Summary
يقدم هذا البروتوكول نموذجًا قويًا قابلًا للاستنساخ من زرع الكلاروستونتر المركب الوعائي (VCA) الموجه نحو دراسة متزامنة لعلم المناعة والتعافي الوظيفي. الوقت المستثمر في تقنية دقيقة في زرع العظام الطرف الخلفي في منتصف الفخذ الأيمن مع أنستووموز الأوعية الدموية المخيط يدويًا والتكptation العصبي ينتج القدرة على دراسة التعافي الوظيفي.
Abstract
زرع الأطراف على وجه الخصوص والأوعية الدموية المركبة allotransplant (VCA) بشكل عام لديهم وعد علاجي واسع تم تعثرت بسبب القيود الحالية في قمع المناعة والانتعاش العصبي الوظيفي. وقد تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية لدراسة ميزات فريدة من نوعها من VCA، ولكن هنا نقدم نموذجا قويا استنساخها من زرع الأطراف الخلفية التقويمية في الفئران مصممة للتحقيق في وقت واحد كلا الجانبين من الحد VCA الحالي: استراتيجيات المناعة والمناعة الانتعاش العصبي الوظيفي. في قلب النموذج تقع على التزام دقيق, تقنيات الجراحة المجهرية اختبار الزمن مثل اليد مخيط anastomoses الأوعية الدموية واليد مخيط coaptation العصبية العصب الفخذي والعصب الوركي. ويسفر هذا النهج عن إعادة بناء دائمة للأطراف تسمح بالحيوانات التي تعيش حياة أطول والقادرة على إعادة التأهيل، واستئناف الأنشطة اليومية، والاختبار الوظيفي. مع العلاج على المدى القصير من العوامل التقليدية المثبطة للمناعة، نجت الحيوانات المزروعة بعد 70 يومًا من بعد الزراعة، وتوفر الحيوانات المزروعة بمقاييس المقاييس ضوابط طويلة الأمد تتجاوز 200 يوم بعد الجراحة. دليل على الانتعاش الوظيفي العصبي موجود من قبل 30 يوما بعد المنطوق. هذا النموذج لا يوفر فقط منصة مفيدة لاستجواب الأسئلة المناعية فريدة من نوعها ل VCA وتجديد الأعصاب، ولكن يسمح أيضا لاختبار في الجسم الحي للاستراتيجيات العلاجية الجديدة مصممة خصيصا لVCA.
Introduction
زرع الأطراف في إطار الفئة الأوسع من زرع الكلابير المركبة الوعائية (VCA) أو زرع الخلايا الالية النسيجية المركبة (CTA) لم تف بعد بوعدها العلاجي. منذ أول عمليات زرع يد بشرية ناجحة في ليون وفرنسا ولويزفيلي، كنتاكي في 1998 و 1999، تم إجراء أكثر من 100 عملية زرع أطراف عليا في جميع أنحاء العالم في المرضى المختارين بعناية1. وقد أحبطت تطبيق أوسع من قبل كبت المناعة كبيرة والانتعاش العصبي الوظيفية محدودة. استراتيجيات كبت المناعة الحالية تؤدي إلى حدوث 85٪ من الرفض الحاد في مواجهة 77٪ من الإصابة بالعدوى الانتهازية2. من ناحية أخرى ، يحدث الشفاء الوظيفي بعد زرع اليد ؛ يعني العجز من الكتف الذراع واليد (داش) عشرات تحسين من 71 إلى 43، ولكن هذا المستوى من وظيفة قد لا تزال مؤهلة كإعاقة2. ونظرا لطبيعة إنقاذ غير الحياة لزراعة الأطراف، يجب صقل التقنيات الحالية في نماذج الحيوانات لاتخاذ الخطوة التالية في VCA.
منذ أول نموذج الفئران من زرع الأطراف في 19783, وقد وضعت العديد من النماذج الحيوانية المبتكرة للنهوض مجال VCA4, دمج الأوعية الدموية المقيدة لتقليل الوقت المنطوق5,6, hetero عمليات زرع أوستيومييكوتيوسيوميستي للتقليل من إهانة فسيولوجية إلى الحيوان المتلقي7،8،9،10،11، ورواية نهج المناعة7،12،13،14. يؤكد نموذج الفئران لزراعة منتصف الفخذ اليمنى للمغضم الأيمن المؤجج هنا على التقنيات الدقيقة التي تم اختبارها زمنيًا مثل أوعية الأوعية الدموية المخيطة يدويًا وcoaptation العصبي كاستثمار مقدم في منصة نموذجية قوية وقابلة للاستنساخ للتحقيق في وقت واحد في كلا جانبي الحد الحالي من VCA: استراتيجيات قمع المناعة والانتعاش العصبي الوظيفي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع التجارب وفقا لدليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة، ووافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة نورث وسترن. تم تنفيذ الإجراءات المحددة بموجب بروتوكول IS00001663.
ملاحظة: تم استخدام سلالات اثنين من الفئران، الفئران لويس وأغسطس كوبنهاغن x الأيرلندية (ACI) الفئران. تم تقسيم الحيوانات إلى ثلاث مجموعات العلاج: allotransplant دون قمع المناعة (ACI إلى لويس)، allotransplant مع قمع المناعة التقليدية (ACI إلى لويس)، وisotransplant (لويس لويس أو ACI إلى ACI). لويس هو سلالة أصيلة، في حين أن الفئران ACI تمثل من نوع البرية ولدت خارج، وبالتالي تم اختيار هذا المزيج لنموذج استجابة الرفض أسوأ حالة. تم إعطاء كبت المناعة التقليدية تحت الجلد إما باسم راباميسين 1 ملغم/ كجم من يوم ما بعد الجراحة (POD) ناقص 1 إلى POD 28 أو كما FK506 3 ملغ/ كجم من POD 0 إلى POD 14، ثم مرة واحدة أسبوعيا بعد ذلك. وكان كل من الجرذان الذكور والإناث متلقين مؤهلين من 8 إلى 16 أسبوعا، وكان وزنهما يتراوح بين 250 و 400 غرام في وقت الجراحة.
1. المانح حصاد الأطراف الخلفية اليمنى
- الحث التخدير العام مع 5٪ isoflurane في الأكسجين النقي من خلال المبخر مع نظام الكسح المناسب.
- تأكيد عمق كاف من التخدير مع قرصة إصبع، ومن ثم استخدام مقصات الشعر لتقليم الفراء قبالة من الطرف الخلفي الأيمن والحق في الفخذ موقع الجراحية
- أسفل- titrate isoflurane من خلال مخروط الأنف القوارض إلى 2-2.5٪ .
- ضع الجرذ مع أطرافه المنتشرة اُسجّل على الجانبين على لوحة عمليات مع وسادة تدفئة تحتها. تطهير الجلد بلا شعر مع 70٪ فرك الكحول وحماية المجال الجراحي مع الشاش العقيم.
- باستخدام المجهر المجهري المناسب، والأدوات الجراحية الدقيقة، ومع سهولة الوصول إلى القطبين والكهرباء monopolar، تبدأ تشريح.
- استخدام مقص لجعل الجلد المحيطي / شق الأنسجة تحت الجلد حول hindlimb الحق. تبدأ في منتصف التجاعيد الإربية في نفس مستوى تقريباً مثل الرباط الإربي وتمديد الظهري-جزئياً لإكمال شق المحيطي.
- بعد أن كشفت طبقة العضلات مباشرة تحت شق, تشريح وتكويد الأوعية شرسوفية السطحية التي تؤدي من طبقة العضلات إلى الجلد القريب / رفرف تحت الجلد التي تم إنشاؤها للتو.
- تعكس رفرف قريب superomedially إلى الرباط الإربي والجلد القعد / رفرف تحت الجلد بشكل الاستدلال إلى الركبة.
- استخدام الأسلاك الداحر أو الشاش المدلفن للمساعدة في فضح الحقل.
- لاحظ أن التشريح الأرينى للجرذ يشبه البشر ؛ من الجانبي إلى الوسط تكمن العصب والشريان والوريد.
- تشريح العصب الفخذي، وتقسيمه بشكل حاد في الرباط الأربيني، وقريبة إلى التشعب إذا كان ذلك ممكنا. تراجع العصب المنقسم دون المستوى، والحفاظ عليه بأمان بعيدا عن الطريق، مغطاة تحت الشاش الرطب.
- توجيه الانتباه إلى الشريان الفخذي والوريد، استخدم 4 سم 7-0 ربطات عنق الحرير لسحب أحتواك الأوعية بدلاً من التعامل معها مباشرة.
- Ligate جميع فروع الأوعية الفخذية لأنها تنشأ مع 7-0 علاقات الحرير؛ تقسيم الفروع بين الروابط. بالنسبة إلى الفروع الصغيرة جداً، يمكن استخدام الكي ثنائي القطب بدلاً من الروابط.
ملاحظة: تشمل الفروع الشريانية والفورية التي تتطلب تقسيم الحرقف السطحي والأوعية العضلية. الحرقف السطحي هو عادة أكبر ويبدو أن الغوص العميق كما هو الحال مع femoral profunda في البشر، ولكن profunda غائب في الفئران15. فروع أكثر شطرا من الأوعية الفخذية مثل أعلى genicular وفرع السفح لا تتطلب عادة الانقسام. - حقن منهجي 500 وحدة دولية من الهيبارين من خلال الوريد القضيب في متبرع الفئران الذكور. استخدام الوريد شرسوفي سطحية إذا كان الجرذ المانح أنثى.
- السماح لهسبارين لتعميم بشكل نظامي لمدة 2 دقيقة قبل الشروع في الخطوات التالية.
- Ligate الشريان الفخذي مع 7-0 العلاقات الحريرية كما أقرب إلى الرباط الأربيني ممكن وتقسيم بين العلاقات.
- على غرار الشريان، ligate وتقسيم الوريد الفخذ.
- تعكس كلا من الشريان والوريد دونية، بأمان للخروج من الطريق، مغطاة تحت الشاش الرطب جنبا إلى جنب مع العصب الفخذي غطت سابقا. تشريح مجموعات العضلات البطنية، مع الحرص على الكي أي وعاء مرئية التي تنشأ. الاهتمام بهدمات هنا سوف يقلل من فقدان الدم المتلقي بعد إعادة ضخ.
- عميق لمجموعات العضلات البطنية، وتحديد وتقسيم حاد في العصب الوركي القريب إلى فروعه. عادة ما تكون ثلاثة فروع الوركية مرئية: التيبالية، و peroneal وال sural. وينبغي أن يتم الحفاظ على جميع الثلاثة في الطرف المانح. لا ينظر فرع الجلد الرابع عادة في هذا التشريح15,16.
- الانتهاء من تقسيم مجموعات العضلات البطنية والعضلة الظهرية المتبقية على مستوى منتصف الفخذ مع الهباس الدقيق. قد يكون من الضروري التراجع عن الوسيط الطرف لاستكمال تقسيم العضلات.
- احول عظم الفخذ في منتصف العمود باستخدام منشار دوار لاسلكي محمول باليد.
- بعد إزالة الكسب غير المشروع من الطرف من المتبرع ، قطع النهايات المربوطة بالحرير من الشريان الفخذي الجانبي للكسب غير المشروع وجذوع الوريد ، وبالتالي إعادة فتح الأوعية.
- أدخل أنجيوكاثيتر 24 قياسا في جذع الشريان الكسب غير المشروع وتدفق الكسب غير المشروع مع 250 وحدة دولية من الهيبارين المخففة في 5 مل من المالحة الطبيعية الباردة الجليد، ومشاهدته يتدفقون واضحة من خلال الوريد المفتوح.
- ببطء، برفق طرد الكسب غير المشروع لمدة 3 دقائق. قد يؤدي التنظيف القوي الزائد إلى تلف بطانة الغدد.
- ضع الكسب غير المشروع في طبق ملحي مبرد متداخل في دلو ثلج حتى الزراعة.
- القتل الرحيم الجرذ المانح مع استئصال الصدر الثنائي.
- تنظيف جميع الأدوات الجراحية بشكل مناسب.
2. المتلقي الأصلي الحق في بتر الأطراف الخلفية
- حث التخدير مع ايزوفلوران في 5٪، تأكيد العمق، وتقليم الفراء، ووضع الحيوان، وتطهير الجلد مع الكحول كما هو موضح بالنسبة للجرذ المانحة.
- أسفل- الثمل isoflurane إلى 2-2.5٪ وحقن مسكنة تحت الجلد قبل الجراحة الظفر مع البوبرينورفين 1.2 ملغ / كغ، والاتقاء قبل الجراحة مع enrofloxacin 7.5 ملغ / كغ.
- نفس بالنسبة للمتبرع ، قم بعمل شق محيطي في التجعد الإربي ، وتعكس رفرفات الجلد التي تضمن الهباس ، وتشريح العصب الفخذي والشريان والوريد ، وربط الأوعية الفرعية نفسها كما هو موجود أعلاه.
- تقسيم العصب الفخذي أكثر distally من للمتبرع، ولكن بالوكالة إلى التشعب إذا كان ذلك ممكنا.
- تشريح خارج الشريان الفخذي والوريد مع مساحة كافية لقط كل على حدة على مستوى الرباط الاربي. المشبك الوريد والشريان مع المشابك البلدغ microsurgical. مرة واحدة فرضت، وتقسيم كل سفينة بحدة مع مقص.
- تقسيم عضلات البطن والبرازالية من الفخذ على مستوى منتصف الفخذ مع اقصى دقيق، والتراجع عن منتصف الطرف حسب الضرورة.
- تحديد وتقسيم الأعصاب الوركية قريبة إلى نقاط فرعها على النحو الوارد أعلاه.
- احولي عظم الفخذ في منتصف التشميد باستخدام المنشار.
- إزالة المتلقي الأصلي الحق الخلفي الطرف والتخلص بشكل مناسب.
- أسفل- titrate isoflurane إلى 1-1.5٪ من خلال مخروط الأنف.
3- المانحة لزرع الطرف المتلقي
- باستخدام منشار السلطة المحمولة باليد، حلق قبالة أي مخالفات من كل من المانحة والمتلقية قطع الفخذ ينتهي.
- باستخدام المنشار، وقطع نهاية محور إبرة 18 قياس، والتي سوف تصبح قضيب داخل الفخذ داخل الفخذ.
- قبل التلاعب في العظام، ضعي كمية صغيرة من شمع العظام على نهاية عظم الفخذ لقطع المتلقي لتقليل نزيف النخاع أثناء عملية الرام.
