Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Sonraki Adım Taking: Bir Nöral Coaptation Ortotopic Hind Limb Transplant Modeli Sıçan Fonksiyonel Kurtarma Maksimize etmek

Published: August 30, 2020 doi: 10.3791/60777

Summary

Bu protokol, immünoloji ve fonksiyonel iyileşme nin eşzamanlı çalışmasına yönelik sağlam, tekrarlanabilir vasküler kompozit allotransplant (VCA) modelini sunmaktadır. El dikilmiş vasküler anastomozlar ve nöral coaptation ile sağ orta uyluk arka ekstremite ortopik nakli titiz tekniği yatırım zaman fonksiyonel kurtarma çalışma yeteneği verir.

Abstract

Özellikle ekstremite nakli ve genel olarak vaskülarize kompozit allotransplant (VCA) immünsupresif ve fonksiyonel nöromotor kurtarma mevcut sınırlamalar tarafından stymied edilmiştir geniş terapötik söz var. Birçok hayvan modelleri VCA benzersiz özellikleri incelemek için geliştirilmiştir, ama burada aynı anda mevcut VCA sınırlama her iki yönünü araştırmak için tasarlanmış sıçanlarda ortotopik arka ekstremite nakli sağlam bir tekrarlanabilir modeli mevcut: immünsupresyon stratejileri ve fonksiyonel nöromotor kurtarma. Modelin özünde titiz bir taahhüt dinleniyor, el dikilmiş vasküler anastomozlar ve femoral sinir ve siyatik sinir el dikilmiş nöral coaptation gibi zaman test mikrocerrahi teknikleri. Bu yaklaşım, rehabilitasyon, günlük faaliyetlerin devamı ve fonksiyonel testler yeteneğine sahip daha uzun ömürlü hayvanlar için izin dayanıklı ekstremite rekonstrüksiyonları verir. Konvansiyonel immünsupresif ajanların kısa süreli tedavisi ile, allotransplanted hayvanlar nakil sonrası 70 güne kadar hayatta, ve isotransplanted hayvanlar ameliyat sonrası 200 gün ötesinde uzun ömürlü kontroller sağlar. Nörolojik fonksiyonel iyileşme nin kanıtları ameliyat sonrası 30 gün mevcuttur. Bu model sadece VCA ve sinir rejenerasyonu için benzersiz immünolojik soruları sorgulamak için yararlı bir platform sağlar, ama aynı zamanda vca için özel olarak tasarlanmış yeni tedavi stratejileri in vivo test sağlar.

Introduction

Vaskülarize-kompozit allotransplant (VCA) veya kompozit doku allotransplant (CTA) daha geniş kategori altında ekstremite nakli henüz terapötik sözünü yerine getirmemiştir. Lyon, Fransa ve Louisville, Kentucky 1998 ve 1999 yılında ilk başarılı insan el nakli bu yana, 100'den fazla üst ekstremite nakli dikkatle seçilmiş hastalarda dünya çapında yapılmıştır1. Daha geniş uygulanabilirlik önemli immünsupresyon ve sınırlı fonksiyonel nöromotor kurtarma tarafından stymied olmuştur. Mevcut immünsupresyon stratejileri fırsatçı enfeksiyon2%77 insidansı karşısında akut ret% 85 insidansı ile sonuçlanır. Öte yandan, el nakli sonrası fonksiyonel iyileşme gerçekleşir; Kol Omuz ve El (DASH) puanları ortalama Sakatlık 71 den 43 geliştirmek, ancak fonksiyon bu düzeyde hala bir sakatlık2olarak nitelendirebilir . Ekstremite naklinin hayat kurtarıcı olmayan doğası göz önüne alındığında, VCA'da bir sonraki adımı atmak için hayvan modellerinde mevcut teknikler rafine edilmelidir.

1978 yılında ekstremite nakli ilk sıçan modeli bu yana3, Birçok yenilikçi hayvan modelleri VCA alanında ilerletmek için geliştirilmiştir4, operatif zaman en aza indirmek için vasküler kelepçeli anastomozlar birleştiren5,6, heterotopik osteomiyokutanöz nakli alıcıhayvanafizyolojik hakaret en aza indirmek için 7,8,9,10,11, ve yeni immünolojik yaklaşımlar7,12,13,14. Burada sunulan ortotopik sağ arka ekstremite orta uyluk naklisıçan modeli aynı anda mevcut VCA sınırlama her iki yönünü araştırmak için sağlam, tekrarlanabilir model platformu bir ön yatırım olarak el dikilmiş vasküler anastomoz ve nöral coaptation gibi titiz, zaman test mikrocerrahi teknikleri vurgulamaktadır: immünsupresyon stratejileri ve fonksiyonel nöromotor kurtarma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yapılmıştır ve Northwestern Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Belirli yordamlar IS00001663 protokolü altında gerçekleştirilmiştir.

NOT: İki sıçan suşları kullanıldı: Lewis sıçanları ve Ağustos Kopenhag x İrlandalı (ACI) sıçanlar. Hayvanlar üç tedavi grubuna ayrıldı: immün baskıolmadan allotransplant (ACI Lewis), konvansiyonel immün baskılama ile allotransplant (Lewis ACI) ve isotransplant (Lewis Lewis veya ACI ACI için). Lewis bir inbred gerginlik, ACI sıçanlar bir out-bred vahşi tip temsil ederken, bu nedenle bu kombinasyon kötü durumda ret yanıtı modellemek için seçildi. Konvansiyonel immünsupresyon postoperatif gün (POD) eksi 1'den POD 28'e kadar rapamisin 1 mg/kg veya POD 0'dan POD 14'e kadar FK506 3 mg/kg olarak ve daha sonra haftada bir kez deri altı uygulandı. Hem erkek hem de dişi sıçanlar, ameliyat sırasında 250 ila 400 gram ağırlığında, 8 ila 16 haftalık tantanaları ydı.

1. Donör sağ arka ekstremite hasat

  1. Uygun bir atma sistemi ile bir buharlaştırıcı ile saf oksijen% 5 izofluran ile genel anestezi indüklemek.
  2. Parmak tutam ile anestezi yeterli derinliği onaylamak ve sonra sağ arka ekstremite ve sağ kasık cerrahi sitekürk kesmek için saç makası kullanın
  3. Down-titrat bir kemirgen burun konisi ile isoflurane için 2-2.5%.
  4. Altında ısıtma yastığı olan bir ameliyat panosunda yanlara bantlanmış yayılmış uzuvları ile fare supine konumlandırın. Tüysüz cildi %70 sürtünme alkolile dezenfekte edin ve cerrahi alanı steril gazlı bezle koruyun.
  5. Uygun bir mikrocerrahi mikroskop kullanarak, mikrocerrahi aletler, ve bipolar ve monopolar elektrokoter kolay erişim ile, diseksiyon başlar.
  6. Sağ arka ekstremite çevresinde bir çevresel deri / deri altı doku kesi yapmak için makas kullanın. Inguinal ligament ile kabaca aynı düzeyde medial olarak başlayın ve çevresel kesi tamamlamak için dorsal-lateral uzatmak.
  7. Kesinin hemen altındaki kas tabakasını ortaya çıkardıktan sonra, kas tabakasından proksimal deriye/subkutan flebeye giden yüzeysel epigastrik damarları inceleyin ve kauterize edin.
  8. Proksimal flebi inguinal ligamente ve distal deri/subkutan flep inferolateral olarak dize yansıtın.
  9. Alanı ortaya çıkarmak için bir tel retraktör veya haddelenmiş gazlı bez kullanın.
  10. Farenin inguinal anatomisi insanlara benzer olduğunu gözlemleyin; lateral medial sinir yalan, arter, ve ven.
  11. Femoral siniri parçalayın, inguinal ligamentde keskin bir şekilde bölün, mümkünse çatallanmanın proksimal.'ına. Bölünmüş sinirinferior geri, güvenli bir şekilde şekilde tutmak, nemli gazlı bez altında kaplı.
  12. Femoral arter ve ven dikkat çevirerek, atravmatik yerine doğrudan onları işleme damarları geri 4 cm 7-0 ipek bağları kullanın.
  13. Onlar 7-0 ipek bağları ile ortaya çıkan femoral damarların tüm dalları ligate; dalları bağlar arasında bölün. Çok küçük dallar için bağlar yerine bipolar kateter kullanılabilir.
    NOT: Bölünme gerektiren arteriyel ve venöz dallar arasında yüzeysel circumflex iliak ve kas damarları sayılabilir. Yüzeysel circumflex iliac genellikle en büyük ve insanlarda profunda femoral gibi derin dalış görünür, ama profunda sıçan yok15. En yüksek geniküler ve safenöz dal gibi femoral damarların daha distal dalları genellikle bölünme gerektirmez.
  14. Sistematik bir erkek sıçan donör penis ven yoluyla heparin 500 uluslararası birimleri enjekte. Donör sıçan kadın ise yüzeysel epigastrik ven kullanın.
  15. Sonraki adımlara geçmeden önce heparin in 2 dakika boyunca sistemli olarak dolaşmasına izin verin.
  16. Mümkün olduğunca inguinal ligament proksimal olarak 7-0 ipek bağları ile femoral arter ligate ve bağlar arasında bölmek.
  17. Arter benzer, ligate ve femoral ven bölmek.
  18. Arter ve damar inferiora yansıtın, güvenli bir şekilde dışarı, femoral sinir ile birlikte nemli gazlı bez altında daha önce kaplı kaplı. Ventral kas gruplarını inceleyin, ortaya çıkan herhangi bir görünür damar cauterize dikkat. Burada hemostaz dikkat reperfüzyon sonrası alıcı kan kaybını en aza indirecektir.
  19. Derin ventral kas grupları, tanımlamak ve keskin dalları için siyatik sinir proksimal bölmek. Üç siyatik dalları genellikle görülebilir: tibial, peroneal ve sural. Üçü de donör uzuvlarında korunmalıdır. Dördüncü kutanöz dal genellikle bu diseksiyon da görülmez15,16.
  20. Titiz hemostaz ile orta uyluk düzeyinde kalan ventral ve dorsal kas grupları bölen bitirmek. Bu kasları bölen tamamlamak için medily ekstremite geri çekmek için gerekli olabilir.
  21. Femur kemiğini el tutamayan akülü döner testere kullanarak orta şaftta geçirin.
  22. Donörden ekstremite grefti çıkarıldıktan sonra, greft tarafı femoral arter ve damar kütüklerinden ipek bağlı uçları keserek damarları yeniden açar.
  23. Greft arter kütüğüne 24-gauge anjiyokateter yerleştirin ve grefti 5 mL buz gibi normal tuzlu suda seyreltilmiş 250 uluslararası heparin birimiyle temizleyin ve açık damardan dışarı akmasını izleyin.
  24. Yavaşça, yavaşça yaklaşık 3 dakika boyunca greft floş. Aşırı güçlü yıkama endotel zarar verebilir.
  25. Grefti, nakil yapılana kadar buz kovasında iç içe olan soğutulmuş tuzlu bir tabağa koyun.
  26. Donör sıçanı bilateral torakotomi ile ötenazi.
  27. Tüm cerrahi aletleri uygun şekilde temizleyin.

