Summary
Этот протокол описывает процедуру секционирования и культивирования человеческих сердечных ломтиков для доклинического тестирования на наркотики и подробно описывает использование оптического картирования для записи трансмембранное напряжение и внутриклеточные сигналы кальция одновременно из этих ломтиков.
Abstract
Препараты сердечного ломтика человека недавно были разработаны в качестве платформы для исследований физиологии человека и тестирования терапии, чтобы преодолеть разрыв между животными и клиническими испытаниями. Многочисленные модели животных и клеток были использованы для изучения последствий наркотиков, но эти ответы часто отличаются у людей. Человеческие сердечные ломтики предлагают преимущество для тестирования на наркотики в том, что они непосредственно получены из жизнеспособных человеческих сердец. В дополнение к сохранению многоклеточных структур, клеточной связи и внеклеточной матрицы среды, человеческие сердечные ткани ломтики могут быть использованы для непосредственного тестирования влияния бесчисленных препаратов на взрослых человека сердечной физиологии. Что отличает эту модель от других препаратов сердца, таких как целые сердца или клинья, является то, что ломтики могут быть подвергнуты долгосрочной культуры. Таким образом, сердечные ломтики позволяют изучать острые, а также хронические эффекты наркотиков. Кроме того, способность собирать от нескольких сотен до тысячи ломтиков из одного сердца делает это высокопроизводительной модели для тестирования нескольких препаратов в различной концентрации и комбинаций с другими препаратами в то же время. Кусочки могут быть подготовлены из любой области сердца. В этом протоколе мы описываем подготовку ломтиков левого желудочка путем изоляции кубиков тканей от левой стены желудочка и срезания их на кусочки с помощью высокой точности вибрирующих микротомов. Эти ломтики могут быть либо подвергнуты острым экспериментам для измерения базовой сердечной электрофизиологической функции или культивируются для хронических исследований наркотиков. Этот протокол также описывает двойное оптическое картирование сердечных ломтиков для одновременных записей трансмембраных потенциалов и внутриклеточной динамики кальция для определения влияния исследуемых препаратов.
Introduction
Модели животных были ценным инструментом, используемым для понимания основных механизмов физиологии и патофизиологии человека, а также платформой для предварительного тестирования методов лечения различных заболеваний1. Большие успехи были приняты в области биомедицинских исследований на основе этих исследований на животных2. Тем не менее, значительные межвидовые различия существуют между человеческими и животными физиологии, в том числе мышей, крыс, морских свинок, кроликов, овец, свиней и собак3,4. В результате, были многочисленные лекарства, гены и клетки терапии, которые показали обещание во время стадии тестирования на животных, но не оправдали результатов в клинических испытаниях5. Чтобы преодолеть этот разрыв, изолированные сердечные миоциты и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) были разработаны в качестве моделей для проверки реакции физиологии человека на различные препараты и болезни6. Стволовые клетки полученных кардиомиоцитов были широко использованы в орган-на-чип систем в качестве суррогата сердца6,7,8. Однако полезность кардиомиоцитов, полученных из IPSC (iPSC-CMs), затрудняется их относительно незрелым фенотипом и отсутствием представления субпопуляляции кардиомиоцитов; зрелый миокард представляет собой сложную структуру, состоящую из нескольких сосуществующих типов клеток, таких как фибробласты, нейроны, макрофаги и эндотелиальные клетки. С другой стороны, изолированные кардиомиоциты человека являются электрически зрелыми, и различные субпопуляции кардиомиоцитов могут быть получены путем изменения параметров культивирования9. Тем не менее, эти миоциты обычно демонстрируют измененные действия потенциальных морфологии из-за отсутствия клеточной связи, быстрой де-дифференциации, и возникновение проаритмического поведения в пробирке10,11. Некоторые ограничения были рассмотрены 3D-модели клеточной культуры iPSC-CMs и сердечных миоцитов. Эти модели, которые включают сфероиды, гидрогеля эшафот инкапсулированные 3D культуры, инженерии тканей сердца (EHTs), и сердце-на-чип системы, использовать несколько сердечных клеток населения, таких как кардиомиоциты, фибробласты, и эндотелиальных клеток. Они либо самостоятельно собираются, либо собираются вдоль эшафота, чтобы сформировать 3D структуры, а некоторые даже воспроизводят сложную анисотропную природу миокарда. Сообщается, что эти модели имеют клетки зрелых фенотипов, сократительные свойства и молекулярные профили, похожие на сердечную ткань. Система «сердце-на-чип» также позволяет изучать системные эффекты при тестировании на наркотики и моделях заболеваний. Тем не менее, в пробирке на основе клеток модели не имеют родной внеклеточной матрицы и, следовательно, не может точно имитировать электрофизиологии уровня органа. Человеческие сердечные ломтики, напротив, имеют нетронутую внеклеточную матрицу и родные контакты между клетками, что делает их полезными для более точного изучения аритмогенных свойств человеческого миокарда.