- Coapt عظام الفخذ المانح والمتلقي باستخدام إبرة 18 قياس كقضيب داخل الullary. بعض القوة ضرورية، ولكن لا ream إما العظام بقدر ما لكسر القشرة.
- حسب الحاجة، قم بإزالة الإبرة وتقليمها إلى طول مناسب بحيث تناسب كلتا العظمتين بسلاسة فوق الإبرة دون أن تظهر إبرة بين العظم.
- وضع دعم صغير مثل وسادة من الشاش أو صخرة صغيرة أو طين النمذجة تحت الطرف المانح لإبقائه بعيدا عن التوتر.
- إعادة تنشيط مجموعات العضلات البطنية مع ثمانية إلى عشرة انقطاع بسيطة 5-0 الغرز البوليجلاكتين بحيث لا تدور الكسب غير المشروع حول إبرة الفخذ. وهذا يعطي استقرار الطرف ل anastomoses.
- ري بشكل دوري في مجال الكسب غير المشروع والجراحة مع المالحة الجليد الباردة لأفضل التصور والحد من إصابة اضمائي الدفء.
- محاذاة الشرايين الفخذية المانحة والمتلقية و أنستموميوز لهم في نهاية المطاف إلى نهاية الأزياء باستخدام انقطاع بسيطة 10-0 خياطة النايلون، وتجنب كل من التوتر وحلقات. يتطلب الشريان ما معدله ست خياطة.
- على غرار الشريان، anastomose الأوردة الفخذية المانحة والمتلقية في نهاية إلى نهاية الموضة. يتطلب الوريد من ستة إلى ثمانية خياطة.
ملاحظة: الري الملحي البارد السخي، وتقنية التعامل مع السفن الأذيتة، وترك ذيول طويلة لتكون بمثابة خياطة البقاء لتراجع السفينة هي أدوات هامة لأوعية الأوعية الجراحية الدقيقة الفعالة. - ضع كمية صغيرة من مسحوق السليلوز الهديم حول كل من أنستولوز، ثم قم بإزالة المشابك البلدغ المجهرية القريبة على الوريد والشريان.
- فحص كل من anastomoses لباتة جيدة وتدفق. استخدام القطن مسحة العصي إلى حث بلطف الوريد وضمان hemostasis جيدة من كل من أنستابوس. عقد الضغط على مواقع النزيف ووضع المزيد من مسحوق السليلوز hemostatic إذا لزم الأمر. قد توضع خياطة أخرى من خلال ثقب نزيف في خطر "الجدار الخلفي" الإبرة فقط كملاذ أخير.
- عندما يتم تأكيد كل من anastomoses مرضية، وتقليم أي المتبقية طويلة البقاء ذيل خياطة قصيرة لتتناسب مع الآخرين.
- إعادة وضع الجرذ إلى موقف اليسار متحرر الجانب، واستخدام الكهربائية الليبرالية لتحقيق الهفوات الدقيق من أي نزيف العضلات reperfusion.
- بدوره الانتباه إلى أنسيتوموز العصب مرة واحدة يتم ضمان هضم العضلات. تقليم الظهر أي نهايات قطع العصب التي تظهر خشنة.
- إعادة اإيصال مجموعات العضلات الظهرية تحت العصب الوركي مع انقطاع بسيطة 5-0 الغرز polyglactin.
- إعادة تنشيط العصب الوركي. ثمانية إلى عشرة 10-0 النايلون العصبية انقطاع الغرز انقطاع عادة ما يكفي.
- إعادة اِيعيدُ تنشيط مجموعات العضلات الظهرية التذكير وثم أغلق الجلد الظهري مع 4-0 البوليجلاكتين خياطة مستمرة.
- إعادة وضع الجرذ إلى وضعية الوبين وإعادة تنشيط العصب الفخذي. اثنين إلى ثلاثة 10-0 النايلون العصبية انقطاع الغرز انقطاع عادة ما يكفي.
- أغلق الجلد البطني مع 4-0 البوليلاكتين خياطة مستمرة. تجنب الذيل خياطة الزائدة، والتي يمكن أن تكون مزعجة للجرذ مستيقظا مرة واحدة.
4- الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية
- استعادة الحيوانات في أقفاصها مع وسادة التدفئة تحت القفص والوصول الجاهزة إلى الغذاء والماء، ورصد المضاعفات المبكرة يوميا للأسبوع الأول.
- توفير مسكن بعد الجراحة مع ميلوكسيكام تحت الجلد 1 ملغ/ كغ حقن يوميا من خلال POD 2. توفير وقائي المضادات الحيوية بعد العملية الجراحية تخفيف رذاذ انروفلوكساسين. توفير مثبطات لاستئصال الأوتوماتيكي (تشويه الذات) مع مر الضباب الآمن رش مرتين يوميا إلى الكسب غير المشروع من خلال POD 7.