2. Alıcı yerli sağ arka ekstremite amputasyonu

  1. %5 oranında isofluran ile anestezi, derinliği onaylamak, kürk kırpma, hayvan konumlandırma kıvrak ve donör sıçan için açıklandığı gibi alkol ile cildi dezenfekte.
  2. Down-titrat isofluran %2-2.5 ve subkutan preoperatif preoperatif analjezi ile buprenorfin 1.2 mg/kg enjekte edilir ve preoperatif profilaksi ile enrofloksasin 7.5 mg/kg.
  3. Donör için aynı, inguinal kreaz bir sünnet kesisi yapmak, hemostaz temin deri flepleri yansıtmak, ve femoral sinir dışarı incelemek, arter ve damar, yukarıdaki gibi aynı dal damarları ligating.
  4. Femoral siniri donörden daha distal olarak bölün, ancak mümkünse çatallanmaya yakın.
  5. Femoral arter ve ven her ayrı inguinal ligament düzeyinde kelepçe lemek için yeterli alan ile diseksiyon. Mikrocerrahi bulldog kelepçeler ile damar ve arter kelepçe. Bir kez kenetlenmiş, makas ile keskin bir şekilde her gemi bölün.
  6. Titiz hemostaz ile uyluk orta uyluk düzeyinde ventral ve dorsal kasları bölmek, gerektiğinde medily ekstremite geri çekerek.
  7. Yukarıdaki gibi kendi dal noktalarına proksimal siyatik sinirleri tanımlamak ve bölmek.
  8. Testereyi kullanarak femuru orta şaftta geçirin.
  9. Alıcının sağ arka ekstremitesini çıkarın ve uygun şekilde atın.
  10. Burun konisi ile isoflurane%1-1.5'e kadar titrat.