Исследователи разработали человеческие сердечные органотипические ломтики в качестве физиологической доклинической платформы для острого и хронического тестирования на наркотики и для изучения сердечной электрофизиологии и прогрессирования сердечных заболеваний12,13,,14,15,16,17,18,19. По сравнению с iPSC-производными кардиомиоцитами, человеческие сердечные ломтики более точно реплицируют взрослую сердечную электрофизиологию сердца человека со зрелым кардиомиоцитом фенотипом. По сравнению с изолированными кардиомиоцитами человека, сердечные ломтики обладают физиологическим потенциалом действия из-за хорошо сохранившейся клеточной связи и внутреннего существования их родной внутри- и внеклеточной среды.
Этот протокол описывает процесс генерации сердечных ломтиков человека из целых донорских сердец, выполняя острые (т.е. часовые) и хронические (т.е. многодневные) исследования для проверки параметров сердечной электрофизиологии с помощью оптического картирования. Хотя этот протокол описывает только использование левой желудочковой (LV) ткани, он был успешно применен к другим регионам сердца, а также других видов, таких как мыши, крысы, морские свинки, и свиньи14,20,21,22. Наша лаборатория использует целые человеческие донорские сердца, которые были отклонены для трансплантации в течение последних 5 лет, но это возможно для этих же процедур, которые будут проводиться на любой донорской ткани образца сердца, полученные альтернативными средствами (например, левый желудочковый аппарат помощи "LVAD" имплантации, биопсии, миэктомии) до тех пор, как ткани имеют возможность быть разделены в кубики. Оптическое картирование используется для анализа в данном исследовании из-за его способности одновременно картировать оптические потенциалы действия и транзитор кальция с высоким пространственным (100 х 100 пикселей) и временным разрешением (1000 кадров/с). Можно также использовать альтернативные методы, такие как многоэлектронные массивы (MEA) или микроэлектроде, но эти методы ограничены относительно низкими пространственными разрешениями. Кроме того, MEAs были разработаны для использования с клеточными культурами, и острые микроэлектроды легче управлять для использования с целыми сердцами или большими клиньями ткани.
Цель статьи состоит в том, чтобы дать возможность большему числу исследователей использовать человеческие сердечные ткани для кардиологических электрофизиологических исследований. Следует отметить, что технология, описанная в данной статье, является относительно простой и полезной для краткосрочных исследований (порядка нескольких часов в дни). Более физиологической биомиметической культуры для долгосрочных исследований (на порядок недель) была обсуждена и описана рядом других исследований12,18,23. Электрическая стимуляция, механическая нагрузка и растяжение тканей являются выгодными механизмами кондиционирования, которые могут помочь ограничить начало ткани in vitro ремоделирования12,,18,,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные методы были выполнены в соответствии со всеми институциональными, национальными и международными руководящими принципами в области благосостояния человека. Исследование было одобрено Советом по обзору институтов (IRB) при Университете Джорджа Вашингтона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Донор человеческие сердца были приобретены из Вашингтона Регионального сообщества трансплантации, как deidentified отбрасываются ткани с одобрения от Университета Джорджа Вашингтона IRB. Высадившиеся сердца кардиоплегически арестовываются раствором холодной кардиоплегии (кровь в этом процессе очищается от сердца) и передаются в лабораторию при стандартных условиях пересадки органов.
1. Подготовка решений
- Для каждого сердца, сделать 4 L кардиоплегического раствора (110 мМ NaCl, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 mM NaHCO3, 1.2 mM CaCl2; pH 7.4). Храните 3 л при 4 градусов по Цельсию, а остальные 1 л при -20 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может быть сделано до нескольких дней вперед. - Свежеприготовленный 1 л каждый из нарезки раствора Tyrode (140 мМ NaCl, 6 мМ ККл, 1 мМ MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, 10 мМ 2,3-butanedione monoxime ; рН No 7,4) и решение для восстановления Tyrode (140 мМ NaCl, 4,5 мМ ККл, 1 мМ MgCl2, 1,8 мМ CaCl2, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, 10 мМ BDM; pH 7.4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Решения для нарезки и восстановления должны быть сделаны в день эксперимента и могут храниться при 4 градусах Цельсия. - Подготовьте стоковые растворы флуоресцентных красителей. Восстанавливаем чувствительный к напряжению краситель RH237 при 1,25 мг/мл в диметил-сульфоксиде (DMSO) и храните его в 30 хл aliquots при 4 градусах Цельсия. Восстановить кальций индикатор Rhod-2AM на 1 мг/ мл в DMSO. Хранить в 30 qL aliquots при -20 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Di-4-ANEPPS (решение на складе 1,25 мг/мл в DMSO) может быть использован в экспериментах для однокамерной визуализации трансмембранного потенциала в одиночку.- Перед началом эксперимента, sonicate красителей с помощью ультразвукового sonicator, по крайней мере 10 мин и разбавить каждый aliquot флуоресцентных красителей в 1 мЛ раствора восстановления. Добавьте Pluronic F-127(Таблица материалов)к Rhod-2AM в соотношении 1:1 перед разбавлением в растворе восстановления.
- Подготовьте стоковый раствор возбуждения-сокращения некуполера blebbistatin при 2 мг/мл раствор в DMSO. Хранить в aliquots при -20 градусов по Цельсию. В ходе экспериментов по оптическому картированию разбавляют стоковый раствор блефулистина до рабочей концентрации 5–10 мкМ в растворе восстановления Тирода.
- Сделайте новую культурную среду, дополнив среднюю 199 с 2% пенициллин-стрептомицин, 1x инсулин-трансферрин-селен (ITS) жидкие средства массовой информации дополнения, и 10 мМ БДМ. Фильтруй среду с помощью стерильного фильтра 0,2 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для фармакологических исследований возмущения, препараты могут быть добавлены непосредственно к среде культуры. Среда культуры может храниться при 37 градусов по Цельсию. - Сделать 4% агароз гель для ткани монтажа путем растворения низкоплавления точки агарозы в дистиллированной воде и нагревания смеси в микроволновой печи до полного растворения. Лечить агарозы в чашке Петри толщиной 5 мм и хранить при 4 градусах Цельсия.
2. Установка оборудования
- Вибрирующая установка микротома
- Калибровать вибрирующий микротом перед каждым экспериментом.
- Используя высокоточное вибрирующее микротом(Таблица материалов),загрузите керамическое режущее лезвие в держатель и прикрепите калибровочное устройство, оснащенное вибрирующий микротом. Выберите вариант регулировки лезвия из меню и выберите керамические для типа лезвия.
- Выберите опцию вибрировать, проверьте значение оси. Если это значение составляет 1 мкм, выйдите из меню калибровки. Если нет, тонко отрегулируйте калибровочный винт, прикрепленный к верхней части вибрируемой головы, и выберите опцию вибрировать. Повторите столько раз, сколько необходимо, чтобы установить ось к Зтл;1 мкм.
- Установите настройки вибратома до толщины 400 мкм резки, 0,02 мм/с для предсердной ткани и 0,04 мм/с для желудочковой ткани, 2 мм горизонтальной амплитуда вибрации и частоты вибрации 80 Гц.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как 400 мкм рекомендуется толщина, чтобы компенсировать повреждение клеток на разрезных поверхностях ломтика, тоньше ломтики также могут быть подготовлены. Учитывая, что предел диффузии кислорода составляет около 150 мкм, ломтики около 300 мкм часто используются14,17,18,24. - Заполните ванну вибрирующий микротом с нарезкой раствор при температуре 4 градуса цельсия и поддерживать температуру, окружая вне ванны со льдом, пополняя по мере необходимости по всему протоколу нарезки. Непрерывно оксигенировать нарезка раствора в ванне, восходящей с 100% кислородом во время нарезки.
- Настройка второго блюда с таким количеством 100 мкм нейлоновой сетки клеток ситечко и сетки шайбы по мере необходимости (одна клетка ситечко на ломтик). Заполните эту тарелку раствором восстановления и насытите его кислородом, восходящей со 100% кислородом при комнатной температуре (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение поддерживается на RT во время эксперимента.
- Калибровать вибрирующий микротом перед каждым экспериментом.
- Оптическая настройка картирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробное описание оптической картографической системы представлено в предыдущих публикациях16,,25,,26.- Прикрепите тканевую ванну с слоем геля полидилсилоксана (PDMS) внизу (для привязыв ломтиков) к системе перфузии. Циркулируйте 1 л раствора восстановления при температуре 37 градусов по Цельсию и оксигенируйте 100% кислородом, через систему перфузии с скоростью потока достаточно быстро, чтобы поддерживать температуру и четкое накопление перфузии ванны.
