Summary
Bu protokol, çevirisel biyobelirteç analizi için kullanılabilecek klinik çalışma alanında yüksek kaliteli PBMC ve plazma biyosampllerinin klinik olarak uygulanabilir hazırlanmasını detaylandırır.
Abstract
Periferik kandaki biyobelirteçlerin analizi, tedavinin etkilerini değerlendirmek için mekanizma kanıtı oluşturmak ve terapötiklerin doz ve program ayarını yönlendirmeye yardımcı olmak için klinik çalışmalarda giderek daha önemli hale gelmektedir. Tek bir kan çekiminden periferik kan mononükleer hücreleri izole edilebilir ve protein belirteçlerini analiz etmek ve ölçmek için işlenebilir ve dolaşımdaki tümör DNA'larının, sitokinlerin ve plazma metabolomiklerinin analizi için plazma örnekleri kullanılabilir. Bir tedaviden alınan uzunlamasına örnekler, belirli bir protein belirtecinin evrimi, mutasyon durumu ve hastanın immünolojik manzarası hakkında bilgi sağlar. Bu, ancak periferik kanın işlenmesi klinik bölgelerde etkili bir şekilde gerçekleştirilirse ve numuneler başucundan tezgaha uygun şekilde korunursa elde edilebilir. Burada, çok merkezli klinik çalışmalarda PBMC peletleri ve plazma örnekleri elde etmek için klinik sahalarda uygulanabilecek, hastane laboratuvarlarındaki klinik profesyonellerin teknik uzmanlık düzeylerine bakılmaksızın yüksek kaliteli örnekleri başarıyla sağlamalarını sağlayacak optimize edilmiş bir genel amaçlı protokol sunuyoruz. Daha spesifik aşağı akış analitik yöntemleri için optimize edilmiş alternatif protokol varyasyonları da sunulmaktadır. DDR ilaçlarının ve/veya radyoterapinin uygulandığı onkoloji ortamlarında ve mekanistik hipotez testinin gerekli olduğu preklinik aşamalarda yaklaşımın uygunluğunu göstermek için X-ışını ışınlanmış kandaki DNA hasar yanıtına (DDR) karşı protein biyobelirteçlerinin incelenmesi için bu protokolü uyguluyoruz.
Introduction
İlaç geliştirme, karşılanmamış tıbbi ihtiyaçları ve daha hedefli, kişiselleştirilmiş tıbbı ele alan yeni terapötikler sunmayı amaçlamaktadır. Kinaz1, proteaz 2 veya poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörleri3, protein düşürücüler4, terapötik antikorlar5ve antikor konjuge ilaçlar (ADC'ler)6gibi enzymatic inhibisyon dahil olmak üzere birden fazla ilaç mekanizması aktif olarak araştırmaktadır. Onkolojide daha iyi tedaviler elde etme çabalarına bir örnek, kanserli hücrelerin çoğalmasını sağlayan sinyal basamaklarını durdurmak amacıyla kinaz inhibitörlerinin kullanılmasıdır1,7. Bu kinazlara özgü substrat fosforilasyon seviyelerini ölçmek, bu inhibitörlerin etki mekanizmasını ölçmek için en iyi farmakodinamik biyobelirteçtir8. Diğer ilaçlar belirli bir proteinin ekspresyonunun modüle edilebilir ve bu durumda tedavi boyunca hedef proteinlerinin konsantrasyonundaki değişiklikleri uzunlamasına ölçebilmek çok önemlidir. Bu nedenle, bir ilacın veya patolojinin özelliklerinden bağımsız olarak, ilaç maruziyeti ve hedef modülasyon arasındaki farmakokinetik (PK)/ farmakodinamik (PD) ilişkisini kurmak için biyobelirteçlerin değerlendirilmesi erken klinik gelişimde en iyi uygulamadır ve güvenli ve tolere edilen farmakolojik olarak aktif bir doz / program belirlenmesini sağlar9.
Onkoloji klinik gelişiminde, biyopsilerde biyobelirteç analizi bir ilacın mekanizmasının kanıtını oluşturmak için en iyi ayar olabilir, bir denemede mevcut biyopsilerin sayısı genellikle oldukça sınırlıdır10,11. Alternatif olarak, periferik kan örnekleri klinik çalışmalar için oldukça değerlidir, çünkü minimal invaziv bir prosedür içerirler, kolaylaşan boyuna analiz elde etmek hızlı ve kolaydır, biyopsilerden daha ucuzdur ve bir tedavinin sonucunun gerçek zamanlı izlenmesi için geniş bilgi sağlar. Periferik kandaki PD biyobelirteçlerini değerlendirmenin ek bir yararı, PK/ PD nicel ilişkilerinin belirlenmesinde kesinlik sağlayan PK'yı ve sonraki PK / PD modellemesini ölçmek için biyosample kullanma kapasitesidir12,13. Tüm kandan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC' ler), ifade düzeylerinde veya çeviri sonrası modifikasyonlarında değişiklikler yaşayan protein belirteçlerini incelemek için izole edilebilir. Ek olarak, PBMC'ler immünofenotiping amacıyla kullanılabilir14,15, antikora bağımlı hücresel sitotoksisiteyi (ADCC) değerlendirmek gibi immün işlevsellik tahlilleri (ADCC)16 ve RNA izolasyonu yoluyla epigenetik analiz. Aynı şekilde, tam kandan alınan plazma, bir hastanın immünolojik yanıtını karakterize etmek, metabolik çalışmalar yapmak ve ayrıca terapötik ajandan seçilen hastalığın klonal evrimini izlemek için dolaşımdaki tümör DNA'sını (ctDNA) izole etmek ve dizilemek için sitokinleri ölçmek için kullanılabilir, genellikle tedavi direnci için mekanistik bir temel sağlar17,18,19 sonraki terapötik nesillerin gelişmesini sağlar20. Son olarak, dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC' ler) periferik kandan izolasyonu, uzunlamasına numaralandırma, DNA/ RNA dizilimi ve protein-biyobelirteç analizi ile hastalığın ilerlemesinin değerlendirilmesini sağlar21. Bu izolasyon burada açıklanan protokol ile uyumlu olmasına rağmen22Birçok kanser türünde ve hastalığın erken evrelerinde CTC'lerin düşük bolluğu, CTC bozulmasını en aza indirmek için özel tüplerin kullanımını daha uygun hale getirir23.
Son yıllarda, sıvı biyopsilerinin kullanımı klinik çalışmalarda elde edilen bilgileri geliştirmiştir ve PBMC koleksiyonları, bazı hematolojik malignite türleri için doğrudan tümör hücrelerinde veya PBMC'lerin kendilerinde tümör hücrelerinin PD taşıyıcıları olarak hedef katılımını ve mekanizma kanıtını izlemek için birçok çalışmaya dahil edilmiştir24,25,26. Yüksek kaliteli örneklerin hazırlanması, belirli bir patoloji için en güvenli ve en etkili tedaviyi belirlemeyi olumlu yönde etkiler, ancak deneyimlerimize göre, farklı klinik bölgelerden elde edilen PBMC preparatlarının kalitesi, aşağı akış analizi amacına uygun olmayan örneklerle sonuçlanan kalitede geniş değişkenliğe maruz kalmıştır. Bu, bu çalışmalardan toplanabilecek PD verilerinin miktarını etkilemıştır.
