Summary
该协议提出了一个强大的，可重复的模型血管化复合异体移植（VCA），旨在同时研究免疫学和功能恢复。时间投入到细致的技术，在右中大腿后肢正交移植与手工缝制血管肿瘤和神经共性产生研究功能恢复的能力。
Abstract
特别是肢体移植和血管化复合异体移植（VCA），一般有广泛的治疗前景，由于目前免疫抑制和功能神经运动恢复的限制，已经阻碍了这种前景。许多动物模型已经开发用于研究VCA的独特特性，但在这里我们提出了一个强大的可重复模型的老鼠正交后肢移植，旨在同时研究当前VCA限制的两个方面：免疫抑制策略和功能神经运动恢复。该模型的核心是致力于细致，久经考验的显微外科技术，如手工缝制血管肿瘤和手工缝制神经共生股股骨神经和坐骨神经。这种方法可以进行持久的肢体重建，使活更长的动物能够恢复、恢复日常活动和功能测试。通过传统免疫抑制剂的短期治疗，异体移植动物在移植后存活了70天，而异体移植动物在术后200天后提供长寿对控制。神经功能恢复的证据在术后30天存在。该模型不仅为询问VCA和神经再生特有的免疫问题提供了一个有用的平台，还允许对专为VCA量身定做的新治疗策略进行体内测试。
Introduction
血管化复合异体移植（VCA）或复合组织异体移植（CTA）等更广泛范畴的肢体移植尚未实现其治疗承诺。自1998年、1999年在法国里昂和肯塔基州路易斯维尔成功进行人类手部移植手术以来，全球已对经过精心挑选的患者进行了100多例上肢移植手术。广泛的适用性已经阻碍了大量的免疫抑制和有限的功能神经运动恢复。目前的免疫抑制策略导致85%的急性排斥发生率，面对77%的机会性感染2。另一方面，手移植后功能恢复发生;手臂肩部和手部（DASH）的残疾分数从71分提高到43分，但功能水平可能仍有资格成为残疾2。鉴于肢体移植的非生命保存性质，目前的技术必须在动物模型中进行改进，才能在VCA中迈出下一步。
自1978年第一个大鼠模型的肢体移植3，许多创新的动物模型已经发展，以推进VCA 4领域，纳入血管袖口的阿内斯特莫西，以尽量减少手术时间5,5，6，异位 骨皮移植，以尽量减少生理侮辱接受动物77，8，9，10，11，,8,9,10,11和新颖的免疫方法7，12，13，14。,13,147,这里介绍的正畸右后肢中大腿移植的老鼠模型强调经过精密、久经考验的显微手术技术，如手工缝制血管肿瘤和神经整形，作为对一个稳健、可重复的模型平台的前期投资，同时研究当前VCA限制的两个方面：免疫抑制策略和功能神经运动恢复。
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Protocol
所有实验都是根据国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南进行的，并经西北大学动物护理和使用委员会批准。具体程序根据协议 IS00001663 执行。
注：使用两株老鼠，刘易斯大鼠和八月哥本哈根x爱尔兰（ACI）大鼠。动物被分成三个治疗组：无免疫抑制的异丙类移植（ACI到刘易斯），常规免疫抑制的异丙移植植物（ACI到刘易斯），和异种移植（刘易斯对刘易斯或ACI到ACI）。Lewis 是一种近亲繁殖菌株，而 ACI 大鼠则代表一种近亲繁殖的野生型，因此选择这种组合来模拟更坏情况的排斥反应。传统的免疫抑制被作为皮下管理，要么从术后一天（POD）减去1到POD 28，或作为FK506 3毫克/千克从POD 0到POD 14，然后每周一次。雄性大鼠和雌性大鼠都是8至16周大的合格接受者，手术时体重在250至400克之间。
1. 捐赠者右后肢收获
- 通过具有适当清除系统的蒸发器，在纯氧中用 5% 异氟来诱导全身麻醉。
- 用脚趾捏来确认足够的麻醉深度，然后用剪发器修剪右后肢和右腹股沟手术场的毛皮
- 通过啮齿动物鼻锥将异氟化物降低至2-2.5%。
- 将展开的四肢贴在操作板上的两侧，下面有加热垫。用 70% 的酒精对无毛皮肤进行消毒，用无菌纱布保护手术场。
- 使用适当的显微外科显微镜、显微手术仪器和容易接触双极和单极电卡，开始解剖。
- 使用剪刀在右后肢周围做包皮/皮下组织切口。从内皮折痕开始，与内侧韧带大致相同，并侧侧延伸以完成包周切口。
- 在切口下方暴露肌肉层后，解剖和烧灼从肌肉层到刚刚创建的近体皮肤/皮瓣的肤浅的表层。
- 将近位皮瓣超位反射到内侧韧带和近侧皮肤/皮下皮瓣推断到膝盖。
- 使用钢丝缩回器或卷纱布帮助露出磁场。
- 观察大鼠的内科解剖与人类相似;从横向到中枢，在于神经、动脉和静脉。
- 解剖股骨神经，在内侧韧带上急剧分割，如果可能的话，与分叉近。低劣地收回分裂的神经， 保持它的安全远离的方式， 覆盖在潮湿的纱布下。
- 将注意力转向股动脉和静脉，使用 4 厘米 7-0 丝丝领带，以创伤性地缩回血管，而不是直接处理它们。