- Отрегулируйте фокус и выравнивание двух камер CMOS(Таблица материалов)с помощью цели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о выравнивании можно найти в предыдущих исследованиях26. - Используйте зеленый светодиодный источник света с длиной волны 520 и 5 нм, чтобы возбудить чувствительных к напряжению и кальциевых индикаторов красителей одновременно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Источник света возбуждения крепится к кубику фильтра возбуждения оптической картографической системы и отражается от 550-нм дихроического зеркала для эпицентрического освещения. Излучаемый свет собирается 1x объективом и делится вторым дихроическим зеркалом на 630 нм на компоненты напряжения и кальция, прежде чем он фильтруется 690 и 590 нм и 590 х 33 нм фильтры, соответственно, и записаны двумя камерами.
3. Протокол нарезки
- Готовясь к вскрытию тканей и экспериментам, приготовьте ванну с холодной кардиоплегией, смешивая замороженную и жидкую кардиоплегию. Держите сердце погружено в ванну кардиоплегии до сбора тканей для нарезки(Рисунок 1A).
- Приклеить готовый гель агарозы к задней части держателей металлической ткани вибратома.
- Определите левую желудочковую свободную стенку и нарежьте 1 см3 кубика ткани в холодном кардиоплегическом растворе. Затем, быстро смонтировать ткани блоков на держатели металлической ткани с эндокардиальных поверхностей вверх и прикрепить их к агарозе гель с использованием актуальных клей кожи (Рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранная область ткани должна быть вдали от крупных кровеносных сосудов, чтобы избежать отверстий в ломтиках. Плоскость секций примерно параллельна ориентации волокна в эндокардиальном слое(рисунок 1E)и плоскость секции может быть под небольшим углом из-за вращающейся анисотропии в более глубоком слое стенки LV. Для увеличения пропускной способности, до двух блоков ткани могут быть установлены бок о бок на том же держателе. - Перенесите металлические держатели в ванну вибратом, наполненную холодным кислородом нарезки раствором. Убедитесь, что кубики тканей полностью погружены в воду.
- Переместите лезвие к переднему краю ткани и включите вибратом, чтобы начать нарезку с заданными параметрами. Отбросьте первые несколько ломтиков, пока лезвие не выйдет за пределы трабекула в гладкую эндокардную ткань.
- После того, как каждый ломтик разрезается, тщательно передать ломтик кислородом (100% O2) ванна решения восстановления Tyrode в RT. Аккуратно поместите каждый ломтик в отдельных 100 м нейлоновой сетки клеточных ситечко и покрыть сеткой шайбы, чтобы сохранить ткани ломтики от керлинга (Рисунок 1C). Храните ломтики в растворе восстановления в течение по крайней мере 20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы могут храниться в ванне в таких условиях до 3–4 ч без вредных электрофизиологических эффектов.
4. Нарезка культивирования в статических условиях
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму вероятность заражения, стерилизовать щипцы с помощью бисера стерилизатор перед каждым шагом передачи.
- Готовясь к культуре, тщательно перенесите каждый ломтик в отдельные колодцы 6-го колодца, наполненного стерильным фосфатно-буферизированным солевым раствором (PBS). Аккуратно раскачивайте хорошо пластину, чтобы промыть кусочки раствора восстановления.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента, ломтики должны быть выставлены только в BSL2 ламинар потока культуры капот, и стерильные щипцы должны быть использованы для обработки ткани. - Передача ломтиков в колодцы свежих PBS тщательно промыть и стерилизовать ломтики для культуры. Выполните этот шаг мыть 3x, чтобы обеспечить полное удаление раствора восстановления от ломтиков.
- Передача ломтиков в отдельные колодцы 6 хорошо пластины заполнены 3 мл предварительно нагревается (37 градусов по Цельсию) культуры среды (с или без наркотиков, Рисунок 1D). Поместите пластины на орбитальный шейкер при 20 об/мин в увлажненный инкубатор при 37 градусах с 30% O2 и 5% CO2. Аспирировать и заменять культурную среду каждые 48 ч.
5. Функциональная характеристика и оптическое картирование
- Для оптических картографических исследований либо сразу после нарезки или после культивирования, тщательно передать ломтик интереса к тканевой ванне системы перфузии на 37 градусов по Цельсию со 100% O2 в решении восстановления Tyrode, и приколоть вниз четыре угла к слое геля PDMS при применении минимального растяжения (т.е., как раз достаточно, чтобы сохранить ломтик от легко движущихся в условиях потока). Разрешить ломтики отдохнуть в этой ванне с циркулирующим раствором восстановления в течение примерно 10 минут.
- Добавьте 0,3–0,5 мл разбавленного блефулистина в резервуар, содержащий раствор для восстановления. Пусть ломтик инкубировать с blebbistatin в течение примерно 10 минут.
