ~23 nm. (B) A trama de dispersão apresenta a relação entre ub desdobramento da força (202 ± 44 pN, média ± s.d., n = 198) e ΔLc (23 ± 2 nm, média ± s.d.). Este número foi modificado a partir de Ref.8. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: O espectro de absorção UV-Vis de GL-GB1-Fe(III)-Rd-NGL e GL-GB1-(Zn)-Rd-NGL. O Fe(III)-form Rd (espectro esquerdo, colorido em marrom, código PDB:1BRF) apresentou picos típicos de absorção UV-Vis em 495 nm e 579 nm, enquanto o zn-form não (espectro direito, colorido no vinho, código PDB: 1IRN). Este número foi modificado a partir de Ref.8. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 3
Figura 3: Resultados de gel SDS-PAGE de digestão e ligadura stepwise usando PROTEase TEV e OaAEP1 para construir o dimer Ub. As pistas 1-4 mostraram Coh-tev-L-Ub, a mistura de proteína resultante do decote TEV, protease gfp-TEV puro e produto purificado (GL-Ub). As pistas 5-7 mostraram a mistura de ligadura GL-Ub e Coh-tev-L-Ub-NGL com (Lane 5) ou sem (Pista 6) OaAEP1 e OaAEP1 pura. Este número foi modificado a partir de Ref.8. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 4
Figura 4: Gráfico de processo descrevendo cada passo para funcionalidade de tampas de vidro e cantilever. Após a limpeza e ativação por ácido cromômico, o deslizamento de cobertura e o cantilever compartilham processo de funcionalização semelhante, exceto o último passo em que gl-ELP50nm-C casais com tampa, enquanto c-ELP50nm-NGL casais com cantilever. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 5
Figura 5: Gráfico de processo descrevendo cada passo para a imobilização da poliproteína na superfície. O diagrama de fluxo de processo superior esquerdo mostra a construção stepwise da poliproteína com sequências controladas no deslizamento de cobertura. O diagrama superior direito mostra a preparação do cantilever funcional usado nas medições de AFM. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 6
Figura 6: Traços típicos dos polímeros proteicos com uma sequência racionalmente controlada pelo SMFS baseado em AFM. (A)Curvas típicas de extensão de força semelhantes a dente-de-dente de Ub apresentaram ΔLc de ~23 nm como esperado. (B) As curvas típicas de extensão de força de Rd apresentaram ΔLc de ~13 nm como esperado. (C) Curvas típicas de extensão de força da mistura de proteína (Ub-Rd)n em que o pico azul significa os eventos desdobramentos de Ub enquanto o vermelho significa Rd. Este número foi modificado a partir de Ref.8. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 6
Figura Suplementar 1: SDS-PAGE gel resultados da eficiência da ligação proteica diferente sanção entre dois reagentes. A eficiência da ligação foi de 20% quando a proporção é de 1 para 1 e atingiu 75% na proporção de 10 para 1. Este número foi modificado a partir de Ref.8. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Descrevemos um protocolo de biossíntese enzimática e imobilização da poliproteína e verificamos o projeto de poliproteína pela SMFS baseada em AFM. Essa metodologia fornece uma nova abordagem para a construção do polímero proteico em uma sequência projetada, que complementa métodos anteriores para engenharia de poliproteína e imobilização4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61.

Comparado com a clássica metodologia de DNA recombinante para construção depoliproteínas 7,62, nosso método baseia-se na ligação entre pequenos monômeros proteicos. Assim, permite a expressão de moléculas de proteínas de grande porte ou tóxicas para construção de poliproteínas. Além disso, permite a purificação do monomer proteico antes da conjugação.

Comparado com o método bi-cisínea amplamente utilizado formando ligação de dimsulfeto intermolecular para polimerização deproteínas 4,nosso método enzimático usando protease OaAEP1 e TEV resulta em uma poliproteína com uma sequência relativamente controlada e geometria de conexão definida. E não usa cisteína, que é um resíduo funcional essencial para muitas proteínas.

Nosso método é principalmente semelhante à conjugação proteica à base de espécie59. A característica única do nosso método é que a ligadura proteica baseada em OaAEP1 é muito mais eficiente, permitindo assim a construção de pentamer proteico com um rendimento razoávelde 10,53. Também precisa de menos resíduos para ligadura e resulta em um linker NGL de três resíduos mais curto. Como resultado, não mostra nenhum "efeito linker", pois o recém-formado linker NGL não afeta a estabilidade do monomer de proteína individual ou induz qualquer interação proteína-proteína não natural. No entanto, acreditamos que todos os métodos têm suas próprias vantagens e desvantagens. Por exemplo, o método clássico de DNA recombinante não adiciona nenhum resíduo entre o monômero de proteína e não requer o uso de nenhuma enzima para ligadura. E o método bi-cisteína é simples e fácil para a polimerização proteica. Assim, todos eles podem ser úteis diferentes requisitos experimentais.

Para nossa construção stepwise da poliproteína, é crucial remover completamente a proteína não reagida. Tome bastante volume de tampão AFM e tempo suficiente para limpar a superfície reagida cuidadosamente. Caso contrário, a proteína residual ou protease afetará novas reações de síntese.

A eficiência da ligadura OaAEP1 é um limite crítico para o nosso método, já que a eficiência do decote TEV está quase completa (96%). É fundamental aumentar a proporção entre os dois reagentes, a PROTEÍNA GL e a proteína-NGL, para melhorar a eficiência da ligação. Nosso estudo mostra que quando a proteína-NGL é dez vezes maior para a proteína GL, a eficiência aumenta de 20% (a proporção é de 1 para 1) para 75%(Figura Suplementar 1). É fundamental consumir o reagedor, que foi imobilizado na superfície, pois o reagidor livre pode ser movido lavando com tampão. Além disso, se o terminal N ou C está exposto à solução também é um fator crucial para a ligação. É uma abordagem opcional para expor o terminal adicionando um linker contendo o local reconhecido ao respectivo terminal.

No final, nosso protocolo é uma maneira enzimática de conjugar proteínas em uma sequência projetada. Também fornece uma abordagem alternativa para acasalar e imobilizar amostras de proteínas em estudos de moléculaúnica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant no. 21771103, 21977047), Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (Grant No. BK20160639) e Shuangchuang Program of Jiangsu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8 (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1 (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41 (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10 (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139 (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8 (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13 (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1 (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11 (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12 (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19 (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9 (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11 (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3 (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39 (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. iJ., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134 (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139 (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9 (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52 (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30 (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57 (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29 (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O'Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49 (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27 (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2 (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116 (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).

Tags

Bioquímica Edição 156 espectroscopia de força de molécula única bioconjugação imobilização proteica espectroscopia da força atômica OaAEP1 engenharia de proteínas
Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi,… More

Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter