Summary
このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。
Abstract
タンパク質の複数の翻訳後修飾(PTM)を研究することは、PTMクロストークを理解し、タンパク質機能に関するより全体的な洞察を得るための重要なステップです。マルチPTM濃縮研究の重要性にもかかわらず、PTMの複数のグローバルプロテオーム分析を行うために必要な費用、時間、および大量のタンパク質量のために、一度に複数のPTMを調査する研究はほとんどありません。このプロトコルで詳述されている「ワンポット」アフィニティエンリッチメントは、低量のサンプルを含むリジン残基を含むペプチドの同時同定と定量を可能にすることによって、これらの障壁を克服する入力。このプロトコルには、SIRT5ノックアウトマウスのマウス肝臓からのタンパク質ライセートの調製、トリプシン消化の性能、PTMの濃縮、およびデータ独立型獲得(DIA)ワークフローを用いた質量分析分析のパフォーマンスが含まれる。このワークフローは、同じサンプルから2つのPTMを同時に濃縮できるため、大量のサンプルを必要とせずにPTMクロストークを研究するための実用的なツールを提供し、サンプル調製、データの調製に必要な時間を大幅に短縮します。取得、および分析を行います。ワークフローの DIA コンポーネントは、包括的な PTM 固有の情報を提供します。DIA は、さまざまな PTM ローカライズ アイソフォームを区別するために計算で解読できるフラグメントイオンの包括的なセットを提供するため、PTM サイトのローカリゼーションを研究する際に特に重要です。
Introduction
翻訳後の無数の修飾は、活性1、シグナル伝達2、およびターンオーバー3、4に対する作用を通してタンパク質および経路を動的に調節する。例えば、リン酸基5の添加によりタンパク質キナーゼが活性化または不活性化され、ヒストンアセチル化および他の修飾は、クロマチン構造を変化させ、転写調節機構6,7として機能するメカニズムを提供する。近年、複数のPTMが協調して働くか、タンパク質機能または活性を調節するために競合しているという証拠が高まっています8,9,10,11.そのため、PTM クロストークを理解することは、PTM 研究における新たなニーズです。しかし、PTMサイトを識別し定量するほとんどのプロテオームワークフローは、複数の改変の相互作用ではなく、単一の改変に焦点を当てています。記載されたワークフローは、複数の異なるPTMによって修飾される特異的タンパク質修飾「ホットスポット」およびリジン残基を相関させる。
科学界では、複数のPTMを同時に12個の研究に向けた、実現可能な方法が求められる。PTMの複数のタイプのサイトをグローバルに識別し、定量化するほとんどの方法は、高いコストと組織の量が12、13を必要とするため、困難です。マルチPTM濃縮実験は、サンプル調製、データ収集、およびデータ分析の面で時間がかかるだけでなく、通常、これらの研究は、タンパク質11の大量かつしばしば禁止量を必要とします。ここで説明する複数の PTM の同時エンリッチメントと分析のためのプロトコルは、これらの障壁のいくつかに対処し、さまざまな PTM14間の大規模な PTM プロファイリングとクロストークの評価を可能にします。このワンポットワークフローは、生物医学研究者が複数のPTMをグローバルにプロファイリングし、共変性ペプチドを同定し、PTMクロストークを効率的かつ費用対効果の高い方法で研究するための実用的な方法を概説します14,15.
ここでは、50年以上前に最初に研究されたミトコンドリアタンパク質アシル化を調べることによって紹介されています。具体的には、リジンアセチル化17とコハシニル化18に、タンパク質に対するこれらの修飾の共発生、さらにはペプチドレベルでの共修飾を含む。研究はサーチュイン5(SIRT5)ノックアウトマウスモデルを使用しているので、アセチル化および凝集部位の濃縮に焦点を当てることが選ばれました。この決定は、コハクニル化部位がSIRT5 desuccinylaseの標的であり、KOマウスで有意な上方調節を示すことを期待されているためであり、この場合において最も関連性の高いPTMとなる。両方のPTMは、最近Carricoら19によって要約されているように生物学的に関連しています。一般に、アセチル化は遺伝子発現および代謝に重要な影響を及ぼし、そして、コハクニル化は心臓代謝および機能20を調節することが報告されている。
上記のプロトコルは、タンパク質の投入物質の量が少ない(例えば、1mgのタンパク質ライセート)で行われ、サンプル処理、MS取得、およびデータ分析に費やされる時間を短縮することにより、実験の総持続時間を短縮することができる。ワークフローの回路図は、図 1に示されています。また、さらに低い量の出発物質(タンパク質ライセートの100μgまで、それに応じて使用されるビーズの量を縮小)を使用しており、予想通り、同定されたアシル化ペプチドの全体的な収率を低下させます。しかし、それはまだ非常に貴重な結果と定量化されたペプチドを提供します。
いわゆるトップダウンまたはミドルダウンのワークフローでは、通常、タンパク質分解酵素アプローチを使用しません(したがって、1つのタンパク質内の複数のPTMの接続性を維持します)、このプロトコルは、PTMの同定と定量のための余分な深さと感度を得るためのペプチドベースの親和性エンリッチメントアプローチに焦点を当てています(図1)。さらに、このペプチド中心のワークフローは、1)スペクトルライブラリを生成するためのデータ依存型取得(DDA)の組み合わせ、およびラベルフリーワークフローにおける正確なPTM定量のための2)データ非依存の取得(DIA)を含む最新の質量分析法を利用する。
DIAワークフローは、サンプリングされたm/z範囲21内のすべてのペプチド信号を包括的に断片化することにより、典型的なDDAスキャンスキームのサンプリングストカスティシティを克服する。この特徴は、ペプチド内でどの特定の断片イオンが修飾されているかに関する情報を得やすくなるため、部位局在化の点でも非常に有益である。さらに、DIAワークフローは、同一の前駆体イオンを有するマイナーPTMペプチドアイソフォームの同定および定量化を可能にする。DIA法はまた、常に包括的に測定される特定の対応する断片イオンに基づいて、ペプチド内の特定のPTM部位の局在を決定することができる。しかし、DDAアプローチでは、同じ前駆体イオンに対してMS/MSの複数のサンプリングを除外する「動的除外」機能を利用することが多く、マイナーPTMアイソフォームが欠落しています。
ここで説明する同時エンリッチメント戦略は、複数のPTMのグローバルプロファイリングと定量化、PTMクロストークの検証、翻訳後の変更の動的相互作用の理解の恩恵を受ける研究に最適です。1つの結合されたワークフローにおける複数の濃縮PTMの同定は、タンパク質分解ペプチドを含むPTMのグローバル、シリアルまたは並列の濃縮、またはインタクトタンパク質の分析によって説明されています。アセチル化およびコハクチル化の連続濃縮と直接比較して、ワンポット方法論の効率は非常に類似した14として確立された。これらの代替プロトコルは、出発材料と時間のかなりの量を必要とし、非常に高価なことができます。これに対し、ワンポットプロトコルは、その後の分析と同定を伴う複数のPTMの濃縮のための安価で効率的な方法を提供します。
マウス肝組織はSIRT5ノックアウトマウスから得られ、ここで出発物質として使用される。このプロトコルは、異なる組織または細胞培養実験からのタンパク質のライセートに対しても行うことができる。このプロトコルは、組織または細胞培養ペレットから得られるタンパク質ライセートに適用することができる。
Protocol
プロトコルに記載されているすべての実験は、バック研究所の機関動物研究委員会のガイドラインに従います。
1. 均質化組織からのタンパク質抽出とプロテアーゼによる消化
- 8 M尿素、50 mMトリエチランモニウム重炭酸塩(TEAB)、1 μMトリコスタチンA(TSA)、20mMニコチンアミド、75mM塩化ナトリウム(NaCl)、1xプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテル(PIC)をHPLCグレードの水で作り出します。
- ビーズミルホモジナイザーと互換性のある2 mLチューブに1つの滅菌鋼ビーズを加え、組織片(エンドウ豆サイズ)をチューブに入れる。リシスバッファー(500 μL)とボルテックスを短時間加え、必要に応じて、バッファーが組織片を覆っていることを確認します(必要に応じて、より多くのリシスバッファを追加します)。予冷アダプターセットにチューブを置き、ホモジナイザーの2つのアダプター間でチューブのバランスを取ります。
- サンプルを25Hzで2xで均質化し、それぞれ3分間4°Cで組織が完全に均質化されていない場合は、チューブを短時間回転させ、均質化されたライセートをラベル付けされた新しい1.5 mLチューブに移します。次いで、残りの組織片にさらなる分解緩衝液を加え、それぞれ3分間25Hzで均質化2xを繰り返す。均質化の2ラウンドは、典型的には、組織を分割するのに十分である。
- 金属ビーズをトゥイザーで取り除く。各サンプルの間に、再びHPLCグレードの水、HPLCグレードのメタノール、およびHPLCグレードの水でツイーザーをすすいでください。
- ホモジナイズの2ラウンドを適用した場合は均質化ライセートを組み合わせ、超音波処理器を30 s on/30 s offで10サイクル、高出力で4°Cで超音波処理します。
- ホモジナイズライセートを4°Cで10分間14,000 x gで遠心分離し、ライセートをクリアします。上清(クリアライセート)を新しい1.5mLマイクロ遠心チューブに移し、上清の上に座る可能性のある脂肪層とチューブの底部の破片を避けます。
- 適切な希釈(例えば、1:20および/または1:200)でクリアされた溶解物のタンパク質濃度を測定するために、ビチンポニン酸(BCA)アッセイを行います。BCAの結果によると、各サンプルから1mgのタンパク質をアリコートした。
- 37°Cで4.5 mMジチオトレイトール(DTT)でタンパク質を30分間、1,400rpmで撹拌して還元します。続いて、10 mMのヨードアセトアミド(IAA)中のアルキル酸タンパク質を、室温(RT)で30分間暗闇(引き出しまたはキャビネット内の場所)にインキュベートした。
注: IAA の代わりに N-エチルマレイミド(NEM)などの代替試薬を使用できます。 - サンプルに50 mM TEABを加えたら、尿素濃度をpH紙に2M未満のスポット1μLまで希釈し、希釈したサンプルのpHが7.0〜8.5の間であることを確認します。トリプシンを各サンプルに1:50の割合で添加し(トリプシン対タンパク質、wt/wt)、一晩37°C(約14〜16時間)で撹拌してタンパク質を消化する。
- 翌日10%ギ酸に達するまで10%のギ酸で消化をクエンチ。渦とスピンを短時間。サンプルの1μLをpHストリップに当て、ダイジェストがpH= 2-3であることを確認します。遠心分離は、任意の不溶性物質をペレットにRTで15分間1,800 x gでサンプルします。
2. 大規模固相抽出による非濃縮タンパク質分解ペプチドの脱塩
- 最大10mgのタンパク質に結合できるC18樹脂を含むカートリッジを入手します。これらのカートリッジを真空装置に取り付け、次の各ステップで液体をカートリッジから引き抜くことができる真空吸引を使用します。各ペプチドサンプルに1つのカートリッジを指定します。
- 800 μL 80% アセトニトリル (ACN) を 19.8% 水のカートリッジに 0.2% ギ酸で加え、真空吸引を使用して液体を引き抜きます。このステップ1xを繰り返し、カートリッジの乾燥を完全に回避します。
- 真空吸引を用いて水に800 μLのギ酸を加えて、フィルターを通して全容を引き出すことで、カートリッジを平衡化します。この2倍を繰り返します。真空吸引でカートリッジにペプチドをロードします。真空吸引の下で水のギ酸の800 μLの2xを洗う。
- 各カートリッジの下に1.5 mLマイクロ遠心チューブを配置し、最終ステップで溶出するペプチドを集める。カートリッジからの真空吸引溶出ペプチドの下で、最初に800 μL 80%のACNを0.2%のギ酸および19.8%の水で、次に同じ溶液の400 μLと。脱塩ペプチドサンプルを真空濃縮器(2-3時間)で完全に乾燥させます。
3. 免疫親和性ビーズを用いたK-アセチル化ペプチドとK-コハクニル化ペプチドの同時濃縮
- 乾燥したペプチドを1.4 mLの冷たい1x免疫親和性精製(IAP)バッファーに再懸濁する。ボルテックスを混合し、〜7のpHを確保する。遠心分離機は、4°Cで10分間10,000 x gでサンプルをサンプリングします。小さなペレットが現れる場合があります。
- 抗体ビーズを準備しながら、氷の上にペプチドを脇に置きます。K-アセチルおよびチューブのK-スクシニル抗体ビーズスラリーのチューブ(体積:チューブ当たり100μLのスラリー)に、冷たい1mLの冷たい1mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、ピペッティングにより混合する。新しい1.5 mLチューブに溶液全体を移し、RTで30sのミニチュア遠心分離機で回転させます。
- PBSを吸引し、ビーズを吸い取らないように注意してください。冷たい1x PBSの1 mLで再び洗浄し、RTで30sの遠心分離し、PBSを吸い取ることによって、洗浄3倍を繰り返します。
- ビーズをPBSの約440μLで再懸濁する。各PTMチューブ中のビーズの数の4分の1(100 μL、メーカー提供)は、1ポットの濃縮(K-アセチルおよびK-スクシニル抗体ビーズの両方に対して固定化された抗体の約62.5μg)に使用されます。ビーズを数回ピペットよく混ぜる。100 μLのアセチルリジン抗体ビーズを取り除き、200 μLのプレカットチップで1本のチューブに移し、マスターミックスが一貫してよく混合されることを保証します。
- 各チューブ内のアセチルリジン抗体とサクシニルリジン抗体の等しい部分に到達するためにチューブに100 μLのスクシニルリジン抗体ビーズを除去することにより、スクシニルリジン抗体ビーズと同じことを行う。ミニチュア遠心分離機で30s回転し、ゲルローダーチップでメディアを吸い取ります(ビーズは白になります)。
注:各チューブの下部に同様のビーズペレットが必要です。 - 再懸濁したペプチドを洗浄したビーズに直接ピペット。ペレットを避けるように注意してください(ビーズを乾燥させないように素早く追加してください)。4°Cで一晩ビーズを使用してペプチドをインキュベートし、撹拌します。
4. 抗体ビーズに結合したペプチドの溶出
- ペプチドサンプルを4°Cで30sの2,000 x gでスピンします。非結合ペプチドを含む上清を除去し、必要に応じて将来の実験のために保存します。ビーズに1 mLの冷たい1x IAPバッファーを加え、5倍に反転して洗浄して混合します。4 °Cで30sの2,000 x gでスピンします。IAP溶液を吸引し、合計2回の洗浄のためにIAP洗浄ステップ1xを繰り返します。
- 1 mLの冷たいHPLC水をビーズに加え、5倍に反転して混ぜます。4 °Cで30sの2,000 x gでスピンします。水を吸い取る。合計3回の洗浄のために水洗浄ステップを2回繰り返します。4 °Cで30sの2,000 x gで追加の時間をスピンして、チューブの底部に残った水を集めます。平らなチップを入れたゲルローディングチップで収集した可能性のある余分な水を吸引します。ビーズの吸引を避けるように注意してください。
- 55 μLの0.15%のトリフルオロ酢酸を水に加えます。時折、チューブの底をタップして混ぜながら、RTでビーズを10分間インキュベートします。ミニチュア遠心分離機で30sのRTでビーズを回転させます。溶出したペプチドを取り除き、平らなチップを入れたゲルローディングチップを使用して脇に置きます。
- 45 μLのトリフルオロ酢酸を水に加えてビーズに入れます。時々チューブの底をタップしながらRTで10分間インキュベートして混ぜます。ミニチュア遠心分離機で30sのRTでビーズを回転させます。平らな先端のゲルローディングチップを使用して2番目の溶出を取り除き、最初の溶出と組み合わせます。
- RTで5分間12,000 x gで結合された溶出ペプチドをスピンして、持ち越すビーズをペレットにします。ペプチドサンプル溶液を新しい500μLチューブに移します。
注: ここでプロトコルを一時停止できます。
5. 濃縮ペプチドの脱塩
注:C18樹脂を含む先端に最適な結合のためにサンプルのpHは4未満でなければなりません。C18樹脂0.6μL、10μLピペットを含む10μLピペットチップを使用してチップを制御します。
- 10 μLのアセトニトリルを先端にピペッティングしてC18チップを予め湿らせた。アセトニトリルを無駄に分配します。この手順を 2 回繰り返します。
- 水にギ酸0.2%の10 μLで3xを洗浄してチップを平衡化します。各平衡化後に溶液を無駄に分配します。
- サンプルからチップにペプチドを連続的にピペッティングし、チップで濃縮したペプチドサンプルを分配することにより、先端にペプチドをロードします。ピペットは少なくとも20倍繰り返し上下し、チップから残りの溶液を分配します。
- 結合したペプチドを含む先端を10 μLのギ酸で水で洗浄します。廃液に溶液を分配します。この手順 9x を繰り返します。
- 0.2%のギ酸、50%のアセトニトリル、および49.8%の水を含む溶出緩衝液の10 μLを使用して新しい管に溶出ペプチド。繰り返しピペットと新しいチューブ15x内の溶液の10 μLを分配します。さらに10 μLの溶出バッファーを使用してこのステップを繰り返し、前の溶出と同じチューブに繰り返しピペットを入れます。
- 真空濃縮器で完全に乾燥したペプチド(約20分)。乾燥したペプチドを適切な量0.2%のギ酸を水中に再懸濁する。
注: ここでプロトコルを一時停止できます。
6. DDAとDIAを用いたデータ取得
注:DDAおよびDIA LC-MS/MSメソッドでサンプルを分析し、利用可能な質量分析装置に応じて調整できます。ここでは、ナノLC2D HPLCシステムを用いて試料を解析し、高解像度質量分析計に結合した。
- 質量分析計に直接接続されたチップベースのプラットフォームHPLCシステムと組み合わせたHPLCシステムを使用してください(多くのLC-MS構成およびシステムも使用できます)。
- 逆相HPLC-ESI-MS/MSを用いたサンプルの分析
- 注射後、ペプチド混合物をC18プリカラムチップに移し、移動相Aを2μL/分で10分間洗浄してペプチドを脱塩します。次に、移動相AとBを用いて2〜3時間勾配で300nL/minの流量でペプチドを分析カラムに移し、具体的には、5%移動相Bから35%移動相Bまでの直線勾配を80分にわたって使用します。
- その後、移動相Bを5分以上80%にランプし、8分間80%Bで保持してから5%Bに戻り、25分間の再平衡化を行います。
- DDA用のMS計測器法を構築し、以下の計測器スキャン実験を定義
- 実験1:ms1前駆体イオンスキャン m/z 400-1,500(蓄積時間250ms)。MS/MS スキャンをトリガして充電状態のイオンが 2 ~ 5 ~ 200 カウントに達するまでの強度しきい値を設定します。前駆体イオンの動的除外を60sに設定します。
- 実験 2: MS2 スキャンの MS/MS 製品イオンスキャンは m/z 100-1,500 (1 サイクルあたり 30 製品イオンスキャンあたり 100 ミリ秒の蓄積時間) から開始します。衝突エネルギーの広がりをCES=5に設定し、「高感度製品イオンスキャンモード」を選択する。
注:DDA法は、各調査MS1スキャンの後に30の最も豊富な前駆体イオンのMS /MSスペクトルを取得し、合計サイクル時間は〜3.3秒になります。
- DIAのMS計測方法を構築し、以下の計測器スキャン実験を定義する。
- 実験1:ms/z 400-1,250(蓄積時間250ms)からMS1前駆体イオンスキャンを行う。
- 実験 2: MS2 スキャン範囲 m/z 100-1,500 (1 サイクルあたり 64 製品のイオン スキャンあたり 45 ミリ秒の蓄積時間) を使用して、64 個の可変 SWATH セグメントに対して MS/MS 製品イオン スキャンを実行します。衝突エネルギーの広がりをCES=10に設定し、「高感度製品イオンスキャンモード」を選択する。
- シリングら22で説明した64可変ウィンドウDIA/SWATH取得戦略を使用して、合計サイクル時間が~3.2 sのラベルフリー定量を取得します。 この取得では、Q1四重極が衝突セルに狭い質量範囲を送信する代わりに、可変ウィンドウ幅(5 -90 m/z)のより広いウィンドウが、フルマス範囲(m/z 400 -1,250、64 SWATHセグメント)の増分ステップで渡され、それぞれ45 ms蓄積時間が1回のMS.2秒のサイクルタイムが得られます。250 msの蓄積時間を有する)。
注: 可変ウィンドウ幅は、可変ウィンドウ計算アルゴリズム22を使用して、特定の m/z 範囲内で観測される一般的な MS1 イオン電流の複雑さに従って調整されます (より狭いウィンドウは「ビジー」の m/z 範囲で選択され、m/z 範囲の幅が広く、前駆体のイオンが少ない)。他の MS 計測器プラットフォームでは、他の DIA ウィンドウ戦略を実装できます。
7. データ分析
注: 一部のデータ分析設定は、特定の実験に合わせて変更し、調整する必要があります。例えば、選択されるタンパク質データベース(FASTAファイル)は、サンプルが調製された種(ここでは、Musmusculus)に依存する。以下に、アセチル化ペプチドおよびコハシニル化ペプチドに対して濃縮されたマウスサンプルのデータ分析について説明する。
- MS データベース検索エンジンを使用して、DDA の取得を分析します。次のように、データベース検索エンジンのメソッドを作成します。
- サンプル記述パラメータの場合:サンプルタイプの下で「識別」を選択し、「システインアルキル化」の下の「トリプシン」を選択し、「消化」の下にある「トリプシン」を選択し(「リジンとアルギニンでC末端切断を仮定する」)、楽器の下の「TripleTOF 6600」を選択し、特別な要因の下でアセチル化とスハシニル濃縮をチェックし、ムスカル
- 特定の処理パラメータの場合: [ID フォーカス] の下の [生物学的修飾"を選択し、[検索の取り組み] で [完全な ID]をオンにし、[検出されたタンパク質の閾値] の下の [誤検出率分析の実行] をオンにします。検索エンジンの方法を保存し、生成されたメソッドを使用して、データベース検索エンジンで処理するための質量分析コードの生ファイルを送信します。
注: 反復処理では、すべての MS および MS/MS スキャンは、最初の注釈と結果に基づいて検索エンジンによって自動的に再調整されます。
- 検索が完了したら「ペプチドの要約をエクスポート」をクリックし、スプレッドシートソフトウェアで99の「信頼閾値」によってすべてのペプチド識別結果をフィルタリングします(例えば、Excel;偽発見率[FDR]1%)。
- 「ペプチド要約」スプレッドシートファイルでは、修飾欄にPTM注釈「アセチル化」および「簡潔化」を含むすべてのペプチドをフィルタして、アシル化ペプチドおよび対応するタンパク質のみを提示する結果報告を生成する。
- DIAの生ファイルをさらに処理し、さらに相対的な定量を行うためにMS/MSスペクトルライブラリを構築するには、DIA定量分析ソフトウェアを開きます。[ライブラリ] タブを選択し、(ページの下部にある) [データベース検索エンジンからスペクトル ライブラリを生成する] をクリックし、DDA のファイル データベース検索プロセスの一部として自動的に生成されたデータベース検索エンジンFDR レポート(*FDR.xlsx ファイル) を開きます。次に、[次へ] をクリックし、[ライブラリ設定スキーマ] と[次へ] を選択します。データベースとして[Uniprot_mouse_proteome]を選択し、ジーン 注釈 (オントロジー) ファイルとして [次へ] および[goa_mouse]をクリックします。最後に、"finish"をクリックすると、スペクトルライブラリが生成されます。
注: DDA 生データファイルからのアセチル化ペプチドおよびコハシナイ化ペプチド、MS1 からの前駆体イオンスキャン、MS2 からのフラグメントイオンスキャンに関する情報がスペクトルライブラリに含まれます(保持時間、MS/MS フラグメンテーションパターンなど)。 - DIA定量プロテオミクス分析ソフトウェアを使用して、アセチル化および凝固レベルの相対的な定量を行い、さらなるデータ分析に使用できる候補PTM含有ペプチドのスプレッドシートを作成します。
- PTM含有ペプチドを分析し、定量化するためにDIA定量分析ソフトウェアを開き、テンプレート分析スキーマを使用します。テンプレート スキーマは、ソフトウェアでオプションの "設定パースペクティブ" |DIA分析|"BGS PTM"(実験に応じて有意またはまばら)。
注: DIA 定量分析ソフトウェアで BGS PTM 分析テンプレートを使用する代わりに、すべての PTM 固有の設定を手動で設定することもできます。2) 「定量化」 で、 "マイナーペプチドグループ" |"変更されたシーケンス" ;そして3)「事後分析」の下で、「微分量のグループ化」を選択する|"マイナー グループ" (定量設定)。これらの設定は、PTMの局在化機能を活性化し、修飾されたペプチドが個々のエントリとしてリストされ、差動分析がペプチドレベルで行われるようにします。 - 定量分析を開始するには、[パイプライン] タブを選択し、[ファイルから DIA 分析を設定] をクリックし、相対定量化のために関心のある MS DIA の未処理ファイルを開きます。[スペクトル ライブラリの割り当て] を選択し、上で作成したライブラリを選択して、"load"をクリックします。"次の"。"BGS PTM" 分析スキーマを選択し、" 次へ" をクリックします。適切なデータベース FASTA ファイル"Uniprot_mouse_proteome"を選択してください 。"次の"。サンプルに異なる条件を割り当てる条件設定を定義し、「次へ」をクリックします。遺伝子注釈 (オントロジー) ファイルとして"goa_mouse"を選択し、次の"" をクリックします。分析の概要(実験の設定の概要)を確認し、出力ディレクトリを選択します。"仕上げ"。最後に、[パイプラインの実行] をクリックして、ラベルなしの定量分析を実行します。
注: DIA定量分析ソフトウェアの統計モジュールは、自動的にFDR分析を行い、異なる条件を比較したヒートマップと火山プロットを生成し、同定および定量化されたペプチドおよびタンパク質のリストを生成し、提供します。Q値と相対的な折り返しの変化は、異なる条件を比較します。
- PTM含有ペプチドを分析し、定量化するためにDIA定量分析ソフトウェアを開き、テンプレート分析スキーマを使用します。テンプレート スキーマは、ソフトウェアでオプションの "設定パースペクティブ" |DIA分析|"BGS PTM"(実験に応じて有意またはまばら)。
- 代わりに、データを処理し、アセチル化およびコハシネーションサイトの抽出ピーク領域をエクスポートした後の統計分析を実行するためのDIAデータセットの干渉除去のためのソフトウェアを使用してください。
8. 修飾ペプチドのデータ可視化とPTMサイト局在化の評価
- 生成されたDIA定量分析を開くには、「分析」タブに続いて「定量分析ソフトウェア実験をロードする」を選択します(保存された実験から*を開きます)。SNE ファイル)。* に移動します。SNE 結果ファイルを開き、"開く" を選択します。
- 左パネルで、上から3番目の生データ*.wiffファイルの左側にある矢印をクリックして、64のSWATHセグメントをすべて展開して視覚化します。セグメント [428.7-437.3] の左側にある矢印をクリックして、特定のセグメントを展開し、この質量範囲に対して同定された修飾ペプチドを表示します。トリプリン酸ペプチド KQYGEAFEK[アセチル]Rをクリックします。
注: 既定では、右上のパネルには通常 MS2 XIC が表示され、下部のパネルには MS1 同位体エンベロープ XIC が表示されます。- 上のパネルで、"PTM ローカリゼーションプロット"を選択します。下部パネルで、「PTM ローカリゼーションプロット」を選択します。
- PTM局在プロットで、トップペプチド配列"KQYGEAFEK[アセチル]R"を選択し、合計PTM局在化スコアは18.32です。左の矢印をクリックしてビューを展開し、イオンの確認と反論を視覚化します。「イオンの確認」の横にある矢印をクリックし、イオン "y3 [+42]を選択して、その特定のイオンをハイライトし、そのイオンがペプチド配列のK2上にあることを確認します。
- PTM局在プロットでは、合計(非常に低い)PTM局在スコア1の2番目のペプチド配列「K[アセチル]QYGEAFEKR」を選択します。左の矢印をクリックしてビューを展開し、イオンの確認と反論を視覚化します。「イオンの確認」の横にある矢印をクリックし、「反論イオン」の横にある矢印をクリックし、抽出されたイオンクロマトグラムとMS/MSスペクトルを視覚化して評価する断片イオンを選択します(図5)。
注:割り当てられたPTMローカリゼーションスコアと目視検査は、正しいPTM異性体がKQYGEAFEK[アセチル]Rであることを示していますが、他の可能なPTM異性体K[アセチル]QYGEAFEKRに対する証拠は存在しません。
