Summary
本プロトコルは、前臨床薬物検査のためのヒト心臓スライスの切り離しおよび培養の手順を説明し、これらのスライスから膜貫通電圧および細胞内カルシウム信号を同時に記録するための光学マッピングの使用について詳述する。
Abstract
ヒト心臓スライス製剤は、動物と臨床試験の間のギャップを埋めるために、ヒト生理学研究と治療試験のプラットフォームとして最近開発されました。薬物の効果を調べるために多くの動物および細胞モデルが使用されてきたが、これらの反応はヒトにおいてしばしば異なる。ヒトの心臓スライスは、実行可能な人間の心臓から直接派生するという点で、薬物検査の利点を提供します。保存された多細胞構造、細胞と細胞の結合、および細胞外マトリックス環境に加えて、ヒト心臓組織スライスは、成人ヒト心臓生理学に対する無数の薬物の効果を直接テストするために使用することができる。このモデルを心臓全体やくさびなどの他の心臓製剤と区別しているのは、スライスが長期的な培養を受けることができてしまうということです。したがって、心臓スライスは、薬物の急性および慢性の影響を研究することを可能にする。さらに、単一の心臓から数百から千のスライスを収集する能力は、同時に様々な濃度と他の薬物との組み合わせでいくつかの薬物をテストするハイスループットモデルになります。スライスは、心臓の任意の領域から調製することができます。このプロトコルでは、左心室自由壁から組織キューブを単離し、高精度振動ミクロトームを用いてスライスに切り離すことによって、左心室スライスの調製について説明する。これらのスライスは、その後、急性実験を行ってベースライン心臓電気生理学的機能を測定するか、慢性薬物研究のために培養することができる。このプロトコルはまた、膜貫通電位と細胞内カルシウムダイナミクスの同時記録のための心臓スライスの二重光学マッピングを記述し、調査中の薬物の効果を決定する。
Introduction
動物モデルは、ヒト生理学および病態生理学の基礎的なメカニズムを理解するために使用される貴重なツールであり、また様々な疾患を治療するための治療法の予備試験のためのプラットフォームである1。これらの動物研究2に基づく生物医学研究の分野で大きな進歩がとられています。しかし、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、およびイヌ,3、4を含む、ヒトと動物の生理学の3間に有意な種間の違いが存在する。その結果、動物実験の段階で約束を示したが、臨床試験5で結果に応えられなかった多くの薬物、遺伝子、および細胞療法があった。このギャップを埋めるために、孤立した心筋細胞およびヒト人工多能性幹細胞(iPSC)は、様々な薬物および疾患に対するヒト生理学の応答を試験するモデルとして開発された6。幹細胞由来心筋細胞は、心臓,6,7,87の代理として臓器オンチップ系で広く使用されている。68しかし、iPSC由来の心筋細胞(iPSC-CM)の有用性は、比較的未熟な表現型と心筋細胞亜集団の表現の欠如によって妨げられる。成熟した心筋は、線維芽細胞、ニューロン、マクロファージ、内皮細胞などのいくつかの共存する細胞タイプから構成される複雑な構造である。一方、孤立したヒト心筋細胞は電気的に成熟しており、培養パラメータ9を改変することにより異なる心筋細胞亜集団を得ることができる。それでも、これらの筋細胞は一般的に、細胞間結合の欠如、急速な分化、およびvitro10,11,11における不整脈行動の発生による変化作用電位形態を示す。いくつかの制限は、iPSC-CMおよび心臓筋細胞の3D細胞培養モデルによって対処された。これらのモデルは、スフェロイド、3D培養物をカプセル化したヒドロゲル足場、設計された心臓組織(EHT)、および心臓オンチップシステムを含み、心筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞などの複数の心臓細胞集団を使用する。彼らは自己集合するか、足場に沿って組み立てて3D構造を形成し、心筋の複雑な異方性の性質を再現するものもあります。これらのモデルは、成熟した型の細胞、収縮特性、および心臓組織に類似した分子プロファイルを有することが報告されている。心臓オンチップシステムはまた、薬物検査および疾患モデルにおける全身効果の研究を可能にする。しかし、インビトロ細胞ベースモデルは、天然の細胞外マトリックスを欠いているため、臓器レベルの電気生理学を正確に模倣することはできません。対照的に、ヒト心臓スライスは、無傷の細胞外マトリックスおよびネイティブ細胞間接触を有し、ヒト心筋の不整脈特性をより正確に調べるのに有用である。
