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Biology

क्वांटिफिकेशन और साइट स्थानीयकरण के लिए दो पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का एक साथ आत्मीय समृद्धि संवर्धन

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60780
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Buck Institute for Research on Aging

Summary

यह कार्यप्रवाह मात्रात्मक वैश्विक प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए एक साथ कई प्रोटीन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएमएस) के समय और लागत कुशल संवर्धन के प्रदर्शन का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल कई संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ पेप्टाइड-स्तरीय पीटीएम संवर्धन का उपयोग करता है, जिसके बाद पीटीएम क्रॉसटॉक में जैविक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण किया जाता है।

Abstract

प्रोटीन के कई पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) का अध्ययन पीटीएम क्रॉसटॉक को समझने और प्रोटीन फ़ंक्शन में अधिक समग्र अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। मल्टी-पीटीएम संवर्धन अध्ययनों के महत्व के बावजूद, कुछ अध्ययन एक समय में एक से अधिक पीटीएम की जांच करते हैं, आंशिक रूप से पीटीएमएस के कई वैश्विक प्रोटेओमिक विश्लेषण करने के लिए आवश्यक खर्चों, समय और बड़ी प्रोटीन मात्रा के कारण। इस प्रोटोकॉल में विस्तृत "वन-पॉट" आत्मीयता संवर्धन इन बाधाओं को एक साथ पहचान और लाइसिन अवशेषों के साथ पेप्टाइड की मात्रा की अनुमति देकर इन बाधाओं को दूर करता है जिसमें कम मात्रा में एसिटिलेशन और संक्षिप्त ताम्म युक्त नमूना इनपुट. प्रोटोकॉल में SIRT5 नॉकआउट चूहों के माउस यकृत से प्रोटीन लाइसेट की तैयारी, ट्राइप्सिन पाचन का प्रदर्शन, पीटीएमएस के लिए संवर्धन, और डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण (व्यास) कार्यप्रवाह का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण का प्रदर्शन शामिल है। क्योंकि यह कार्यप्रवाह एक साथ एक ही नमूने से दो पीटीएम के संवर्धन के लिए अनुमति देता है, यह बड़ी मात्रा में नमूनों की आवश्यकता के बिना पीटीएम क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए एक व्यावहारिक उपकरण प्रदान करता है, और यह नमूना तैयारकरने, डेटा के लिए आवश्यक समय को बहुत कम कर देता है अधिग्रहण, और विश्लेषण। कार्यप्रवाह का व्यास घटक व्यापक पीटीएम-विशिष्ट जानकारी प्रदान करता है। पीटीएम साइट स्थानीयकरण का अध्ययन करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि डीआईए टुकड़ों आयनों के व्यापक सेट प्रदान करता है जिन्हें विभिन्न पीटीएम स्थानीयकरण आइसोफॉर्म के बीच अंतर करने के लिए गणना रूप से समझा जा सकता है।

Introduction

ट्रांसलेशनल संशोधनों के असंख्य गतिशील रूप से1गतिविधि 1, सिग्नलिंग2और टर्नओवर3,4पर प्रभाव के माध्यम से प्रोटीन और रास्तों को विनियमित करते हैं । उदाहरण के लिए, फॉस्फेटसमूह5के अलावा प्रोटीन किनेस को सक्रिय या निष्क्रिय कर दिया जाता है, और हिस्टोन एसिटिलेशन और अन्य संशोधन क्रोमेटिन संरचना को बदलने और प्रतिलेखन नियामक तंत्र6,7के रूप में काम करने के लिए एक तंत्र प्रदान करते हैं। हाल के वर्षों में, सबूत ों ने इस बात का सबूत दिया है कि कई पीटीएमएस कॉन्सर्ट में काम करते हैं या प्रोटीन फंक्शन या गतिविधि8,9,10,11को विनियमित करने के लिए प्रतिस्पर्धा करते हैं । इसलिए पीटीएम क्रॉसटॉक को समझना पीटीएम रिसर्च की उभरती जरूरत है। हालांकि, पीटीएम साइटों की पहचान करने और निर्धारित करने के लिए अधिकांश उपलब्ध प्रोटेओमिक वर्कफ्लो कई संशोधनों के परस्पर क्रिया के बजाय एकल संशोधनों पर ध्यान केंद्रित करते हैं। वर्णित कार्यप्रवाह विशिष्ट प्रोटीन संशोधन "हॉट-स्पॉट" और लाइसिन अवशेषों से संबंधित है जिन्हें कई अलग-अलग पीटीएमएस द्वारा संशोधित किया जाता है।

वैज्ञानिक समुदाय में एक साथ12पीटीएम का अध्ययन करने के लिए व्यवहार्य तरीकों की आवश्यकता बढ़ रही है . कई प्रकार के पीटीएमएस की साइटों की विश्व स्तर पर पहचान और मात्रा निर्धारित करने के अधिकांश तरीके चुनौतीपूर्ण हैं क्योंकि उच्च लागत और ऊतककी मात्रा12,13की आवश्यकता होती है . न केवल नमूना तैयारी, डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण के मामले में बहु-पीटीएम संवर्धन प्रयोग समय लेने वाले हैं, बल्कि इन अध्ययनों में आमतौर पर प्रोटीन11की बड़ी और अक्सर निषेधात्मक मात्रा की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित कई पीटीएमएस के एक साथ संवर्धन और विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल है, जो इनमें से कई बाधाओं को भी संबोधित करता है और विभिन्न पीटीएमएस14के बीच क्रॉसटॉक का आकलन करने और बड़े पैमाने पर पीटीएम प्रोफाइलिंग और आकलन करने में सक्षम बनाता है। यह एक बर्तन कार्यप्रवाह जैव चिकित्सा शोधकर्ताओं के लिए विश्व स्तर पर कई PTMs प्रोफ़ाइल, सह संशोधित पेप्टाइड्स की पहचान करने और एक कुशल और लागत प्रभावी तरीके से पीटीएम क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए एक व्यावहारिक तरीका रेखांकित करता है14,15।

यहां, इस विधि को माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन एसिलेशन की जांच करके प्रदर्शित किया जाता है, जिसका पहली बार16साल पहले 50 साल से अधिक अध्ययन किया गया था। यह विशेष रूप से लाइसिन एसीटिलेशन17 और संक्षिप्त18पर केंद्रित है, जिसमें प्रोटीन पर इन संशोधनों की सह-घटना और पेप्टाइड स्तर पर सह-संशोधन भी शामिल है। चूंकि अध्ययन एक सिरटुइन 5 (SIRT5) नॉकआउट माउस मॉडल का उपयोग करता है, यह एसीटिलेशन और संक्षिप्तीकरण साइटों के संवर्धन पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चुना गया था । यह निर्णय इसलिए किया गया था क्योंकि संक्षिप्त ीकरण साइटें SIRT5 desuccinylase के लक्ष्य हैं और इस प्रकार KO चूहों में महत्वपूर्ण अपरेगुलेशन दिखाने की उम्मीद है, जिससे उन्हें इस मामले में सबसे प्रासंगिक पीटीएमएस बना दिया गया है। दोनों PTMs जैविक रूप से प्रासंगिक के रूप में हाल ही में Carrico एट अल19द्वारा संक्षेप में कर रहे हैं । सामान्य तौर पर, एसीटिलेशन जीन अभिव्यक्ति और चयापचय पर महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाता है, और दिल के चयापचय और समारोह20को विनियमित करने के लिए संक्षिप्तता की सूचना दी गई है।

वर्णित प्रोटोकॉल प्रोटीन इनपुट सामग्री (जैसे, 1 मिलीग्राम प्रोटीन लाइसेट) की कम मात्रा के साथ किया जा सकता है और नमूना प्रसंस्करण, एमएस अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण के लिए बिताए गए समय को कम करके प्रयोग की कुल अवधि को कम करता है। चित्रा 1में एक कार्यप्रवाह योजनाबद्ध प्रदान किया जाता है। हमने शुरुआती सामग्री की भी कम मात्रा का उपयोग किया है (प्रोटीन लाइसेट के 100 μg तक नीचे, तदनुसार उपयोग किए जाने वाले मोतियों की मात्रा को स्केल करना), जो उम्मीद के अनुसार, पहचाने गए एसिलेटेड पेप्टाइड्स की समग्र उपज को कम करता है; हालांकि, यह अभी भी अत्यधिक मूल्यवान परिणाम और मात्रात्मक एसायटेड पेप्टाइड्स प्रदान करता है।

जबकि तथाकथित टॉप-डाउन या मिडिल-डाउन वर्कफ्लो आमतौर पर प्रोटेलिटिक पाचन दृष्टिकोणों का उपयोग नहीं करते हैं (और इस प्रकार एक प्रोटीन के भीतर कई पीटीएमएस की कनेक्टिविटी बनाए रखते हैं), यह प्रोटोकॉल पीटीएम पहचान और मात्राकरण(चित्रा 1)के लिए अतिरिक्त गहराई और संवेदनशीलता हासिल करने के लिए पेप्टाइड-आधारित आत्मीयता संवर्धन दृष्टिकोण पर केंद्रित है। इसके अलावा, यह पेप्टाइड-केंद्रित कार्यप्रवाह आधुनिक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विधियों का उपयोग करता है, जिसमें 1) डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) का संयोजन स्पेक्ट्रल पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए, और लेबल-मुक्त कार्यप्रवाह में सटीक पीटीएम क्वांटिफिकेशन के लिए 2) डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण (डीआईए) शामिल है।

डीआईए वर्कफ्लो ने नमूना मे/जेड रेंज21के भीतर सभी पेप्टाइड संकेतों को व्यापक रूप से खंडित करके ठेठ डीडीए स्कैन योजनाओं की नमूनाकरण पर काबू पा लिया । साइट स्थानीयकरण के मामले में यह सुविधा भी बेहद फायदेमंद है, क्योंकि पेप्टाइड के भीतर किस विशिष्ट टुकड़े आयनों को संशोधित किया जाता है, इसके बारे में जानकारी हासिल करना आसान है। इसके अलावा, डीआईए वर्कफ्लो समान अग्रदूत आयनों के साथ मामूली पीटीएम-पेप्टाइड आइसोफॉर्म की पहचान और मात्रा की अनुमति देता है। डीआईए विधियां विशिष्ट संबंधित टुकड़ों आयनों के आधार पर पेप्टाइड के भीतर एक विशिष्ट पीटीएम साइट स्थानीयकरण भी निर्धारित कर सकती हैं जिन्हें हर समय व्यापक रूप से मापा जाता है। हालांकि, डीडीए अक्सर "गतिशील बहिष्कार" सुविधाओं का उपयोग करता है जो एक ही अग्रदूत आयन के लिए एमएस/एमएस के कई नमूने को बाहर करते हैं, इस प्रकार मामूली पीटीएम आइसोफॉर्म गायब हो जाते हैं।

यहां वर्णित एक साथ संवर्धन रणनीति आदर्श रूप से अध्ययनों के लिए अनुकूल है जो कई पीटीएम की वैश्विक प्रोफाइलिंग और मात्राकरण से लाभान्वित होगी, पीटीएम क्रॉसटॉक की जांच करेगी, और ट्रांसलेशनल संशोधनों के बाद की गतिशील बातचीत को समझेगी। एक संयुक्त कार्यप्रवाह में कई समृद्ध पीटीएमएस की पहचान का वर्णन किया गया है: वैश्विक, धारावाहिक या पीटीएम के समानांतर संवर्धन जिसमें प्रोटेओलिटिक पेप्टाइड्स होते हैं, या वैकल्पिक रूप से बरकरार प्रोटीन के विश्लेषण से। एसीटिलेशन और संक्षिप्तीकरण के धारावाहिक संवर्धन के साथ सीधी तुलना में, एक बर्तन पद्धति की दक्षता बहुत समान14होने के रूप में स्थापित किया गया था । इन वैकल्पिक प्रोटोकॉल सामग्री और समय शुरू करने की महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता है और निषेधात्मक महंगा हो सकता है । इसके विपरीत, एक बर्तन प्रोटोकॉल बाद के विश्लेषण और पहचान के साथ एक से अधिक पीटीएम के संवर्धन के लिए एक सस्ती और कुशल विधि प्रदान करता है ।

माउस जिगर के ऊतकों SIRT5 नॉकआउट चूहों से प्राप्त कर रहे है और यहां शुरू सामग्री के रूप में उपयोग किया जाता है । यह प्रोटोकॉल विभिन्न ऊतकों या सेल संस्कृति प्रयोगों से प्रोटीन लाइसेट्स के लिए भी किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल ऊतकों या कोशिका संस्कृति छर्रों से प्राप्त प्रोटीन लाइकेट्स पर लागू किया जा सकता है।

Protocol

प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रयोग बक इंस्टीट्यूट इंस्टीट्यूशनल एनिमल रिसर्च कमेटी के दिशा-निर्देशों का पालन करते हैं ।

1. समरूप ऊतक और प्रोटीज के साथ पाचन से प्रोटीन की निकासी

  1. हौसले से 8 एम यूरिया, 50 एमएम ट्राइथेलम्मोनियम बाइकार्बोनेट (टीईबी), 1 माइक्रोएम ट्राइकोस्टेटिन ए (टीएसए), 20 एमएम निकोटीनमाइड, 75 एमएम सोडियम क्लोराइड (एनसीएल), 1x प्रोटीज/फॉस्फेटेस अवरोधक कॉकटेल (पीआईसी) की अंतिम एकाग्रता के लिए लिसिस बफर तैयार करें एचपीएलसी ग्रेड के पानी के साथ।
  2. एक बाँझ स्टील बीड एक 2 मिलीग्राम ट्यूब के लिए एक बीड मिल समरूपता के साथ संगत जोड़ें, तो ऊतक टुकड़ा (मटर के आकार) ट्यूब में जगह है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि बफर ऊतक टुकड़ा को कवर करता है (यदि आवश्यक हो तो अधिक lysis बफर जोड़ें) के लिए लिसिस बफर (500 माइक्रोन) और भंवर जोड़ें। पूर्व-ठंडा एडाप्टर सेट पर ट्यूब रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ट्यूब समरूपके दो एडाप्टर के बीच संतुलित हैं।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिन के लिए 25 हर्ट्ज पर 2x के नमूने होमोजेनाइज़ करें। यदि ऊतक पूरी तरह से समरूप नहीं है, तो ट्यूबों को संक्षेप में स्पिन करें और समरूप लाइसेट को एक हौसले से लेबल वाली 1.5 मिलील ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिर, शेष ऊतक टुकड़े में अतिरिक्त lysis बफर जोड़ें, और 3 मिन प्रत्येक के लिए 25 हर्ट्ज पर समरूपता 2x दोहराएं। समरूपता के दो दौर आम तौर पर ऊतक को तोड़ने के लिए पर्याप्त हैं।
  4. एक ट्वीजर के साथ धातु मनका निकालें। प्रत्येक नमूने के बीच में, एचपीएलसी ग्रेड पानी, एचपीएलसी ग्रेड मेथनॉल, और एचपीएलसी ग्रेड पानी के साथ फिर से ट्वीजर कुल्ला।
  5. यदि समरूपता के दो राउंड लागू किए गए थे और 30 एस ऑन/30 एस ऑफ पर 10 चक्रों के लिए अल्ट्रासोनिकेटर के साथ एक अल्ट्रासोनिकेटर के साथ नमूने और उच्च शक्ति पर 4 डिग्री सेल्सियस के साथ संयोजित किए गए थे।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए 14,000 x ग्राम पर समरूप लाइसेट्स को केंद्रित करने के लिए lysate साफ करने के लिए । सुपरनेटेंट (क्लीयर लिसैट) को एक नई 1.5 मिलीएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, किसी भी वसा परत से बचें जो अलौकिक के शीर्ष पर बैठ सकता है और ट्यूब के तल पर कोई भी मलबा हो सकता है।
  7. एक उचित कमजोर पड़ने के साथ साफ लाइसेट की प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए एक बिकिनोइनिक एसिड (बीसीए) परख प्रदर्शन (उदाहरण के लिए, 1:20 और/या 1:200) । बीसीए के नतीजों के मुताबिक, प्रत्येक नमूने से 1 मिलीग्राम प्रोटीन का बहाना।
  8. 1,400 आरपीएम पर आंदोलन के साथ 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 4.5 एमएम डिथियोथ्रिटॉल (डीटीटी) में प्रोटीन कम करें। इसके बाद, 10 एमएम iodoacetamide (आईएए) में अल्कालेट प्रोटीन 30 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर अंधेरे में ऊष्मायन (दराज या कैबिनेट में जगह) के साथ।
    नोट: वैकल्पिक अभिकर्मकों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे आईएए के बजाय एन-एथिलमालिमिड (एनीएम)।
  9. नमूनों में 50 एमएम टीईबी जोड़ें ताकि एक पीएच पेपर पर नमूने के 2 एम स्पॉट 1 माइक्रोन से नीचे यूरिया एकाग्रता को पतला किया जा सके ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पतला नमूना का पीएच 7.0-8.5 के बीच है। 1:50 (ट्राइप्सिन-टू-प्रोटीन, डब्ल्यूटी/डब्ल्यूटी) के अनुपात में प्रत्येक नमूने में ट्राइप्सिन जोड़ें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस (लगभग 14-16 घंटे) पर आंदोलन के साथ प्रोटीन को पचाएं।
  10. अगले दिन 1% फोरमिक एसिड तक पहुंचने के लिए 10% फोरमिक एसिड के साथ डाइजेस्ट को बुझाएं। भंवर और स्पिन संक्षेप में। पीएच स्ट्रिप्स पर नमूना के स्पॉट 1 μL को सुनिश्चित करने के लिए डाइजेस्ट पीएच = 2-3 है । किसी भी अघुलनशील सामग्री को गोली देने के लिए आरटी में 15 मिन के लिए 1,800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूने।

2. बड़े पैमाने पर ठोस चरण निष्कर्षण के माध्यम से गैर-समृद्ध प्रोटेओलिटिक पेप्टाइड्स का डीसाल्टिंग

  1. C18 रेसिन युक्त कारतूस प्राप्त करें जो 10 मिलीग्राम प्रोटीन तक बांध सकते हैं। इन कारतूस ों को वैक्यूम सक्शन का उपयोग करने के लिए वैक्यूम उपकरण में फिट करें जो निम्नलिखित चरणों में से प्रत्येक के दौरान कारतूस के माध्यम से तरल खींच सकता है। प्रत्येक पेप्टाइड नमूने के लिए एक कारतूस नामित करें।
  2. 19.8% पानी के साथ कारतूस के लिए 0.2% formic एसिड में 80% एसीटोनिट्रिल (ACN) के 800 μL जोड़ें और वैक्यूम सक्शन का उपयोग करने के माध्यम से तरल खींचने के लिए। कारतूस के सूखने से बचते हुए इस चरण को 1x दोहराएं।
  3. फिल्टर के माध्यम से पूरी मात्रा खींचने के लिए वैक्यूम सक्शन के साथ पानी में 0.2% फोरमिक एसिड के 800 माइक्रोन जोड़कर कारतूस की समतुल्य करें। इस 2x को दोहराएं। वैक्यूम सक्शन के साथ कारतूस पर पेप्टाइड्स लोड करें। वैक्यूम सक्शन के तहत पानी में 0.2% फोरिक एसिड के 800 माइक्रोन के साथ पेप्टाइड्स 2x धोएं।
  4. अंतिम चरण में पेप्टाइड को इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक कारतूस के नीचे 1.5 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूबों की व्यवस्था करें। कारतूस से वैक्यूम सक्शन एल्ट पेप्टाइड्स के तहत, पहले 0.2% फोरिक एसिड और 19.8% पानी में 800 माइक्रोन के 800 माइक्रोन के साथ, फिर एक ही समाधान के 400 माइक्रोन के साथ। डिसाल्टेड पेप्टाइड नमूनों को पूरी तरह से वैक्यूम एकाग्र (2-3 एच) में सुखा लें।

3. इम्यूनोफिनिटी मोतियों के साथ कश्मीर-एसिटिलेटेड और कश्मीर-संक्षिप्त पेप्टाइड्स का एक साथ संवर्धन

  1. ठंड 1x इम्यूनो-एफ़िनिटी शुद्धि (आईएपी) बफर के 1.4 मिलील में सूखे पेप्टाइड्स को फिर से निलंबित करें। भंवर मिश्रण और ~ 7 के एक पीएच सुनिश्चित करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूने। एक छोटी सी गोली दिखाई दे सकती है।
  2. एंटीबॉडी-मोतियों को तैयार करते समय बर्फ पर पेप्टाइड्स को अलग सेट करें। कश्मीर-एसीटाइल और कश्मीर-सुसिनाइल एंटीबॉडी बीड घोल (मात्रा: 100 माइक्रोन प्रति ट्यूब) की ट्यूब के लिए, ठंड 1x फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) का 1 एमएल जोड़ें और पाइपटिंग द्वारा मिलाएं। एक नया 1.5 mL ट्यूब के लिए पूरे समाधान हस्तांतरण और आरटी में 30 एस के लिए एक लघु अपकेंद्रित्र में स्पिन।
  3. किसी भी मोतियों को बंद करने से बचने के लिए देखभाल करते हुए पीबीएस को एस्पिरेट करें। ठंड 1x पीबीएस के 1 मिलील के साथ फिर से धोने से धोने 3x दोहराएं, आरटी में 30 एस के लिए अपकेंद्री और पीबीएस बंद aspirating ।
  4. पीबीएस के लगभग 440 माइक्रोन में मोतियों को फिर से निलंबित करें। प्रत्येक पीटीएम ट्यूब (निर्माता द्वारा प्रदान की गई 100 माइक्रोन) में मोतियों की संख्या का एक चौथाई उपयोग एक-बर्तन संवर्धन (कश्मीर-एसीटाइल और कश्मीर-सुसिनाइल एंटीबॉडी मोतियों दोनों के लिए प्रत्येक स्थिर एंटीबॉडी के लगभग 62.5 माइक्रोन) के लिए किया जाता है। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए कई बार मोतियों को पिपेट करें। एसीटाइल-लिसीन एंटीबॉडी मोतियों के 100 माइक्रोन निकालें और 200 माइक्रोन प्रीकट युक्तियों के साथ एक ट्यूब में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करें कि मास्टर मिश्रण लगातार अच्छी तरह से मिश्रित रहता है।
  5. प्रत्येक ट्यूब में एसीटाइल-लिसिन एंटीबॉडी और संक्षिप्त-lysine एंटीबॉडी के बराबर भागों तक पहुंचने के लिए ट्यूब के लिए संक्षिप्त-lysine एंटीबॉडी मोतियों के 100 माइक्रोन को हटाकर संक्षिप्त-lysine एंटीबॉडी मोतियों के साथ भी ऐसा ही करें। एक लघु अपकेंद्रित्र में 30 एस के लिए नीचे स्पिन और जेल लोडर टिप के साथ मीडिया से aspirate (मोती सफेद हो जाएगा) ।
    नोट: प्रत्येक ट्यूब के नीचे एक समान बीनने गोली होनी चाहिए।
  6. धोया मोती पर सीधे पुनः निलंबित पेप्टाइड पिपेट। किसी भी छर्रों से बचने के लिए सावधान रहें (मोतियों को सुखाने से बचने के लिए जल्दी जोड़ें)। आंदोलन के साथ रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर मोतियों के साथ पेप्टाइड्स इनक्यूबेट करें।

4. एंटीबॉडी मोतियों के लिए बाध्य पेप्टाइड्स का एल्यूशन

  1. पेप्टाइड नमूनों को 30 एस के लिए 2,000 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। अनबाउंड पेप्टाइड्स वाले अधिष्णक को हटा दें और यदि वांछित हो तो भविष्य के प्रयोगों के लिए सहेजें। 5x को उलटकर धोने और मिलाने के लिए मोतियों में ठंड 1x आईएपी बफर का 1 मिलील जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 2,000 x ग्राम पर स्पिन करें। आईएपी समाधान से एस्पिरेट और कुल दो वॉश के लिए आईएपी वॉश स्टेप 1x दोहराएं।
  2. मोतियों में ठंडे एचपीएलसी पानी का 1 मिलील जोड़ें और 5x को उलटकर मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 2,000 x ग्राम पर स्पिन करें। पानी से एस्पिरेट। कुल तीन वॉश के लिए दो बार वॉटर वॉश स्टेप दोहराएं। ट्यूब के नीचे किसी भी शेष पानी को इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 2,000 x ग्राम पर एक अतिरिक्त समय स्पिन करें। फ्लैट-इत्तला जेल लोडिंग सुझावों के साथ एकत्र किए गए किसी भी अतिरिक्त पानी को एस्पिरेट करें। मोतियों को एस्पिरेटिंग करने से बचने के लिए सावधान रहें।
  3. मोतियों में पानी में 0.15% ट्राइफ्लोरोसेटिक एसिड के 55 माइक्रोन जोड़ें। आरटी में 10 मिन के लिए मोतियों को इनक्यूबेट करें जबकि कभी-कभी ट्यूब के नीचे को मिक्स करने के लिए टैप करते हैं । एक लघु अपकेंद्रित्र में 30 एस के लिए आरटी पर मोती स्पिन । लुटे हुए पेप्टाइड्स को हटा दें और फ्लैट-इत्तला देने वाले जेल-लोडिंग टिप का उपयोग करके अलग सेट करें।
  4. मोतियों में पानी में 0.15% ट्राइफ्लोरोसेटिक एसिड के 45 माइक्रोन जोड़ें। आरटी में 10 मिन के लिए इनक्यूबेट जबकि ट्यूब के नीचे कभी-कभी मिश्रण करने के लिए टैप करते हैं। एक लघु अपकेंद्रित्र में 30 एस के लिए आरटी पर मोती स्पिन । फ्लैट-इत्तला दे दी जेल-लोडिंग टिप का उपयोग करके दूसरा एल्यूशन निकालें और पहले एल्यूशन के साथ गठबंधन करें।
  5. आरटी पर 5 मिन के लिए 12,000 x ग्राम पर संयुक्त चमकदार पेप्टाइड्स स्पिन किसी भी मोतियों कि पर ले गोली । पेप्टाइड्स नमूना समाधान को एक नए 500 माइक्रोन ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

5. समृद्ध पेप्टाइड्स का डिसाल्टिंग

नोट: सी18 रेसिन युक्त टिप के लिए इष्टतम बाध्यकारी के लिए नमूनों का पीएच 4 से कम होना चाहिए। टिप को नियंत्रित करने के लिए सी18 राल के 0.6 माइक्रोन युक्त 10 माइक्रोन पिपेट टिप और 10 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करें।

  1. टिप में एसीटोनिट्रिल के 10 μl पाइपिंग द्वारा C18 टिप पूर्व गीला । कचरे में एसीटोनिट्रिल बांटें। इस कदम को दो बार और दोहराएं।
  2. पानी में 0.2% फोरमिक एसिड के 10 माइक्रोन के साथ 3x धोकर टिप को समतुल्य करें। प्रत्येक समतुल्यता के बाद समाधान को कचरे में बांटें।
  3. टिप के साथ समृद्ध पेप्टाइड नमूने को लगातार पाइपिंग और वितरण करके टिप पर नमूने से पेप्टाइड्स लोड करें। पिपेट अप और नीचे बार-बार कम से कम 20x और टिप से शेष समाधान बांटना।
  4. पानी में 0.2% फोरमिक एसिड के 10 μL के साथ बाउंड पेप्टाइड युक्त टिप धोएं। कचरे में समाधान बांटें। इस चरण को 9x दोहराएं।
  5. एक नई ट्यूब में Elute पेप्टाइड्स 0.2% formic एसिड, 50% एसीटोनिट्रिल, और 49.8% पानी युक्त एक एल्यूशन बफर के 10 μL का उपयोग कर। बार-बार नई ट्यूब 15x के भीतर समाधान के 10 μL को पिपेट और वितरित करें। इस चरण को एल्यूशन बफर के अतिरिक्त 10 माइक्रोन के साथ दोहराएं, बार-बार पिछले एलुशन के रूप में एक ही ट्यूब में पाइपिंग करें।
  6. वैक्यूम कॉन्ट्रेटर (लगभग 20 00) में पूरी तरह से ड्राई पेप्टाइड्स। सूखे पेप्टाइड्स को पानी में 0.2% फोरिक एसिड की उचित मात्रा में फिर से निलंबित करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

6. डीडीए और डीआईए का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण

नोट: डीडीए और व्यास एलसी-एमएस/एमएस विधियों के साथ नमूनों का विश्लेषण करें, जिन्हें उपलब्ध मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक साधन के आधार पर समायोजित किया जा सकता है । यहां, नमूनों का विश्लेषण नैनो-एलसीडी 2डी एचपीएलसी प्रणाली का उपयोग करके एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ किया गया था।

  1. एक चिप आधारित मंच एचपीएलसी प्रणाली के साथ संयुक्त एक एचपीएलसी प्रणाली का उपयोग करें सीधे एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़े (कई एलसी-एमएस विन्यास और सिस्टम का भी उपयोग किया जा सकता है)।
  2. रिवर्स-फेज एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस का उपयोग करनमूनों का विश्लेषण
    1. इंजेक्शन के बाद, पेप्टाइड मिश्रण को C18 पूर्व-कॉलम चिप पर स्थानांतरित करें और 10 मिन के लिए 2 μL/मिन में मोबाइल चरण ए के साथ धोकर पेप्टाइड्स को डिसाल्ट करें। फिर, पेप्टाइड्स को एक विश्लेषणात्मक कॉलम में स्थानांतरित करें और मोबाइल चरणों ए और बी विशेष रूप से 2-3 एच ग्रेडिएंट के साथ 300 एनएम/मिन की प्रवाह दर पर एल्यूट करें, 80 से अधिक 5% मोबाइल चरण बी से 35% मोबाइल चरण बी तक रैखिक ढाल का उपयोग करें।
    2. इसके बाद, मोबाइल चरण बी को 5 मिन से अधिक 80% तक रैंप करें, फिर 25 मिन पुनः संतुलन के लिए 5% बी पर लौटने से पहले 8 0% बी के लिए 80% बी पर पकड़ें।
  3. डीडीए के लिए एक एमएस साधन विधि का निर्माण करें और निम्नलिखित उपकरण स्कैन प्रयोगों को परिभाषित करें
    1. प्रयोग 1: MS1 अग्रदूत आयन एम/जेड 400-1,500 से स्कैन (२५० एमएस का संचय समय) । प्रभारी राज्यों के आयनों के लिए एमएस/एमएस स्कैन को ट्रिगर करने के लिए तीव्रता सीमा निर्धारित करें 2-5 से २०० मायने रखता है । अग्रदूत आयनों के गतिशील बहिष्कार को 60 एस तक सेट करें।
    2. प्रयोग 2: एमएस/एमएस उत्पाद आयन स्कैन एम/जेड 100-1,500 से एमएस 2 स्कैन रेंज (प्रत्येक 30-उत्पाद आयन स्कैन प्रति चक्र प्रति 100 एमएस का संचय समय)। सीईएस = 5 में फैली टकराव ऊर्जा को सेट करें, फिर"उच्च संवेदनशीलता उत्पाद आयन स्कैन मोड"का चयन करें।
      नोट: डीडीए विधि प्रत्येक सर्वेक्षण MS1 प्रति चक्र स्कैन के बाद 30 सबसे प्रचुर मात्रा में अग्रदूत आयनों के लिए एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा प्राप्त करेगा, और कुल चक्र समय ~3.3 एस डीडीए अधिग्रहण होगा जिसका उपयोग धारा 7 में वर्णित स्पेक्ट्रल पुस्तकालयों के निर्माण के लिए किया जाएगा।
  4. व्यास के लिए एक एमएस साधन विधि का निर्माण और निम्नलिखित साधन स्कैन प्रयोगों को परिभाषित करना।
    1. प्रयोग 1: एम/जेड 400-1,250 (250 एमएस का संचय समय) से MS1 अग्रदूत आयन स्कैन करें।
    2. प्रयोग 2: एम/जेड 100-1,500 (प्रति चक्र प्रत्येक उत्पाद आयन स्कैन) से एमएस2 स्कैन रेंज के साथ 64 चर स्वात खंडों के लिए एमएस/एमएस उत्पाद आयन स्कैन करें। सीईएस = 10 में फैली टकराव ऊर्जा को सेट करें, फिर"उच्च संवेदनशीलता उत्पाद आयन स्कैन मोड"का चयन करें।
    3. 64 चर खिड़की व्यास/ संक्षेप में, इस अधिग्रहण में, टक्कर सेल के माध्यम से एक संकीर्ण द्रव्यमान सीमा का प्रसारण करने वाले Q1 क्वाड्रपोल के बजाय, चर खिड़की की चौड़ाई (5-90 मीटर/जेड) की एक व्यापक खिड़की पूर्ण द्रव्यमान सीमा (एम/जेड 400-1,250 से अधिक 64 SWATH खंडों के साथ वृद्धिशील चरणों में पारित की जाती है, प्रत्येक 45 एमएस संचय समय के साथ, 3.2 एस के चक्र समय का परिणाम है, जिसमें एक एमएस 1 एस शामिल है 250 एमएस संचय समय के साथ)।
      नोट: चर खिड़की चौड़ाई ठेठ MS1 आयन वर्तमान की जटिलता के अनुसार समायोजित किया जाता है एक निश्चित एम/जेड रेंज के भीतर मनाया एक चर खिड़की कैलकुलेटर एल्गोरिथ्म22 का उपयोग कर (अधिक संकीर्ण खिड़कियों "व्यस्त" एम/जेड पर्वतमाला में चुना जाता है, एम में व्यापक खिड़कियां/ अन्य एमएस इंस्ट्रूमेंट प्लेटफार्मों पर, अन्य डीआईए विंडो रणनीतियों को लागू किया जा सकता है।

7. डेटा विश्लेषण

नोट: कुछ डेटा विश्लेषण सेटिंग्स को बदल कर विशिष्ट प्रयोग के अनुरूप होना चाहिए. उदाहरण के लिए, चयनित प्रोटीन डेटाबेस (फास्टा फ़ाइल) उन प्रजातियों पर निर्भर करता है जिनसे नमूना तैयार किया गया था (यहां, मस मस्कुलस)। नीचे, एसिटिलेटेड और संक्षिप्त पेप्टाइड्स के लिए समृद्ध माउस नमूनों के लिए डेटा विश्लेषण का वर्णन किया गया है।

