Summary
이 프로토콜은 전임상 약물 검사를 위해 인간의 심장 조각을 단면화 및 배양하는 절차를 설명하고 이러한 조각에서 동시에 세포간 전압 및 세포내 칼슘 신호를 기록하기 위한 광학 매핑의 사용을 자세히 설명합니다.
Abstract
인간 심장 슬라이스 제제는 최근 인간 생리학 연구 및 치료 테스트를 위한 플랫폼으로 개발되어 동물 실험과 임상 시험 사이의 격차를 해소하고 있습니다. 수많은 동물 및 세포 모델은 약물의 효과 검사 하는 데 사용 되었습니다., 하지만 이러한 응답은 종종 인간에서 다릅니다. 인간의 심장 조각은 실행 가능한 인간의 마음에서 직접 파생된다는 점에서 약물 검사에 대한 이점을 제공합니다. 다세포 구조, 세포 세포 커플링 및 세포 외 매트릭스 환경을 보존하는 것 외에도 인간 심장 조직 조각은 성인 인간 심장 생리학에 무수한 약물의 효과를 직접 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델을 전체 하트 나 웨지와 같은 다른 심장 준비와 구별하는 것은 슬라이스가 장기적인 문화를 받을 수 있다는 것입니다. 따라서 심장 조각은 급성뿐만 아니라 약물의 만성 효과를 연구 할 수 있습니다. 더욱이, 단일 심장에서 수백에서 천 조각을 수집하는 능력은 동시에 다른 약물과 다양한 농도와 조합에서 여러 약물을 테스트하는 높은 처리량 모델을 만든다. 슬라이스는 심장의 주어진 부위에서 제조 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 왼쪽 심실 프리 월에서 조직 큐브를 분리하고 고정밀 진동 미세 토메를 사용하여 조각으로 분할하여 왼쪽 심실 슬라이스의 준비를 설명합니다. 이 조각은 그 때 기준선 심장 전기 생리학적 기능을 측정하기 위하여 심각한 실험을 복종하거나 만성 약 연구 결과를 위해 배양될 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 조사되는 약의 효력을 결정하기 위하여 세포내 전위 및 세포내 칼슘 역학의 동시 기록을 위한 심장 조각의 이중 광학 매핑을 기술합니다.
Introduction
동물 모델은 인간 생리학 및 병리학의 기본 메커니즘을 이해하는 데 사용되는 귀중한 도구뿐만 아니라 다양한 질병을 치료하는 치료의 예비 테스트를위한플랫폼이었습니다 1. 이 동물 연구 2에 근거를 둔 생물 의학 연구의 분야에서 큰 보폭을 취했습니다2. 그러나, 마우스, 쥐, 기니피그, 토끼, 양, 돼지 및 개3,,4를포함하여 인간과 동물 생리학 사이에 중요한 종 간 차이가 존재한다. 그 결과, 동물 실험 단계에서 약속을 보였지만 임상 시험5의결과에 부응하지 못하는 수많은 약물, 유전자 및 세포 치료법이 있었습니다. 이러한 격차를 해소하기 위해, 고립된 심장 심근세포와 인간 유도만능 줄기세포(iPSC)는 다양한 약물 및 질병에 대한 인간 생리학의 반응을 시험하는 모델로 개발되었다6. 줄기 세포 유래 심근세포는,심장6,7,78의대리로서 장기-온-칩 시스템에서 널리 사용되고 있다. 그러나, iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM)의 유용성은 상대적으로 미성숙표현형과 심근세포 하위집단의 표현부족에 의해 방해된다. 성숙한 심근은 섬유아세포, 뉴런, 대식세포 및 내피 세포와 같은 여러 공존세포 유형으로 구성된 복합구조이다. 한편, 고립된 인간 심근세포는 전기적으로 성숙하며, 상이한 심근세포 하위집단은 배양 파라미터9를변경하여 얻을 수 있다. 여전히, 이러한 근세포는 일반적으로 세포 세포 커플링의 부족, 신속한 분화 및 시험관 내의 비리듬 거동의 발생으로 인해 변경된 작용 잠재적형태론을나타낸다10,11. 일부 제한 사항은 iPSC-CM 및 심장 심근세포의 3D 세포 배양 모델에 의해 해결되었습니다. 스페로이드, 하이드로겔 스캐폴드 캡슐화 된 3D 배양, 엔지니어링 심장 조직 (EHTs), 및 심장 온 칩 시스템을 포함하는 이 모델은 심근세포, 섬유아세포 및 내피 세포와 같은 다중 심장 세포 집단을 사용합니다. 그들은 3D 구조를 형성하기 위해 비계를 따라 자체 조립하거나 조립하고 일부는 심근의 복잡한 이색성 특성을 재현합니다. 이 모형은 성숙한 표현형의 세포가 있기 위하여 보고되었습니다, 수축 속성, 및 심장 조직과 유사한 분자 단면도. 심장 에 칩 시스템은 또한 약물 테스트 및 질병 모델에서 전신 효과의 연구를 할 수 있습니다. 그러나, 체외 세포 기반 모델은 네이티브 세포 외 매트릭스가 부족하므로 기관 수준 전기 생리학을 정확하게 모방 할 수 없습니다. 반면 인간의 심장 조각은 그대로 세포 외 매트릭스와 네이티브 세포 대 세포 접촉을 가지고 있어 인간 심근의 부정맥 특성을 보다 정확하게 검사하는 데 유용합니다.