Burada, hem PBMC'lerin hem de plazma örneklerinin klinik bir ortamda tek bir kan çekiminden nasıl verimli bir şekilde izole edileceğini gösteren takip etmesi kolay bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Protokol, gerçek dünya deneyiminin klinik siteler tarafından bildirilen santrifüjleme sorunları, işlem gecikmeleri ve cryovials'a örnek aktarımı gibi protokol yürütmede zorlukları vurguladığı modifikasyonları içeren mononükleer hücre hazırlama tüplerinin üreticisi tarafından sağlanan talimatlara dayanmaktadır. Çözeltiyi kandan ayıran bir bariyerli veya bariyersiz polisakkarit çözeltileri kullanarak yoğunluk gradyan ayrımına dayanan mononükleer hücre hazırlama tüplerinin kullanımına alternatif ticari olarak mevcut yöntemler vardır27. İlgili klinik site bu alternatif metodolojilerde zaten deneyimliyse, bu protokol kabul edilebilir bir şekilde bunlarla ikame edilebilir. Bu gibi durumlarda, iki faktör düşünülebilir: bazı alternatif yöntemler, bir toplama tüpünden, insan birincil biyolojik materyalinin ek bir transferinin biraz daha artan bir güvenlik riski sunabileceği ayrı bir hazırlık tüpüne tam kan transferini gerektirir ve kanı polisakkarit çözeltisinden ayıran bariyersiz yöntemlerin başarısı, kan örneğini her zaman bir hastane laboratuvar ortamında bulunmayan rafine bir teknik uzmanlık seviyesinin geliştirilmesini gerektiren yoğunluk gradyan ortamına katmanlamak gibi kritik adımlara dayanır. Yukarıdaki noktalara rağmen, genel canlılık ve hücre iyileşmesi bu teknikler arasında karşılaştırılabilir15,28. Bu nedenle, metodolojinin seçimi, biraz önceki teknik deneyime bağlıdır, ancak elimizde, mononükleer hücre hazırlama tüpleri geniş bir klinik bağlamda başarıyla kullanılabilir ve aksi takdirde önerimizdir.
Bu protokolün bir uç noktası, lysates içine daha fazla işlem için PBMC peletleri üretmek olsa da, PBMC koleksiyonunun nükleik asitlerin izolasyonu veya immünofiztokimya (IHC) yöntemlerine uygun PBMC smearları veya PBMC blokları üretme gibi diğer son uygulamaları uygulanabilir. Daha da önemlisi, hastalardan alınan her biyosample en azından bir düzeyde invaziv bir prosedürü temsil ettiği için, bu protokol sitokin analizleri, metabolomik çalışmalar veya ctDNA dizilimi için kullanılabilecek plazmayı izole ederek her örnekten faydalı malzemeyi en üst düzeye çıkarır.
Onkoloji denemelerinde periferik biyobelirteçlerin analizi PBMC lysates'in birçok uygulamasından biridir. Bir örnek, kemoterapi, radyoterapi veya fosfatidiylinositol-3 kinaz ile ilişkili kinazlar (PIKKs)7 vePARP3,13gibi DDR'de yer alan enzimlerin inhibitörlerinin kullanımı gibi tedavilerde DNA hasar yanıtının (DDR) değerlendirilmesidir. Bu tedavilerin amacı çoğalan hücrelerde DNA hasarını artırmaktır, bu da DDR mekanizmaları bozulmuş hücrelerde ve kanser hücreleri gibi hücre döngüsü kontrol noktalarında yüksek toksisite oluşturur. Burada, röntgen ışınlarına maruz kalan periferik kandaki DDR biyobelirteçlerinin bir çalışması ile bir örnek sunuyoruz.
Protocol
Bilgilendirilmiş hasta onayı ve her yargı alanındaki ilgili ulusal etik gerekliliklerine tam uyum, örneğin, İnsan Dokuları Yasası (HTA - Birleşik Krallık, 2004) ve Sağlık Sigortası Taşınabilirlik ve Hesap Verebilirlik Yasası (HIPAA - Amerika Birleşik Devletleri, 1996) zorunludur. İnsan kaynaklı materyaller üzerinde herhangi bir çalışmaya başlamadan önce etik onayı tam olarak belgelemiş olduğundan emin olun. Bu protokolün optimizasyonunda kullanılan kan, Ulusal Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (NIHR) Cambridge Biyomedikal Araştırma Merkezi ile yapılan İnsan Biyolojik Örnekleri tedarik anlaşması kapsamında NIHR Cambridge Klinik Araştırma Tesisi, Cambridge, Birleşik Krallık tarafından yürütülen Gönüllüler İlerleyen Tıp Paneli'nden (VAMP) (etik referans 16/EE/0459, çalışma CRF494, alt çalışma 001) uygun onay ile sağlanmıştır. İngiltere'deki AstraZeneca Biyobankası, İnsan Doku Kurumu (Lisans No. 12109) tarafından lisanslanmıştır ve Araştırma Doku Bankası (RTB) (REC No 17/NW/0207) olarak Ulusal Araştırma Etiği Hizmet Komitesi (NREC) Onayına sahiptir.
1. Genel hazırlık rehberliği
NOT: Bu protokoldeki kan, plazma ve PBMC'ler gibi düzeltilmemiş insan materyali ile yapılan tüm çalışmalar, bu malzemelerin potansiyel olarak bulaşıcı ajanlar taşıyabileceği varsayımıyla çalışmalı ve bu nedenle uygun biyogüvenlik önlemleri altında yapılmalıdır. Bilinen patojenler için negatif olarak test edilmiş hastalar için, örneklerin bulaşıcı olmadığını varsaymayın ve bu nedenle uygun güvenlik önlemleri hala uygulanmalıdır. Bu malzemelerden üretilen atık ürünler de aynı biyogüvenlik önlemleri ile arıtılmalı ve yerel kurallara göre bertaraf edilmelidir.
- Antikoagülan olarak sodyum sitrat veya sodyum heparin kullanan iki tür mononükleer hücre hazırlama tüpü arasında seçim yapın. Birçok aşağı akış uygulaması için bu iki antikoagülan birbirinin yerine kullanılabilir, ancak deneme için birini seçmeden önce her iki pıhtı önleyici test edilmelidir.
- Hastanın kodlanmış kimliği ile kan toplanması için kullanılacak bir adet 8 mL mononükleer hücre hazırlama tüpünü etiketle.
- 1x PBS'i oda sıcaklığında (18-25 °C) saklayın. Hazırlık başına 30 mL kullanın.
- Ayrı plazma örnekleri için tüplerin ve PBMC örneğinin cryovial'ının laboratuvar kılavuzunun uygun bölümünde belirtildiği gibi benzersiz tanımlayıcılarla doğru bir şekilde etiketlendiğini unutmayın.
- FOSFORİlLİ PROTEINLerİ İzlemeK için PBMC'ler kullanılacaksa, fosfataz inhibitörleri ile desteklenmiş PBS hazırlayın: 5 mL PBS'yi 50 μL fosfataz inhibitörü kokteyli 2 + 50 μL fosfataz inhibitörü kokteyli ile karıştırın 3. Taze hazırlayın ve kullanıma kadar buzda tutun.
- PBMC'ler kriyoprezerserve edilecekse, %90 FBS + %10 DMSO karıştırarak numune başına 1 mL donma karışımı hazırlayın.
2. PBMC koleksiyonu (Şekil 1A)
- Üretici tarafından açıklanan standart tekniği kullanarak mononükleer hücre hazırlama tüpüne 8 mL kan alın. Antikoagülan katkı maddesini kanla karıştırmak için tüpü 8 ila 10 kez hafifçe ters çevirin. Hemolizden kaçınmak için sallamayın. Kanın çekildiği zamanı kaydet.
- Toplamadan sonra, tüpü santrifüj olana kadar oda sıcaklığında dik olarak saklayın. Örnekleri mümkün olan en kısa sürede, ideal olarak bu kan toplama işleminden sonraki bir saat içinde, ancak 4 saatten sonra değil. Kanın işlenmesine başlarken zamanlamayı kaydedin.
- Santrifüj remikslemeden hemen önce, tüpü 8 ila 10 kez daha nazikçe ters çevirerek kan örneğini remiksler.
- Tüp/kan örneği tüpleri yatay rotorda (salıncak kafası) oda sıcaklığında (18-25 °C) 30 dakika boyunca 1.500 – 1.800 x g'da santrifüjleyin. Tüm tüplerin düzgün dengelenmiş olduğundan emin olun.