  1. डीडीए अधिग्रहण का विश्लेषण करने के लिए एमएस डेटाबेस सर्च इंजन का उपयोग करें। इस प्रकार एक डेटाबेस खोज इंजन विधि बनाएं:
    1. नमूना विवरण मापदंडों के लिए: नमूना प्रकार के तहत"पहचान"का चयन करें, "साइस्टीन अल्किलेशन" के तहत"आयोडोसेटिक एसिड"का चयन करें, "पाचन" के तहत"ट्राइप्सिन"का चयन करें (लाइसाइन और आर्जिनिन में सी-टर्मिनल दरार मानते हुए), विशेष कारकों के तहत इंस्ट्रूमेंट के तहत"ट्रिपलओएफ 6600"का चयन करें, विशेष कारकों के तहत, विशेष कारकों के तहत, उपकरण के तहत "ट्रिपलओएफ 6600" का चयन करें, विशेष कारकों के तहत, एसिटाइलेशन जोर और सुच्चीनि संवर्धनकी जांच करें और मस्कुलस का चयन करें।
    2. विशिष्ट प्रसंस्करण मापदंडों के लिए: आईडी फोकस के तहत"जैविक संशोधन"का चयन करें, डेटाबेस के तहत"स्विसप्रोट"का चयन करें, खोज प्रयास के तहत"पूरी आईडी"देखें, "पता लगाया प्रोटीन दहलीज" के तहत"0.05 (10%)का चयन करें, और "परिणाम गुणवत्ता" के तहत"भागो झूठी डिस्कवरी दर विश्लेषण"की जांच करें। सर्च इंजन विधि को सहेजें और उत्पन्न विधि का उपयोग करके डेटाबेस खोज इंजन द्वारा प्रसंस्करण के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक कच्ची फाइलें सबमिट करें।
      नोट: एक पुनरावर्तक प्रक्रिया में, सभी एमएस और एमएस/एमएस स्कैन प्रारंभिक एनोटेशन और परिणामों के आधार पर खोज इंजन द्वारा स्वचालित रूप से पुनः कैलिब्रेट किए जाते हैं।
  2. खोज के पूरा होने पर"निर्यात पेप्टाइड सारांश"पर क्लिक करें और एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर (जैसे, एक्सेल; झूठी खोज दर [एफडीआर] 1%)
  3. "पेप्टाइड सारांश"स्प्रेडशीट फ़ाइल में, सभी पेप्टाइड्स के लिए फ़िल्टर करें जिनमें पीटीएम एनोटेशन"एसीटिलेशन"और"संक्षिप्तीकरण"संशोधन कॉलम में विशेष रूप से एसाइटेड पेप्टाइड्स और उनके संबंधित प्रोटीन पेश करने के लिए परिणाम रिपोर्ट उत्पन्न करने के लिए शामिल हैं।
  4. डीआईए कच्ची फाइल और आगे सापेक्ष मात्रा को संसाधित करने के लिए एमएस/एमएस स्पेक्ट्रल पुस्तकालयों का निर्माण करने के लिए, व्यास मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें । 'लाइब्रेरी'टैब का चयन करें, फिर (पृष्ठ के नीचे) क्लिक करें"डाटाबेस सर्च इंजन"से'जेनरेट स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी'और डेटाबेस सर्च इंजन एफडीआर रिपोर्ट (*FDR.xlsx फ़ाइल) खोलें, जो डीडीए रॉ फाइल डेटाबेस खोज प्रक्रिया के हिस्से के रूप में स्वचालित रूप से उत्पन्न हो गई थी। इसके बाद'नेक्स्ट'पर क्लिक करें और'लाइब्रेरीसेटिंग्स स्कीमा'और'नेक्स्ट'का चयन करें। डेटाबेस के रूप में'Uniprot_mouse_proteome'का चयन करें, फिर जीन एनोटेशन (ऑन्टोलॉजी) फ़ाइल के रूप में"नेक्स्ट"और'goa_mouse'पर क्लिक करें। अंत में, क्लिक करें"खत्म",और स्पेक्ट्रल पुस्तकालय उत्पन्न किया जाएगा।
    नोट: theDDA कच्चे डेटा फ़ाइलों से एसिटिटेड और संक्षिप्त पेप्टाइड्स के बारे में जानकारी, MS1 से अग्रदूत आयन स्कैन, और MS2 से टुकड़ा आयन स्कैन स्पेक्ट्रल पुस्तकालयों में शामिल किया जाएगा (इसमें प्रतिधारण समय, एमएस/एमएस विखंडन पैटर्न आदि शामिल हैं)।
  5. एसिटिलेशन और संक्षिप्तीकरण के स्तर के सापेक्ष मात्रा करण करने के लिए व्यास मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और उम्मीदवार पीटीएम युक्त पेप्टाइड्स की स्प्रेडशीट बनाएं जिनका उपयोग आगे डेटा विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
    1. पीटीएम युक्त पेप्टाइड्स का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करने के लिए व्यास मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलते हैं, टेम्पलेट विश्लेषण स्कीमा का उपयोग करें। टेम्पलेट स्कीमा सॉफ्टवेयर में"सेटिंग्स पर्सपेक्टिव"विकल्प का चयन करके उपलब्ध है। "व्यासविश्लेषण"। "बीजीएस पीटीएमएस"(प्रयोग के आधार पर या तो महत्वपूर्ण या विरल)।
      नोट: व्यास मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर में बीजीएस पीटीएम विश्लेषण टेम्पलेट का उपयोग करने के बजाय, सभी पीटीएम-विशिष्ट सेटिंग्स को इन निर्देशों का पालन करते हुए मैन्युअल रूप से भी स्थापित किया जा सकता है: 1)"पहचान"के तहत,"पीटीएम स्थानीयकरण"(संभावना कटऑफ = 0.75); 2)"क्वांटिफिकेशन"में ,"माइनर पेप्टाइड ग्रुपिंग"का चयन करें । "संशोधितअनुक्रम"; और 3)"पोस्ट एनालिसिस"के तहत ,"अंतर बहुतायत समूह"का चयन करें । "माइनरग्रुप"(क्वांटिफिकेशन सेटिंग्स) । ये सेटिंग्स पीटीएम स्थानीयकरण सुविधा को सक्रिय करेंगी ताकि संशोधित पेप्टाइड्स को व्यक्तिगत प्रविष्टियों के रूप में सूचीबद्ध किया जा सके और पेप्टाइड स्तर पर अंतर विश्लेषण किया जा सके।
    2. क्वांटिफिकेशन एनालिसिस शुरू करने के लिए'पाइपलाइन'टैब का चयन करें, फिर क्लिक करें"फ़ाइल से एक व्यास विश्लेषण स्थापितकरें", सापेक्ष परिमाणीकरण के लिए ब्याज की एमएस व्यास कच्ची फाइलें खोलें। "असाइन स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी"का चयन करें और ऊपर बनाई गई लाइब्रेरी का चयन करें, क्लिक करें"लोड"। "अगला"। 'बीजीएस पीटीएमएस'एनालिसिस स्कीमा का चयन करें और क्लिक करें"नेक्स्ट"। उपयुक्त डाटाबेस FASTA फ़ाइल"Uniprot_mouse_proteome"का चयन करें । "अगला"। शर्त सेट-अप को परिभाषित करें, जो नमूनों को विभिन्न शर्तों को असाइन करता है, और क्लिक करें"अगला"। जीन एनोटेशन (ऑन्टोलॉजी) फ़ाइल के रूप में"goa_mouse"का चयन करें और क्लिक करें"अगला"। विश्लेषण अवलोकन (प्रयोग सेट-अप का सारांश) की समीक्षा करें और"आउटपुट निर्देशिका"का चयन करें। "खत्म"। अंत में लेबल-फ्री क्वांटिटेटिव एनालिसिस करने के लिए'रन पाइपलाइन'पर क्लिक करें।
      नोट: व्यास मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर में सांख्यिकीय मॉड्यूल स्वचालित रूप से एफडीआर विश्लेषण करते हैं, विभिन्न स्थितियों की तुलना में गर्मी के नक्शे और ज्वालामुखी भूखंड उत्पन्न करते हैं, पहचाने गए और मात्रानिर्धारित पेप्टाइड्स और प्रोटीन की सूची उत्पन्न करते हैं, और प्रदान करते हैं विभिन्न स्थितियों की तुलना में सापेक्ष गुना परिवर्तनों के साथ-साथ क्यू-मान।
  6. एक विकल्प के रूप में, एसीटिलेशन और संक्षिप्तीकरण साइटों के लिए निकाले गए शिखर क्षेत्रों का निर्यात करने के बाद डेटा प्रसंस्करण और सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए व्यास डेटासेट के हस्तक्षेप हटाने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

8. संशोधित पेप्टाइड्स का डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और पीटीएम साइट स्थानीयकरण का मूल्यांकन