연구진은 급성 및 만성 약물 검사를 위한 생리학적 전임상 플랫폼으로서 인간 심장 조직화 슬라이스를 개발하여 심장 전기생리학과 심장질환 진행,12,13,,,14,,15,,16,17,,18,19를연구하고 있다., iPSC 유래 심근세포와 비교했을 때, 인간 심장 조각은 성숙한 심근세포 표현형으로 성인 심장 전기 생리학을 보다 충실하게 복제합니다. 고립 된 인간 심근 세포와 비교할 때, 심장 조각은 잘 보존 된 세포 세포 커플링과 그들의 토착 세포 내 및 세포 외 환경의 본질적인 존재 때문에 생리적 작용 잠재적 인 기간을 나타낸다.
이 프로토콜은 전체 기증자 심혼에서 인간 적인 심장 조각을 생성하는 과정을 설명합니다, 광학 매핑을 통해 심장 전기 생리학 파라미터를 테스트하기 위하여 급성 (즉, 시간 긴) 및 만성 (즉, 일- 긴) 연구 결과를 능력을 발휘합니다. 이 프로토콜은 좌심실(LV) 조직의 사용만을 설명하지만, 마우스, 쥐, 기니피그 및돼지(14,,20,,21,,22)와같은 다른 종뿐만 아니라 심장의 다른 부위에도 성공적으로 적용되었다. 우리의 실험실은 지난 5 년 동안 이식을 위해 거부 된 전체 인간 기증자 심장을 사용하지만, 조직이 큐브로 절제 될 수있는 능력을 가지고 있는 한 대안적 수단 (예를 들어, 좌심실 보조 장치 [LVAD] 이식, 생검, myectomies)에 의해 얻은 모든 기증자 심장 샘플 조직에서 이러한 동일한 절차를 수행 할 수 있습니다. 광학 매핑은 광학 작용 잠재력과 칼슘 과도를 높은 공간(100 x 100 픽셀) 및 측두구(>1,000 프레임/s) 해상도로 동시에 매핑할 수 있는 능력으로 인해 이 연구에서 분석을 위해 사용됩니다. 다중 전극 어레이(MEA) 또는 마이크로 전극과 같은 대체 방법도 사용할 수 있지만 이러한 기술은 상대적으로 낮은 공간 해상도에 의해 제한됩니다. 또한, MEA는 세포 배양과 함께 사용하도록 설계되었으며, 날카로운 미세 전극은 전체 하트 또는 큰 조직 웨지와 함께 사용하기 위해 보다 쉽게 관리됩니다.
이 기사의 목표는 더 많은 연구원이 심장 전기 생리학 연구를 위해 인간 심장 조직을 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 이 문서에 설명 된 기술은 상대적으로 간단 하 고 단기 연구에 대 한 도움이 (몇 시간의 순서에 일). 장기 연구를 위한 더 많은 생리적 생체 mimetic 배양 (주 순서에) 다른 연구의 숫자에 의해 논의 및 설명 되었다12,,18,,23. 전기 자극, 기계적 적재 및 조직 스트레칭은 체외,조직 리모델링12,,18,23의발병을 제한하는 데 도움이 되는 유리한 컨디셔닝 메커니즘이다.
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Protocol
설명된 모든 방법은 인간 복지에 대한 모든 제도적, 국가 적, 국제 지침에 따라 수행되었습니다. 연구는 조지 워싱턴 대학에서 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인되었다.
참고 : 기증자 인간의 마음은 조지 워싱턴 대학 IRB의 승인을 가진 식별 된 버려진 조직으로 워싱턴 지역 이식 커뮤니티에서 인수되었다. 심이식 된 심장은 얼음 차가운 심폐증 (이 과정에서 심장에서 혈액이 지워졌음)의 용액으로 심장을 플러시하여 심장마비로 체포되어 표준 장기 이식 조건하에서 실험실로 옮겨집니다.
1. 솔루션 준비
- 각 심장에 대해, 심장 마비 용액 4 L (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,1.2 mM CaCl2;pH = 7.4)를 확인하십시오. 3 L을 4°C에서 저장하고 나머지 1L은 -20°C에 저장합니다.
참고: 이 솔루션은 최대 며칠 전에 만들 수 있습니다. - 티로드의 슬라이스 용액 1L(140m NaCl, 6mM KCl, 1mM MgCl2,1.8mM CaCl2,10mM 포도당) 10mM HEPES, 10mMM 2,3-부탄디온 단화형 [BDM]; pH = 7.4) 및 티로드의 복구 솔루션(140m NaCl, 4.5mM KCl, 1mM MgCl2,1.8m M CaCl2,10mMM, 10mM) = 10mM HEPES, 10mM HEPES, 10mM HEPES, 10mM HEPES, 10mM HEPES, 10mM HEPES, 10mM HEPES, 10mM HEPES, 10mM HEPES, 10mM HEPES, 10m MM HEPES, 10mM HEPES, 10m MM HEPES, 10mM HEPES, 10mM HEPES, 10m M M HEPES, 10mM HEPES, 10m MM HEPES, 10m MM HEPES, 10m MM.