- Восстановление 30 мл чувствительного к давлению красителя, RH237, в 1 мл раствора восстановления при 37 градусов по Цельсию. Выключите насосы и медленно загрузите 0,2-0,3 мл рабочего раствора красителя на поверхность ломтика в течение 30 с. Разрешить ломтик инкубировать в красителе с насосами на период до 90 с, а затем включить насосы снова, чтобы любой избыток, чтобы вымыть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует проявлять осторожность, чтобы применить краситель равномерно по всему ломтику. Кроме того, очень медленное применение красителя имеет решающее значение для предотвращения красителя от плавающей от ломтика. - Повторите шаг 5.3, чтобы восстановить индикатор кальция запасов Rhod-2AM и загрузить его на ломтик.
- Сосредоточьте камеры на срезе, отрегулируя расстояние от объектива.
- Позиция биполярного платины иридия ходить электрод так, что его кончик находится в контакте с серединой ломтика и применять ходить стимулы увеличения амплитуды, чтобы определить минимальный порог темпа, необходимых для получения электрического ответа. Пейс ломтик на 1 Гц с 2 мс шириной импульса продолжительность в 1,5 раза амплитуду заранее порог темпа. Поместите крышку над ломтиком ткани.
- Осветите ломтик с помощью источника света для светодиодных возбуждений на 520 и 5 нм. Запись испускаемых сигналов напряжения и кальция с двумя камерами CMOS на 1000 кадров / с.
- Проверьте запись на хорошее качество сигнала и подавленные артефакты движения(рисунок 1F). Добавьте больше blebbistatin к резервуару в шагах 0.1 mL до тех пор пока движение не будет больше не производит артефакты в оптических сигналах. Добавить больше красителя, если это необходимо, для улучшения качества сигнала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошее качество сигнала относится к качественно оцененной большой амплитуде сигнала и низкому фоновой шуму в зарегистрированных оптических сигналах.
6. Обработка данных с ПОМОЩЬЮ RHYTHM1.2
ПРИМЕЧАНИЕ: RHYTHM1.2 — это пользовательский интерфейс на основе MATLAB, который используется для отображения, состояния и анализа оптических картографических данных, полученных с помощью однокапуационных оптических картографических систем(рисунок 3). Он используется в сочетании с системой визуализации.
- Загрузка файлов данных
- Загрузите файлы данных в RHYTHM1.2, выбрав любое из четырех окон дисплея на экране и используя кнопки Select Directory и Load.
- Программа подскажет пользователю выбрать данные камеры 1 или камеры 2 для записи с двойным напряжением и кальцием. Выберите камеру 1 для сигнала напряжения.
- Повторите процесс загрузки сигнала кальция (Камера 2) в одно из соседних окон дисплея.
- Выберите флажок Dual Data Linking между двумя выбранными окнами дисплея, чтобы связать два окна дисплея, так как два набора данных записываются из одного региона на срезе.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, если поддерживается одно и то же поле зрения, эта функция может быть использована для связи двух изображений, которые были получены в отдельных точках времени, чтобы увидеть временной ответ в электрофизиологии исследуемого препарата. Двойное нажатие любого окна дисплея позволяет максимально использовать это одно окно, чтобы обеспечить простоту анализа.
- Кондиционирование сигнала
- Выберите анализ данных (ru) Параметры состояния для состояния напряжения и оптических картографических данных кальция до дальнейшего анализа.
- Используйте функцию«Удалить фон»для удаления пикселей, которые не содержат сигнала, основанного на пороге флуоресцентной интенсивности (порог фона BG) и степени кластеризации пикселей (порог возбуждения ).
- Выполните пространственное усреднение оптических картографических данных с помощью функции«Бин»для улучшения качества сигнала.
- Фильтр оптического картографирования данных с помощью фильтра полоса пройти с функцией"Фильтр".
- Используйте функцию«Дрифт»для удаления базового дрейфа в оптическом картографическом сигнале.
- Используя функцию«Нормализация»,нормализуйте оптические картографические данные с каждого пикселя, чтобы иметь максимальную амплитуду 1.
- Используйте функцию«Обратный сигнал»,чтобы инвертировать следы кальция для дальнейшего анализа.
- Нажмите Display Wave, чтобы выбрать условный след из любого данного места в окне дисплея и наметить его в окне Waveform. Отрегулируйте параметры кондиционирования сигнала, чтобы получить оптимальный потенциал действия и переходные следы кальция.