3. Donörden alıcı ekstremite implantasyonuna

  1. El testeresini kullanarak, hem donörhem de alıcı uyluk kesim uçlarından kaynaklanan düzensizlikleri önler.
  2. Testere kullanarak, femur intramedüller çubuk olacak bir 18-gauge iğne, göbek ucu kesti.
  3. Kemik manipüle etmeden önce, reaming işlemi sırasında ilik kanamasını azaltmak için femur kemiğinin alıcı kesim ucuna kemik balmumu küçük bir miktar uygulayın.
  4. Bir intramedüller çubuk olarak 18-gauge iğne kullanarak donör ve alıcı femoral kemikleri Coapt. Bazı kuvvet gereklidir, ama şimdiye kadar korteks kırık olarak her iki kemik ream yok.
  5. Gerektiği gibi, iğneyi çıkarın ve her iki kemiğin de kemik arasında iğne görünmeden iğnenin üzerine düzgün bir şekilde sığması için uygun bir uzunluğa doğru kırpın.
  6. Gerginlikten uzak tutmak için donör ekstremitenin altına gazlı bez veya küçük bir kaya veya modelleme kil gibi küçük bir destek yerleştirin.
  7. Greftin femur iğnesi etrafında dönmemesi için 8-10 basit kesilen 5-0 poliglactin dikişleri ile ventral kas gruplarını yeniden approximatea. Bu anastomozlar için ekstremite stabilitesi verir.
  8. Daha iyi görüntüleme ve sıcak iskemik reperfüzyon yaralanmasını azaltmak için greft ve cerrahi alanı buz gibi tuzlu suile periyodik olarak sulandırın.
  9. Donör ve alıcı femoral arterler hizalayın ve basit kesmeli 10-0 naylon dikiş kullanarak moda sonuna kadar onları anastomose, hem gerginlik ve döngü kaçınarak. Arter ortalama altı dikiş gerektirir.
  10. Arter benzer, anastomoz donör ve alıcı femoral damarlar sonunda moda sonuna kadar. Damar altı ila sekiz dikiş gerektirir.
    NOT: Cömert soğuk tuzlu sulama, atravmatik damar işleme tekniği ve damar geri çekilmesi için dikiş olarak hizmet etmek için uzun kuyrukları bırakarak etkili mikrocerrahi anastomozlar için önemli araçlardır.
  11. Her iki anastomoz etrafında hemostatik selüloz tozu küçük bir miktar yerleştirin ve sonra damar ve arter proksimal mikrocerrahi bulldog kelepçeler kaldırın.
  12. İyi bir açıklık ve akış için her iki anastomoz inceleyin. Nazikçe damar prod ve her iki anastomoz iyi hemostaz sağlamak için pamuklu bez çubukları kullanın. Kanama bölgeleri üzerinde basınç tutun ve gerekirse daha fazla hemostatik selüloz tozu yerleştirin. Başka bir dikiş sadece son çare olarak iğne "arka duvar" riski bir kanama deliğinden yerleştirilebilir.
  13. Her iki anastomoz tatmin edici doğrulandığında, kalan uzun süre kalan dikiş kuyruklarını diğerleriyle eşleşecek şekilde kısa kırpın.
  14. Sol lateral dekübitus pozisyonuna sıçan repozisyon, herhangi bir reperfüzyon kas kanaması titiz hemostaz elde etmek için liberal elektrokoter kullanın.
  15. Kas hemostazı güvence altına alındıktan sonra sinir anastomozlarına dikkat çek. Yırtık gibi görünen sinir kesik uçlarını geri alın.
  16. Basit kesilen 5-0 poliglactin sütür ile siyatik sinir altında dorsal kas grupları reapproximate.
  17. Siyatik siniri yeniden approximateat. 8-10 10-0 naylon nöral basit kesilmiş dikişler genellikle yeterli olacaktır.
  18. Hatırlatan dorsal kas gruplarını yeniden approximatelayın ve sonra 4-0 poliglactin sürekli sütür ile dorsal deri kapatın.
  19. Sıçanı supine pozisyonuna geri döndürün ve femoral siniri yeniden canlandırın. 2-3 10-0 naylon nöral basit kesilmiş dikişler genellikle yeterli olacaktır.
  20. Ventral deriyi 4-0 poliglactin sürekli sütür le kapatın. Bir kez uyanık sıçan için rahatsız edici olabilir aşırı dikiş kuyruk, kaçının.

4. Ameliyat sonrası bakım

  1. Kafesin altında bir ısıtma yastığı ve yiyecek ve suya hazır erişim ile kafeslerinde hayvanları kurtarmak, ilk hafta için her gün erken komplikasyonlar için izleme.
  2. POD 2 ile post-operatif analjezi deri altı meloksikam 1 mg/kg günlük enjeksiyon ile sağlayın. Postoperatif antibiyotik profilaksisi seyreltik enrofloksasin sprey sağlayın. Bitter Safe Mist pod 7 ile greft günde iki kez püskürtülür ile ototomi (kendi kendine sakatlanma) için caydırıcı olun.
  3. Nakledilen sıçanları diğer sıçanlarla birlikte kafeslerde muhafaza edin, günlük aktivitelere geri dönüşü teşvik edin ve nakledilen uzvun rehabilite edin.