  1. एक उत्पन्न व्यास मात्रात्मक विश्लेषण खोलने के लिए"विश्लेषण"टैब का चयन करें जिसके बाद"मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रयोग लोडकरें" (एक सहेजे गए प्रयोग से * खोलना। स्ने फ़ाइल)। * पर नेविगेट करें। SNE परिणाम फ़ाइल और चयन करें"खुला"।
  2. बाएं पैनल में, सभी 64 कटी हुई खंडों का विस्तार और कल्पना करने के लिए शीर्ष से तीसरे कच्चे डेटा *.wiff फ़ाइल के बाईं ओर तीर पर क्लिक करें। विशिष्ट खंड का विस्तार करने और इस जन सीमा के लिए पहचाने गए संशोधित पेप्टाइड्स को प्रदर्शित करने के लिए सेगमेंट [428.7-437.3] के बाईं ओर तीर पर क्लिक करें। त्रिपाले पर क्लिक करें पेप्टाइड KQYGEAFEK [Acetyl]R.
    नोट: डिफ़ॉल्ट रूप से, सही ऊपरी पैनल आम तौर पर MS2 XIC प्रदर्शित करता है, और निचले पैनल MS1 आइसोटोप लिफाफा XIC प्रदर्शित करता है
    1. ऊपरी पैनल में,"पीटीएम स्थानीयकरण प्लॉट"का चयन करें। निचले पैनल में,"पीटीएम स्थानीयकरण प्लॉट"का चयन करें।
    2. पीटीएम स्थानीयकरण प्लॉट में, 18.32 के कुल पीटीएम स्थानीयकरण स्कोर के साथ शीर्ष पेप्टाइड अनुक्रम"KQYGEAFEK [Acetyl]R"का चयन करें। देखने का विस्तार करने और पुष्टि और आयनों का खंडन करने के लिए बाईं ओर तीर पर क्लिक करें । "पुष्टिआयनों"के बगल में तीर पर क्लिक करें, तो आयन का चयन करें"y3 [+ 42]"उस विशेष आयन को उजागर करने के लिए, जो पुष्टि करता है कि एसिटिलेशन साइट पेप्टाइड अनुक्रम के K2 पर स्थित है ।
    3. पीटीएम स्थानीयकरण प्लॉट में 1 के कुल (बहुत कम) पीटीएम स्थानीयकरण स्कोर के साथ दूसरे पेप्टाइड अनुक्रम"K [Acetyl]QYGEAFEKR"का चयन करें। देखने का विस्तार करने और पुष्टि और आयनों का खंडन करने के लिए बाईं ओर तीर पर क्लिक करें । "पुष्टिआयनों"के बगल में तीर पर क्लिक करें, तो'खंडन आयनों'के बगल में तीर पर, तो कल्पना और निकाले गए आयन क्रोम्टोग्राम और एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा(चित्र 5)का आकलन करने के लिए कुछ टुकड़ा आयनों का चयन करें।
      नोट: सौंपा PTM स्थानीयकरण स्कोर और दृश्य निरीक्षण से संकेत मिलता है कि सही PTM isomer KQYGEAFEK [Acetyl] आर है, जबकि कोई या ंयूनतम सबूत अंय संभव PTM isomer कश्मीर [Acetyl] QYGEAFEKR के लिए मौजूद है ।

Representative Results

चित्रा 1 कार्यप्रवाह के एक सामान्य आरेख को दिखाता है, जिसमें माउस यकृत से ऊतक की कटाई करना, ट्राइप्सिन के साथ प्रोटीन लाइसेट को पचाने के लिए 1 मिलीग्राम प्रोटीन का उपयोग करना, एंटीबॉडी-कंजुगेटेड मोतियों के साथ पेप्टाइड्स को इनक्यूबेट करना, एमएस पर नमूने प्राप्त करना, और अंत में विभिन्न मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर पैकेज (अकादमिक और वाणिज्यिक) का उपयोग करके डेटा का व्यास/स्वाथ विश्लेषण करना शामिल है।

चित्रा 2ए से पता चलता है कि वर्तमान में मल्टी-पीटीएम संवर्धन अध्ययनों के लिए उपयोग किए जा रहे वैकल्पिक तरीकों की तुलना में कार्यप्रवाह की समयरेखा और नमूना और प्रोटीन की मात्रा कैसे आवश्यक है। एक बर्तन विधि आधे में ज्यादा समय के रूप में और इन वैकल्पिक तरीकों के रूप में नमूनों की आधी संख्या के साथ किया जा सकता है । दो सिंगल-पीटीएम संवर्धन विधि की तुलना में, वन-पॉट प्रोटोकॉल में प्रोटीन की आधी मात्रा की भी आवश्यकता होती है।

इस प्रोटोकॉल को एक व्यवहार्य और लागत प्रभावी विकल्प दिखाया गया है । चित्रा 2बी से पता चलता है कि संशोधित पेप्टाइड क्षेत्रों के लिए भिन्नता (सीवी) का औसत गुणांक एकल-पीटीएम और धारावाहिक-पीटीएम संवर्धन की तुलना में वन-पॉट विधि में कम था। चित्रा 2सी, डी से पता चलता है कि, एक बर्तन पीटीएम और एकल-पीटीएम संवर्धन विधियों की तुलना करते समय, दो संशोधनों के लिए साइट-स्तर के क्वांटिफिकेशन के सहसंबंधों के बीच कोई उल्लेखनीय अंतर स्पष्ट नहीं था। यह पेप्टाइड स्तर और खंड स्तर के सहसंबंधों के लिए भी सच था । एक बर्तन और धारावाहिक-पीटीएम संवर्धन की तुलना करते समय सभी तीन सहसंबंधों के लिए एक ही अवलोकन आयोजित किया गया । सभी अंतर्निहित एमएस कच्चे डेटा और प्रोसेस्ड एक्सेल परिणाम शीट बेसस्टेएट अल14 द्वारा हाल ही में एक रिपोर्ट से जुड़े उपलब्ध हैं और MassIVE (MSV000081906) और ProteomeXchange (PXD008640) से डाउनलोड किया जा सकता है ।

सामान्य तौर पर, जबकि एंटीबॉडी संवर्धन रणनीतियां कुछ सीमाएं दिखा सकती हैं, जैसे संभावित एपिटोप ऑक्क्लूजन या सीमित विशिष्टता, इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी स्वतंत्र रूप से उत्पन्न क्लोन के मिश्रण हैं और इस प्रकार व्यापक श्रेणियां प्रदान करते हैं विशिष्टताएं।

प्रायोगिक परिणाम पीटीएम क्रॉसटॉक का पता लगाने और आकलन करने की संभावना को दस्तावेज करते हैं। चित्रा 3 एक सफल संवर्धन से डेटा प्रदर्शित करता है और पीटीएम क्रॉसटॉक की कल्पना करने वाले कई और अलग-अलग एसिल संशोधनों वाले पेप्टाइड के लिए एक उदाहरण दिखाता है। चित्रा 3ए एक पेप्टाइड दिखाता है जो एक लाइसेन अवशेषों पर एसिटाइटेड होता है और दूसरे पर संक्षिप्त होता है, और चित्रा 3बी दोनों lysines पर एक ही पेप्टाइड को दिखाता है। यह दर्शाता है कि एक ही lysine अवशेष दोनों acylation समूहों के साथ संशोधित किया जा सकता है, और वहां उस साइट पर होने वाली क्रॉसटॉक की संभावना है । चित्रा 4 दोनों संशोधनों को ले जाने के लिए धारा7.1-7.3 में वर्णित लीसिन अवशेषों की संख्या को प्रदर्शित करता है, जो संभावित पीटीएम क्रॉसटॉक की ओर भी इशारा करता है।