- 用7-0丝带将股骨容器的所有分支都拉上;划分之间的领带分支。对于非常小的树枝，可以使用双极烧灼，而不是领带。
注：需要分割的动脉和静脉分支包括表面的环静脉和肌肉血管。表面的环皮动物通常是最大的，似乎潜入深，就像人类的富伦达股骨一样，但大鼠15中不存在。股骨血管（如最高根和盐状分支）的更近处分支通常不需要分割。 - 系统地在雄性大鼠供体中通过笔静脉注射500个国际单位的肝素。如果捐赠大鼠为雌性，请使用表面的胃静脉。
- 在继续下一步之前，允许肝素系统循环 2 分钟。
- 将股骨动脉与 7- 0 丝状动脉尽可能与内关节韧带保持近，并在连接之间划分。
- 类似于动脉，拉大和分割股骨静脉。
- 反射动脉和静脉低劣，安全的方式，覆盖在潮湿的纱布下与股骨神经覆盖之前。解剖腹体肌肉群，注意烧灼任何可见的血管。这里的对血侧损伤的关注将最大限度地减少再灌注后接受者失血。
- 深到腹骨肌肉群，识别和尖锐地划分坐骨神经近到它的分支。三个坐骨神经科通常可见：胸肉，胸膜和耳骨。这三者都应保留在捐赠者肢体中。第四个皮肤分支是通常不见在此解剖15，16。15,
- 完成在中大腿水平的其余腹体和背部肌肉群的分部与细致的海莫西。可能需要以医疗方式收回肢体以完成肌肉的分割。
- 使用手持无绳旋转锯在中轴上转换股骨。
- 从捐赠者那里取出肢体移植物后，从移植侧股股动脉和静脉树桩上切开丝束的末端，从而重新打开血管。
- 将一个24测量的血管导管插入移植动脉树桩，用250个国际单位的肝素在5 mL的冰冷普通盐水中稀释，观察它通过打开的静脉流出来。
- 慢慢地，轻轻冲洗移植物约3分钟。过度的强力冲洗可能会损坏内皮。
- 将移植物放在冷藏盐水盘中，嵌套在冰桶中，直到移植。
- 用双边胸腔切除术对捐赠鼠进行安乐死。
- 适当清洁所有手术器械。
2. 接收者原生右后肢截肢
- 诱导麻醉与异氟兰5%，确认深度，修剪毛皮，定位动物，并消毒皮肤与酒精，如所述的捐赠大鼠。
- 将同流血球降低至2-2.5%，注射皮下术前镇痛剂，注射丁丙诺啡1.2毫克/千克，术前预防与苯丙沙星7.5毫克/千克。
- 与捐赠者相同，在内脏折痕中进行包环切，反射皮肤皮瓣，确保血栓，并解剖股骨神经、动脉和静脉，将与上述分支血管连接。
- 比捐赠者更分裂股骨神经，但如果可能的话，则与分体神经分开。
- 解剖股动脉和静脉，有足够的空间分别夹在内关节韧带的水平。用微手术斗牛犬夹夹住静脉和动脉。夹紧后，用剪刀将每个容器尖锐地分开。
- 用细致的下大腿水平分割大腿的腹体和背部肌肉，必要时以医疗方式缩回肢体。
- 识别并分割坐骨神经，如上所示。
- 使用锯在中轴上横贯股骨。
- 取出接收者本机右后肢并适当处置。
- 通过鼻锥将异氟降低至1-1.5%。
3. 接受者肢体植入的捐赠者
- 使用手持式电源锯，剃掉捐赠者和接受者股骨切割末端的任何不规则现象。
- 使用锯子，切断18表针的轮毂端，这将成为股骨内杆。
- 在操作骨骼之前，将少量骨蜡涂抹到股骨的接受者切端，以减少骨髓在重开过程中出血。
- 使用18量针作为内杆，将捐赠者和接受者股骨进行注射。一些力是必要的，但不要把骨骼都用，以使皮层断裂。
- 根据需要，取出针头并将其修剪到适当的长度，使两个骨骼平滑地在针上，骨骼之间没有针。
- 将小支撑，如纱布垫或小岩石或建模粘土在捐赠者肢体下面，以保持其张力。
- 用8到10个简单的中断的5-0多糖蛋白缝合线重新建立腹体肌肉群，使移植物不会围绕股骨针旋转。这为动物提供了肢体稳定性。
- 定期用冰冷的盐水灌溉移植物和手术场，以便更好地可视化，减少热缺血再灌注损伤。
- 使用简单的中断 10-0 尼龙缝合线，将供体和接受者股动脉对齐，并最终对它们进行原子化，避免张力和循环。动脉平均需要六个缝合线。
- 与动脉类似，对供体和接受者股骨静脉进行最后到年底的时尚。静脉需要六到八个缝合线。
注：慷慨的冷盐水灌溉，创伤容器处理技术，并留下长尾巴作为容器缩回的停留缝合线是有效微外科麻醉的重要工具。 - 将少量止血纤维素粉末放在两个麻醉剂周围，然后去除静脉和动脉上的近端微外科斗牛犬夹。
- 检查两种麻醉和流动。使用棉签棒轻轻搅拌静脉，并确保两种麻醉素的良好的血栓。保持出血点的压力，并放置更多的止血纤维素粉，如果需要的话。另一种缝合线可能通过出血孔放置，风险只是作为最后手段"背壁"针头。
- 当两个 anastomos 被确认为令人满意时，修剪任何剩余的长停留缝合尾部短，以匹配其他。
- 将大鼠重新定位到左侧脱花位置，使用自由电烧机获得任何再灌注肌肉出血的细致止血。
- 一旦肌肉痉挛得到保证，将注意力转向神经神经。修剪回任何神经切割端，看起来不规则。
- 用简单中断的 5-0 多糖蛋白缝合线在坐骨神经下的后体肌肉群中重新建立。
- 重新发展坐骨神经。八到十 10-0尼龙神经简单的中断缝合线通常就足够了。
- 重新建立提醒的后体肌肉群，然后用4-0多糖蛋白连续缝合关闭后体皮肤。