研究者は、急性および慢性薬物検査のための生理学的前臨床プラットフォームとしてヒト心臓組織学的スライスを開発し、心臓電気生理学および心臓病進行を研究するために12、13、14、15、16、17、18、19。12,13,14,15,16,17,18,19iPSC由来の心筋細胞と比較すると、ヒト心臓スライスは成熟した心筋細胞表現型を有する成人ヒト心臓電気生理学をより忠実に複製する。単離されたヒト心筋細胞と比較すると、心臓スライスは、良好に保存された細胞と細胞の結合と、その本来の細胞内および細胞外環境の本質的な存在のために、生理作用の可能性のある持続時間を示す。
このプロトコルは、ドナー心臓全体からヒト心臓スライスを生成するプロセスを記述し、急性(すなわち、時間の長さ)および慢性(すなわち、日-長い)研究を行い、光学マッピングを介して心臓電気生理学パラメータをテストする。このプロトコルは左心室(LV)組織の使用のみを説明するが、それは正常にマウス、ラット、モルモット、および豚14、20、21、22,20,21などの他の種だけでなく、心臓の他の領域に適用されています。,22私たちの研究室では、過去5年間移植を拒否されたヒトドナー心臓全体を使用していますが、組織がキューブに切り離される能力を持っている限り、代替手段(例えば、左心室補助装置[LVAD]移植、生検、子宮摘出)によって得られたドナー心臓サンプル組織に対してこれらの同じ手順を行うことは可能です。光学マッピングは、高空間(100 x 100ピクセル)と時間(>1,000フレーム/s)解像度で光学的作用電位とカルシウム過渡を同時にマッピングする能力があるため、この研究では分析に使用されています。多電極アレイ(MEA)や微小電極などの代替方法も使用できますが、これらの手法は比較的低い空間解像度によって制限されます。さらに、MEAは細胞培養用に設計されており、鋭利な微小電極は、心臓全体または大きな組織ウェッジで使用するためにより簡単に管理できます。
この記事の目的は、より多くの研究者が心臓電気生理学研究のためにヒト心臓組織を使用できるようにすることです。この記事に記載されている技術は、比較的単純で、短期間の研究(数時間から数日の順序で)に有益であることを留意すべきです。より多くの生理学的な生物模倣文化は、より長期にわたる研究(週の順)に関して議論され、他の多くの研究によって説明されてきた1212、18、23。,18,23電気刺激,、機械的負荷、および組織ストレッチは、12、18、23,18のインビトロ組織再モデリングの発症を制限するのに役立つ有利な調整機構である。23
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Protocol
記述されたすべての方法は、人間の福祉のためのすべての制度的、国家的、国際的なガイドラインに従って行われてきました。研究は、ジョージワシントン大学の機関審査委員会(IRB)によって承認されました。
注:ドナーの人間の心臓は、ジョージワシントン大学IRBの承認を得て廃棄された組織を識別解除したため、ワシントン地域移植コミュニティから取得されました。外植えられた心臓は、氷冷心プレギア(この過程で心臓から血液を取り除いた)の溶液で心臓を洗い流すことによって心前的に逮捕され、標準的な臓器移植条件下で実験室に移される。
1. ソリューションの準備
- 心臓ごとに、4 Lの心肢麻痺溶液(110 mM NaCl、16 mM KCl、162mM MgCl 2、10 mM NaHCO 3、1.2 mM CaCl2;pH= 7.4)を作ります。33 Lを4°Cで保存し、残りの1Lを-20°Cで保管します。
注:このソリューションは、数日前まで行うことができます。 - タイロードのスライス溶液(140 mM NaCl、6 mM KCl、1 mM MgCl 2、1.8 mM CaCl2、10mMグルコース、10 mMグルコース、10 mMのグルコース)をそれぞれ1Lずつ準備し、 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-ブタンジオン単一体 [BDM]; pH = 7.4) およびタイロードの回収液 (140 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl22,10 mMグルコース, 10 mM HEPES, 10 mM BH;2
注:スライスと回収の両方のソリューションは、実験の日に行われるべきであり、4°Cで保存することができます。 - 蛍光色素のストック溶液を準備します。1.25 mg/mLで1.25mg/mLで耐圧性染料RH237を再構成し、4°Cで30μLアリコートに保存します。DMSO で 1 mg/mL でカルシウムインジケーター Rhod-2AM を再構成します。.-20 °Cで30μLのアリコートで保管してください。