- الحفاظ على الفئران المزروعة في أقفاص مع الفئران الأخرى، لتحفيز العودة إلى الأنشطة اليومية وإعادة تأهيل الطرف المزروع.
5. بعد الجراحة اختبار الإحساس
- تطبيق اختبار Hargreaves من بروتوكول الإحساس الحراري، كما وصف في مكان آخر17،18.
- ضع الجرذ في حاوية الاختبار وسمح له بالتأقلم لمدة 20 دقيقة. تم تأكيد نظافة زجاج الجهاز، وأكد مصدر الحرارة أنه يعمل بإصبع المحقق.
- قبل الاختبار، تأكد من أن الجرذ مستيقظ ويتم وضع مخلب اختبارها على كاشف الحركة الأشعة تحت الحمراء.
- نقل الطاقة الحرارية في مستوى كثافة 90. يتم تسجيل تأخير الوقت في الحيوان تتحرك مخلبه بعيدا عن مصدر الحرارة. إذا لم يحدث أي حركة في غضون 20 ثانية، يتم إحباط الاختبار لمنع الإصابة.
- الحصول على خمس تجارب لكل طرف تم اختباره، باستثناء أعلى وأدنى قيمة قبل حساب متوسط وقت زمن زمن السحب لكل.
6. بعد الجراحة اختبار السيارات
- باستخدام جهاز المشي في تحليل المشية ومنصة تحليل البرامج المتكاملة ، اختر المرشحين لاختبار المطحنة في أربعة إلى ستة أسابيع بعد الجراحة.
- تقليم جميع أظافر الفئران يوم أو يومين قبل الاختبار.
- التأقلم الحيوانات إلى غرفة الاختبار لمدة ساعة واحدة قبل الاختبار، والسماح لمدة دقيقة واحدة من ما قبل اختبار المداعى لتهدئة القلق.
- وضع الفئران داخل حلقة مفرغة، تشغيل حلقة مفرغة في التجارب من زيادة السرعة، من 10 سم / س، إلى 14 سم / س، إلى الهدف 18 سم / س. إذا كان الجرذ متحفظاً ولا يمكن إقناعه بالسير، أجهض الاختبار في ذلك اليوم لتجنب التكييف السلبي. السماح للأداء العالي على المشي حتى 24 سم / الثانية.
- شطف جهاز حلقة مفرغة مع الإيثانول 70٪ بين الحيوانات اختبارها.
- معلمات المشي هي نتاج من برنامج نظام التحليل الخاص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعتمد البقاء على قيد الحياة والتعافي على تقنية جراحية دقيقة. الاهتمام بأنامضم الأوعية الدموية و أنستوموزس العصبية, فضلا عن coaptation العظام كما هو موضح أعلاه هو حاسم تعظيم نجاح هذا النموذج. يتم عرض التصميم المنطوق والنتائج التمثيلية في الشكل 1.
وكان معدل الوفيات الكلي يعتمد على استراتيجية كبت المناعة، مع غالبية الحيوانات متساوي الانسtransed تحقيق نقطة نهاية الدراسة من 100-200 أيام بعد العملية الجراحية كما رأينا في الشكل 2. وبمجرد الخروج من النافذة الحادة بعد الجراحة، يمكن للحيوانات المعالجة التي تم زرعها أن تعاني من البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 58 يومًا بعد الجراحة. عاشت الفئران الأيزوغرات إلى أجل غير مسمى على مدار الدراسة في حين أن الفئران المزروعة allograft كان لها وفيات متغيرة من راباميسين وFK506. من العلاجات FK506 روجت أطول قابلية للحياة (اليوم 57)، في حين كان rapamycin ثاني أفضل (اليوم 20) على السيطرة غير المعالجة (اليوم 10).
ويمكن إظهار الانتعاش الحسية والحركية في الشكل 3. وقد تبين أن الحيوانات قد استعادت وظيفة العصب الحسية من مخلب زرع باستخدام جهاز Hargreaves بحلول اليوم 30. أظهرت الحيوانات انتعاشًا كبيرًا بعد أربعة أسابيع من الجراحة (Aii). وأظهرت الحيوانات تحسنا ملحوظا في وظيفة المحرك من الطرف المزروع باستخدام المشي آلة تحليل المشي ومنصة تحليل البرمجيات المتكاملة. مثال معلمة مشية على أساس أطراف محددة تظهر (بي) كما يتم عرض مؤشر الدالة Sciatic (SFI) (Biii).