- 重新定位大鼠回到苏平位置，重新发展股骨神经。两到三个10-0尼龙神经简单的中断缝合线通常就足够了。
- 用4-0多糖蛋白连续缝合关闭腹肌皮肤。避免多余的缝合尾巴，这一旦醒来，可能会刺激大鼠。
4. 术后护理
- 在笼子里用加热垫恢复动物，并随时获得食物和水，在第一周每天监测早期并发症。
- 通过POD 2提供术后镇痛与皮下旋律1毫克/千克每日注射。提供术后抗生素预防稀释的苯丙沙星喷雾剂。提供抑制自体切除术（自残），苦安全雾每天通过POD 7喷洒两次到移植物上。
- 与其他大鼠一起将移植的老鼠关在笼子里，以刺激他们恢复日常活动，恢复移植的肢体。
5. 术后感觉测试
- 应用哈格里夫斯热感觉协议测试，也描述了其他地方17，18。17,
- 将大鼠放在测试容器中，并允许其适应20分钟。仪器玻璃被证实清洁，热源被证实与调查人员的手指工作。
- 测试前，确认大鼠已唤醒，测试的爪子位于红外运动探测器上。
- 在强度级别 90 时传输热能。记录动物移动爪子远离热源的时间延迟。如果在 20 秒内未发生任何移动，则中止测试以防止受伤。
- 在计算每种动物的每次戒断延迟时间之前，每个测试肢体获得五次试验，不包括最高值和最低值。
6. 术后电机测试
- 使用步态分析跑步机和集成软件分析平台，在手术后四到六周内选择跑步机测试的候选者。
- 在测试前一两天修剪所有大鼠脚趾甲。
- 在测试前将动物适应到测试室一小时，并允许一分钟的测试前宠物，以平息焦虑。
- 将大鼠放入跑步机内，在速度增加的试验中运行跑步机，从10厘米/s到14厘米/s，到目标18厘米/s。如果大鼠是沉默的，不能哄着走路，中止当天的测试，以避免阴性调节。允许高绩效者步行至 24 厘米/s。
- 在测试动物之间用70%的乙醇冲洗跑步机设备。
- 盖特参数来自分析平台的专有软件。
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Representative Results
生存和恢复取决于细致的手术技术。注意血管性肿瘤和神经性肿瘤，以及上述骨合一，是最大化此模型成功的关键。操作设计和具有代表性的原子结果如图 1所示。
总体死亡率取决于免疫抑制策略，大多数异移植动物达到100-200个术后研究终点，如图 2所示。一旦走出急性术后窗口，治疗的异种移植动物可以体验到生存长达58个术后天。在研究过程中，异种大鼠无限期地生活，而异体移植大鼠的霉素具有来自拉帕霉素和FK506的可变死亡。在治疗中，FK506促进了最长的生存能力（第57天），而拉帕霉素（第20天）比未经治疗的对照（第10天）排名第二。
感官和电机恢复如图3 所示。动物被证明已经恢复感觉神经功能移植的爪子使用哈格里夫斯仪器第30天。动物在手术后四周（Aii）表现出显著的恢复。使用步态分析跑步机和集成软件分析平台，动物对移植肢体的运动功能有明显改善。显示了基于特定四肢的步态参数示例 （Bii），并显示了坐骨功能指数 （SFI） （Bi）。
图1：操作设计以卡通格式描述。（A） 大鼠的显示与 （ B ）右后腿横截面描绘 （i） 股骨束 （神经、动脉和静脉） （ii） 坐骨神经和 （iii） 骨骼。（C） 手术显微镜（供体左和接受者右）的代表性显微图取自（i） 坐骨神经瘤（二）股骨动脉和静脉动脉瘤（从上到下显示）和（三）18针内血栓股骨共生。请注意，捐赠者结构出现在每张照片的左侧。另请注意，当两个骨骼对等且针头隐藏在完全共合之前，股骨会显示出来。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：动物在手术后的天数（POD）存活率百分比。显示的组包括异种移植、无治疗的异丙酸、拉帕霉素和FK506免疫抑制剂药物。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：感官神经恢复在（A）哈格里夫斯测试移植动物每个在六个术后时间点和在（B）仍然拍摄的跑步机测试使用DidiGait。（i） 代表图片显示（二）各自的爪子数据。爪子的彩色编码图像也以 0.025 ms 帧表示。还显示了数字模型 （iii）。使用采用邦费罗尼的多重比较测试和 SEM 的双向 ANOVA 确定显著性，其中 n=7 和 p< 0.05。这些特殊的DidiGait数据取自术后第28天测试的异质动物。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
肢体移植，在更广泛的血管成分异位移植（VCA）类别下，具有广泛的应用治疗前景尚未实现。主要障碍在于VCA和神经运动恢复技术目前所特有的未解决的免疫学问题。新技术的发展将取决于灵活、健壮和可重复的动物建模。