참고: 슬라이스 및 복구 솔루션 모두 실험 당일에 만들어져야 하며 4°C에 저장할 수 있습니다. - 형광염료의 스톡 솔루션을 준비합니다. 디메틸 설산화물(DMSO)에서 1.25 mg/mL에서 전압 에 민감한 염료 RH237을 재구성하고 4°C에서 30 μL 알리쿼트에 보관한다. DMSO에서 1 mg/ mL에서 칼슘 표시기 Rhod-2AM을 재구성하십시오. -20°C에서 30 μL 알리코에 보관하십시오.
참고: Di-4-ANEPPS(DMSO의 1.25 mg/mL의 스톡 솔루션)는 막 전위 단독의 단일 카메라 이미징 실험에 사용될 수 있습니다.- 실험이 시작되기 전에 초음파 초음파 처리기를 사용하여 염료를 최소 10 분 동안 초음파 처리하고 복구 용액의 1 mL에서 형광 염료의 각 알리쿼트를 희석시하십시오. 복구 용액에서 희석하기 전에 1:1 비율로 Rhod-2AM에 플루론 F-127(재료표)을추가합니다.
- DMSO에서 2 mg/mL 용액에서 흥분 수축 되지 않은 블비스타틴의 스톡 솔루션을 준비합니다. -20°C에서 알리쿼트에 보관하십시오. 광학 매핑 실험 중에 티로드의 복구 솔루션에서 blebbistatin의 재고 용액을 5-10 μM의 작업 농도로 희석합니다.
- 배지 199를 2% 페니실린-연쇄절제술, 인슐린-트랜스퍼린 셀레늄(ITS) 액체 미디어 보충제, 10mM BDM으로 보충하여 신선한 배양 배지를 만듭니다. 0.2 μm 멸균 필터를 사용하여 매체를 필터링합니다.
참고: 약리학적 인 동요 연구의 경우 약물을 배양 배지에 직접 첨가 할 수 있습니다. 배양 배지는 37°C로 저장될 수 있다. - 증류수에 저융점 아가로즈를 용해하고 혼합물을 완전히 녹일 때까지 전자레인지에 가열하여 조직 장착을 위한 4% 아가로즈 젤을 만드십시오. 아가로즈를 5mm 두께로 페트리 접시에 들어서서 4°C에 보관하십시오.
2. 장비 설정
- 진동 마이크로토메 설정
- 각 실험 전에 진동 마이크로토메를 교정합니다.
- 고정밀 진동 마이크로톤(재료표)을사용하여 세라믹 커팅 블레이드를 홀더에 적재하고 진동 마이크로톤과 함께 제공되는 교정 장치를 부착합니다. 메뉴에서 블레이드 조정 옵션을 선택하고 블레이드 유형에 맞게 세라믹을 선택합니다.
- 진동 옵션을 선택하고 Z 축 값을 확인합니다. 이 값이 <1 μm인 경우 교정 메뉴를 종료합니다. 그렇지 않은 경우 진동 헤드 상단에 부착된 교정 나사를 미세하게 조정하고 진동 옵션을 선택합니다. Z 축을 <1 μm로 설정하려면 필요에 따라 여러 번 반복합니다.
- 진동 설정을 400 μm 절단 두께, 심방 조직의 경우 0.02mm/s의 사전 속도, 심실 조직을 위한 0.04mm/s 의 사전 속도, 2mm 수평 진동 진폭 및 80Hz 진동 주파수로 설정합니다.
참고: 400 μm은 슬라이스의 절단 표면의 셀 손상을 보상하기 위해 권장되는 두께이지만 얇은 슬라이스도 준비할 수 있습니다. 산소 확산 한계가 약 150 μm임을 감안할 때, 300 μm 주위의 슬라이스는 종종14,,17,,18,,24를사용한다. - 진동 마이크로토메의 목욕을 4°C에서 슬라이스 용액으로 채우고, 배스 의외부를 얼음으로 둘러싸서 온도를 유지하여 슬라이스 프로토콜 전반에 걸쳐 필요에 따라 보충한다. 슬라이스 하는 동안 100% 산소로 버블링하여 목욕 중에 슬라이스 용액을 지속적으로 산소로 공급합니다.
- 필요에 따라 100 μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너와 메쉬 와셔 (슬라이스 당 하나의 셀 스트레이너)와 두 번째 접시를 설정합니다. 이 접시를 복구 용액으로 채우고 실온 (RT)에서 100 % 산소로 버블링하여 산소를 공급하십시오.
참고: 이 솔루션은 실험 중에 RT에서 유지됩니다.
- 각 실험 전에 진동 마이크로토메를 교정합니다.
- 광학 매핑 설정
참고: 광학 매핑 시스템에 대한 자세한 설명은 이전 간행물16,,25,,26에제공됩니다.- 폴리디메틸실록산(PDMS) 젤 층을 바닥에 부착하여 배혈 시스템에 부착한다. 37°C에서 회수 용액 의 1L을 순환시키고 100% 산소로 산소를 공급하고, 유량으로 관류 시스템을 통해 공기와 배스 퍼퓨전의 명확한 축적을 유지한다.