Şekil 1: Protokolün genel görünümü ve santrifüjün temsili görüntüleri. (A) PBMC'lerin ve plazmanın hazırlanmasına ilişkin protokole şematik genel bakış. *Zaman kısıtlamaları varsa, 2.4. adım 20 dk'ya kısaltılabilir ve 3.3 ile 3.6 arası adımlar kaldırılabilir. ** Gerekirse hücreleri saymak için bir aliquot alın. 2.4. adım için ayarlanmış bir baş rotor santrifüjün ctDNA analizi / metabolomics (B) görüntüsü için 2 ekstra santrifüj adımı gereklidir. (C) Mononükleer hücre hazırlama tüplerini döndürmek için adaptörleri içeren iki kova içeren rotorun görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
NOT: x g (RCF, göreli santrifüj birimleri olarak da adlandırılır) ve RPM (dakika başına devir) farklı birimlerdir. Santrifüjü x g (RCF) için ayarladığından emin olun. Dönüşüm için çevrimiçi hesap makinesini kullanın (bkz. Malzeme Tablosu). Yalnızca sabit açılı rotor mevcutsa, bu adımı 1.500 – 1.800 x g'da10 dakika boyunca gerçekleştirin.
- Santrifüjlemeden sonra, bariyerin altında koyu kırmızı bir tabaka (çoğunlukla kırmızı kan hücreleri içeren) ve bariyerin üzerinde 2 katman olup olmadığını kontrol edin. Üst katman plazmadır (saman renkli) ve altındaki beyazımsı tabaka PBMC'leri içeren buffy kattır. Bu katmanlar, tüpü koyu/siyah bir arka plana karşı görüntülerken kolayca ayırt edilebilir.
Şekil 2: PBMC'leri izole etmek için tüpler. (A) Santrifüjlemeden önce tüplerin görüntüsü (adım 2.4), boş (solda) veya kan içeren (sağda). (B) Santrifüjlemeden sonra PBMC katmanının başarılı bir şekilde ayrılması (adım 2.5). (C) Tüm PBMC'lerin toplanmasını sağlamak için santrifüjleme ve biraz plazmadan sonra PBMC katmanının görüntüsü (adım 2.7). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
NOT: Bu katmanlar görünmüyorsa, bu büyük olasılıkla santrifüj ünitelerinin ayarlanmasında bir hata olduğunu gösterir. Doğru santrifüj adaptörünün kullanıldığından ve doğru "x g" ayarını yaptığından emin olun. 2.4.
- Santrifüjlemeden hemen sonra, PBMC tabakasını (yaklaşık 4-5 mL) rahatsız etmemeye dikkat ederken, plazmanın yaklaşık yarısını kapaklı etiketli 15 mL boyutunda konik santrifüj tüpüne aktarmak için serolojik bir pipet kullanın. Bu tüpü 4. Şimdilik kenara koyun.
- Pipeti hücre tabakasının içine yerleştirerek tüm PBMC katmanını pastör pipetle toplayın ve kapaklı farklı bir 15 mL boyutunda konik santrifüj tüpüne aktarın. Tüm PBMC katmanını tamamen almak için gerekirse az miktarda plazma almak da kabul edilebilir. Hacim genellikle 1-2 mL'dir. Hemen aşağıdaki 3.
3. PBMC yıkama adımları
NOT: Yıkama adımlarının amacı, PBMC peletinden kalan trombositleri ve plazmayı seyreltmek ve çıkarmaktır. Tüm santrifüjleme adımları oda sıcaklığında (18-25 °C) yapılmalıdır.
- Ses seviyesini 15 mL'ye çıkarmak için PBMC tüpüne oda sıcaklığı PBS ekleyin. Tüpü kapla. Tüpü 5 kez hafifçe ters çevirerek hücreleri karıştırın.
- 300 x g'da15 dakika santrifüj. Bunun ilk santrifüjden çok daha nazik bir santrifüj olduğunu unutmayın.
- Tüpü koyu/siyah bir arka plana karşı görüntüleyerek peletin görselleştirin. Süpernatant vakum aspirasyonu veya pipet ile çıkarın (Şekil 3A). Beyazımsı renkli PBMC peletinin üzerinde yaklaşık 500 μL hacim bırakarak süpernatantı atın.
Şekil 3: PBMC peletleri. (A) İlk yıkama adımı 3.3'te elde edilen pelet. (B) İkinci yıkamada izole edilmiş pelet (adım 3.7). (C) İkinci yıkamada izole edilen kan çekiminden 4 saatten daha geç işlenen kandan elde edilen yüksek hemoliz seviyesine sahip pelet (adım 3.6). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Hücre peletini, artık süpernatanta yukarı ve aşağı hafifçe pipetleme yaparak yeniden diriltin.
- Ses seviyesini 10 mL'ye getirmek için ek 1x PBS ekleyin. Tüpü kapla. Tüpü 5x hafifçe ters çevirerek hücreleri karıştırın. Çalışma protokolünde hücre sayımı gerekiyorsa, 3.5.1 adımına gidin, gerekli değilse doğrudan 3.6 adımına geçin.
- Yeniden askıya alınan hücrelerin 40 μL'lik bir aliquot'unu alın ve 40 μL trippan mavisi ile karıştırın. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak uygulanabilir hücreleri sayın.
- Süspansiyonu adım 3.5'ten 300 x g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peletini bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatant çıkarın.
- Hücre peletini bozmadan ince bir uç Pasteur pipet veya bir mikropipette kullanarak pipetleme yaparak hücre peletinin üzerinde kalan herhangi bir üstnatantı dikkatlice çıkarın ve atın. Bu adımı tamamladıktan sonra peletin üzerinde çok az veya hiç sıvı bırakmayın. Bu protokolün bitiş noktası PBMC pelet hareketi ise adım 3.8; uç nokta kriyoprezidasyonlu PBMC'ler ise, 3.10 adımına gidin.
- Tüm hücreleri homojen bir şekilde yeniden kullanmak için bir mikropipette kullanarak pelete ve pipeteye 50 μL yeni PBS (veya uç noktanıza uygunsa 1,5 adımda hazırlanan ekLENMIŞ PBS) ekleyin. Tüm hücre süspansiyonunu etiketli 1,5 mL cryovial'a aktarın ve numuneleri dondurana kadar hemen ıslak buza yerleştirin.
- Etiketli numuneleri sıvı nitrojene veya doğrudan kuru buza yerleştirerek dondurun. Hücreler ayrıca hücre dondurma kutuları kullanılarak -80 °C dondurucuda dondurulabilir. Bu durumda, hücre tüplerini eklemeden önce kutuları tamamen -80 °C'de ön edin. Hücre peletlerinin dondurulduğu zamanı kaydedin. Hücreler donduktan sonra - 80 ° C'de saklayın, kuru buz üzerinde donmuş gemi.
- İsteğe bağlı olarak, PBMC'leri dondurma karışımının 1 mL'sinde (adım 1.6) peleti yeniden askıya almak ve etiketli bir cryovial'a aktarmak için. 3.9 adımında açıklandığı gibi devam edin, ancak bu durumda, örnekleri dondurmak için yalnızca hücre dondurma kutularının kullanılması kabul edilebilir. En az 24 saat boyunca dondurucu kutuda bulunduktan sonra nakliye ve depolama için sıvı nitrojene aktarın.
4. Plazma hazırlama adımları (Şekil 1A)
- PBMC peletlerinin -80 °C depolanmasını takiben, şimdi 2.6 adımda geçici olarak ıslak buzda depolanan plazma aliquot'u hazırlayın. Numunenin amacı ctDNA analizi ise plazmayı netleştirmek için aşağıdaki santrifüjleme adımlarını gerçekleştirin, aksi takdirde doğrudan 4.2 adımına geçin.
- Plazmayı sabit açılı bir rotorda (veya salıncak rotorunda 15 dk) 4 – 8 °C'de 1.600 - 2.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Plazma süpernatantını dikkatlice pipetle kapatın, herhangi bir peletin rahatsız olmamasına ve yeni bir 15 mL tüpe aktarılmasına dikkat edin. Peletlenmiş malzemeyi içeren tüpü atın.