الشكل 1: تصميم المنطوق هو يصور في شكل الكرتون. (أ) يظهر الجرذ مع (B) الجزء العرضي الخلفي من الساق اليمنى يصور (i) حزمة الفخذ (العصب والشريان والوريد) (ii) العصب الوركي ، و (3) العظم. (ج)تم أخذ ميكروجرافات تمثيلية من المجهر التشغيلي (الجهة المانحة اليسرى والمتلقية اليمنى) من (i) anstomosis العصب الوركي (ii) الشريان العصبي الفخذي، وnastomoses الوريدي (يظهر من أعلى إلى أسفل)، و (3) إبرة 18 قياس قضيب الفخذ داخل الفخذ coaptation العظام. لاحظ أن هياكل المانح تظهر إلى اليسار في كل صورة. لاحظ أيضا يظهر عظم الفخذ قبل coaptation الكامل عندما تعارض كل من العظام ويتم إخفاء الإبرة داخل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نسبة بقاء الحيوانات كما هي معروضة أيام بعد الجراحة (POD). وتشمل المجموعات المعروضة الأيزوجرافت، allografts مع عدم وجود علاج، rapamycin، والأدوية FK506 مثبطة للمناعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يظهر الانتعاش العصبي الحسي في (أ) Hargreaves اختبار الحيوانات المزروعة كل في ست نقاط زمنية بعد العملية الجراحية وفي (ب) لا تزال لقطة من اختبار حلقة مفرغة باستخدام DigiGait. '1' تُعرض الصور التمثيلية مع '2' بيانات الكفوف الخاصة. صور تلوين تلوين من الكفوف هي أيضا في إطارات 0.025 مللي ثانية. كما تظهر نماذج Digigate (3). تم تحديد أهمية باستخدام ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار مقارنة متعددة Bonferroni و SEM ، حيث ن= 7 و p< 0.05. وقد أخذت هذه البيانات DigiGait خاصة من isogeneic اختبارها في اليوم بعد العملية 28. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
زرع الأطراف، في إطار الفئة الأوسع من زرع المكونات الوعائية (VCA)، لديه وعد علاجي قابل للتطبيق على نطاق واسع حتى الآن لم يتحقق. وتكمن حواجز الطرق الرئيسية في قضايا مناعية غير محلولة فريدة من نوعها لتقنيات الاستعادة الحركية العصبية المستخدمة حاليًا. تطوير تقنيات جديدة سوف تعتمد على النمذجة الحيوانية التي هي مرنة، قوية، وقابلة للتكرار.
وقد أنشئت العديد من النماذج الحيوانية في VCA، ولكل منها مزايا محددة4. نماذج الرئيسيات غير البشرية توفر قابلية ترجمة جذابة للمرضى الإنسان، ولكن تم إعاقة من قبل المخاوف من التكاليف ومستويات سامة من كبت المناعةالمطلوبة 4. وقد ينظر إلى نماذج الكلاب على أنها مفيدة لأوجه التشابه محددة من بنية العضلات والبشر، فضلا عن نظام المناعة أكثر خبرة19,20. نماذج Porcine تقدم فوائد نموذج كبير حيث يتم دراسة الجهاز المناعي بشكل جيد على نحو متزايد21,22. نظم نموذج الماوس تقديم التقنيات الأكثر تقدما لدراسة علم المناعة، ولكن على الرغم من التقدم المهم في الأوعية الدموية المكبوتة الأوعية المجهرية23، زرع الأطراف الماوس لا تزال صعبة من الناحية الفنية ، وبعض القيود في تقييم الانتعاش الوظيفي5،24،25،26.
وقد استخدمت نماذج الفئران في VCA منذ 19783، وتوفير منصة ناضجة للتحقيق في كل من فرضيات المناعة واعصاب6،9،13،14،17،27،28،38. النموذج هنا يجمع بين مزايا النهج التقويمي hindlimb, خياطة أنستومومي, إعادة تقدير الأعصاب, وإمكانية تحليل مشية. Hindlimb orthotopic بدلا من زرع forelimb هو أقل من الهمل على الفئران أثناء عملية الانتعاش ويسمح لاستمرار الاستمالة العادية والتغذية السلوكيات بعد المنطوق. خياطة anastomosis على الرغم من أن المضنية قد تقدم يحتمل أقل التقنية الخلط للدراسات على المدى الطويل. إعادة تقدير الأعصاب يسمح للتحقيق في المستقبل17,18 ومشية تحليل. يعتمد هذا البروتوكول على دقيقة، وتقنيات جراحية مجهرية اختبار الزمن وصفها جيدا في مكان آخر29، والتي تتطلب اهتماما مستمرا لتجنب المزالق الفورية من جرعة زائدة من التخدير ، والفشل في التخدير ، والتخثر التحسسي ، وفقدان الدم الجراحي المفرط. على الرغم من أن جراحات مجهرية متعددة يمكن أن تحسن سير العمل ، فقد وصفنا طريقة يمكن من خلالها لجرّج ميكروسيريون تشغيلي واحد تحقيق مخرج تجريبي كاف.