- 대상을 사용하여 두 CMOS카메라(재료 표)의초점과 정렬을 조정합니다.
참고: 정렬에 대한 자세한 내용은 이전 연구26에서찾을 수 있습니다. - 520 ± 5 nm의 파장이있는 녹색 LED 광원을 사용하여 전압에 민감한 및 칼슘 표시기 염료를 동시에 자극합니다.
참고: 흥분광원은 광학 매핑 시스템의 여기 필터 큐브에 부착되어 있으며 상심 조명을 위해 550nm 이산화 거울을 반사합니다. 방출된 광은 1x 렌즈에 의해 수집되고 630nm에서 제2 이색 거울에 의해 전압 및 칼슘 성분으로 분할된 후 각각 690 ±50 nm 및 590 ±33 nm 필터로 여과되고, 두 개의 카메라에 의해 기록된다.
3. 슬라이싱 프로토콜
- 조직 해부 및 실험을 준비하면 냉동 및 액체 심폐를 혼합하여 얼음 차가운 심폐의 목욕을 준비하십시오. 슬라이스조직 수집전까지 심장을 심폐탕에 담근 상태로 두십시오(그림1A).
- 미리 만들어진 아가로즈 젤을 진동기의 금속 조직 홀더 뒷면에 붙입니다.
- 좌심실 프리 월을 식별하고 차가운 심폐 용액에서 1cm3 큐브의 조직을 잘라냅니다. 이어서, 내막 표면이 위로 향하여 금속 조직 홀더에 조직 블록을 신속하게 장착하고 국소 피부접착제(도 1B)를사용하여 아가로즈 젤에 부착한다.
참고: 선택된 조직 영역은 슬라이스에 구멍을 피하기 위해 큰 혈관에서 떨어져 있어야 합니다. 단면의 평면은 내막층(도 1E)의섬유 방향과 거의 평행하며 단면의 평면은 LV 벽의 깊은 층에서 회전 성 이방성으로 인해 약간의 각도로 이루어질 수 있다. 처리량을 증가시키기 위해 최대 2개의 조직 블록을 동일한 홀더에 나란히 장착할 수 있습니다. - 금속 홀더를 얼음차가운 산소 슬라이스 용액으로 채워진 진동 용으로 옮춥시다. 조직 큐브가 완전히 침수되었는지 확인합니다.
- 블레이드를 조직의 전면 가장자리로 이동하고 진동을 켜서 미리 설정된 매개 변수로 슬라이스를 시작합니다. 블레이드가 trabeculae를 넘어 매끄러운 내막 조직으로 도달 할 때까지 처음 여러 조각을 버립니다.
- 각 슬라이스가 절단되면, 조심스럽게 개별 100 μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너에 각 조각을 배치하고 컬링에서 조직 조각을 유지하기 위해 메쉬 와셔로 커버 티로드의 복구 용액의 산소 (100 % O2)목욕에 슬라이스를 전송(그림 1C). 적어도 20 분 동안 복구 솔루션에 조각을 유지합니다.
참고: 슬라이스는 해로운 전기 생리학적 효과없이 최대 3-4 h의 이러한 조건하에서 목욕에 보관할 수 있습니다.
4. 정적 조건에서 배양 슬라이스
참고: 오염 가능성을 최소화하려면 각 전달 단계 전에 비드 멸균기를 사용하여 집게를 소독하십시오.
- 배양할 준비가 되면 각 슬라이스를 멸균 인산염 완충식식염(PBS)으로 채워진 6웰 플레이트의 개별 우물로 조심스럽게 옮기는 다. 웰 플레이트를 부드럽게 흔들어 복구 용액의 조각을 헹구십시오.
참고: 이 시점부터 는 BSL2 라미나르 흐름 배양 후드에만 슬라이스가 노출되어야 하며 멸균 집게를 사용하여 조직을 처리해야 합니다. - 슬라이스를 신선한 PBS 의 우물로 옮기면 문화를 위해 조각을 완전히 헹구고 살균하십시오. 이 세척 단계 3x를 수행하여 슬라이스에서 복구 용액을 완벽하게 제거하십시오.
- 미리 온 진 (37°C) 배양 배지 (약물 유무에, 도 1D)의3 mL로 채워진 6 웰 플레이트의 개별 우물로 슬라이스를 전송합니다. 플레이트를 37°C의 가습된 인큐베이터에 20rpm에 30% O2 및 5% CO2로놓습니다. 배양 배지를 48시간마다 흡인하고 대체합니다.
5. 기능 적 특성화 -광학 매핑
- 광학 매핑 연구의 경우 슬라이스 직후 또는 배양 후, 타이로드의 복구 용액에서 100% O2로 37°C의 관류 시스템의 조직 배스로 관심 있는 조각을 조심스럽게 옮기고, 최소 스트레칭을 적용하면서 4개의 모서리를 PDMS 젤 층으로 고정하여 최소한의 스트레치(즉, 흐름 조건에서 쉽게 움직일 수 있는 것만으로 충분). 약 10 분 동안 순환 복구 솔루션이 욕조에서 슬라이스를 휴식을 허용합니다.