- Plazmayı sabit açılı bir rotorda (veya salıncak rotorunda 15 dk) 4 – 8 °C'de 1.600 - 2.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Plazma süpernatantı, herhangi bir peletlenmiş malzemeyi rahatsız etmediğinden emin olarak yeni bir 15 mL tüpe dikkatlice aktarın. Peletlenmiş malzemeyi içeren tüpü atın.
NOT: Soğutulmuş bir santrifüj yoksa, hücreleri her dönüş arasında 5 dakika buzda tutun veya soğuk bir odada santrifüj örnekleri.
- Plazmayı 1 mL aliquots içinde 5 taze 2 mL mikrotüplere aktarın. 5 şişeyi 1 mL aliquots ile doldurmak için yeterli plazma yoksa 5'ten az şişe kullanın ve son şişenin 1 mL'den az plazma içermesi beklenir. 5 mL'den fazla plazma varsa, geri kalanını atın. Her tüpteki toplam plazma hacmini kaydedin.
- Plazma aliquots'u -80 °C'de saklayarak hemen dik olarak dondurun.
5. Örnek sevkiyat
- Hem PBMC peletlerini hem de plazma örneklerini kuru buz üzerinde sevk edin.
- Numunenin sevkiyat öncesi ve sırasında çözülmediğinden emin olun. Nakliye sürecinde oluşabilecek olası gecikmeleri göz önünde bulundurarak, nakliye sürecinin tamamında donmuş kalmalarını sağlamak için numunelerle yeterli kuru buz paketleyin.
6. DDR biyobelirteçlerinin tam kan ışınlanması ve batı leke analizi (Şekil 4A)
NOT: Bu, klinikteki çoğu durumda gerekli olmayacak bir eks vivo tedavidir, ancak bu deneyler uygun klinik biyobelirteçleri bulmak için değerli bir keşif stratejisidir. Kan örnekleri en iyi sonuçları elde etmek için en kısa sürede alınmalıdır.
- X-ray kabinini ısıtın. Üç adet 15 mL tüpü sırasıyla 0, 0.2 ve 7 Gy olarak etiketle.
- Tek bir bireyden taze çekilmiş kan içeren üç mononükleer hücre hazırlama tüpü alın ve tüpleri 8 ila 10 kez nazikçe ters çevirdikten sonra kanları üç 15 mL tüpe aktarın.
- 0.2 Gy tüpünü X-ray kabinine yerleştirin, kapıyı kapatın ve raf numarasını ve dozu seçerek tüpe 0.2 Gy dozu uygulayın. Kabinde seçilen dozu ayarlayarak 7 Gy tüpüne 7 Gy radyasyon dozu uygulayın.
- Üç tüpü 37 °C'de bir saat kuluçkaya yatırın.
- Kanı mononükleer hücre hazırlama tüplerine geri aktarın ve 2.4 ile 3.8.
- Hücre peletlerinin her birine hücre pelet hacmine eşit proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile desteklenmiş bir lizis tamponu hacmi ekleyin (bu durumda 70 μL RIPA tamponu), pipet yukarı ve aşağı ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Bir sonicator mevcutsa örnekleri sonicate (3 döngü, 30 s ON / 30 s KAPA, 4 °C), alternatif olarak numunedeki viskoziteyi ortadan kaldırmak için nükleik asitleri kırmak için örnekleri şırıngam.
- Numuneleri 15.000 x g≥ 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin. Her bir süpernatantı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın, kalitatif olarak hemoliz seviyesini (görsel muayene) değerlendirin ve protein konsantrasyonu herhangi bir tercih edilen yöntemle ölçün.
- Toplam 40 μg'yi SDS ve numune azaltıcı madde içeren numune yükleme tamponu ile karıştırın. Numuneleri bir ısı bloğunda 5 dakika kaynatın.
- Şerit başına her numunenin 20 μg'sini %4-12 bis-tris protein jelinde kopya halinde yükleyin ve bir SDS-PAGE çalıştırın.
- Ayırmadan sonra, proteinleri piyasada bulunan bir sistem (20 V, 10 dk) kullanarak nitroselüloz bir zara aktarın ve TBST'de% 5 süt içeren blok.
- Membranı ilgili moleküler boyutlarda kesin ve birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın (antikorlar ve seyreltmeler için Malzeme Tablosu'na bakın).
- Birincil antikorları çıkarın ve membranları ODA sıcaklığında 5 dakika boyunca TBST ile 3 kez yıkayın. HRP konjuge sekonder antikorlarla oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya yatırın.
- 5 dakika boyunca TBST ile 3 kez yıkayın.
- ECL reaktifini uygulayın ve HRP sinyaline göre elde edilen görüntüleri analiz edin.
Representative Results
Klinik çalışmalarımızda PBMC preparatlarının kalitesini artırmak için, moleküler biyoloji geçmişinden ve laboratuvar becerilerinden bağımsız olarak hastane laboratuvar profesyonelleri tarafından takip edilebilecek özlü, net adımlarla bir protokol oluşturduk. Çeşitli çok merkezli klinik çalışmalarda yer alan klinik sitelerden yürütme sorunlarının tespit edildiği veya raporlandığı adımlarla ilgili değişiklikleri içeren üretici protokolünü uyarladık. Bununla birlikte, protokol klinik sitedeki zaman kısıtlamaları veya aşağı akış analizlerinin türü gibi belirli gereksinimleri karşılamak için daha da optimize edilebilir (bkz. DDR'nin PBMC'lerde radyasyonun neden olduğu DNA hasarı üzerine belirli biyobelirteçlere bakarak analiz edilebileceğini gösteriyoruz.
Klinik sitelerden aldığımız en yaygın sorgular, PBMC'leri başarıyla izole edebilmeyi ve son PBMC peletini elde edebilmeyi doğrudan etkileyen santrifüjleme adımlarıyla ilgilidir. Uygun tip baş rotor santrifüjü(Şekil 1B,C)kullanmak protokolün başarısının anahtarıdır. Bununla birlikte, klinik alanda sadece sabit açılı bir rotor santrifüj mevcut olduğunda, adım 2.4'ü bir baş rotorla aynı RCF'de sabit açılı bir rotorda, ancak sadece 10 dakika boyunca gerçekleştirmeyi öneririz. Bu, pbmc katmanının plazmadan ayrılmasını sağlar (bkz. Şekil 2B,C). Bir yoğunluk gradyan ayırma ortamında kanın tabakalanması frenleme santrifüjleme gerektirirken, mononükleer hücre hazırlama tüplerindeki kan, tüpte daha yoğun kan bileşenlerinden ayrılmış PBMC tabakasının korunmasını sağlayan bir jel bariyerinin varlığı nedeniyle frenlerle santrifüjlenebilir27,28.
Kanın 8 mL tüp formatında santrifüjlenmesinden en az 4 mL yüksek kaliteli, seyreltilmemiş plazma elde edildi, bu da ctDNA dizileme veya metabolomik çalışmalar 29,30 (isteğe bağlı adımlar 4.1.1-4.1.4) gibi özel analizlerde kullanımı için daha da netleştirilebilir. İzole PBMC'lerin miktarı, peletlerin büyüklüğü ve hemoliz veya kırmızı kan hücresi kontaminasyonu klinik bölgelerden gelen diğer endişeler ve örnekleri analiz etme deneyimi olmuştur. 8 mL kandan elde edilen hücre sayısı hasta ve hastalık ayarına bağlı olarak değişkendi, ancak genel olarak elde edilen pelet küçük boyutludur ve şeffaf / beyaz renklendirme (Şekil 3A,B). Bu özellikler nedeniyle, yıkama adımları sırasında (2.5 ve 3.3) yanlışlıkla aspirasyonunu önlemek için peletin karanlık bir arka plana karşı görselleştirilmesi önemlidir. Bazen peletler kırmızı kan hücresi kirlenmesi nedeniyle bir miktar kırmızı renklenme olabilir (Şekil 3C) ve bu preparatın kalitesi üzerinde olumsuz bir etkiye sahiptir. Şekil 3'tegösterilenler gibi küçük peletlerin kaybedilmemesi için PBMC peletinin bir cryovial'a aktarılması, PBMC peletinin 50 μL PBS'de yeniden depolandığı 3.7.