注:Di-4-ANEPPS(DMSOで1.25mg/mLのストック溶液)は、膜貫通電位単独の単一カメライメージングの実験に使用することができます。- 実験開始前に、超音波超音波処理器を使用して少なくとも10分間色素を超音波処理し、1mLの回収液で蛍光色素の各アリコートを希釈する。回収液中希釈前に1:1の比率で、Pluronic F-127(材料表)をRhod-2AMに加えます。
- DMSOで2mg/mL溶液で励起収縮を解除したブレビスタチンのストック溶液を調製する。アリコートで-20 °Cで保管してください。光学マッピング実験中に、タイローデの回収液中の5-10 μMの作業濃度にブレビスタチンのストック溶液を希釈します。
- 培地199を2%ペニシリン連鎖菌、1xインスリントランスフェリンセレン(ITS)液体培地サプリメント、および10 mM BDMで補充することにより、新鮮な培地を作ります。0.2 μmの滅菌フィルターを使用して培地をフィルターします。
注:薬理学的摂動研究のために、薬物は、培養培地に直接添加することができます。培養液は、37°Cで保存することができる。 - 蒸留水に低融点アガロースを溶解し、完全に溶解するまでマイクロ波で混合物を加熱することによって、組織実装のための4%アガロースゲルを作ります。厚さ5mmのペトリ皿でアガロースを治し、4°Cで保管してください。
2. 機器のセットアップ
- 振動マイクロトームのセットアップ
- 各実験の前に振動ミクロトームを較正します。
- 高精度振動ミクロトーム(材料表)を使用して、セラミック切断ブレードをホルダーに積み込み、振動ミクロトームを備えた校正装置を取り付けます。メニューからブレード調整オプションを選択し、ブレードの種類にセラミックを選択します。
- 振動オプションを選択し、Z 軸の値を確認します。この値が <1 μm の場合は、調整メニューを終了します。ない場合は、振動ヘッドの上部に取り付けられたキャリブレーションねじを細かく調整し、振動オプションを選択します。必要に応じて何度も繰り返して、Z 軸を <1 μm に設定します。
- ビブラートの設定を400 μm切断厚、心房組織の場合は0.02 mm/sのアドバンススピード、心室組織の場合は0.04 mm/秒の前進速度、2mmの水平振動振幅、80Hz振動周波数に設定します。
注:スライスの切断面の細胞損傷を補うために400μmが推奨される厚さですが、薄いスライスも用意することができます。酸素拡散限界が約150μmであることを考えると、300 μmの周りのスライスは、多くの場合、14、17、18、2417,18,24を使用します。14 - 4°Cでスライス溶液で振動ミクロトームの浴を充填し、スライスプロトコル全体で必要に応じて補充、氷で浴の外側を囲んで温度を維持します。スライス中に100%酸素を泡立て、お風呂内のスライス溶液を継続的に酸素化します。
- 必要に応じて100 μmのナイロンメッシュセルストレーナーとメッシュワッシャー(スライスごとに1つのセルストレーナー)を備えた2番目の皿をセットアップします。この皿に回収液を充填し、室温(RT)で100%酸素を泡立て、酸素化します。
注: このソリューションは、実験中に RT で維持されます。
- 各実験の前に振動ミクロトームを較正します。
- 光マッピングの設定
注: 光マッピング システムの詳細については、前の資料16、25,、26に記載されています。- ポリジメチルシロキサン(PDMS)ゲル層を下部に(スライスをピン留めする)と組織浴を灌流システムに取り付けます。回収液の1Lを37°Cで循環し、酸素を100%酸素で、水温の温度と透明な蓄積を維持するのに十分な速さで流量システムを介して、お風呂の透過液を透明に保ちます。
- ターゲットを使用して、2 台の CMOS カメラ (表)の焦点と位置合わせを調整します。
注:アライメントの詳細については、以前の研究26で見つけることができます。 - 520 ± 5 nm の波長の緑色の LED 光源を使用して、電圧感受性とカルシウムインジケーターの色素を同時に励起します。
注:励起光源は光学マッピング システムの励起フィルター立方体に取り付けられ、エピセントリック照明用の 550 nm の二色性ミラーから反射されます。放出された光は1xレンズによって収集され、630 nmの第二次鏡によって電圧およびカルシウム成分に分割され、それぞれ690±50nmおよび590±33nmのフィルターで濾過され、2台のカメラによって記録される。
3. スライスプロトコル
- 組織解剖と実験の準備ができたら、凍結した心筋機能と液体の心筋機能を混合して氷冷心筋プレギアの浴を準備します。心臓を、スライスのための組織採取まで心筋槽に沈めておく(図1A)。