5. Postoperatif duyum testi

  1. Termal duyum protokolü Hargreaves test uygulayın, ayrıca başka bir yerde açıklanan17,18.
  2. Test kabına sıçan yerleştirin ve 20 dakika boyunca alışmak için izin verdi. Cihaz camı temiz ve ısı kaynağı nın müfettişin parmağıyla çalıştığı doğrulandı.
  3. Testten önce, farenin uyanık olduğunu ve test edilen pençenin kızılötesi hareket dedektörü üzerine yerleştirdiğini doğrulayın.
  4. Termal enerjiyi yoğunluk seviyesi 90'da iletin. Hayvanın pençesini ısı kaynağından uzaklaştırmasında zaman gecikmesi kaydedilir. 20 saniye içinde herhangi bir hareket oluşursa, yaralanmayı önlemek için test iptal edilir.
  5. Her hayvan için ortalama çekilme gecikme süresini hesaplamadan önce en yüksek ve en düşük değer hariç olmak üzere, test edilen ekstremite başına beş deneme alın.

6. Ameliyat sonrası motor testi

  1. Yürüyüş analizi koşu bandı ve entegre yazılım analiz platformu kullanarak, ameliyat sonrası dört ila altı hafta koşu bandı testi için adayları seçin.
  2. Testetmeden bir veya iki gün önce tüm fare ayak tırnaklarını kesin.
  3. Hayvanları test ten önce bir saat boyunca test odasına alıştırın ve anksiyeteyi yatıştırmak için bir dakikalık ön test petting'e izin verin.
  4. Fareyi koşu bandının içine yerleştirerek, koşu bandını 10 cm/s'den 14 cm/s'ye, hedefe 18 cm/s'ye kadar artan hız denemelerinde çalıştırın. Sıçan suskun ve yürümeye ikna edilemez, negatif klima önlemek için o gün test iptal. Yüksek performanslı ların 24 cm/s'ye kadar yürümesine izin verin.
  5. Test edilmiş hayvanlar arasında %70 etanol ile koşu bandı aparatını durula.
  6. Yürüyüş parametreleri, analiz platformunun tescilli yazılımından elde edilen çıktılardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sağkalım ve iyileşme titiz cerrahi tekniğe bağlıdır. Vasküler anastomozlara ve nöral anastomozlara dikkat edilmesi ve yukarıda açıklandığı gibi kemik uyumunun bu modelin başarısını en üst düzeye çıkarmak çok önemlidir. Operatif tasarım ve temsili anastomoz sonuçları Şekil 1'degösterilmiştir.

Genel mortalite immünsupresif stratejisine bağlı ydı ve izotransplante edilen hayvanların çoğunluğu Şekil 2'degörüldüğü gibi 100-200 ameliyat sonrası gün çalışma bitiş noktasına uymaktadır. Akut postoperatif pencereden çıktıktan sonra, tedavi edilen allotransplanted hayvanlar 58 ameliyat sonrası güne kadar hayatta kalma deneyimi yaşayabilirler. Izografted sıçanlar çalışma süresince süresiz olarak yaşarken, allograft nakledilen sıçanlarda rapamisin ve FK506'dan değişken ölümler vardı. Tedaviler in Out FK506 en uzun canlılık teşvik (gün 57), rapamycin tedavi edilmeyen kontrol (gün 10) üzerinde ikinci en iyi (gün 20) iken.

Duyusal ve motor geri kazanım Şekil 3'tegösterilebilir. Hayvanların 30. Hayvanlar ameliyattan dört hafta sonra (Aii) önemli bir iyileşme gösterdi. Hayvanlar bir yürüyüş analizi koşu bandı ve entegre yazılım analiz platformu kullanarak nakledilen ekstremite motor fonksiyonu belirgin iyileştirmeler gösterdi. Belirli ekstremitelere dayalı örnek yürüyüş parametresi gösterilir (Bii) ve Siyatik Fonksiyon İndeksi (SFI) de sunulur (Biii).

Figure 1
Şekil 1: Operatif tasarım karikatür formatında betimlenmiştir. (A) Sıçan ile gösterilir (B) sağ arka bacak kesiti tasvir (i) femoral demet (sinir, arter, ve ven) (ii) siyatik sinir, ve (iii) kemik. (C) Çalışma mikroskobundan (donör sol ve alıcı sağ) temsili mikrograflar (i) siyatik sinir anastomoz (ii) femoral sinir arteri ve ven anastomozları (yukarıdan aşağıya doğru gösterilmiştir) ve (iii) 18-gauge iğne intrameduller çubuk-femur kemik koaptasyonu alınmıştır. Her fotoğrafta donör yapılarının sola doğru göründüğünü unutmayın. Ayrıca her iki kemik karşı ve iğne içinde gizlendiğinde femur tam uyum önce gösterilir unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Ameliyat sonrası (POD) sunulduğu nda hayvanların yüzde hayatta kalma yüzdesi. Gösterilen gruplar arasında isogreft, tedavisi olmayan allogreftler, rapamisin ve FK506 immünsupresan ilaçlar yer almaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Duyusal sinir kurtarma (A) Hargreaves altı post-operatif zaman noktalarında her nakledilen hayvanların test ve (B) hala DigiGait kullanarak koşu bandı testi çekim gösterilmiştir. (i) Temsili resimler (ii) ilgili pençe verileri ile gösterilir. Patilerin renk kodlu görüntüleri de 0,025 ms çerçevelerdedir. Digigate modelleri (iii) de gösterilmiştir. Önemi, Bonferroni'nin çoklu karşılaştırma testi ve SEM ile n=7 ve p< 0.05 ile tek yönlü bir ANOVA kullanılarak belirlendi. Bu digiGait verileri ameliyat sonrası 28.günde test edilen bir iyojenik hayvandan alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Limb transplantasyonu, vaskülarize komponent allotransplantasyonu (VCA) daha geniş bir kategori altında, henüz yerine getirilmemiş olarak yaygın olarak uygulanabilir terapötik söz vardır. Ana barikatlar vca ve nöromotor kurtarma teknikleri şu anda kullanılan benzersiz çözülmemiş immünolojik sorunlar yatıyor. Yeni tekniklerin geliştirilmesi esnek, sağlam ve tekrarlanabilir hayvan modelleme bağlıdır.