- 회수 용액을 포함하는 저장소에 희석 된 blebbistatin의 0.3-0.5 mL을 추가합니다. 슬라이스가 블리비스타틴으로 약 10분 동안 배양하게 하십시오.
- 37°C에서 1mL의 회수 용액에서 스톡 전압 에민감한 염료 RH237의 30 μL을 재구성한다. 펌프를 끄고 30s의 기간 동안 슬라이스표면에 작업염액0.2-0.3mL을 천천히 적재합니다.
참고: 조각 전체에 염료를 고르게 바르려면 주의해야 합니다. 또한 매우 느린 염료 응용 프로그램은 염료가 슬라이스에서 멀리 떠있는 것을 방지하는 데 중요합니다. - 5.3단계를 반복하여 주식 칼슘 표시기를 Rod-2AM으로 재구성하고 슬라이스에 로드합니다.
- 렌즈에서 슬라이스의 거리를 조정하여 카메라를 슬라이스에 집중시합니다.
- 이중극 백금-이리듐 속도 전극을 배치하여 팁이 슬라이스의 중간과 접촉하고 증가진폭의 속도 자극을 적용하여 전기 반응을 유도하는 데 필요한 최소 속도 임계값을 결정합니다. 1Hz에서 슬라이스를 1.5배의 펄스 폭 지속 시간으로 페이스로 조정하여 미리 결정된 속도 임계값의 진폭을 조정합니다. 조직 조각 위에 덮개 슬립을 놓습니다.
- 520 ± 5 nm LED 여기 광원을 사용하여 슬라이스를 조명하십시오. 방출된 전압 및 칼슘 신호를 두 대의 CMOS 카메라로 1,000프레임/s로 기록합니다.
- 좋은 신호 품질과 억제 된 모션 아티팩트(그림 1F)에대한 기록을 확인합니다. 모션이 더 이상 광학 신호에서 아티팩트를 생성하지 않는 때까지 0.1 mL 단계로 저장소에 더 많은 blebbistatin을 추가합니다. 필요한 경우 염료를 더 추가하여 신호 품질을 향상시킵니다.
참고: 양호한 신호 품질은 기록된 광학 신호에서 질적으로 평가된 큰 신호 진폭과 낮은 배경 잡음을 나타냅니다.
6. 리듬1.2와 데이터 처리
참고: RHYTHM1.2는 단일 또는 듀얼 카메라 광학 매핑시스템(그림 3)에서획득한 광학 매핑 데이터를 표시, 상태 및 분석하는 데 사용되는 MATLAB 기반 사용자 인터페이스입니다. 이미징 시스템과 함께 사용됩니다.
- 데이터 파일 로드
- 화면의 네 개의 디스플레이 창 중 하나를 선택하고 디렉터리 및 로드 선택 단추를 사용하여 데이터 파일을 RHYTHM1.2로 로드합니다.
- 이 프로그램은 사용자에게 듀얼 전압 및 칼슘 레코딩에 대한 카메라 1 또는 카메라 2 데이터를 선택하라는 메시지를 표시합니다. 전압 신호에 대해 카메라 1을 선택합니다.
- 칼슘 신호(Camera 2)를 인접한 디스플레이 창 중 하나에 로드하는 과정을 반복합니다.
- 두 데이터 집합이 슬라이스의 동일한 영역에서 기록되므로 선택한 두 개의 디스플레이 창 간에 이중 데이터 연결 확인란을 선택하여 두 개의 디스플레이 창을 연결합니다.
참고: 또는 동일한 시야가 유지되면 이 기능을 사용하여 별도의 시점에서 얻은 두 개의 이미지를 연결하여 조사 중인 약물의 전기생리학에서 시간 반응을 볼 수 있습니다. 하나의 디스플레이 창을 두 번 클릭하면 하나의 창을 최대화하여 분석이 용이하도록 합니다.
- 신호 컨디셔닝
- 데이터 분석 선택 | 조건 파라미터는 추가 분석 전에 전압 및 칼슘 광학 매핑 데이터를 조건화합니다.
- "배경제거"함수를 사용하여 형광 강도 임계값(배경 [BG] 임계값) 및 픽셀 클러스터링 정도(여기[EX] 임계값)를 기반으로 신호를 포함하지 않는 픽셀을 제거합니다.
- 신호 품질을 개선하기 위해"Bin"기능을 사용하여 광학 매핑 데이터의 공간 평균을 수행합니다.
- "필터"기능을 사용하여 대역 패스 필터를 사용하여 광학 매핑 데이터를 필터링합니다.
- "드리프트"함수를 사용하여 광학 매핑 신호에서 기준선 드리프트를 제거합니다.
- "정규화"함수를 사용하여 각 픽셀의 광학 매핑 데이터를 정규화하여 최대 진폭을 1로 합니다.
- "역신호"기능을 사용하여 추가 분석을 위해 칼슘 흔적을 반전시면 됩니다.
- 디스플레이 웨이브를 클릭하여 디스플레이 창의 지정된 지점에서 조건된 추적을 선택하고 파형 창에 플롯합니다. 신호 컨디셔닝 파라미터를 조정하여 최적의 작용 전위 및 칼슘 과도 추적을 얻습니다.