- ビブラートメの金属組織ホルダーの背面に、あらかじめ作られたアガロースゲルを接着します。
- 左心室自由壁を特定し、冷たい心肢麻痺溶液で組織の1 cm3キューブを切断します。次いで、内心表面を上に向けた金属組織ホルダーに組織ブロックを素早く取り付け、局所皮膚接着剤を使用してアガロースゲルに取り付けます(図1B)。
注:選択した組織領域は、スライスの穴を避けるために大きな血管から離れている必要があります。断面の平面は、心内膜層(図1E)の繊維配向とほぼ平行であり、断面の平面は、LV壁のより深い層の回転異方性のためにわずかな角度ですることができる。スループットを向上させるために、最大2つの組織ブロックを同じホルダーに並べて取り付けることができます。 - 金属ホルダーを氷冷酸素スライス溶液で満たされたビブラートメ浴に移します。組織キューブが完全に水没していることを確認します。
- ブレードを組織の前端に移動し、ビブラートメをオンにして、プリセットパラメータでスライスを開始します。刃が滑らかな内心組織にトラベキュラを越えて到達するまで、最初のいくつかのスライスを捨てます。
- 各スライスがカットされたら、慎重にRTでタイロードの回復溶液の酸素化された(100%O2)浴にスライスを移し、個々の100 μmナイロンメッシュセルストレーナーに各スライスをそっと置き、メッシュ化された洗濯機で覆い、組織スライスをカールから守ります(図1C)。2少なくとも20分間、復元液にスライスを保管してください。
注:スライスは、有害な電気生理学的効果なしに3-4時間まで、これらの条件下で浴中に保つことができます。
4. 静的条件下でのスライス培養
注:汚染の可能性を最小限に抑えるために、各転送ステップの前にビーズ滅菌器を使用して鉗子を殺菌してください。
- 培養する準備ができたら、滅菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で満たされた6ウェルプレートの個々のウェルに各スライスを慎重に移します。ウェルプレートをそっと揺らし、回収液のスライスをすすきます。
注:この時点から、スライスはBSL2層流培養フードでのみ露出し、滅菌鉗子を使用して組織を処理する必要があります。 - スライスを新鮮なPBSの井戸に移し、徹底的にすすいで培養するためにスライスを殺菌します。この洗浄ステップ3xを実行して、スライスから回収液を完全に除去します。
- 3 mLの前温(37°C)培養培地(薬物の有無にかかわらず、図1D)で満たされた6ウェルプレートの個々のウェルにスライスを移す。37°Cの加湿インキュベーターで20rpmで軌道シェーカーにプレートを置き、30%O2と5%CO2を有2する。吸引し、48時間毎に培地を交換する。
5. 機能特性評価-光学的マッピング
- 光学マッピング研究では、スライス直後または培養後に、ティローデの回収液中の100%O2で37°Cの灌流系の組織浴に関心のある2スライスを慎重に移し、最小限のストレッチを適用しながら4つの角をPDMSゲル層に固定します(すなわち、スライスが流れ条件下で容易に動かないようにするのに十分です)。スライスを循環回復液で約10分間この浴中で休ませる。
- 希釈したブレビスタチンの0.3-0.5mLを回収液を含む貯蔵所に加えます。スライスにブレビスタチンを約10分間インキュベートします。
- 37°Cで1mLの回収液で、30μLのストック電圧感受性色素、RH237を再構成します。ポンプをオフにし、30 sの期間にわたってスライスの表面に0.2-0.3 mLの作業染料溶液をゆっくりとロードします。
注:スライス全体に均一に染料を適用するために注意する必要があります。さらに、非常に遅い染料の塗布は、染料がスライスから離れて浮かぶのを防ぐために重要です。 - ステップ 5.3 を繰り返して、ストックカルシウムインジケーター Rhod-2AM を再構成し、スライスにロードします。
- レンズからのスライスの距離を調整して、カメラをスライスに合わせます。
- その先端がスライスの中央に接触するようにバイポーラ白金-イリジウムペーシング電極を配置し、電気応答を引き出すために必要な最小ペーシングしきい値を決定するために振幅を増加させるペーシング刺激を適用します。1 Hz で、所定のペーシングしきい値の振幅を 1.5 倍に 2 ミリ秒のパルス幅持続時間で 1 Hz で調整します。ティッシュスライスの上にカバースリップを置きます。
- 520 ± 5 nm LED 励起光源を使用してスライスを照らします。2台のCMOSカメラで、1,000フレーム/sで放出された電圧とカルシウム信号を記録します。