- Расчет скорости проводимости (CV)
ПРИМЕЧАНИЕ: Время активации определяется как время максимальной производной оптического сигнала (dF/dtmax).- Выберите анализ данных (ru) Карта активации и введите время начала и время окончания, чтобы охватить один потенциал действия в следе. Нажмите расчет и выберите интересующий регион (ROI) для отображения карты активации выбранного региона(рисунок 1G).
- Выберите анализ данных (ru) CV Карта и аналогичным образом, выбрать время начала и конец времени. Введите значения межпиксельного разрешения на основе настройки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1x систем увеличения межпиксельное разрешение составляет 0,1 мм в направлении X и Y. - Нажмите на Generate Vec. Кнопка карты для выбора рентабельности инвестиций и отображения векторов CV в этом регионе. Среднее, среднее, стандартное отклонение и количество векторов, включенных в анализ, а также средний угол распространения векторов CV в выбранном регионе вычисляются и отображаются в разделе Статистика.
- Нажмите кнопку Draw Line, чтобы нарисовать линию вдоль заданного направления распространения. Будут выбраны все векторы резюме в этом направлении. Нажмите Calculate CV, чтобы использовать только выбранные векторы резюме для расчета статистики, которая будет отображаться в разделе Статистика.
- Потенциальная продолжительность действия (APD) и расчет переходной продолжительности кальция (CaTD)
ПРИМЕЧАНИЕ: APD является еще одним фундаментальным параметром сердечной электрофизиологии. Карты APD могут быть созданы путем определения разницы во времени между активацией и определенным процентом реполаризации каждого оптического потенциала действия. Неоднородность APD или пролонгация и сокращение APD могут быть использованы для прогнозирования восприимчивости к аритмии.- Чтобы вычислить APD в RHYTHM1.2, выберите анализ данных APD / CaT Карта.
- Выберите время начала и время окончания, чтобы охватить один полный потенциал действия. Установите минимальное и максимальное значение APD/CaTD для удаления любых выбросов (например, 0 и 1000 мс, соответственно). Введите процент реполаляризации, которая будет определять APD, например, 0,8 для APD80/CaTD80 или 0,5 для APD50/CaTD50.
- Нажмите Региональный APD Calc, чтобы выбрать рентабельность инвестиций и создать карту APD. Среднее, среднее, стандартное отклонение и количество пикселей, включенных в анализ, будут отображаться в разделе Статистика.
- Время подъема
ПРИМЕЧАНИЕ: Время подъема является еще одним электрофизиологическим параметром, который может быть измерен по оптическим сигналам напряжения и переходных следов кальция. Он дает оценку того, сколько времени требуется для деполяризации ионных каналов, чтобы вызвать потенциал действия, или сколько времени требуется для кальция, который будет выпущен в цитоплазму из саркоплазмической ретикулум. Оптическое время подъема не является идеальной заменой времени подъема, измеряемого микроэлектродами, и может быть не столь чувствительным к изменениям в деполяризации, поскольку потенциал оптического действия является средним трансмембранным потенциалом многих клеток. Пространственное и временное разрешение системы также может повлиять на оптические значения времени подъема. Тем не менее, он все еще может быть использован для прогнозирования больших изменений в деполяризации27.- Чтобы определить время подъема, выберите анализ данных Время подъема.
- Выберите время начала и время окончания, чтобы выбрать вверх по одному потенциалу действия или преходящему кальцию. Введите значения Start% и End% (обычно 10-90% рекомендуется для нешутовых сигналов), что позволяет пользователю выбирать только части сигнала без включения шума в случае шумных сигналов.
- Нажмите Вычислить, чтобы выбрать рентабельность инвестиций и определить среднее, среднее, стандартное отклонение и количество пикселей, включенных в анализ времени роста.
- Распад кальция
ПРИМЕЧАНИЕ: Для следов кальция, время постоянная распада кальция переходных может быть определена. Это позволяет анализировать изменения в удалении ионов кальция из цитоплазмы обратно в СР.- Выберите анализ данных (ru) Кальций Распад и введите время начала и конца времени, чтобы охватить всю часть распада одного кальция переходного сигнала.
- Нажмите Calculate Tau, чтобы выбрать рентабельность инвестиций и определить среднее, среднее, стандартное отклонение и количество пикселей, включенных в анализ постоянного времени распада кальция.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Человеческие органотипические ломтики были собраны из левого желудочка донорского человеческого сердца в соответствии с протоколом, описанным выше и иллюстрированным вРисунок 1. Двойная камера оптической картографической системы, как, что вРисунок 2был использован в вертикальной конфигурации изображения для выполнения одновременного оптического картирования напряжения и кальция около 1 ч после завершения протокола нарезки. Данные были проанализированы с помощью RHYTHM1.2 (Рисунок 3), инструмент анализа оптических картографических данных с открытым исходным кодом, ранее опубликованный нашей лабораторией и свободно доступный на Github (https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2). Измеренные электрофизиологические параметры иллюстрируются вРисунок 4. Потенциал действия и переходные следы кальция были обусловлены сигналом, а репрезентативные следы, используемые в дальнейшем анализе, иллюстрируются вРисунок 4A. Время активации было определено для каждого пикселя и изохрональные карты времени активации, определяемого по напряжению и следов кальция, иллюстрируются вРисунок 4B,C. Обратите внимание, что активация в изохрон кальция отстает от напряжения, как ожидалось. Векторы резюме, построения вРисунок 4Dбыли рассчитаны с использованием времени активации и известного межпиксельного разрешения. Среднее резюме в поперечном направлении было определено 21,2 см/с в этом срезе. Это значение резюме сравнимо с ранее сообщалось желудочкового поперечного РЕЗЮМЕ, измеренного из высадивных целых человеческих сердец (24 и 28 и 7 см/с в сердцах с диффузным и пятнистым фиброзом)28. Константа преходящего кальция была измерена путем установки полиномиальной к разлагающейся части следов кальция, а средняя константа распада была определена как 105,3 мс в этом ломтике (карта вРисунок 4E). Далее, APD и CaTD были измерены как продолжительность времени между временем активации и указанным процентом репоаляризации/удаления кальция, формой цитоплазмы. Средний APD80и CaTD80были определены в 343,1 мс и 442,6 мс, соответственно (Рисунок 4F,Г). Предыдущие in vivo человеческих исследований доклад активации восстановления интервал (ARI) измеряется из однополярных электрограмм, записанных из in vivo человеческих сердец во время устойчивого ходить состояние на 1 Гц в качестве суррогата для APD. Значения ОРВИ в этих исследованиях варьируются от 250 до 450 мс29,30. Значения APD от человеческих сердечных ломтиков, о чем сообщалось здесь, сопоставимы с предыдущими значениями ОРВИ. Регионы с артефактами движения были удалены из расчетов APD и CaTD. Наконец, были измерены и сопоставлены время подъема (т.е. продолжительность подъема) следов напряжения и кальция. Они показаны вРисунок 4HИРисунок 4IСоответственно. Средние значения были определены в 10,2 мс и 13,3 мс, соответственно. Артефакты на картах справа от точки темпа из-за ходить провода в поле зрения. Наконец, использование этого фрагмента модели в остром тестировании на наркотики было продемонстрировано, когда ломтики были культивируются в течение 24 ч с доксорубицином (DOX), химиотерапевтический агент, как известно, кардиотоксические эффекты. Обработка ломтиков с 50 МЛ DOX привела к снижению скорости поперечной проводимости с 19,4 и 3,4 см/с до 9,6 х 3,2 см/с, о чем свидетельствуют карты активации вРисунок 5A, карты векторов CV вРисунок 5B, и сводные данные вРисунок 5C. Меньший размер выборки в группе DOX был обусловлен большим числом нежизнеспособных ломтиков после обработки DOX. Увеличенные артефакты движения в обработанных DOX срезах помешали вычислению точных значений APD. Другим важным параметром, который может быть измерен с помощью двойного напряжения и визуализации кальция, является VМ-Ca задержки, чтобы определить надежные возбуждения-сокращения связи в ткани31. Задержки или отрицательные значения этого параметра могут быть пагубными.
Рисунок 1: Препарат сердечного органотипического ломтика человека. () Человеческиесердца хранились в ледяной кардиоплегической ванне (смесь решения кардиоплегии и кардиоплегии льда) при поиске. (B) 1 см3 кубика левой желудочковой ткани были вырезаны и установлены на держатель металлической ткани с 4% агарозного геля приклеены к задней стенке держателя и переданы в ледяную ванну кислородом нарезки раствора. (C) После вырезать, ломтики были переданы кислородом решение восстановления на RT в отдельных 100 мкм нейлоновой сетки клеточных ситечко. Сетчатые шайбы покрывали ткани, чтобы сохранить ломтики от керлинга. (D) Для долгосрочной культуры, ломтики были вымыты в PBS и культивируются в 6 пластин скважины с 3 мл ткани среды при 37 градусов по Цельсию. (E) Мейсон в трихром окрашенных ломтик разделе с указанием волокна ориентации. (F) Представитель оптического потенциала действия, записанные из среза. (G) Представитель активации карты среза темп в центре (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Двойная камера оптической картографической системы. Двойная камера оптической картографической системы в вертикальной конфигурации изображения. Системные части включают: 1) мастер и раб камеры для двойного отображения; 2) тканевая ванна с гель PDMS; 3) кубики фильтра которые устанавливают excitation и фильтры излучения и зеркала dichroic; 4) держатели линз и линзы; и 5) возбуждение источника света (520 нм зеленого светодиода). Вставка на правых деталях фильтра и дихроических зеркальных комбинаций для двойного оптического картирования Vm и кальция с использованием RH237 и Rhod-2-AM, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: графический пользовательский интерфейс RHYTHM1.2 (GUI) инструмента оптического картографического анализа данных с открытым исходным кодом для анализа одного параметра и мультипараметрового анализа. Параметры загрузки файла данных и список файлов отображаются в красном поле. Параметры анализа данных перечислены в меню выпадения анализа данных, указанном зеленым цветом. Окна отображения для отображения карт данных обозначены темно-синим цветом. Чекбоксы для связи двойных картографических файлов данных для одновременного анализа данных двойной камеры отображаются фиолетовым цветом. Окно волновой формы для построения потенциала действия и переходных следов кальция отображается желтым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Трансмембраненный потенциал и транзитор кальция, отображаемые из препарата человеческого органотипического сердечного ломтика. (A) Представитель оптического потенциала действия (черный) и кальций переходный (бордовый). (B,C) Карты активации, полученные из записей Vm и кальция, соответственно. (D) Векторная карта скорости поведения (CV). (E) Кальций переходный распад постоянной (Тау) карта. (F,G) Потенциальная продолжительность действия (APD80) и преходящая продолжительность кальция (CaTD80)карта, соответственно. (H,I) Карты времени подъема upstrokes потенциала действия и кальция преходящего, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Лечение доксорубицином замедляет скорость поперечной проводимости. (A) Карты активации из ломтиков, культивируемых в течение 24 часов без (контроля) и с доксорубицином при 50 мкм (DOX). (B) Вектор скорости поведения карты от контроля и DOX ломтиками. (C) Средняя скорость поперечной проводимости, рассчитанная из контрольных и обработанных DOX ломтиков. ЗП йтт; 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем пошаговые методы получения жизнеспособных сердечных ломтиков из кардиоплегически арестованных человеческих сердец и функционально характеризуем ломтики с помощью двойного оптического картирования трансмембрана потенциала и внутриклеточного кальция. С сохраненной внеклеточной средой и родной клеточной связи, человеческие сердечные ломтики могут быть использованы в качестве точной модели человеческого сердца для фундаментальных научных открытий и для эффективности и кардиотоксичности тестирования фармакологических агентов и генной терапии. Технология также позволяет структурно-функциональное картирование конкретных областей сердца, таких как синоатриальный узел, атриовентрикулярный узел, и Purkinje волокон. В протоколе, описанном здесь, перечислены основные шаги для генерации сердечного среза, визуализации и анализов, которые лучше всего подходят для краткосрочных исследований. Статическая культура ломтиков ткани, как было показано, вызывают изменения в сердечной ткани в течение длительных периодов времени, поэтому для долгосрочных исследований, мы призываем читателя включить более физиологические условия культуры, такие как электромеханическая стимуляция12,13,14.
Следует позаботиться о ряде шагов для поддержания здоровья тканей. Например, время между уборкой сердца и нарезкой тканей должно быть сведено к минимуму. Как показано ранее21, расширенная продолжительность кардиоплегического ареста может привести к изменению электрофизиологии. Кроме того, для сохранения целостности внеклеточной матрицы и клеточной связи следует избегать чрезмерной обработки и растяжения ломтиков во время сбора среза, культивирования и функциональных исследований. Чрезмерное растяжение ломтиков может привести к проведению блоков. Кроме того, все решения, описанные в этом протоколе, должны храниться на уровне рН 7,4. Решение Tyrode описано здесь использует HEPES для поддержания надлежащего рН с помощью 100% O2. Бикарбонат натрия может быть использован для контроля рН вместо этого, но это решение должно быть пузыриться с 95% O2 и 5% CO2. Наконец, во время транспортировки и нарезки сердца, следует убедиться, что кардиоплегия и нарезка раствора хранятся как можно ближе к температуре замерзания, как это возможно, чтобы сохранить жизнеспособность ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Финансирование NIH (гранты R21 EB023106, R44 HL139248 и R01 HL126802), фондом Leducq (проект RHYTHM) и Американской ассоциацией сердца постдокторской стипендии (19POST34370122) с благодарностью признаны.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
- Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
- Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today's translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
- Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
- Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
- Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
- Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
- Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
- George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
- Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
- Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
- Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).