- 전도 속도(CV) 계산
참고: 활성화 시간은 광학 신호(dF/dt최대)의최대 유도체 시간으로 정의됩니다.- 데이터 분석 선택 | 활성화 맵을 입력하고 시작 시간 및 종료 시간을 입력하여 추적에서 단일 작업 잠재력을 포괄합니다. 선택한영역(그림 1G)의활성화 맵을 표시하기 위해 관심 영역(ROI)을 계산하고 선택합니다.
- 데이터 분석 선택 | 이력서 맵과 마찬가지로 시작 시간과 종료 시간을 선택합니다. 설정에 따라 픽셀 간 해상도 값을 입력합니다.
참고: 1배 배율 시스템의 경우 X 및 Y 방향에서 픽셀 해상도가 0.1mm입니다. - 생성 벡을 누릅니다. 매핑 버튼을 눌러 ROI를 선택하고 해당 영역 내에 CV 벡터를 표시합니다. 해석에 포함된 평균, 중앙값, 표준 편차 및 벡터 수뿐만 아니라 선택한 영역에서 CV 벡터의 평균 전파 각도가 계산되어 통계 섹션에 표시됩니다.
- 그리기 선 버튼을 클릭하여 지정된 전파 방향을 따라 선을 그립니다. 해당 방향의 모든 CV 벡터가 선택됩니다. CV 계산을 클릭하여 선택한 CV 벡터만 사용하여 통계 섹션에 표시되는 통계를 계산합니다.
- 작용 잠재력 지속 시간(APD) 및 칼슘 과도 지속 시간(CaTD) 계산
참고: APD는 심장 전기 생리학의 또 다른 근본적인 매개 변수입니다. APD 맵은 활성화와 각 광학 작업 잠재력의 반복화의 지정된 비율 사이의 시간 차이를 결정하여 생성될 수 있습니다. APD 이질성 또는 APD 연장 및 단축은 부정맥 감수성을 예측하는 데 사용될 수 있다.- RHYTHM1.2에서 APD를 계산하려면 데이터 분석을 선택 | APD/CaT 지도.
- 시작 시간 및 종료 시간을 선택하여 하나의 전체 작업 잠재력을 포괄합니다. APD/CaTD의 최소 값과 최대 값을 설정하여 이상치(예: 0 및 1,000ms)를 제거합니다. APD를 결정하는 백분율 재극화를 입력, 예를 들어, APD80/CaTD 80 또는 APD50/CaTD50에 대한 0.5에 대한0.8.
- 지역 APD Calc를 클릭하여 ROI를 선택하고 APD 맵을 생성합니다. 해석에 포함된 평균, 중앙값, 표준 편차 및 픽셀 수가 통계 섹션에 표시됩니다.
- 상승 시간
참고: 상승 시간은 전압 및 칼슘 과도 추적의 광학 신호에서 측정할 수 있는 또 다른 전기 생리학적 파라미터입니다. 탈극화 이온 채널이 작용 잠재력을 유발하는 데 걸리는 시간 또는 칼슘이 석관 망상에서 세포질로 방출되는 데 걸리는 시간을 추정합니다. 광학 상승 시간은 미세 전극에 의해 측정된 상승 시간을 위한 완벽한 대체가 아니며, 광작용 전위가 많은 세포의 극막 전위의 평균이기 때문에, 탈극화의 변화에 민감하지 않을 수 있습니다. 시스템의 공간 및 시간 적 해상도는 광학 상승 시간 값에도 영향을 줄 수 있습니다. 그러나, 그것은 여전히 탈극화(27)의큰 변화를 예측하는 데 사용할 수 있습니다.- 상승 시간을 확인하려면 데이터 분석을 선택 | 상승 시간.
- 시작 시간 및 종료 시간을 선택하여 단일 작업 잠재력 또는 칼슘 과도한 단일 동작의 업스트로크를 선택합니다. 시작%와 End%의 값을 입력하면(일반적으로 시끄러운 신호가 아닌 경우 10~90%가 권장됨)을 입력하여 시끄러운 신호의 경우 노이즈를 포함하지 않고 신호의 일부만 선택할 수 있습니다.
- 계산을 클릭하여 ROI를 선택하고 상승 시간 분석에 포함된 평균, 중앙값, 표준 편차 및 픽셀 수를 결정합니다.
- 칼슘 부패
참고: 칼슘 흔적의 경우, 과도칼슘의 부패의 시간 상수를 결정할 수 있습니다. 이를 통해 세포질에서 SR으로 칼슘 이온제거의 변화를 분석할 수 있습니다.- 데이터 분석 선택 | 칼슘 부패와 단일 칼슘 과도 신호의 전체 부패 부분을 포괄하는 시작 시간과 종료 시간을 입력합니다.
- 타우 계산을 클릭하여 ROI를 선택하고 칼슘 부패 시간 상수 분석에 포함된 평균, 중앙값, 표준 편차 및 픽셀 수를 결정합니다.