- 良好な信号品質と抑制されたモーションアーティファクトの記録を確認してください(図1F)。モーションが光学信号にアーチファクトを生成しなくなるまで、0.1 mL のステップで、より多くのブレビスタチンをリザーバに追加します。必要に応じて、より多くの色素を追加して、信号品質を向上させます。
注:良好な信号品質とは、記録された光信号の大きな信号振幅と低いバックグラウンドノイズを定性的に評価することを指します。
6. RHYTHM1.2 でのデータ処理
注: RHYTHM1.2 は MATLAB ベースのユーザインタフェースで、単一またはデュアルカメラの光マッピングシステムで取得した光学マッピングデータの表示、条件、解析に使用されます (図 3)。これは、イメージングシステムと組み合わせて使用されます。
- データ ファイルの読み込み
- 画面の4つの表示ウィンドウのいずれかを選択し、「ディレクトリを選択」ボタンと「ロード」ボタンを使用して、データファイルをRHYTHM1.2にロードします。
- プログラムは、デュアル電圧とカルシウムの記録のためのカメラ1またはカメラ2データを選択するようにユーザーに促します。電圧信号に対してカメラ1を選択します。
- このプロセスを繰り返して、カルシウム信号(カメラ2)を隣接するディスプレイウィンドウの1つにロードします。
- 2 つのデータセットはスライス上の同じリージョンから記録されるため、選択した 2 つのディスプレイ ウィンドウ間の[デュアル データ リンク] チェックボックスをオンにして、2 つの表示ウィンドウをリンクします。
注:あるいは、同じ視野が維持されている場合、この機能を使用して、別々の時点で得られた2つの画像をリンクして、調査中の薬物の電気生理学における時間応答を見ることができます。いずれかの表示ウィンドウをダブルクリックすると、そのウィンドウを最大化して分析を容易にできます。
- 信号調節
- データ分析の選択 |条件 さらなる分析の前に電圧およびカルシウム光学マッピングデータを条件とするパラメータ。
- 蛍光強度しきい値(バックグラウンド[BG]しきい値)およびピクセルクラスタリングの度合い(励起[EX]しきい値)に基づいて信号を含まないピクセルを削除するには、「バックグラウンドを削除」機能を使用します。
- 信号品質を向上させるために"Bin"関数を使用して、光マッピングデータの空間平均化を行います。
- "Filter" 関数を使用して、バンド パス フィルタを使用して光マッピング データをフィルタします。
- 光マッピング信号のベースラインドリフトを削除するには、ドリフト機能を使用します。
- 「Normalize」関数を使用して、各ピクセルのオプティカル マッピング データを正規化して、最大振幅 1 にします。
- 「逆信号」機能を使用して、カルシウムトレースを反転してさらなる分析を行います。
- [波形表示]をクリックして、表示ウィンドウ内の特定のスポットから条件付きトレースを選択し、波形ウィンドウにプロットします。信号調節パラメータを調整して、最適な作用電位とカルシウム過渡トレースを得ます。
- 伝導速度(CV)計算
注: アクティブ化時間は、光信号の最大導関数値の時間 (dF/dtmax)として定義されます。- データ分析の選択 |アクティブ化マップを使用して開始時刻と終了時刻を入力し、トレース内の 1 つのアクションの可能性を包含します。[計算]を押して対象地域(ROI)を選択し、選択した領域のアクティブ化マップを表示します(図1G)。
- データ分析の選択 |CVマップと同様に、開始時間と終了時間を選択します。設定に基づいてピクセル間解像度の値を入力します。
注:1x倍率システムの場合、ピクセル間解像度はX方向とY方向で0.1mmです。 - [Vec を生成]を押します。[マップ]ボタンをクリックして ROI を選択し、その領域内の CV ベクトルを表示します。解析に含まれる平均、中央値、標準偏差、およびベクトルの数、および選択した領域における CV ベクトルの伝播の平均角度が計算され、[統計]セクションに表示されます。
- [線の描画] ボタンをクリックして、特定の伝播方向に沿って線を描画します。その方向のすべての CV ベクトルが選択されます。[CVの計算] をクリックして、選択した CV ベクトルのみを使用して、[統計]セクションに表示される統計情報を計算します。
- 作用電位持続時間(APD)とカルシウム過渡期間(CaTD)計算
注:APDは心臓電気生理学のもう一つの基本的なパラメータです。APDマップは、活性化と各光学アクションポテンシャルの再分極の指定された割合との間の時間差を決定することによって生成することができる。APDの不均一性またはAPDの延長および短縮は不整脈感受性を予測するために使用することができる。- リズム 1.2 で APD を計算するには、データ分析|APD/CaT マップ。