وقد تم استئصال أوتوماتيا أو تشويه الذات ظاهرة لوحظت في العديد من النماذج المجهرية، وأنه قد افترض أن يرتبط عكسيا مع الشفاء العصبي30،31. تم التحكم في عملية استئصال الأوتوماتيكية بشكل عام في هذا النموذج ، وربما تقنية عصبية عصبية دقيقة. كما انخفضت عملية استئصال الأوتوماتيكية إلى أبعد من ذلك في منحنى التعلم. كان "الضباب الآمن المرير" مساعدًا قيمًا في السيطرة على هذه الظاهرة.
وقد درس تحليل مشية في الفئران لنماذج متعددة من إصابة32,33,34, الأكثر صلة للإصابة العصب الوركي35,36. الفئران حتى عندما لا يكون متلقي زرع الأطراف معروفة لتكون مواضيع heterogenous لتحليل المشية، والمحققين لا تزال مناقشة المعلمات التحليل الذي يصف الانتعاش37. في هذا النموذج قمنا بوصف عدة طرق للحصول على أفضل البيانات من المتلقين المزروعة الذين هم على استعداد وقادرة على المشي. ولم يكن الاختيار المسبق للمشاة الملائمين تنبؤاً بالتعاون بعد العملية. على الرغم من أن الحيوانات قادرة على التحرك حول مساكنهم في أقرب وقت بعد عدة ساعات من الجراحة ، إلا أنها ليست مستعدة لطحن المطحنة حتى أربعة إلى ستة أسابيع على الأقل بعد الجراحة.
قدرة بروتوكول لقياس الانتعاش العصبي في VCA تعتمد على استراتيجيتها لإعادة التأهيل. يشجع هذا البروتوكول صراحة متلقي زرع التفاعل مع الفئران الأخرى كحافز للعمل. هذه الاستراتيجية تدرك أهمية إعادة تأهيل النمذجة ، ولكنها بسيطة واقتصادية ، وهي قياسية إلى حد كبير. وقد تشمل الاستراتيجيات المستقبلية إعادة تأهيل أكثر نشاطاً مثل التدريب على المطحنة.
تقنيات مناعية تنطبق على هذا النموذج هي خارج نطاق هذه المناقشة، ولكن على وجه الخصوص، مقارنة ايزو ترانسانترول مقابل الحيوانات زرع يوفر سيطرة مفيدة للتمييز الظواهر المناعية allograft والرفض من إصابة ريليفة الإقفارية، والتهاب، revascularization، وعمليات العدوى بعد الجراحة الكامنة في جراحة زرع نفسها. توفر زراعة الـIsotransplants تحكمًا مماثلًا لدراسات وظائف الأعصاب لنفس السبب.
باستخدام هذه المنصة، قد يكون المحققون قادرين على النهوض بكل من المناعة VCA والانتعاش العصبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة فرانكل ومستشفى نورث وسترن التذكاري ماكورميك غرانت (عملية استعادة). وقد تم دعم البحوث التي تم الإبلاغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابعة للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة T32GM008152. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة نورث وسترن Microsurgery الأساسية والسلوكية فينوتيبينغ الأساسية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | Vet Equip | 911103 | |
| 0.5cc syringe | Exel | 26018 | |
| 18-gauge needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| 22-gauge needle | BD | 305156 | |
| 24-gauge angiocatheter | Sur-Vet | SROX2419V | |
| 25-gauge needle | Exel | 26403 | |
| 3 cc syringe | BD | 309657 | |
| 5cc syringe | Exel | 26230 | |
| Alcohol | Fisher Scientific | HC-600-1GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Vet Equip | 941443 | |
| Anesthetic gas scavenger system | Vet Equip | 931401 | |
| Bipolar electrocautery | Aura | 26-500 | |
| Bitter Spray Mist | Henry Schein | 5553 | |
| Bone wax | CP Medical | CPB31A | |
| Breathing circuit | Vet Equip | 921413 | |
| Buprenophine | Reckitt Benckiser | 12496075705 | |
| Castro-Viejos needle drivers | Roboz | RS-6416 | |
| Cordless rotary saw | Dremel | 8050-N/18 | |
| Cotton swab stick | Fisher Scientific | 23-400-101 | For hemostasis |
| DigiGait Appparatus and Software | Mouse Specifics | MSI-DIG, DIG-SOFT | |
| Dumont forceps (#4) | Roboz | RS-4972 | |
| Dumont forceps (#5) | Roboz | RS-5035 | |
| Enrofloxacin | Norbrook | ANADA 200-495 | |
| FK-506 | Astellas | 301601 | |
| Gauze | Kendall | 1903 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gloves | Microflex | DGP-350-M | |
| Hair clippers | Oster | 078005-010-003 | |
| Handheld monopolar electrocautery | Bovie | AA00 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy | 37370 | |
| Heating pad | Walgreens | 126987 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | 42592K | |
| Hot plate | Corning | PC-351 | For warming resusscitation fluid |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter | 2B2074 | |
| Large petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | For donor graft while in chilled saline |
| Meloxicam | Henry Schein | 49755 | |
| micro Collin Hartmann retractor | |||
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | |
| Microfibrillar collagen powder | BD | 1010590 | For hemostasis |
| Microvascular clips | Roboz | RS-5420 | |
| Normal saline | Baxter | 2F7124 | |
| Opthalmic lube | Dechra | IS4398 | |
| Rapmycin | MedChem Express | HY-10219 | |
| Small petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | For warmed resusscitation fluid |
| Sterile drapes | ProAdvantage | N207100 | |
| Surgical gown | Cardinal Health | 9511 | |
| Surgical mask | 3M | 1805 | |
| Surgical microscope, optic model OPMIMD | Zeiss | 169756 | |
| Surgical microscope, Universal S3 | Zeiss | 243188 | |
| Suture 10-0 nylon | Covidien | N2512 | |
| Suture 5-0 vicryl | Ethicon | J213H | |
| Suture 7-0 silk tie | Teleflex | 103-S | |
| Tape | 3M | 1530-1 | |
| Ultrasonic instrument cleaner | Roboz | RS-9911 | |
| Vessel dilation forceps | Roboz | RS-5047 |
References
- Elliott, R. M., Tintle, S. M., Levin, L. S. Upper extremity transplantation: current concepts and challenges in an emerging field. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine. 7 (1), 83-88 (2014).