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Representative Results
인간 organotypic 조각은 위에 상세하고 상세한 프로토콜에 따라 기증자 인간의 심장의 좌심실에서 수집되고그림 1. 이중 카메라 광학 매핑 시스템그림 2직립 이미징 구성에서 전압 및 칼슘의 동시 광학 매핑을 수행 하 여 약 1 시간 슬라이스 프로토콜의 완료 후 사용 되었다. 데이터는 RHYTHM1.2 (를 사용하여 분석되었다)그림 3), 이전에 우리의 실험실에 의해 출판 및 Github (https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2)에서 자유롭게 사용할 수있는 오픈 소스 광학 매핑 데이터 분석 도구. 측정된 전기생리학적 파라미터는그림 4. 작용 잠재력 및 칼슘 과도 추적은 신호 조절되었고 추가 분석에 사용되는 대표적인 흔적이그림 4A. 활성화 시간은 각 픽셀에 대해 결정되었으며 전압 및 칼슘 흔적에서 결정된 활성화 시간의 이소크로날 맵은그림 4B,C. 칼슘 이소크론의 활성화는 예상대로 전압보다 뒤쳐진다는 점에 유의하십시오. 플롯된 CV 벡터그림 4D활성화 시간과 알려진 인터픽셀 해상도를 사용하여 계산되었습니다. 횡방향의 평균 CV는 이 슬라이스에서 21.2cm/s로 결정되었다. 이 CV 값은 전 인간의 심혼 (24 ± 4 및 28 ± 7cm/s의 확산 및 패치 섬유증을 가진 심혼에서 측정한 이전에 보고된 심실 횡단 CV와 비교됩니다)28. 칼슘 과도 부패 상수는 칼슘 흔적의 부패 부위에 다각형을 피팅하여 측정하였고 평균 부패 상수는 이 슬라이스에서 105.3ms로 결정되었다(지도에서그림 4E). 다음으로, APD와 CaTD는 활성화 시간과 재발성/칼슘 제거의 지정된 퍼센트 사이의 시간 지속시간으로 측정되어 세포질을 형성했다. 평균 APD80및 CaTD80각각 343.1ms 및 442.6 ms로 결정되었다(그림 4F,G). 이전 생체 내 인간 연구는 APD에 대한 대리로서 1Hz에서 안정된 상태 동안 생체 내 인간의 심장에서 기록된 단극성 전기그램으로부터 측정된 활성화 회수 간격(ARI)을 보고합니다. 이러한 연구에서 ARI 값범위 250-450 ms29,30. 여기에 보고된 인간 심장 조각의 APD 값은 이전 ARI 값과 비슷합니다. 동작 아티팩트가 있는 영역은 APD 및 CaTD 계산에서 제거되었습니다. 마지막으로, 전압 및 칼슘 흔적의 상승 시간(즉, 업스트로크의 지속 시간)을 측정하고 매핑하였다. 이 것들은그림 4H및그림 4I각각. 평균 값은 각각 10.2ms 및 13.3 ms로 결정되었습니다. 진행 지점의 오른쪽에 있는 맵의 아티팩트는 시야 내의 속도 와이어 때문입니다. 마지막으로, 급성 약물 검사에서 이 슬라이스 모델의 사용은 심폐성 효과가 있는 것으로 알려진 화학요법 제인 독소루비신(DOX)과 함께 24시간 동안 슬라이스를 배양했을 때 입증되었다. 50 μM DOX슬라이스를 처리한 결과, 활성화 맵에서 알 수 있듯이 횡방향 전도 속도가 19.4±3.4cm/s에서 9.6 ±3.2cm/s로 감소했습니다.그림 5A, CV 벡터 맵에서그림 5B및 요약 데이터그림 5C. DOX 그룹에서 의 샘플 크기가 작을수록 DOX 처리 후 실행 불가능한 조각수가 더 많기 때문입니다. DOX 처리 된 조각에서 모션 아티팩트가 증가하면 정확한 APD 값계산이 방지되었습니다. 이중 전압 및 칼슘 이미징으로 측정할 수 있는 또 다른 중요한 매개 변수는 V입니다.M-Ca 지연, 조직 내의 강력한 흥분 수축 커플링을 결정하기 위해31. 이 매개 변수의 지연 또는 음수 값은 해로울 수 있습니다.
그림 1: 인간의 심장 조직형 슬라이스 제제. (A)인간의 심장은 검색 시 얼음냉이 심근탕(심폐용액과 심폐얼음의 혼합물)에 보관하였다. (B)좌심실 조직의 1cm3 큐브를 금속 조직 홀더에 장착하여 홀더의 뒷벽에 접착하여 산소 슬라이스 용액의 얼음 냉탕으로 옮겼다. (C)절단되면, 슬라이스는 개별 100 μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너에서 RT에서 산소 복구 용액으로 옮겨졌다. 메쉬 와셔는 조각을 컬링에서 유지하기 위해 조직을 덮었다. (D)장기 배양의 경우, 슬라이스는 PBS에서 세척되어 37°C에서 3mL의 조직 배지를 가진 6개의 웰 플레이트로 배양하였다. (E)섬유 방향을 보여주는 메이슨의 트리크롬 스테인드 슬라이스 섹션. (F)슬라이스로부터 기록된 대표적인 광학 작용 전위. (G)중앙(파란색)에서 진행된 슬라이스의 대표적인 활성화 맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 듀얼 카메라 광학 매핑 시스템. 수직 이미징 구성의 듀얼 카메라 광학 매핑 시스템. 시스템 부품은 다음과 같습니다 : 1) 듀얼 매핑을위한 마스터 및 슬레이브 카메라; 2) PDMS 젤티슈 욕조; 3) 여기 저기 및 방출 필터와 이색 거울을 수용 하는 필터 큐브; 4) 렌즈 홀더 및 렌즈; 및 5) 광원 (520 nm 녹색 LED). RH237 및 Rhod-2-AM을 사용하여 Vm과 칼슘의 이중 광학 매핑을 위한 오른쪽 세부 정보 필터 및 이색 거울 조합에 대한 설치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 단일 매개 변수 및 다중 파라미터 분석을 위한 오픈 소스 광학 매핑 데이터 분석 도구의 RHYTHM1.2 그래픽 사용자 인터페이스(GUI). 데이터 파일 로딩 옵션 및 파일 목록이 빨간색 상자에 표시됩니다. 데이터 분석 옵션은 녹색으로 표시된 데이터 분석 드롭다운 메뉴에 나열됩니다. 데이터 맵을 표시하기 위한 표시 창은 진한 파란색으로 표시됩니다. 듀얼 카메라 데이터를 동시 분석하기 위해 이중 매핑 데이터 파일을 연결하는 확인란은 보라색으로 표시됩니다. 동작 잠재력과 칼슘 과도 추적을 플롯하는 파형 창은 노란색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 인간의 조직형 심장 슬라이스 제제로부터 의전전및 칼슘 과도 매핑. (A)대표적인 광학 작용 잠재력(블랙) 및 칼슘 과도(부르고뉴). (B,C) Vm 및 칼슘 레코딩에서 획득한 활성화 맵은 각각 (D)전도 속도(CV) 벡터 맵. (E)칼슘 과도 부패 상수(Tau) 맵. (F,G) 작용 잠재력 지속 시간(APD80)및 칼슘 과도 지속 시간(CaTD80)맵은 각각 맵을 가시합니다. (H,I) 행동 잠재력과 칼슘의 상승 시간의 지도, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 독소루비신 치료는 횡전도 속도를 느리게 합니다. (A)50 μM(DOX)에서 독소루비신을 24시간 동안 배양한 슬라이스의 활성화 맵. (B)제어 및 DOX 슬라이스에서 전도 속도 벡터 맵. (C)제어 및 DOX 처리 된 슬라이스에서 계산 된 평균 횡반 전도 속도. *P&05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서, 우리는 심장마비로 체포된 인간의 심혼에서 실행 가능한 심장 조각을 얻고 세포간 전위 및 세포내 칼슘의 이중 광학 매핑을 사용하여 조각을 기능적으로 특성화하는 단계별 방법을 제시합니다. 보존된 세포 외 환경과 기본 세포 세포 커플링을 통해 인간의 심장 조각은 근본적인 과학적 발견과 약리학 제제 및 유전자 치료의 효능 및 심독성 검사를 위한 인간의 심장의 정확한 모델로 사용될 수 있습니다. 이 기술은 또한 부농 노드, 대실 노드 및 Purkinje 섬유와 같은 심장의 특정 영역의 구조적 기능 적 매핑을 허용합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 단기 연구에 가장 적합한 심장 슬라이스 생성, 이미징 및 분석을 위한 기본 단계를 나열합니다. 조직 슬라이스의 정적 배양은 장기간 에 걸쳐 심장 조직의 변화를 유도하는 것으로 나타났기 때문에 장기 연구를 위해 독자가 전기 기계적 자극12,,13,,14와같은 더 많은 생리 적 배양 조건을 통합하도록 권장합니다.
조직 건강을 유지하기 위한 여러 가지 단계에 주의를 기울여야 합니다. 예를 들어 심장 수확과 조직 슬라이스 사이의 시간을 최소화해야 합니다. 이전에 표시된 바와 같이21,심근 마비 체포의 연장 된 길이 변경 된 전기 생리학으로 이어질 수 있습니다. 또한 세포외 매트릭스 및 세포 세포 커플링의 무결성을 보존하기 위해 슬라이스 수집, 배양 및 기능 적 연구 중에 슬라이스 수집, 배양 및 기능 적 연구 중에 과도한 처리 및 조각 의 스트레칭을 피해야합니다. 슬라이스의 과도한 스트레칭은 전도 블록을 초래할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜에 설명된 모든 솔루션은 7.4의 pH로 유지되어야 합니다. 여기에 설명된 Tyrode의 솔루션은 HEPES를 사용하여 100% O2를사용하여 적절한 pH를 유지합니다. 중탄산나트륨은 pH를 제어하는 데 사용될 수 있지만, 이 용액은 95% O2 및 5% CO2로버블링되어야 한다. 마지막으로, 심장의 운송 및 슬라이스 중에, 하나는 조직 생존력을 유지하기 위해 가능한 한 동결 온도에 가깝게 유지되도록해야합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
NIH (R21 EB023106, R44 HL139248 및 R01 HL126802)에 의한 자금 지원은 Leducq 재단 (프로젝트 리듬)과 미국 심장 협회 후 펠로우십 (19POST34370122)에 의해 감사하게 인정됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
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