- 1 つのアクションの可能性を網羅するには、[開始時刻] と [終了時刻] を選択します。APD/CaTD の最小値と最大値を設定して、外れ値を削除します(たとえば、それぞれ 0 と 1,000 ミリ秒)。APD 80 /CaTD 80 の場合は 0.8、APD50/CaTD5050の場合は 0.550など、APD を決定する再分極率を入力します。
- [地域 APD Calc]をクリックして ROI を選択し、APD マップを生成します。平均値、中央値、標準偏差、および分析に含まれるピクセル数が[統計]セクションに表示されます。
- 立ち上がり時間
注:立ち上がり時間は、電圧およびカルシウム過渡痕の光信号から測定することができるもう一つの電気生理学的パラメータです。これは、脱分極イオンチャネルが作用電位を引き起こすのにかかる時間、またはカルシウムがサルコプラスムレチクルラムから細胞質に放出されるまでにかかる時間の推定値を提供する。光上昇時間は、マイクロ電極によって測定される立ち上がり時間の完全な代替ではなく、光作用電位が多くの細胞の膜貫通電位の平均であるため、脱分極の変化に敏感ではない可能性があります。システムの空間的および時間的解像度も、光上昇時間値に影響を与える可能性があります。しかし、それは依然として脱分極27の大きな変化を予測するために使用することができる。- 立ち上がり時間を決定するには、データ分析|ライズ・タイム.
- 「開始時間」および「終了時間」を選択して、1 つのアクション電位またはカルシウム過渡性のアップストロークを選択します。ノイズの多い信号の場合はノイズを含めずに信号の部分だけを選択できる Start% と End% (通常は 10 ~ 90% がノイズのない信号に推奨) の値を入力します。
- [計算]をクリックしてROIを選択し、立ち上がり時間の解析に含まれる平均値、中央値、標準偏差、ピクセル数を決定します。
- カルシウム崩壊
注:カルシウムトレースの場合、カルシウム過渡性の減衰の時定数を決定することができます。これにより、細胞質からSRへのカルシウムイオンの除去の変化を分析することができます。- データ分析の選択 |カルシウム減衰を開始時間と終了時間を入力して、単一のカルシウム過渡信号の減衰部分全体を包含します。
- [タウ計算]をクリックしてROIを選択し、カルシウム崩壊時定数の分析に含まれる平均値、中央値、標準偏差、ピクセル数を決定します。
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Representative Results
ヒトのorganotypicスライスは、上記のプロトコルに従ってドナー人間の心臓の左心室から収集され、で示された図 1.デュアルカメラ光学マッピングシステム図 2スライスプロトコルの完成後約1時間で電圧とカルシウムの同時光学マッピングを行うために直立画像構成で使用された。データはリズム1.2を用いて分析された(図 3)、私たちの研究室が以前に公開し、Github(https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2)で自由に利用できるオープンソースの光学マッピングデータ分析ツール。測定された電気生理学的パラメータは、図 4.作用電位およびカルシウム過渡痕はシグナルコンディショナリングされ、さらなる分析で使用される代表的な痕跡は、図 4A.活性化時間は各ピクセルについて決定され、電圧およびカルシウムトレースから決定された活性化時間のアイソクロナルマップは、図 4B,C.カルシウムイソクロネの活性化は、期待どおりの電圧の後ろに遅れていることに注意してください。でプロットされた CV ベクトル図4Dは、アクティブ化時間と既知のピクセル間解像度を使用して計算されます。横方向の平均CVは、このスライスで21.2cm/sであると判断した。このCV値は、以前に報告された心室横筋CVに匹敵する(24±4および28±7cm/sの心臓のびまんとおよび斑状線維症を有する)28.カルシウム過渡減衰定数は、カルシウムトレースの減衰部分に多項式を合わせ、平均減衰定数をこのスライスで105.3 msと判定した(地図中図 4E).次に、APDおよびCaTDを、細胞質を形成する再分極/カルシウム除去の活性化時間と、指定された割合の間の時間持続時間として測定した。平均 APD80とCaTD80それぞれ 343.1 ms および 442.6 ms と判定された (図 4F,G).以前の生体内ヒト研究では、APDの代理として1Hzでの定常状態ペーシング中に生体内ヒト心臓から記録された単極電位(ARI)から測定された活性化回復間隔(ARI)を報告しています。これらのスタディの ARI 値の範囲は 250 ~ 450 ミリ秒です。29,30.ここで報告されるヒト心臓スライスからのAPD値は、以前のARI値と同等である。モーション アーティファクトのあるリージョンは、APD および CaTD の計算から削除されました。最後に、電圧およびカルシウムトレースの立ち上がり時間(すなわち、アップストロークの持続時間)を測定し、マッピングした。これらは、図 4Hそして図 4Iそれぞれ。平均値はそれぞれ10.2 msと13.3ミリ秒と判断された。ペーシングのポイントの右側にあるマップのアーティファクトは、視野内のペーシングワイヤによるものです。最後に、急性薬物検査におけるこのスライスモデルの使用は、心毒性作用を有することが知られている化学療法剤であるドキソルビシン(DOX)でスライスを24時間培養したときに実証された。50 μM DOXによるスライスの処理により、横方向の伝導速度が19.4±3.4cm/sから9.6±3.2 cm/sに短縮されました。図 5A、CV ベクトルマップ図 5B、およびサマリー データ図5C.DOX群のサンプルサイズが小さいのは、DOX処理後の非生存可能なスライスの数が多かったためです。DOX 処理スライスのモーションアーティファクトが増加したため、正確な APD 値の計算ができませんでした。二重電圧とカルシウムイメージングで測定できるもう一つの重要なパラメータは、VM-Ca遅延、組織における強い励起収縮結合を決定する31.このパラメータの遅延や負の値は、有害である可能性があります。
図1:ヒト心臓性交素スライス調製。(A)人間の心臓は、取り出し時に氷冷心肢麻痺浴(心筋液と心筋氷の混合物)に貯蔵された。(B)左心室組織の1cm3キューブを切断し、4%のアガロースゲルをホルダーの後壁に接着して金属組織ホルダーに取り付け、酸素化スライス溶液の氷冷浴に移した。(C)切り取ると、スライスを個々の100 μmナイロンメッシュセルストレーナーでRTで酸素化回収溶液に移した。メッシュされた洗濯機は、スライスがカールするのを防ぐために組織を覆った。(D)長期培養のために、スライスをPBSで洗浄し、3mLの組織培地を37°Cで6ウェルプレートで培養した。(E) メイソンのトリクローム染色スライスセクションは繊維配向を示す。(F)スライスから記録された代表的な光学的作用電位。(G)中央にペースを合ったスライスの代表的な活性化マップ(青)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:デュアルカメラ光マッピングシステムアップライトイメージング構成のデュアルカメラ光マッピングシステム。システムパーツには、1)デュアルマッピング用のマスターカメラとスレーブカメラが含まれます。2)PDMSゲル付きティッシュバス;3)励起および放出フィルターおよび二色性ミラーを収容するフィルターキューブ;4)レンズホルダーとレンズ。5)励起光源(520 nm緑LED)。RH237とRhod-2-AMを使用したVmとカルシウムの二重光学マッピングのための右詳細フィルタと二色性ミラーの組み合わせにそれぞれインセット。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:単一パラメータおよびマルチパラメータ解析のためのオープンソース光学マッピングデータ分析ツールのRHYTHM1.2グラフィカルユーザインタフェース(GUI)。データ ファイルの読み込みオプションとファイル リストが赤いボックスに表示されます。データ分析オプションは、緑色で示されたデータ分析ドロップダウンメニューにリストされます。データ マップを表示するための表示ウィンドウは、濃い青色で示されます。デュアルカメラデータの同時分析のためのデュアルマッピングデータファイルをリンクするためのチェックボックスは紫色で示されています。アクション電位とカルシウム過渡トレースをプロットする波形ウィンドウは黄色で表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ヒトの組織性心臓スライス製剤からの膜貫通電位およびカルシウム過渡量マッピング。(A)代表的な光学作用電位(黒)およびカルシウム過渡性(バーガンディ)。(B,C)Vmおよびカルシウム記録からそれぞれ得られる活性化マップ。(D) 伝導速度 (CV) ベクトルマップ。(E) カルシウム過渡減衰定数 (タウ) マップ(F,G)アクション電位期間(APD80)およびカルシウム過渡持続時間(CaTD80)マップをそれぞれ示す。(H,I)それぞれ、起動電位のアップストロークの立ち上がり時間とカルシウム過渡性のマップ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ドキソルビシン処理は、横方向の伝導速度を遅くする。(A)(制御)なしで24時間培養されたスライスと50 μM(DOX)のドキソルビシンで培養されたスライスからの活性化マップ。(B) 制御スライスとDOXスライスからの伝導速度ベクトルマップ。(C)制御とDOX処理スライスから計算した平均横方向伝導速度。*P < 0.05.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、心突っ込んで逮捕されたヒト心臓から実行可能な心臓スライスを得るためのステップバイステップの方法を提示し、膜貫通電位と細胞内カルシウムの二重光学マッピングを用いてスライスを機能的に特徴付ける。保存された細胞外環境とネイティブの細胞と細胞の結合により、ヒト心臓スライスは、基本的な科学的発見と薬理学的薬剤および遺伝子治療の有効性および心臓毒性試験のために、ヒト心臓の正確なモデルとして使用することができる。この技術はまた、心房節、房室節、プルキンエ繊維などの心臓の特定の領域の構造的機能的マッピングを可能にする。ここで説明するプロトコルは、短期研究に最適な心臓スライス生成、画像処理、および分析の基本的な手順をリストしています。組織スライスの静的培養は、長期間にわたって心臓組織の変化を誘発することが示されているので、長期的な研究のために、我々は、電気機械刺激12、13、14,13,14のようなより多くの生理学的培養条件を組み込むことを読者に奨励する。
組織の健康を維持するためのいくつかの手順に注意する必要があります。.例えば、心臓の収穫と組織スライスの間の時間を最小限に抑える必要があります。前に示したように21、心肢麻痺の延長長さは、変化した電気生理学につながる可能性があります。また、細胞外マトリックスと細胞-細胞結合の完全性を保つために、スライスの過剰な取り扱いと伸張は、スライスの収集、培養、および機能研究の間に避けるべきである。スライスの過度のストレッチは、伝導ブロックにつながる可能性があります。さらに、このプロトコルで説明されているすべてのソリューションは、7.4のpHで維持する必要があります。ここで説明するTyrodeのソリューションは、100%O2を使用して適切なpHを維持するためにHEPESを利用しています。炭酸水素ナトリウムは、代わりにpHを制御するために使用することができますが、この溶液は95%O22と5%CO22で泡立たされるべきです。最後に、心臓の輸送およびスライスの間に、心筋およびスライス溶液が組織の生存率を維持するためにできるだけ氷点下の温度に近づけるようにするべきである。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
NIH(助成金R21 EB023106、R44 HL139248、R01 HL126802)、Leducq財団(プロジェクトRHYTHM)、米国心臓協会博士研究員(19POST34370122)による資金提供は感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
- Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
- Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today's translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
- Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
- Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
- Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
- Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
- Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
- George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
- Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
- Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
- Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).