VCA'da her biri özel avantajlara sahip4hayvan modeli kurulmuştur. İnsan olmayan primat modelleri insan hastalar için çekici translatability sunuyoruz, ancak maliyet endişeleri ve immünsupresyon gerekli toksik düzeyleri tarafından engellenmiş olan4. Canine modelleri insanlar gibi kas yapısının belirli benzerlikler için avantajlı olarak görülmüştür yanı sıra daha deneyimli bir bağışıklık sistemi19,20. Domuz modelleri bağışıklık sistemi giderek iyi çalışılır büyük bir hayvan modelinin yararları sunuyoruz21,22. Fare modeli sistemleri immünoloji çalışma için en gelişmiş teknikleri mevcut, ancak kelepçeli vasküler mikrocerrahi anastomoz önemli gelişmelere rağmen23, fare ekstremite nakli teknik olarak zor kalır ve fonksiyonel kurtarma değerlendirme bazı sınırlamalar vardır5,24,25,26.

VCA Sıçan modelleri 1978 yılından bu yana kullanılmaktadır3, hem immünolojik ve nöromotor hipotezler araştırmak için olgun bir platform sağlayan6,9,13,14,17,27,28,38. Buradaki model hindlimb ortotopik yaklaşımın, dikiş anastomozunun, sinir inkişakuşunun ve yürüyüş analizi potansiyelinin avantajlarını bir araya getirmektedir. Hindlimb ortopik forelimb nakli aksine kurtarma işlemi sırasında sıçan için bir encumbrance daha az ve ameliyat sonrası devam normal tımar ve beslenme davranışları sağlar. Dikiş anastomoz her ne kadar özenli potansiyel olarak uzun vadeli çalışmalar için daha az teknik kafa karıştırıcı sunabilir. Sinir yeniden yaklaşık laşma gelecekteki soruşturma17,,18 ve yürüyüş analizi sağlar. Bu protokol, anestezik aşırıdoz,anastomoz yetmezliği, anastomoz trombozu ve aşırı cerrahi kan kaybıhemen tuzakları önlemek için sürekli dikkat gerektiren, başka bir yerde iyi tanımlanmış titiz, zaman test mikrocerrahi teknikleri dayanır. Birden fazla mikrocerrah iş akışını iyileştirebilse de, tek bir çalışan mikrocerrahın yeterli deneysel çıktıelde edebileceği bir yöntem tanımladık.

Ototomi veya kendi kendine sakatlanma birkaç mikrocerrahi modellerde belirtilen bir fenomen olmuştur, ve ters sinir iyileşmesi ile ilişkili hipotez olmuştur30,31. Ototomi genel olarak bu modelde kontrol edildi, muhtemelen ilgili titiz nöral anastomoz tekniği. Ototomi de öğrenme eğrisi içine daha da azaldı. Bitter Safe Mist bu fenomeni kontrol değerli bir yardımcı oldu.

Sıçanlarda yürüyüş analizi yaralanma birden fazla model için çalışılmıştır32,33,34, en uygun siyatik sinir yaralanması için35,36. Sıçanlar bile değil ekstremite nakli alıcılar yürüyüş analizi için heterojen konular olduğu bilinmektedir, ve araştırmacılar hala hangi analiz parametreleri kurtarma tanımlamak tartışma37. Bu modelde, yürümeye istekli ve mutamuza sahip olan nakil alıcılarından en iyi verileri elde etmek için çeşitli yöntemler tanımlanmıştır. Yeterli aylakların önceden seçilmesi post-operatif işbirliği nin öngörüsü değildi. Hayvanlar ameliyattan birkaç saat sonra barınma konusunda hareket edebilseler de, ameliyattan en az 4-6 hafta sonrasına kadar koşu bandı ambülasyonuna hazır değildirler.