Representative Results
図1は、マウス肝臓から組織を採取し、トリプシンでタンパク質ライセートを消化するための1mgのタンパク質を使用し、抗体共役ビーズを有するペプチドをインキュベートし、MS上のサンプルを取得し、最終的に様々な定量プロテオミクスソフトウェアパッケージ(アカデミックおよびコマーシャル)を用いてデータのDIA/SWATH分析を行うなど、ワークフローの一般的な図を示す。
図2Aは、マルチPTM濃縮研究に現在使用されている代替方法と比較して、ワークフローのタイムラインおよび必要なサンプルおよびタンパク質の量を示しています。ワンポット法は、これらの代替方法として半分の時間と半分のサンプル数で行うことができます。2つの単一PTM濃縮法と比較して、ワンポットプロトコルもタンパク質の半分の量を必要とします。
このプロトコルは、実現可能で費用対効果の高い代替手段であることが示されています。図2Bは、修飾ペプチド領域の変動係数(CV)の中央値が、シングルPTMおよびシリアルPTMの濃縮よりもワンポット法で低かったことを示す。図2C,Dは、ワンポットPTMとシングルPTMの濃縮方法を比較しながら、2つの改変に対するサイトレベルの定量の相関の間に顕著な違いは見当たらず、示しています。これは、ペプチドレベルとフラグメントレベルの相関についても当てはまる。1ポットとシリアルPTMのエンリッチメントを比較する際に、3つの相関すべてに対して同じ観測が行われました。Basistyら14による最近のレポートに関連付けられたすべての基礎となるMS生データおよび処理されたExcel結果シートが利用可能であり、MassIVE(MSV00081906)およびプロテオメックスチェンジ(PXD008640)からダウンロードすることができます。
一般に、抗体濃縮戦略は、潜在的なエピトープ咬合または限られた特異性などの特定の制限を示すかもしれないが、この研究で使用される抗体は、独立して生成されたクローンの混合物であり、したがって、より広い範囲を提供する特異 性。
実験結果は、PTMクロストークを検出し、評価する可能性を文書化します。図3は、成功した濃縮からのデータを表示し、PTMクロストークを視覚化する複数の異なるアシル修飾を含むペプチドの例を示しています。図3Aは、一方のリジン残基にアセチル化され、他方にコハシニル化されたペプチドを示し、図3Bは両方のリジンで同じペプチドをコハシニル化した。これは、同じリジン残基が両方のアシル化基で修飾できることを示し、その部位でクロストークが起こる可能性があることを示している。図4は、両方の改変を行うセクション7.1-7.3に記載されているように同定されたリジン残基の数を示し、また可能なPTMクロストークを指し示す。
図5に示すように、DIA PTMデータセットを定量プロテオミクスソフトウェアで処理することで、どのリジン残基が修飾されているかを特定できます。これは、サイトローカリゼーションと呼ばれる概念であり、PTMクロストークの可能性を判断するための分析に不可欠なステップです。図 5は、セクション 8.1~8.3 (具体的にはステップ 8.3.2 および 8.3.3) で説明されているように、視覚化および評価できる各々のイオンの確認と取り合いとともに、2 つのイソフォームの可能性を示しています。この情報に基づいて、元のサンプルに存在するアイソフォームが2つあるのは自信を持って特定できました。確認したアイソフォームKQYGEAFEKacRのMS/MSスペクトルは、アセチル化リジン残基を含むyイオン(y2-y5)が42m/z(アセチル基の増分質量)でシフトし、その修飾されたペプチド中の特異的リジン残基を確認したことを明確に示した。
図 1: PTM のワンポットエンリッチメントの一般的なワークフロー。組織(ここでは肝臓)は、SIRT5 KOおよび野生型(WT)マウスから採取され、タンパク質を分解し、トリプシンを消化してペプチドに分解する。ペプチドは、次に、コクシニル-およびアセチル抗体ビーズの組み合わせによる免疫親和性によって濃縮される。並列MSワークフローは、1)全ライセートタンパク質発現変化(タンパク質正常化用)と2)アシル化部位同定(DDA-MS)および部位局在化のための濃縮アシル含有ペプチドの小さなアリコートの両方を測定し、次いで定量(DIA-MS)を測定する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ワンポットワークフローと代替方法の比較(A)ワンポットワークフロー、シリアルPTMエンリッチメント、および2つのシングルPTMエンリッチメントに必要な時間、コスト、および材料の比較。(B) ワンポットワークフロー、単一アセチルリシンPTM濃縮、および単一のスクシニルリジンPTM濃縮とのCVの比較。スピアマン相関分析は、ワンポットワークフローから得られたアシルペプチドピーク領域と、単一PTM濃縮物を比較する:log2ピーク面積の対応するプロット(C)アセチル化部位および(D)コハシニル化部位に対する結果を示す。回帰勾配および相関因子は、個々のパネル14に示されている。2つの独立した生物学的反復が各条件に対して処理された。この図は Basisty ら14から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:リジン残基のアセチル化とコハシ化修飾との間のクロストーク。ミトコンドリア3-ケトアシル-CoAチオラーゼのトリプチペプチドのMS/MSスペクトルは、同じアミノ酸配列を示すが、異なるPtMを有する2つのリジン残基で修飾されている。この図は Basisty ら14から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:アセチル化およびコハシニル化リジン残基の重複およびクロストーク-タンパク質複合体における特異的な例。(A)ベン図2,235アセチル化と2,173コクチル化部位の間の重複を表示します。