在VCA中已经建立了许多动物模型，每种模型都有特定的优点。非人类灵长类动物模型为人类患者提供了有吸引力的可翻译性，但一直受到成本问题的影响，需要4个免疫抑制的毒性水平。犬模型已被视为有利于肌肉结构与人类的特定相似性，以及更有经验的免疫系统19，20。19,猪模型提供了大型动物模型的好处，其中免疫系统越来越研究21，22。21,小鼠模型系统是研究免疫学的最先进的技术，但尽管在袖口血管微外科肿瘤23的重要进展，小鼠肢体移植在技术上仍然具有挑战性，,并在功能恢复评估5，24，25，2624有一25,些限制。5
VCA中的鼠模型自1978年3以来一直得到利用，为,研究,,,,6、9、13、14、17、27、28、38等免疫学和神经运动假设提供了一个成熟的平台。6,917,27131428这里的模型结合了后视正交法、缝合神经瘤、神经再近似和步态分析的潜力等优点。与前肢移植相比，欣登正畸移植在恢复过程中对大鼠的束缚较小，并且允许在手术后继续保持正常的梳妆和喂养行为。缝合性结膜病，虽然艰苦的可能提供较少的技术混淆长期研究。神经再接近允许未来的调查17，18,和步态分析。该协议依赖于细致，久经考验的微外科技术，在其他地方描述精心描述29，需要不断注意，以避免麻醉过量，麻醉衰竭，阿不分血，和过度手术失血的即时陷阱。虽然多个微外科医生可以改进工作流程，但我们描述了一种单操作微外科医生可以实现足够实验输出的方法。
自我切除术或自残一直是几个显微外科模型注意到的现象，它已被假设与神经愈合30，31,成反比。该模型对自体切除术进行总体控制，可能与神经解剖学技术有关。自动切除术也减到学习曲线的更远。苦涩的安全雾是控制这种现象的宝贵辅助工具。
研究大鼠的步态分析有多种损伤模型32、33、34，,33,34最相关的是坐骨神经损伤35、36。35,36老鼠即使没有肢体移植接受者，已知是异质的步态分析对象，而研究人员仍在争论哪些分析参数描述恢复37。在这个模型中，我们描述了几种从愿意和能够行走的移植接受者那里获得最佳数据的方法。预选足够的步行者并不预测行动后的合作。虽然动物在手术后几个小时内就能在房屋周围移动，但他们直到手术后至少四到六周才准备好跑步机的栓整。
协议测量VCA神经恢复的能力取决于其康复策略。该协议明确促进移植接受者与其他大鼠互动，作为功能的诱因。此策略认识到建模修复的重要性，但简单、经济且在很大程度上是标准的。未来的策略可能包括更积极的康复，如跑步机训练。
适用于此模型的免疫技术超出了本讨论的范围，但特别是，将异体移植与异体移植动物进行比较，为区分异血免疫学现象和排斥与移植手术本身固有的缺血再灌注损伤、炎症、再血管化和手术后感染过程的排斥提供了有用的控制。由于同样的原因，异种移植为神经功能研究提供了类似的控制。
使用此平台，研究人员也许能够推进 VCA 免疫学和神经运动恢复。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由弗兰克尔基金会和西北纪念医院麦考密克·格兰特（恢复行动）资助。本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所的支持，其编号为T32GM008152。这项工作得到了西北大学显微外科核心和行为表型核心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | Vet Equip | 911103 | |
| 0.5cc syringe | Exel | 26018 | |
| 18-gauge needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| 22-gauge needle | BD | 305156 | |
| 24-gauge angiocatheter | Sur-Vet | SROX2419V | |
| 25-gauge needle | Exel | 26403 | |
| 3 cc syringe | BD | 309657 | |
| 5cc syringe | Exel | 26230 | |
| Alcohol | Fisher Scientific | HC-600-1GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Vet Equip | 941443 | |
| Anesthetic gas scavenger system | Vet Equip | 931401 | |
| Bipolar electrocautery | Aura | 26-500 | |
| Bitter Spray Mist | Henry Schein | 5553 | |
| Bone wax | CP Medical | CPB31A | |
| Breathing circuit | Vet Equip | 921413 | |
| Buprenophine | Reckitt Benckiser | 12496075705 | |
| Castro-Viejos needle drivers | Roboz | RS-6416 | |
| Cordless rotary saw | Dremel | 8050-N/18 | |
| Cotton swab stick | Fisher Scientific | 23-400-101 | For hemostasis |
| DigiGait Appparatus and Software | Mouse Specifics | MSI-DIG, DIG-SOFT | |
| Dumont forceps (#4) | Roboz | RS-4972 | |
| Dumont forceps (#5) | Roboz | RS-5035 | |
| Enrofloxacin | Norbrook | ANADA 200-495 | |
| FK-506 | Astellas | 301601 | |
| Gauze | Kendall | 1903 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gloves | Microflex | DGP-350-M | |
| Hair clippers | Oster | 078005-010-003 | |
| Handheld monopolar electrocautery | Bovie | AA00 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy | 37370 | |
| Heating pad | Walgreens | 126987 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | 42592K | |
| Hot plate | Corning | PC-351 | For warming resusscitation fluid |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter | 2B2074 | |
| Large petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | For donor graft while in chilled saline |
| Meloxicam | Henry Schein | 49755 | |
| micro Collin Hartmann retractor | |||
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | |
| Microfibrillar collagen powder | BD | 1010590 | For hemostasis |
| Microvascular clips | Roboz | RS-5420 | |
| Normal saline | Baxter | 2F7124 | |
| Opthalmic lube | Dechra | IS4398 | |
| Rapmycin | MedChem Express | HY-10219 | |
| Small petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | For warmed resusscitation fluid |
| Sterile drapes | ProAdvantage | N207100 | |
| Surgical gown | Cardinal Health | 9511 | |
| Surgical mask | 3M | 1805 | |
| Surgical microscope, optic model OPMIMD | Zeiss | 169756 | |
| Surgical microscope, Universal S3 | Zeiss | 243188 | |
| Suture 10-0 nylon | Covidien | N2512 | |
| Suture 5-0 vicryl | Ethicon | J213H | |
| Suture 7-0 silk tie | Teleflex | 103-S | |
| Tape | 3M | 1530-1 | |
| Ultrasonic instrument cleaner | Roboz | RS-9911 | |
| Vessel dilation forceps | Roboz | RS-5047 |
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