जैसा कि चित्रा 5 दर्शाता है, मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर के साथ डीआईए पीटीएम डेटासेट प्रसंस्करण हमें यह इंगित करने की अनुमति देता है कि कौन से विशिष्ट अवशेषों को संशोधित किया जाता है। यह साइट स्थानीयकरण के रूप में जाना जाने वाला एक अवधारणा है, जो संभावित पीटीएम क्रॉसटॉक के निर्धारण के लिए किसी भी विश्लेषण के लिए एक आवश्यक कदम है। चित्रा 5 प्रत्येक के लिए पुष्टि और खंडन आयनों के साथ दो संभावित आइसोफॉर्म प्रदर्शित करता है जिसे 8.1-8.3 (विशेष रूप से चरण 8.3.2 और 8.3.3) वर्गों में वर्णित किया जा सकता है और मूल्यांकन किया जा सकता है। इस जानकारी के आधार पर हम आत्मविश्वास से पहचान पाए कि मूल नमूने में दो आइसोफॉर्म में से कौन सा मौजूद था। पुष्टि की आइसोफॉर्म KQYGEAFEKacR के एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि y आयनों (y2-y5)एसिटिलेटेड lysine अवशेषों, जो ४२ मीटर/z (एक acetyl समूह के वेतन वृद्धि द्रव्यमान) द्वारा स्थानांतरित कर दिया, पेप्टाइड में विशिष्ट lysine अवशेषों की पुष्टि की है कि संशोधित किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: पीटीएमएस के एक बर्तन संवर्धन के लिए विशिष्ट कार्यप्रवाह। ऊतक (यहां, यकृत) SIRT5 KO और जंगली प्रकार (WT) चूहों से काटा जाता है, और प्रोटीन lysed, पेप्टाइड्स में पचा, और desalted हैं । पेप्टाइड्स तब संक्षिप्त और एसीटाइल-एंटीबॉडी मोतियों के संयोजन के साथ इम्यूनोफिनिटी से समृद्ध होते हैं। समानांतर एमएस वर्कफ्लो दोनों को मापते हैं 1) पूरे लाइसेट प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन (प्रोटीन सामान्यीकरण के लिए) और 2) समृद्ध acyl युक्त पेप्टाइड्स के लिए एसिल-युक्त पेप्टाइड एसिलेशन साइट पहचान (डीडीए-एमएस) और साइट स्थानीयकरण के लिए, इसके बाद क्वाटिफिकेशन (डीआईए-एमएस) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: वैकल्पिक तरीकों के साथ एक बर्तन कार्यप्रवाह की तुलना। (A)वन-पॉट वर्कफ्लो, धारावाहिक-पीटीएम संवर्धन, और दो एकल-पीटीएम संवर्धन ों के लिए आवश्यक समय, लागत और सामग्रियों की तुलना। (ख)वन-पॉट वर्कफ्लो, सिंगल एसिटाइल-लिसिन पीटीएम संवर्धन, और एकल संक्षिप्त-lysine पीटीएम संवर्धन के बीच सीवी की तुलना । स्पीयरमैन सहसंबंध विश्लेषण एक बर्तन कार्यप्रवाह से प्राप्त acyl पेप्टाइड पीक क्षेत्रों की तुलना, और एकल-पीटीएम संवर्धन: लॉग2 पीक क्षेत्र के इसी भूखंड(सी)एसीटिलेशन साइटों और(डी)succinylation साइटों के लिए परिणाम । प्रतिगमन ढलानों और सहसंबंध कारकों को14व्यक्तिगत पैनलों में दर्शाया गया है । प्रत्येक शर्त के लिए दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों पर कार्रवाई की गई। इस आंकड़े को बेसिटी एट अल14से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एसीटिलेशन और लिसिन अवशेषों के संक्षिप्त ीकरण संशोधनों के बीच क्रॉसटॉक। माइटोकॉन्ड्रियल 3-केटोसिल-सीओए थिओलास से ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स का एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा जो एक ही अमीनो एसिड सीक्वेंस दिखाता है लेकिन विभिन्न पीटीएमएस के साथ दो लायसाइन अवशेषों पर संशोधित किया गया है ।(ए)पेप्टाइड AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccटीKacK और(B)के एमएस/एमएस/पेप्टाइड AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK के एमएस/एमएस । इस आंकड़े को बेसिटी एट अल14से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एसिटिलेटेड और संक्षिप्त लाइसिन अवशेषों के बीच ओवरलैप और क्रॉसटॉक- प्रोटीन परिसरों में विशिष्ट उदाहरण। (A)वेन आरेख 2,235 एसीटिलेशन और 2,173 संक्षेप साइटों के बीच ओवरलैप प्रदर्शित करता है। इनमें से 943 साइटों को एसिटेड और सुचियड दोनों किया गया था। एक SIRT5 (de-succinylase) नॉकआउट माउस से जिगर का विश्लेषण किया गया था, और कई संक्षिप्त साइटों की पहचान की गई । वास्तव में, वे माउस लिवर में सामान्य रूप से देखे जाने की तुलना में अधिक प्रचुर मात्रा में थे (संशोधित पेप्टाइड्स को <0.05 के क्यू मूल्य पर फ़िल्टर किया गया था)। (ख)प्रोटीन परिसरों में उनकी उपइकाइयों का प्रतिशत दिखाया जाता है जिनमें एसिटिलेटेड और संक्षिप्त दोनों साइटें होती हैं (बोल्ड रेड लाइन फिशर के सटीक परीक्षण द्वारा निर्धारित महत्व का प्रतिनिधित्व करती है)। (ग)एटीपी सिंथासे कॉम्प्लेक्स का आरेख: लाल रंग में प्रोटीन उपइकाइयां उन उपइकाइयों को दर्शाती हैं जिनमें एसिटिलेटेड और संक्षिप्त दोनों साइटें होती हैं । इस आंकड़े को बेसिटी एट अल14से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर पीटीएमएस के पेप्टाइड साइट स्थानीयकरण को समझता है। पेप्टाइड के एमएस/एमएस विखंडन के आधार पर, विशेष रूप से असिटाइल समूह को संशोधित करने वाले अवशेषों के बारे में जानकारी प्रदान करना संभव है । यह सॉफ्टवेयर की पीटीएमएस के साइट स्थानीयकरण के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करने की क्षमता को प्रदर्शित करता है ।(ए)lysine अवशेष संशोधन और पीटीएम साइट स्थानीयकरण की दो संभावनाएं: KQYGEAFEKacR (बाएं) और KacQYGEAFEKR (दाएं) । पेप्टाइड के संभावित साइट स्थानीयकरण आइसोफॉर्म में से प्रत्येक के लिए "पुष्टि" और "खंडन" टुकड़े आयन दिखाए जाते हैं। इस जानकारी के आधार पर, स्कोर की पुष्टि और स्कोर का खंडन सौंपा जाता है, नमूने में आइसोफॉर्म KQYGEAFEKacR की उपस्थिति की पुष्टि । (ख)एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम की पुष्टि आइसोफॉर्म KQYGEAFEKacR के अनुरूप है कि एसिटिलेटेड लाइसेन अवशेषों (y2 और उच्च) सहित सभी y आयनों + ४२ मीटर/z की वृद्धि द्रव्यमान ले, जो एसिटिल संशोधन से मेल खाती है । मनाया बी आयनों में संशोधन नहीं होता है। (C)वाई2 और वाई3 आयनों के परिणामस्वरूप प्रचुर मात्रा में पीक क्षेत्रों के साथ आयन क्रोमेटोग्राम (XIC) निकाला गया, जिनमें से दोनों पुष्टि आइसोफॉर्म KQYGEAFEKacR में एसिटिलेशन साइट बनाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल पीटीएम क्रॉसटॉक को अधिक प्रभावी ढंग से समझने के लिए एक साथ कई पीटीएम संवर्धन के लिए एक उपन्यास तकनीक का वर्णन करता है। इस उद्देश्य तक पहुंचने के वैकल्पिक तरीके निषेधात्मक रूप से समय लेने वाले और महंगे होते हैं, और उन्हें11,13को सफल होने के लिए बड़ी मात्रा में प्रोटीन की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल एक बहु-पीटीएम संवर्धन कार्यप्रवाह प्रस्तुत करता है जिसमें प्रयोग की समग्र दक्षता में सुधार करने के लिए एक बार में दो पीटीएम के लिए एंटीबॉडी-कंजुगेड मोतियों में ऊष्मायन शामिल है। इस विधि में स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी उत्पादन और डीआईए एमएस अधिग्रहण के लिए डीडीए का उपयोग भी शामिल है ताकि22,23के खंड आयनों से कम हस्तक्षेप के साथ मौजूद पेप्टाइड्स का पता लगाया जा सके और इसकी मात्रा निर्धारित की जा सके । सॉफ्टवेयर प्रोग्राम, जैसे एमएस डेटाबेस सर्च इंजन का उपयोग डीडीए अधिग्रहण से डेटा का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है, जबकि मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर24 और विशिष्ट व्यास मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर25 डीआईए अधिग्रहण द्वारा उत्पादित जटिल स्पेक्ट्रा की व्याख्या करने के लिए आवश्यक हैं।

इस प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिनका सावधानीपूर्वक पालन किया जाना चाहिए। चूंकि प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य एक साथ कई पीटीएमएस के लिए समृद्ध करना है, इसलिए प्रयोग की सफलता के लिए एंटीबॉडी-एफ़िनिटी संवर्धन कदम (धारा 2) महत्वपूर्ण है। मोतियों पर वॉश करते समय, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि कोई भी मोतियों को गलती से नहीं किया जाता है। यूरिया एकाग्रता सुनिश्चित करना ट्राइप्सिन (चरण 1.8) के साथ पाचन से पहले 1 मीटर तक पतला किया गया है। हालांकि प्रोटीन घुलनशीलता के लिए प्रोटोकॉल में पहले 8 एम यूरिया की आवश्यकता होती है, 1 एम से ऊपर यूरिया सांद्रता ट्राइप्सिन की एंजाइमैटिक गतिविधि को बाधित करेगी। इसके अलावा, पूरे प्रोटोकॉल में नमूने के पीएच की लगातार जांच करना महत्वपूर्ण है। यह पाचन से पहले विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। यदि नमूने का पीएच और ट्रिप्सिन समाधान को ऊष्मायन से पहले उचित रूप से निष्क्रिय नहीं किया जाता है, तो इसके परिणामस्वरूप एक अक्षम पाचन हो सकता है जिसमें कई दरार साइटों को याद किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कम पेप्टाइड पहचान होती है।