このうち、943部位はアセチル化およびコハクニル化の両方であった。SIRT5(脱スクシニルラーゼ)ノックアウトマウスから肝臓を分析し、多くの凝視部位を同定した。実際、マウス肝臓で通常観察されるよりも豊富であった(修飾ペプチドは、Q値<0.05で濾過した)。(B) アセチル化部位とコハクニル化部位の両方を含むサブユニットの割合を示すタンパク質複合体 (太字の赤い線は、フィッシャーの正確な検定によって決定された有意性を表す)。(C) ATP合成酵素複合体の図: 赤のタンパク質サブユニットは、アセチル化およびコハシニル化された部位の両方を含むサブユニットを表している。この図は Basisty ら14から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:定量的プロテオミクスソフトウェアは、PTMのペプチド部位局在化を解読する。ペプチドのMS/MS断片化に基づいて、アセチル基が修飾している特異的リジン残基に関する情報を提供することができる。これは、PTMのサイトローカリゼーションに関する貴重な情報を提供するソフトウェアの能力を示しています(A)リジン残渣の修正とPTMサイトのローカリゼーションの2つの可能性:KQYGEAFEKacR(左)とKacQYGEAFEKR(右)。ペプチドのアイソフォームのポテンシャル部位の各々について「確認」および「反論」フラグメントイオンが示されている。この情報に基づいて、スコアの確認と反論スコアが割り当てられ、サンプル中にアイソフォームKQYGEAFEKacRが存在することを確認します。(B) 確認されたアイソフォームに相当する MS/MS スペクトル KQYGEAFEKacR は、アセチル化リジン残基(y2以上)を含むすべてのyイオンが+42 m/zの増分質量を運ぶことを示し、これはアセチル修飾に対応する。観察されたbイオンは、修飾を含まない。(C) y2イオンとy3イオンから生じる豊富なピーク領域を有するイオンクロマトグラム(XIC)を抽出し、いずれも確認したアイソフォームKQYGEAFEKacRのアセチル化部位を構成し、この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、PTM クロストークをより効果的に理解するために、複数の PTM エンリッチメントを同時に行うための新しい手法を記述します。この目的に到達する代替方法は、非常に時間がかかり、高価である傾向があり、11、13を成功させるために大量のタンパク質を必要とします。このプロトコルは、実験の全体的な効率を向上させるために、2つのPTMの抗体結合ビーズに一度にインキュベーションを含むマルチPTM濃縮ワークフローを提示します。この方法はまた、分光ライブラリー生成およびDIA MS取得のためのDDAの使用を含み、フラグメントイオン22、23からの干渉を低減して存在するペプチドを検出および定量する。MSデータベース検索エンジンなどのソフトウェアプログラムは、DDA取得のデータを分析および定量するために使用されますが、定量プロテオミクスソフトウェア24および特定のDIA定量分析ソフトウェア25は、DIA取得によって生成された複雑なスペクトルを解釈するために必要です。
このプロトコルには、注意深く従うべき重要な手順がいくつかあります。プロトコルの主な目的は、複数のPTMを同時に濃縮することであるため、抗体アフィニティエンリッチメントステップ(セクション2)は実験の成功に不可欠です。ビーズに対してワッシュを行う場合、ビーズのどれも誤って吸引されないようにする必要があります。トリプシンで消化する前に尿素濃度を1Mに希釈したことを確認することも必要である(ステップ1.8)。タンパク質可溶化のプロトコルでは8M尿素が早く必要ですが、1Mを超える尿素濃度はトリプシンの酵素活性を阻害します。さらに、プロトコル全体でサンプルのpHを一貫してチェックすることが重要です。これは消化前に特に重要です。サンプルとトリプシン溶液のpHがインキュベーション前に適切に中和されない場合、多くの切断部位が見逃される非効率的な消化をもたらし、ペプチド同定が少なくなる可能性がある。
サンプルを準備する際には、プロトコルに対するいくつかの変更が役立つ場合があります。出発物質の1mgから調達したタンパク質ライセートの場合、各PTMスキャンチューブに設けられた抗体ビーズの4分の1を、費用対効果の高い代替物として使用することができる。より多量の出発物質は、使用される抗体ビーズの量が比例して増加する限り、より良い結果を得ることができます。ワークフローを強化できるもう 1 つの修飾は、トリプシンに加えて別のプロテアーゼでサンプルを消化することです。この修飾は、切断されたペプチドのより多くの変動をもたらし、タンパク質残基のカバレッジを増加させる。必要ではないが、トリプシンは、その高い切断特異性26によるPTM分析に用いられる酵素の1つであることが推奨される。
このプロトコルの制限は、研究されているPTMが14を同時に濃縮するために同様の化学を持つ必要があることです。異なる抗体結合ビーズの手順は、類似の溶媒および溶液を利用して、同様の溶出条件を含む類似の溶媒を利用し、好ましくは同じベンダーからである必要があります。このため、ここで概説する方法は、一例としてアセチル化およびコハシニル化を一貫して使用し、どちらも抗体共役ビーズ(Cellシグナル伝達技術社)を使用する。この方法は理論的には任意の数のPTMに適用できますが、この点でプロトコルの正確な制限を評価するために追加の研究が必要です。さらに、これは抗体ベースの濃縮方法であるため、この方法はPTM部位の相対的な定量しか提供できない。
既存のマルチPTMエンリッチメント方式と比較して、このワークフローは、より実現可能でコスト効率の高い代替手段です。この実験から、この方法の有効性は、個人またはシリアル濃縮などの代替方法と非常によく比較することが観察された。図2Bは、単一PTM濃縮およびシリアルPTM濃縮13と比較して、ワンポット法において、修飾ペプチドピーク領域の中央値CVが実際に減少したことを示す。さらに、アセチル化またはコハクニル化のためのサイトレベルの定量を評価する実験結果を分析した。さらに、スピアマン相関分析(図2C,D)は、ワンポットPTMエンリッチメントがシングルPTMエンリッチメントワークフローと同様に実行されることを実証しました。これはペプチドとフラグメントレベルの相関についても当てはまる。1ポットとシリアルPTM濃縮を比較する際に、3つの相関すべてに対して同じ観測が行われました。
このプロトコルにより、研究者はPTMクロストークに関する魅力的な生物学的洞察を迅速かつ費用対効果の高い方法で行うことができます。ワークフローのDIAコンポーネントは、サイトローカリゼーションに関する情報を提供し、PTMの低サイト占有率などの課題を克服するため、PTMに関する理解を深めることができます。この方法を使用して同時にエンリッチできる PTM の上限を評価するために、フォローアップ実験を行うことができます。このワークフローの将来の改善には、サイトのローカリゼーションとPTMサイト占有の分析をさらに自動化するための、より高度なソフトウェアプラットフォームの開発が含まれる可能性があります。
Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
我々は、バック研究所(1S10 OD016281)におけるTripleTOFシステムに対するNIH共有計装交付金からの支援を認める。この研究は、国立アレルギー・感染症研究所(R01 AI108255からB.S.)と国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(R24 DK085610からエリック・ヴェルディン)によってもサポートされました。R01 DK090242 から エリック・ゲッツマンへ)。X.X.は、国立衛生研究所(NIH助成金T32GM8806、ジュディス・カンピシとリサ・エラービーへの助成金)によって支援され、N.B.はグレン医学研究財団の博士研究員によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
| Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
| Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
| C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
| C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
| Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
| Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
| Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
| Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
| mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
| Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
| PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
| mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
| Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
| Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
| Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
| ProteinPilot 5.0 - 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
| PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
| PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
| Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
| Skyline - 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
| Spectronaut - 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
| Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
| TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
| TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
| Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
| Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
| Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
| ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |
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