Bu tüpleri ve sağlıklı bireylerden gelen kanı kullanırken tipik verim 8 mL için 7 ila 21 x 106 hücre ve deneyimlerimiz olduğu için ve daha önce gösterildiği gibi% 70 ila 80 arasında bir hücre iyileşmesi arasındadeğişmektedir. Bu hem bireysel hücre sayılarına hem de operatöre bağlıdır ve yoğunluk gradyanı (ayırma bariyerli tüpleri kullanan sistemler dahil) kullanılarak diğer yöntemlerle elde edilen hücre sayıları ve hücre kurtarma değerleri ile karşılaştırılabilir15,27,28. Kronik lenfositik lösemi (KLL) hastalarında hastalık ayarına bağlı olarak bu yöntemle izole edilen PBMC sayısındaki varyasyonun açıklayıcı bir örneğidir. Bu protokol uygulanırken 8 mL mononükleer hücre hazırlama tüpünden kurtarılan hücre sayısı, NCT0332827331 (Tablo1) çalışmasında 7 hastadan elde edilen 45 örnekte 1,62 x 10 4 ila1,99 x 10 9 arasında değişmektedir. İlgili bir parametre, bu yöntemle elde edilen PBMC lysates'in protein konsantrasyonudur ve bu, izole edilen hücrelerin sayısına ve protein ekstraksiyonunun verimliliğine bağlıdır. Bölüm 6'da bulunan hücre peletleri RIPA tamponu ve sonication (adım 6.6) ile oluşturulmuştır. Hücre peletlerinin aynı lizis tampon hacminde resüspensiyonu genellikle 3 ila 10 mg/mL arasında bir konsantrasyon aralığına neden olur ve bu özel örnekte lizat konsantrasyonları sırasıyla 0, 0.2 ve 7 Gy için 6.8, 8.3 ve 8.6 mg/mL'dir. Bununla birlikte, bu, klinik bölgelerden en iyi şekilde hazırlanmamış örnekler alırken, hastanın hastalığı ve kırmızı kan hücresi kontaminasyonundan hemoglobin varlığı alındığında yüksek bir değişkenliğe maruz kalır. Örneğin, çok küçük peletlerin hem protein konsantrasyon ölçümüne hem de aşağı akış biyobelirteç analizine izin vermek için hücre pelet hacminden daha büyük bir lizis tampon hacminde yeniden nünmesi gerekir, bu da daha seyreltilmiş numunelerle sonuçlanır. Bu durumda, bir örnek konsantrasyonu 1 mg / mL'nin altındaysa, bu yüksek seyreltme faktörü nedeniyle batı lekesi gibi tahlilleri yapmak için bir zorluk oluşturabilir. Buna karşılık, daha önce bahsedilen CLL örneklerinde, hücre peletlerini yeniden harcamak için eklenen lizis tamponunun hacmi 50 ila 500 μL arasında değişmektedir ve protein konsantrasyonu 1,62 ila 19,77 mg/mL arasında değişmektedir (Tablo 1).
Örnekler kırmızı kan hücresi kontaminasyonu veya hemoliz (Şekil 3C) sunduğunda, PBMC lizatının protein konsantrasyonu eritrositlerden hemoglobin dahil edilmesi nedeniyle fazla tahmin edilir. Bu nedenle, protokolün 6.7. Aşırı yükleme numunesi, bir yükleme kontrolü teste dahil edildiğinde biyobelirteç analizi yaparken hemoglobin varlığını telafi edebilir. Hemolizi ölçmek için 414 nm32'deabsorbansı ölçmek gibi diğer daha nicel yöntemler uygulanabilir.
DDR, bu klinik protokol sonrasında elde edilen PBMC'lerde analiz edildi. Radyoterapi veya kemoterapi gibi KLINIK TEDAVILERE ZARAR VEREN DNA'yı taklit eden bir durumu göstermek için, sağlıklı gönüllülerden gelen tüm kan X-ışını radyasyona maruz kalmıştır (Şekil 4A). X ışınları gibi iyonlaştırıcı radyasyon (IR), DNA çift iplik kopmaları (DSB'ler) dahil olmak üzere farklı DNA hasarına neden olur. Bu lezyonların DNA hasarı algılaması, homolog rekombinasyon (HR) veya homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) gibi DNA onarım mekanizmalarını devreye sokabilen ataksi-telanjiektazi mutasyona uğramış (ATM), ATM ve Rad3 ile ilişkili (ATR) ve DNA'ya bağımlı protein kinaz (DNA-PK) gibi PIKK'ları aktive eder. ATM'nin DSB'lerin varlığıyla aktivasyonu, MRN (MRE11-RAD50-NBS1) kompleksinin hasar alanlarına işe alınmasıyla ortaya çıkar ve Ser1981 de dahil olmak üzere çeşitli kalıntılarda ATM otofosforilasyonuna neden olur. Buna karşılık, aktif ATM, MRN kompleksinin bileşenlerini ve Ser139'daki histone varyantı H2AX gibi diğer proteinleri (pSer139-H2AX'ın φH2AX olarak da bilinir) diğer DDR faktörlerinin işe alımını kolaylaştıran DSB'den yayılan kromatin yapısal bir değişikliği teşvik etmek için fosforilize eder33. PBMC'ler düşük çoğalma hızlarına rağmen iyonlaştırıcı radyasyona duyarlıdır ve kütle spektrometresi yöntemleri, RAD50'deki fosforilasyonlu Ser635'in ATM tarafından yukarı doğrulanmasının ölçülmesine izin verdi. Bu fosforilasyon ATM inhibitörlerinin varlığında azalır ve RAD50 pS635, immünohistokimi8ile tümörlerde klinik ATM inhibitör tedavileri için farmakodinamik biyobelirteç olarak daha da doğrulanmıştır. PBMC'lerin radyasyona tepkisini değerlendirmek için, sağlıklı gönüllülerden gelen kan farklı IR dozlarına maruz kaldı ve 37 °C'de 1 saat inkübasyondan sonra örnekler toplandı (Şekil 4A). Bu amaçla, yüksek sıcaklık nedeniyle PBMC izolasyonunun verimini düşürmemek için plastik tüplere kan aktarıldı (adım 6.2). ATM'nin nasıl etkinleştirildiğini sadece daha önce bildirilen RAD50 pS635'e değil, aynı zamanda ATM pS1981 ve φH2AX'a da bakarak analiz ettik. İncelenen üç olguda bu çeviri sonrası modifikasyonlarda daha yüksek IR dozlarında artış gözlenmiştir(Şekil 4B). İlginçtir ki, ATM ve RAD50'nin fosforilasyonu 0.2 Gy'nin düşük dozunda önemliydi, bu da çeviri sonrası bu değişikliklerin sadece tümör örneklerinde değil, periferik kanda da iyi bir dinamik aralığa sahip DNA DSB'lerin üretilmesini içeren tedaviler için PD biyobelirteçleri olarak sorgulanabileceğini göstermektedir. Bu, tedavi yoluyla uzunlamasına örnekler alarak tedaviye PD yanıtının izlenmesini sağlar. Kan çekiminden numunelerin işlenmesine kadar olan zamanlama, bu sinyal basamaklarının hala aktif olduğundan emin olmak için kritik öneme sahiptir, çünkü işlemdeki gecikmeler bu tür basamakların kinetiğini etkileyecektir ve fosfomeransör olarak kullanılan fosforilasyon olaylarını kaçırabilir.
Şekil 4: Mevcut klinik protokolden sonra ex vivo ışınlanmış kandan izole edilen PBMC'ler, tedavinin neden olduğu DNA hasarının boyutu hakkında bilgi vermek için biyobelirteçleri görüntüler. (A) PBMC'lerin hazırlanması ve DDR'nin tam kan ışınlanması üzerine analizi için protokole şematik genel bakış. *CtDNA analizi/metabolomik için 2 ekstra santrifüjleme adımı gereklidir. (B) PBMC'lerde DDR fosfo-biyobelirteçlerin doza bağlı olarak yukarılanmasını gösteren Batı blot. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnek | PBMC sayısı / 8 mL kan | Ekli RIPA tampon hacmi (μL) | Son konsantrasyon (mg/mL) |
| A.1 | 39100000 | 70 | 12.16 |
| A.2 | 97400000 | 100 | 4.54 |
| A.3 | 233000000 | 150 | 7.63 |
| A.4 | 316000000 | 150 | 16.87 |
| A.5 | 387000000 | 150 | 12.60 |
| A.6 | 459000000 | 150 | 12.71 |
| A.7 | 414000000 | 200 | 15.67 |
| A.8 | 253000000 | 150 | 14.56 |
| A.9 | 509000000 | 300 | 10.67 |
| B.1 | 15200000 | 70 | 2.96 |
| B.2 | 10500000 | 50 | 4.59 |
| B.3 | 13200000 | 50 | 3.99 |
| B.4 | 34800000 | 100 | 10.41 |
| B.5 | 1620000 | 70 | 7.11 |
| B.6 | 70200000 | 100 | 9.26 |
| B.7 | 65400000 | 100 | 12.10 |
| B.8 | 91100000 | 150 | 11.82 |
| C.1 | 6330000 | 70 | 4.04 |
| C.2 | 4400000 | 150 | 19.77 |
| C.3 | 68000000 | 100 | 8.96 |
| C.4 | 35100000 | 50 | 9.30 |
| C.5 | 35400000 | 70 | 10.55 |
| C.6 | 99200000 | 100 | 16.19 |
| D.1 | 402000000 | 70 | 7.23 |
| D.2 | 826000000 | 300 | 16.95 |
| D.3 | 1990000000 | 300 | 14.87 |
| D.4 | 1000000000 | 300 | 18.34 |
| D.5 | 1160000000 | 400 | 16.13 |
| D.6 | 806000000 | 400 | 19.40 |
| E.1 | 302000000 | 300 | 13.86 |
| E.2 | 990000000 | 500 | 19.04 |
| E.3 | 1200000000 | 400 | 17.13 |
| F.1 | 4010000 | 50 | 1.62 |
| F.2 | 5170000 | 50 | 2.84 |
| F.3 | 2810000 | 50 | 3.69 |
| F.4 | 3700000 | 75 | 3.62 |
| F.5 | 3460000 | 70 | 4.03 |
| F.6 | 7060000 | 50 | 3.32 |
| G.1 | 60700000 | 70 | 6.57 |
| G.2 | 82100000 | 150 | 7.78 |
| G.3 | 30500000 | 70 | 8.28 |
| G.4 | 134000000 | 100 | 15.14 |
| G.5 | 91900000 | 100 | 8.61 |
| G.6 | 372000000 | 150 | 15.88 |
| G.7 | 574000000 | 200 | 15.01 |
| 7 hastaya karşılık gelen boyuna PBMC örnekleri | |||
Tablo 1: Kronik lenfositik lösemi hastalarından (KLL) PBMC peletlerinin hücre sayısı ve protein konsantrasyonu. Bu tabloda sunulan veriler mononükleer hücre hazırlama tüplerinde toplanan NCT03328273 çalışmasına katılan 7 CLL hastasından alınan 45 PBMC örneğine karşılık gelmektedir. Bunlar, atıf yapılan çalışma31'denörnekler kullanılarak oluşturulan orijinal verilerdir.
Tamamlayıcı Dosya: Alternatif protokol seçenekleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
PBMC'lerin ve plazmanın klinik çalışma alanlarında sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde hazırlanabilen yüksek kaliteli preparatları, klinik çalışma periferik tahmine dayalı ve farmakodinamik çevirisel biyobelirteç uç noktalarını bilgilendirmek için paha biçilemez. Burada, klinik bir çalışma ortamında yürütme hatalarına karşı savunmasız olan tipik sorunlu adımları ele alan kısa ve net bir protokol sağladık. Bununla birlikte, protokol klinik sahadaki zaman kısıtlamaları veya aşağı akış analizlerinin türü gibi belirli gereksinimleri karşılamak için daha da optimize edilebilir (bkz.
Bu amaçla, çeşitli aşağı akış analizleri için uygun dondurulmuş PBMC peletleri ve dondurulmuş plazma üretmek için mononükleer hücre hazırlama tüpleri kullanarak hem PBMC'lerin hem de plazmanın tam kandan nasıl izole edilmesi gerektiğini gösterdik. 2.5. adımda PBMC katmanının santrifüjlenmesi ve tanımlanmasını ve 3.3 ve 3.6 adımlarında PBMC peletlerini içeren özellikle kritik protokol adımlarına dikkat çektik. Tarihsel olarak, klinik sitelerin sıklıkla yanlış gittiği yer, santrifüjü doğru birimlere ayarlamaktır (bir RCF veya x g değerini RPM değeriyle karıştırmak), kan örneklerinin işlenmesini, sıcaklığı ve donmuş hücre peletinin üzerinde büyük hacimlerde PBS varlığını geciktirmektir. Çoğu santrifüj rotorunda yanlışlıkla RPM ayarı olarak x g değeri girilmesi, sonuçta kötü tanımlanmış veya eksik pbmc katmanı ile önemli ölçüde santrifüj altı santrifüjleme ve verimsiz hücre peletleme nedeniyle yıkama adımları sırasında potansiyel yanlışlıkla PBMC atılması ile sonuçlanacaktır. Bununla birlikte, hasta lökopeni geliştirmişse, doğru santrifüj ayarlarını ve rotor adaptörunu kullanmasına rağmen pbmc tabakasının görünmeme olasılığı vardır. Bu durum kemoterapi veya radyasyon tedavisi nedeniyle onkoloji denemelerinde kayıtlı hastaları etkileyebilir ve düşünülmelidir. Protokolde açıkça ortaya konulmuş bir diğer kritik nokta ise hemolizin protokolü olumsuz etkileme olasılığını azaltmak için numunelerin kan çekiminden itibaren 1-2 saat içinde işlenmesi gerektiğidir. Ayrıca, kan çekiminin ilk saatinde örnekleri işlemeyi hedeflemek, farmakokinetik okumalarda ve Şekil 4'tegösterilen durum gibi kan koruma veya aktif sinyal yollarından etkilenen biyobelirteçlerde büyük bir etkiye sahip olabilecek ex vivo değişkenliğini azaltır. Numune işlemedeki gecikmeler, hücreler kriyoprezserved olacaksa hücre canlılığında zararlı bir etkiye de sahip olabilir34. Hem verimi hem de kırmızı kan hücresi kirlenmesini etkileyebilecek bir diğer faktör, oda sıcaklığında (18-25 °C) tutulması gereken depolama ve santrifüj sıcaklığıdır. Daha düşük sıcaklıklar yoğunluk gradyan ortamının yoğunluğunu arttırır, bu da bu hücreler de bir araya toplanmadığı için daha yüksek derecede kırmızı kan hücresi ve granülosit kirlenmesine neden olur. Öte yandan, daha yüksek sıcaklıklar, agrega eritrositler arasında sıkışan PBMC'lere yol açar, böylece preparatın verimini azaltır15,27,28. Ve son olarak, bu PBMC preparatlarının aşağı akış işlemesinde elde edilen protein lysates konsantrasyonunu olumsuz yönde etkilediğinden, cryovial hücre peletinde en fazla 50-100 μL sıvı bulunması çok önemlidir. Fazla miktarda sıvı, örnekleri aşırıya düşürerek biyobelirteç analizi için uygun olmayan çok düşük protein konsantrasyonuna sahip lisatlara yol açacaktır. Ek olarak, çeviri sonrası değişikliklerin korunması bozulacak ve lizizin verimliliği de büyük ölçüde azaltılacaktır.
Mononükleer hücre hazırlama tüpleri, deneyimlerimize göre mükemmel tekrarlanabilirlik ile klinik çalışmalar için hem PBMC'leri hem de plazmayı tek bir kan çekiminde izole etmenin en basit yolunu sundukları için seçildi. Kan işleme yüksek eğitimli operatörler gerektirmez ve tek bir tüpün kullanılması, kanın seyreltilmesi ve farklı bir tüpe aktarılması ihtiyacını ortadan kaldırarak tehlike riskini azaltır; frenler açıkken santrifüj adımlarını gerçekleştirmesi nedeniyle protokolü kısaltır; ve tüm reaktifler tüptedir, bu da değişkenliği azaltır. Deneyimlerimize göre, bu faydalar sadece yoğunluk gradyan ayırma ortamının kullanımını içeren diğer klasik yöntemlere kıyasla bu tüplerin daha yüksek maliyetinden daha ağır basmaktadır27,28 (60 birim başına 410 £ iken 66 50 mL preparatlar için lenfoprep ortamı £ 215'tir). Her ikisi de izole PBMC35'inişlevselliğini korumada karşılaştırılabilir olan heparin ve sitrat olmak üzere iki tür antikoagülanda mevcuttur, bu nedenle, bir antikoagülanın diğerine göre seçimi, aşağı akış biyobelirteç çalışmalarında heparin veya sitratın olası etkisine dayanacaktır. EDTA tüplerinin heparin veya sitrat13ile karşılaştırıldığında en yüksek PBMC izolasyon verimini sağladığı gösterilmiş olsa da, tek tüplü manipülasyonun kullanım kolaylığının yararı bu hususu dengeler. Sitokinler analiz edilecekse, pıhtı önleyiciler plazmada tespit edilen seviyelerin bir etkisine sahip olabilir, bu nedenle klinik çalışma için birini seçmeden önce her iki antikoagülan test edilmelidir36. Plazma metabolomik çalışmalar için kullanılacaksa, antikoagülan olarak heparin kullanılması tercih edilecektir37. Bu nedenle, son kullanıcıya veya klinik deney çeviri bilimcisine kalan tek nokta, maliyetler değerlendirildikten sonra sitrat veya heparinin amaçlarına daha uygun olup olmayacağıdır.
Hücre hazırlama tüplerini kullanmanın yararları, oluşturdukları sınırlamalara kıyasla çok sayıda olsa da (kısıtlı bir antikoagülan aralığının daha yüksek maliyeti ve kullanılabilirliği), klinik çalışmalarda, özellikle onkolojide PD biyobelirteçleri elde etmek için PBMC'lerin veya plazma kullanımının ana sınırlaması izolasyon yöntemiyle ilgisiz olabilir. Tümörün periferik kandan doğrudan örneklendiği hematolojik kanserler dışında, diğer kanser endikasyonları için plazma ve PBMC'ler primer tümörü taklit etmeyen taşıyıcı dokulardır. Periferik doku genom ve epigenomu primer tümörle paylaşamayabilir, bu nedenle belirli bir tümör mutasyonuna bağımlı biyobelirteçlerin periferik analizi esas olarak ctDNA analizi (plazmadan) veya CTC'lerle (PBMC tabakasının daha sonra sıralanmasıyla) sınırlıdır. Ek olarak, sinyal basamakları tümör çoğalmasına neden olur veya katkıda bulunmak periferik kanda aktif olmayabilir. Bu zorluk, alternatif biyobelirteçleri tanımlamak için kan8'i hedefleyen biyobelirteç keşif yaklaşımları uygulanarak veya plazma38 ve PBMC preparatlarının izolasyonu için ek vivo tedavileri kaplin26ile aşılabilir.
Mevcut protokolde dondurulmuş PBMC peletleri, batı şişkinliği veya ELISA teknikleri ile değerlendirilebilen protein lysates vermek için klinik bölgeden kolayca işlenebilir. IHC yöntemlerini etkinleştirmek için PBMC'leri kullanmak için alternatif yöntemler de sunulmuştur (Tamamlayıcı Dosya). Buna ek olarak, bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri ve ADC'lerin klinik çalışmalarda giderek daha fazla test edildiği, onkolojide ilgili bir uygulama olan immün hücre izleme için PBPC'lerin kriyoprezervasyon olasılığını da ayrıntılı olarak açıkladık . ADCC16 ve immünofenotyping gibi bağışıklık fonksiyonlarının değerlendirilmesi, mononükleer hücre hazırlama tüplerinden izole edilmiş kriyoprezer korunmuş PBMC'lerle uyumlu uygulamalardır15. Kriyoprezervasyonla ilgili bir uyarı var. Belirli yüzey ve iç belirteçlerin aşağı regülasyonını teşvik edebileceğinden ve belirli hücre işlevlerini bozabileceğinden, PBMC kriyoprezervasyonu, birden fazla klinik siteden alınan örnekleri dış laboratuvarlarda işlemeye işlerken zaman kısıtlamaları nedeniyle bu tahlilleri gerçekleştirmenin tek yoludur14,15ve bu zararlı etkiler iyi çözülme yöntemleri ve dinlenme süreleri39ile büyük ölçüde aşılabilir.
Sonuç olarak, burada sağlanan protokol, herhangi bir klinik kurumdaki PBMC'lerin ve plazma örneklerinin ortak ekipman ve malzemelerle güvenilir bir şekilde hazırlanmasına izin verecektir, böylece periferik kandan çeviri uç noktaları küresel klinik çalışmalarda sağlam bir şekilde etkinleştirilebilir.
Son olarak, PBMC lysates analizinin, klinik gelişimi şekillendirmeye yardımcı olmak için kullanılabilecek anahtar DDR faktörlerinin doza bağımlı çeviri sonrası modifikasyonunu göstererek DNA'ya zarar veren ajanlara verilen yanıtı mekanistik olarak nasıl bilgilendirebileceğini gösteriyoruz. İleriye dönük, batı şişkinliğinden daha nicel olan yöntemlerin uygulanması (örneğin, kütle spektrometresi40)ve daha az giriş malzemesi (kılcal batı şişkinliği ve ELISA gibi) gerektiren bu preklinik sonuçların PBMC hasta örneklerinin daha sağlam ve sistematik bir değerlendirmesine doğru taşınmasına yardımcı olacaktır.
Disclosures
Tüm yazarlar AstraZeneca'nın çalışanları ve hisse sahipleridir. VM, AstraZeneca ve Gilead Sciences'ta hisse sahibi olan Acerta Pharma'nın bir çalışanıdır.
Acknowledgments
AstraZeneca Onkoloji Araştırma ve Erken Gelişim'deki Tüm Çeviri Tıbbı üyelerine, başta Hedley Carr, Tammie Yeh ve Nathan Standifer olmak üzere, ctDNA analizi için plazma hazırlama, PBMC izolasyonu ve PBMC kriyoprezervasyon ve immünofenotiping konusunda tavsiyeler için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL cryovial | Nalgene, ThermoFisher | 5000-1020 | To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 525-0990 | This is an example, use your preferred provider |
| 15 mL conical sterile propylene centrifuge tube | Nunc, ThermoFisher | 339651 | Other brands can be used |
| 2 mL screw cap tube sterile, with attached cap | ThermoFisher | 3463 | For plasma aliquoting |
| 20X TBS Buffer | ThermoFisher Scientific | 28358 | Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider |
| 20X TBS Tween 20 Buffer | ThermoFisher Scientific | 28360 | Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer |
| Automated cell counter or haemocytometer | ThermoScientific | AMQAX1000 | We use Countess device and slides but could be other methods. |
| Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
| BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL | BD | 362761, 362753 | There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw |
| Cell-freezing box | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | This is an example, use your preferred provider. |
| Centrifugation unit converter | LabTools | http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/ | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, MERK | D2438 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
| ECL horseradish peroxidase substrate | ThermoFisher | 34075 | Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems. |
| Faxitron MultiFocus X-ray cabinet | Faxitron Bioptics | To irradiate blood. Other models/makers are available | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | ThermoScientific | 102706 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
| Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-018 | Optional |
| Fixed-angle rotor centrifuge | Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics | ||
| Gel doc imaging system | SYNGENE | For imaging HRP developed membranes | |
| Heat block | To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors | ||
| Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge | Thermoscientific | Heraeus Megafuge 40R | This is an example |
| Liquid nitrogen/dry ice | To flash-freeze samples | ||
| Marvel dried skimmed milk | Premier Foods | This is an example, use your preferred provider | |
| Micropipette tips for range 1-200 µL | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells | ThermoFisher Scientific | NP0321BOX | This is an example, cast your own or use your preferred provider |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | For imaging HRP developed membranes |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFisher Scientific | NP0009 | This is an example. |
| PBS, no calcium, no magnesium | Gibco, ThermoFisher | 14190-144 | This is usually provided in the clinical kit. |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma-Aldrich, MERK | P5726-1ML | Optional for step 3.7 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma-Aldrich, MERK | P0044-1ML | Optional for step 3.7 |
| Rabbit anti GAPDH | Cell Signaling Technology | CST 2128 | 1:1000 dilution in 5% milk TBST |
| Rabbit anti γH2AX | Cell Signaling Technology | CST 2577, lot 11 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti pS1981 ATM | Abcam | ab81292 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti pS635 RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 14223 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti total ATM | Abcam | ab32420 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti total RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 3427, lot 2 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, MERK | R0278-50ML | For cell lysis. This is an example, use your preferred provider |
| Sonicator | Diagenode | B01060010 | Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator. |
| Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-030 | This is an example, use your preferred provider |
| Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) | Costar | 4101, 4051 | This is an example, use your preferred provider |
| Trypan blue | ThermoScientific | T10282 | This is for the automated cell counter listed above. |
| Wet ice | To keep plasma samples and lysates cold |
References
- Hoelder, S., Clarke, P. A., Workman, P. Discovery of small molecule cancer drugs: successes, challenges. and opportunities. Molecular Oncology. 6, 155-176 (2012).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 57-77 (2018).
- Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA repair in cancer: beyond PARP inhibitors. Cancer Discovery. 1, 20-37 (2017).
- Pettersson, M., Crews, C. M. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs)-Past, present and future. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 15-27 (2019).
- Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature Reviews Cancer. 12, 278-287 (2012).
- Thomas, A., Teicher, B. A., Hassan, R. Antibody-drug conjugates for cancer therapy. The Lancet Oncology. 17 (6), 254 (2016).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
- Jones, G. N., et al. pRAD50: a novel and clinically applicable pharmacodynamic biomarker of both ATM and ATR inhibition identified using mass spectrometry and immunohistochemistry. British Journal of Cancer. 119 (10), 1233-1243 (2018).
- Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 419-431 (2014).
- Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology. 31 (1), 17-22 (2012).
- Olson, E. M., Lin, N. U., Krop, I. E., Winer, E. P. The ethical use of mandatory research biopsies. Nature reviews Clinical Oncology. 8, 620-625 (2011).
- O'Donnell, A., et al. Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the oral mammalian target of rapamycin inhibitor Everolimus in patients with advanced solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1588-1595 (2008).
- Fong, P. C., et al. Inhibition of Poly(ADP-Ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers. The New England Journal of Medicine. 361 (2), 123-134 (2009).
- Verschoor, C. P., Kohli, V., Balion, C. A comprehensive assessment of immunophenotyping performed in cryopreserved peripheral whole blood. Cytometry B Clinical Cytometry. 94 (5), 662-670 (2018).
- Ruitenberg, J. J., et al. VACUTAINER®CPT™ and Ficoll density gradient separation perform equivalently in maintaining the quality and function of PBMC from HIV seropositive blood samples. BMC Immunology. 7 (11), (2006).
- Yamashita, M., et al. A novel method for evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by flowcytometry using cryopreserved human peripheral blood mononuclear cells. Scientific Reports. 6 (19772), 1-10 (2016).
- Schiavon, G., et al. Analysis of ESR1 mutation in circulating tumor DNA demonstrates evolution during therapy for metastatic breast cancer. Science Translational Medicine. 7 (313), 182 (2015).
- Lee, J., et al. Tumor genomic profiling guides metastatic gastric cancer patients to targeted treatment: the VIKTORY umbrella trial. Cancer Discovery. , (2019).
- Abbosh, C., et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution. Nature. 545, 545 (2017).
- Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21 (6), 560-562 (2015).
- Rossi, G., Ignatiadis, M. Promises and pitfalls of using liquid biopsy for precision medicine. Cancer Research. 79 (11), 2798-2804 (2019).
- Balasubramanian, P., et al. Isolation and characterisation of circulating tumor cells (CTCs) from peripheral blood specimens of patients with advanced solid tumor malignancies (using ApoStream® instrumentation) [abstract 3062]. Proceedings of the Annual meeting of the American Association for Cancer Research. , San Diego, CA. (2014).
- Qin, J., Alt, J. R., Hunsley, B. A., Williams, T. L., Fernando, M. R. Stabilization of circulating tumor cells in blood using a collection device with a preservative reagent. Cancer Cell International. 14 (13), 1-6 (2014).
- Biomarkers definitions working group. Biomarkers and surrogate endpoints: preferred definitions and conceptual framework. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 69 (3), 89-95 (2001).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 472-484 (2013).
- Bundred, N., et al. Evaluation of the pharmacodynamics of the PARP inhibitor olaparib: a phase I multicentre trial in patients scheduled for elective breast cancer surgery. Investigational New Drugs. 31, 949-958 (2013).
- Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Advances in Clinical Chemistry. 92, 141-199 (2019).
- Grievink, H. W., et al. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: cell recovery and viability, population composition and cell functionality. Biopreservation and Biobanking. 14 (5), 410-415 (2016).
- Khadka, M., et al. The effect of anticoagulants, temperature, and time on the human plasma metabolome and lipidome from healthy donors as determined by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomolecules. 9 (5), 1-15 (2019).
- Hellmann, M. D., et al. Circulating tumor DNA analysis to assess risk of progression after long-term response to PD-(L)1 blockade in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (12), 2849-2858 (2020).
- ClinicalTrials.gov [Internet}. Identifier NCT03328273, A study of AZD6738 and Acalabrutinib in subjects with relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL). National Library of Medicine (US). , Bethesda (MD). Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03328273 (2017).
- Kirschner, M. B., et al. The impact of hemolysis on cell-free microRNA biomarkers. Frontiers in Genetics. 4 (94), 1-13 (2013).
- Blackford, A. N., Jackson, S. P. ATM, ATR, and DNA-PK: The Trinity at the Heart of the DNA Damage Response. Molecular Cell. 66, 801-817 (2017).
- Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral Blood Mononuclear Cells: Isolation, Freezing, Thawing, and Culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
- Basavaraj, M. G., Østerud, B., Hansen, J. B. Influence of different anticoagulants on monocyte procoagulant functions and monocyte-platelet aggregates formation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1673-1676 (2011).
- Biancotto, A., Feng, X., Langweiler, M., Young, N. S., McCoy, J. P. Effect of anticoagulants on multiplexed measurements of cytokine/chemokines in healthy subjects. Cytokine. 60, 438-446 (2012).
- Wawrzyniak, R., et al. New plasma preparation approach to enrich metabolome coverage in untargeted metabolomics: plasma protein bound hydrophobic metabolite release with proteinase K. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
- Duffy, D., et al. Standardized whole blood stimulation improves immunomonitoring of induced immune responses in multi-center study. Clinical Immunology. 183, 325-335 (2017).
- Wang, L., et al. Standardization of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells through a resting process for clinical immunomonitoring- development of an algorithm. Cytometry A Clinical Cytometry. 89, 246-258 (2016).
- Whiteaker, J. R., et al. Targeted mass spectrometry enables robust quantification of FANCD2 mono-ubiquitination in response to DNA damage. DNA Repair. 65, 47-53 (2018).
- Lam, N. Y., Rainer, T. H., Chiu, R. W., Lo, Y. M. EDTA is a better anticoagulant than heparin or citrate for delayed blood processing for plasma DNA analysis. Clinical Chemistry. 50, 256-257 (2004).
- Parpart-Li, S., et al. The effect of preservative and temperature on the analysis of circulating tumor DNA. Clinical Cancer Research. 23 (10), 2471-2477 (2017).