नमूने तैयार करते समय प्रोटोकॉल में कुछ संशोधन सहायक हो सकते हैं। 1 मिलीग्राम शुरू करने वाली सामग्री से खरीदे गए प्रोटीन लाइसेट के लिए, प्रत्येक पीटीएम स्कैन ट्यूब में प्रदान किए गए एंटीबॉडी मोतियों का एक चौथाई लागत प्रभावी विकल्प के रूप में उपयोग किया जा सकता है। शुरुआती सामग्री की एक बड़ी मात्रा का उपयोग बेहतर परिणामों के लिए किया जा सकता है, जब तक कि उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी मोतियों की मात्रा आनुपातिक रूप से बढ़ जाती है। एक और संशोधन जो कार्यप्रवाह को बढ़ा सकता है, ट्राइप्सिन के अलावा एक और प्रोटीज़ के साथ नमूनों को पचाने के लिए है। इस संशोधन के परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स क्लीव्ड में अधिक परिवर्तनशीलता आएगी, जिससे प्रोटीन अवशेषों का कवरेज बढ़ जाएगा । हालांकि आवश्यक नहीं है, यह सिफारिश की जाती है कि ट्राइप्सिन अपनी उच्च दरार विशिष्टता26के कारण पीटीएम विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों में से एक हो।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि अध्ययन किए जा रहे पीटीएमएस को14के साथ समृद्ध होने के लिए समान रसायन ों की आवश्यकता होती है । विभिन्न एंटीबॉडी-संयुग्मित मोतियों के लिए प्रक्रियाएं समान होनी चाहिए, इसी तरह के सॉल्वैंट्स और समाधानों का उपयोग करना, जिसमें समान एल्यूशन स्थितियां शामिल हैं, और अधिमानतः एक ही विक्रेता से। इस कारण से, यहां उल्लिखित विधि लगातार एक उदाहरण के रूप में एसीटिलेशन और संक्षिप्त ताक़त का उपयोग करती है, जिनमें से दोनों एंटीबॉडी-कंजुगेड मोतियों (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, इंक) का उपयोग करते हैं। हालांकि इस विधि सैद्धांतिक रूप से पीटीएमएस के किसी भी संख्या के लिए लागू किया जा सकता है, अतिरिक्त अध्ययन के लिए इस संबंध में प्रोटोकॉल की सही सीमा का आकलन करने की जरूरत होगी । इसके अलावा, चूंकि यह एक एंटीबॉडी-आधारित संवर्धन विधि है, इसलिए विधि केवल पीटीएम साइटों का सापेक्ष मात्रा प्रदान कर सकती है।

मौजूदा मल्टी-पीटीएम संवर्धन विधियों की तुलना में, यह कार्यप्रवाह एक अधिक व्यवहार्य और लागत प्रभावी विकल्प है। इस प्रयोग से, यह देखा गया कि इस विधि की प्रभावकारिता व्यक्तिगत या धारावाहिक संवर्धन जैसे वैकल्पिक तरीकों के साथ बहुत अच्छी तरह से तुलना करती है। चित्रा 2बी से पता चलता है कि संशोधित पेप्टाइड पीक क्षेत्रों के लिए औसत सीवी वास्तव में एकल-पीटीएम संवर्धन और धारावाहिक-पीटीएम संवर्धन13की तुलना में एक बर्तन विधि में कम हो गया था । हमने एसिटिलेशन या संक्षिप्तीकरण के लिए साइट-स्तरीय मात्रा का आकलन करने वाले प्रायोगिक परिणामों का विश्लेषण किया। इसके अतिरिक्त, स्पीयरमैन सहसंबंध विश्लेषण(चित्रा 2सी, डी)ने दिखाया कि एक-पॉट पीटीएम संवर्धन ने एकल-पीटीएम संवर्धन कार्यप्रवाह के समान प्रदर्शन किया। यह पेप्टाइड और खंड स्तर के सहसंबंधों के लिए भी सच था । धारावाहिक-पीटीएम संवर्धन के साथ एक बर्तन की तुलना करते समय एक ही अवलोकन सभी तीन सहसंबंधों के लिए आयोजित किया गया ।

यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को त्वरित और लागत प्रभावी तरीके से पीटीएम क्रॉसटॉक में आकर्षक जैविक अंतर्दृष्टि बनाने की अनुमति देता है। कार्यप्रवाह का व्यास घटक शोधकर्ताओं को पीटीएमएस के बारे में अधिक समझने की अनुमति देता है, क्योंकि यह साइट स्थानीयकरण के बारे में जानकारी प्रदान करता है और पीटीएमएस की कम साइट अधिभोग जैसी चुनौतियों पर काबू पा जाता है । अग्रदूत आयनों को डीडीए के साथ बाहर रखा जाता है, जो पीटीएमएस का अध्ययन करते समय विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि साइट अधिभोग अक्सर उस बिंदु पर कम होता है जहां ये पेप्टाइड्स एमएस/एमएस के लिए चयनित नहीं होते हैं लेकिन अभी भी महत्वपूर्ण जानकारी होती है । इस विधि का उपयोग करके एक साथ कितने पीटीएमएस को समृद्ध किया जा सकता है, इसकी ऊपरी सीमा का आकलन करने के लिए अनुवर्ती प्रयोग किए जा सकते हैं। इस कार्यप्रवाह के भविष्य में सुधार में साइट स्थानीयकरण और पीटीएम साइट अधिभोग के विश्लेषण को और अधिक स्वचालित करने के लिए अधिक उन्नत सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों का विकास शामिल हो सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम बक इंस्टीट्यूट (1S10 OD016281) में TripleTOF प्रणाली के लिए एनआईएच साझा इंस्ट्रूमेंटेशन ग्रांट से समर्थन स्वीकार करते हैं। इस काम को राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान (R01 AI108255 से बी.एस.) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (आर 24 डीके085610 से एरिक वर्डिन) द्वारा भी समर्थन दिया गया था; R01 DK090242 एरिक Goetzman करने के लिए) । एक्स एक्स को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच ग्रांट T32GM8806, जूडिथ कैम्पिसी और लिसा एलेर्बी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, एनबीए को ग्लेन फाउंडेशन फॉर मेडिकल रिसर्च से पोस्टडॉक्टोरल फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA T7408
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA 36XL66
Bioruptor sonicator Diagenode, Denville, NJ, USA B01020001
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) SCIEX, Framingham, MA, USA 5015841
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) SCIEX, Framingham, MA, USA 804-00001
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA D9779-5G
Eppendorf Thermomixer Compact Eppendorf AG, Hamburg, Germany T1317-1EA
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) Eppendorf AG, Hamburg, Germany 22363352
Formic acid Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA F0507-500ML
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland Ki-3002-2
Iodoacetamide (IAA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA I1149-25G
mapDIA web link software for interference removal of DIA datasets
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA BJLC230-4
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser VWR International, Radnor, PA, USA 89204-088
mProphet in Skyline incorporated in Skyline integrated statistical algorithms for FDR assessments
Oasis HLB SPE cartridges Waters Corp., Milford, MA, USA WAT094225 cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material
Phosphate buffered saline solution Life Technologies 10010023
Pierce BCA Assay Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 23225
ProteinPilot 5.0 - 'MS database search engine' SCIEX, Framingham, MA, USA software download SCIEX MS database search engine
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 Cell Signaling Technology 13764 antibody beads for affinity enrichment
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 Cell Signaling Technology 13416 antibody beads for affinity enrichment
Sequencing-grade lyophilized trypsin Life Technologies 23225
Skyline - 'Quantitative Proteomics Software' MacCoss lab (academic) open source software Quantitative Proteomics Software (academic)
Spectronaut - 'DIA Quantitative Analysis Software' Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland Sw-3001 DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA SPD131DDA-115 instrument to concentrate liquid volume of samples
TissueLyser II Qiagen, Hilden, Germany 85300 instrument for efficient lysis of tissue
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA T6508-1L
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer SCIEX, Framingham, MA, USA Per quote high resolution mass spectrometer
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA Model #845 chromatographic separation system
Urea Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA PI29700
Water, Burdick and Jackson LC-MS Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA 600-30-76
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL ZTC18S096 C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures

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References

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जीव विज्ञान अंक 156 ट्रांसलेशनल संशोधनों के बाद इम्यूनोफिनिटी संवर्धन क्रॉसटॉक साइट स्थानीयकरण द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण एसिलेशन एसीटिलेशन संक्षिप्तीकरण
क्वांटिफिकेशन और साइट स्थानीयकरण के लिए दो पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का एक साथ आत्मीय समृद्धि संवर्धन
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Xie, X., Shah, S., Holtz, A., Rose,… More

Xie, X., Shah, S., Holtz, A., Rose, J., Basisty, N., Schilling, B. Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization. J. Vis. Exp. (156), e60780, doi:10.3791/60780 (2020).

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