Bir protokolün VCA'daki sinir iyileşmesini ölçme yeteneği rehabilitasyon stratejisine bağlıdır. Bu protokol, organ nakli alıcılarının diğer sıçanlarla etkileşime girmelerini açıkça teşvik eder. Bu strateji modelleme rehabilitasyon öneminin farkında, henüz basit, ekonomik, ve büyük ölçüde standarttır. Gelecekteki stratejiler koşu bandı eğitimi gibi daha aktif rehabilitasyon içerebilir.

Bu modeliçin geçerli olan immünolojik teknikler bu tartışmanın kapsamı dışındadır, ancak özellikle, izotransplant ile allotransplanted hayvanların karşılaştırılması, allograft immünolojik olguları ve ret iskemik reperfüzyon yaralanma, inflamasyon, revaskülarizasyon ve ameliyat sonrası enfeksiyon süreçlerini organ nakli cerrahisinin kendisinden kaynaklanan ayırt etmek için yararlı bir kontrol sağlar. İyotransplantlar da aynı nedenle sinir fonksiyon çalışmaları için benzer bir kontrol sağlar.

Bu platformu kullanarak, araştırmacılar vca immünoloji ve nöromotor kurtarma hem de ilerlemek mümkün olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Frankel Vakfı ve Northwestern Memorial Hastanesi McCormick Grant (Operation RESTORE) tarafından finanse edilmiştir. Bu yayında bildirilen araştırma, T32GM008152 Ödül Numarası kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Medicial Sciences Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma Northwestern Üniversitesi Mikrocerrahi Çekirdek ve Davranışsal Fenotilik Core tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia machine Vet Equip 911103
0.5cc syringe Exel 26018
18-gauge needle BD 305196
1cc syringe BD 309659
22-gauge needle BD 305156
24-gauge angiocatheter Sur-Vet SROX2419V
25-gauge needle Exel 26403
3 cc syringe BD 309657
5cc syringe Exel 26230
Alcohol Fisher Scientific HC-600-1GAL
Anesthesia induction chamber Vet Equip 941443
Anesthetic gas scavenger system Vet Equip 931401
Bipolar electrocautery Aura 26-500
Bitter Spray Mist Henry Schein 5553
Bone wax CP Medical CPB31A
Breathing circuit Vet Equip 921413
Buprenophine Reckitt Benckiser 12496075705
Castro-Viejos needle drivers Roboz RS-6416
Cordless rotary saw Dremel 8050-N/18
Cotton swab stick Fisher Scientific 23-400-101 For hemostasis
DigiGait Appparatus and Software Mouse Specifics MSI-DIG, DIG-SOFT
Dumont forceps (#4) Roboz RS-4972
Dumont forceps (#5) Roboz RS-5035
Enrofloxacin Norbrook ANADA 200-495
FK-506 Astellas 301601
Gauze Kendall 1903
Gauze Covidien 8044
Gloves Microflex DGP-350-M
Hair clippers Oster 078005-010-003
Handheld monopolar electrocautery Bovie AA00
Hargreaves Apparatus Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy 37370
Heating pad Walgreens 126987
Heparin Fresenius Kabi 42592K
Hot plate Corning PC-351 For warming resusscitation fluid
Isoflurane Henry Schein 29405
Lactated ringers Baxter 2B2074
Large petri dish Fisher Scientific FB0875713 For donor graft while in chilled saline
Meloxicam Henry Schein 49755
micro Collin Hartmann retractor
Micro dissecting scissors Roboz RS-5841
Microfibrillar collagen powder BD 1010590 For hemostasis
Microvascular clips Roboz RS-5420
Normal saline Baxter 2F7124
Opthalmic lube Dechra IS4398
Rapmycin MedChem Express HY-10219
Small petri dish Fisher Scientific FB0875713A For warmed resusscitation fluid
Sterile drapes ProAdvantage N207100
Surgical gown Cardinal Health 9511
Surgical mask 3M 1805
Surgical microscope, optic model OPMIMD Zeiss 169756
Surgical microscope, Universal S3 Zeiss 243188
Suture 10-0 nylon Covidien N2512
Suture 5-0 vicryl Ethicon J213H
Suture 7-0 silk tie Teleflex 103-S
Tape 3M 1530-1
Ultrasonic instrument cleaner Roboz RS-9911
Vessel dilation forceps Roboz RS-5047