- Petruzzo, P., et al. The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation. Transplantation. 90 (12), 1590-1594 (2010).
- Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. Journal of Surgical Research. 24 (6), 501-506 (1978).
- Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (108), e53483 (2016).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (41), e2022 (2010).
- Horner, B. M., et al. In vivo observations of cell trafficking in allotransplanted vascularized skin flaps and conventional skin grafts. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (4), 711-719 (2010).
- Fleissig, Y., et al. Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research. Journal of Visualized Experiments. (146), e59458 (2019).
- Zhou, X., et al. A series of rat segmental forelimb ectopic implantation models. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
- Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
- Fries, C. A., et al. enzyme responsive, tacrolimus-eluting hydrogel enables long-term survival of orthotopic porcine limb vascularized composite allografts: A proof of concept study. PLoS One. 14 (1), 0210914 (2019).
- Cottrell, B. L., et al. Neuroregeneration in composite tissue allografts: effect of low-dose FK506 and mycophenolate mofetil immunotherapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 5 (2006).
- Benhaim, P., Anthony, J. P., Lin, L. Y., McCalmont, T. H., Mathes, S. J. A long-term study of allogeneic rat hindlimb transplants immunosuppressed with RS-61443. Transplantation. 56 (4), 911-917 (1993).
- Greene, E. C. Anatomy of the rat. Volume N.S. American Philos. Soc. , Philadelphia, Pa. 27 (1935).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal Pain Sensation in Rats and Mice Using the Hargreaves Test. Bio-protocol. 7 (16), (2017).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Hong, S. H., Eun, S. C. Experimental Forelimb Allotransplantation in Canine Model. BioMed Research International. 2016, 1495710 (2016).
- Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 26 (3), 201-207 (2010).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Fries, C. A., et al. A Porcine Orthotopic Forelimb Vascularized Composite Allotransplantation Model: Technical Considerations and Translational Implications. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3), 71 (2016).
- Kim, M., Fisher, D. T., Powers, C. A., Repasky, E. A., Skitzki, J. J. Improved Cuff Technique and Intraoperative Detection of Vascular Complications for Hind Limb Transplantation in Mice. Transplantation Direct. 4 (2), 345 (2018).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), 015495 (2013).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a mouse model for heterotopic limb and composite-tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (4), 267-273 (2001).
- Tang, J., et al. A vascularized elbow allotransplantation model in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 24 (5), 779-786 (2015).
- Yan, Y., et al. Nerve regeneration in rat limb allografts: evaluation of acute rejection rescue. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (4), 511 (2013).
- Georgiade, N. G., Serafin, D. A Laboratory Manual of Microsurgery. Fourth Printing. , (1986).
- Tseng, S. H. Suppression of autotomy by N-methyl-D-aspartate receptor antagonist (MK-801) in the rat. Neuroscience Letters. 240 (1), 17-20 (1998).
- Haselbach, D., et al. Regeneration patterns influence hindlimb automutilation after sciatic nerve repair using stem cells in rats. Neuroscience Letters. 634, 153-159 (2016).
- Kloos, A. D., Fisher, L. C., Detloff, M. R., Hassenzahl, D. L., Basso, D. M. Stepwise motor and all-or-none sensory recovery is associated with nonlinear sparing after incremental spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 191 (2), 251-265 (2005).
- Berryman, E. R., Harris, R. L., Moalli, M., Bagi, C. M. Digigait quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 11622, 179-188 (2014).
- Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behavioural Brain Research. 219 (1), 55-62 (2011).
- Neckel, N. D. Methods to quantify the velocity dependence of common gait measurements from automated rodent gait analysis devices. Journal of Neuroscience Methods. 253, 244-253 (2015).
- Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (5), 1704-1711 (2000).