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elliott, R. M., Tintle, S. M., Levin, L. S. Upper extremity transplantation: current concepts and challenges in an emerging field. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine. 7 (1), 83-88 (2014).
  2. Petruzzo, P., et al. The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation. Transplantation. 90 (12), 1590-1594 (2010).
  3. Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. Journal of Surgical Research. 24 (6), 501-506 (1978).
  4. Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
  5. Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (108), e53483 (2016).
  6. Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (41), e2022 (2010).
  7. Horner, B. M., et al. In vivo observations of cell trafficking in allotransplanted vascularized skin flaps and conventional skin grafts. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (4), 711-719 (2010).
  8. Fleissig, Y., et al. Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research. Journal of Visualized Experiments. (146), e59458 (2019).
  9. Zhou, X., et al. A series of rat segmental forelimb ectopic implantation models. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  10. Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
  11. Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
  12. Fries, C. A., et al. enzyme responsive, tacrolimus-eluting hydrogel enables long-term survival of orthotopic porcine limb vascularized composite allografts: A proof of concept study. PLoS One. 14 (1), 0210914 (2019).
  13. Cottrell, B. L., et al. Neuroregeneration in composite tissue allografts: effect of low-dose FK506 and mycophenolate mofetil immunotherapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 5 (2006).
  14. Benhaim, P., Anthony, J. P., Lin, L. Y., McCalmont, T. H., Mathes, S. J. A long-term study of allogeneic rat hindlimb transplants immunosuppressed with RS-61443. Transplantation. 56 (4), 911-917 (1993).
  15. Greene, E. C. Anatomy of the rat. Volume N.S. American Philos. Soc. , Philadelphia, Pa. 27 (1935).
  16. Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
  17. Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal Pain Sensation in Rats and Mice Using the Hargreaves Test. Bio-protocol. 7 (16), (2017).
  18. Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
  19. Hong, S. H., Eun, S. C. Experimental Forelimb Allotransplantation in Canine Model. BioMed Research International. 2016, 1495710 (2016).
  20. Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 26 (3), 201-207 (2010).
  21. Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
  22. Fries, C. A., et al. A Porcine Orthotopic Forelimb Vascularized Composite Allotransplantation Model: Technical Considerations and Translational Implications. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3), 71 (2016).
  23. Kim, M., Fisher, D. T., Powers, C. A., Repasky, E. A., Skitzki, J. J. Improved Cuff Technique and Intraoperative Detection of Vascular Complications for Hind Limb Transplantation in Mice. Transplantation Direct. 4 (2), 345 (2018).
  24. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), 015495 (2013).
  25. Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
  26. Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a mouse model for heterotopic limb and composite-tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (4), 267-273 (2001).
  27. Tang, J., et al. A vascularized elbow allotransplantation model in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 24 (5), 779-786 (2015).
  28. Yan, Y., et al. Nerve regeneration in rat limb allografts: evaluation of acute rejection rescue. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (4), 511 (2013).
  29. Georgiade, N. G., Serafin, D. A Laboratory Manual of Microsurgery. Fourth Printing. , (1986).
  30. Tseng, S. H. Suppression of autotomy by N-methyl-D-aspartate receptor antagonist (MK-801) in the rat. Neuroscience Letters. 240 (1), 17-20 (1998).
  31. Haselbach, D., et al. Regeneration patterns influence hindlimb automutilation after sciatic nerve repair using stem cells in rats. Neuroscience Letters. 634, 153-159 (2016).
  32. Kloos, A. D., Fisher, L. C., Detloff, M. R., Hassenzahl, D. L., Basso, D. M. Stepwise motor and all-or-none sensory recovery is associated with nonlinear sparing after incremental spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 191 (2), 251-265 (2005).
  33. Berryman, E. R., Harris, R. L., Moalli, M., Bagi, C. M. Digigait quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
  34. Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
  35. Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 11622, 179-188 (2014).
  36. Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behavioural Brain Research. 219 (1), 55-62 (2011).
  37. Neckel, N. D. Methods to quantify the velocity dependence of common gait measurements from automated rodent gait analysis devices. Journal of Neuroscience Methods. 253, 244-253 (2015).
  38. Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (5), 1704-1711 (2000).

Tags

Tıp Sayı 162 Hayvan modelleri Ekstremite nakli sıçan rehabilitasyon kompozit doku allotransplantasyonu (KTA) vaskülarize kompozit allotransplantasyon (VCA) mikrocerrahi immünoloji periferik sinir yaralanması
Sonraki Adım Taking: Bir Nöral Coaptation Ortotopic Hind Limb Transplant Modeli Sıçan Fonksiyonel Kurtarma Maksimize etmek
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zheng, F., Tully, A., Koss, K. M.,More

Zheng, F., Tully, A., Koss, K. M., Zhang, X., Qiu, L., Wang, J. J., Naved, B. A., Ivancic, D. Z., Mathew, J. M., Wertheim, J. A., Zhang, Z. J. Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat. J. Vis. Exp. (162), e60777, doi:10.3791/60777 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter