Summary
Este protocolo descreve o procedimento de secção e cultivo de fatias cardíacas humanas para testes de drogas pré-clínicos e detalha o uso de mapeamento óptico para o registro de tensão transmembrana e sinais de cálcio intracelular simultaneamente a partir dessas fatias.
Abstract
As preparações de fatias cardíacas humanas foram recentemente desenvolvidas como uma plataforma para estudos de fisiologia humana e testes de terapia para diminuir a distância entre os ensaios animais e clínicos. Numerosos modelos animais e células têm sido usados para examinar os efeitos das drogas, mas essas respostas muitas vezes diferem em humanos. As fatias cardíacas humanas oferecem uma vantagem para o teste de drogas, pois são diretamente derivadas de corações humanos viáveis. Além de ter preservado estruturas multicelulares, acoplamento celular-célula e ambientes de matriz extracelular, fatias de tecido cardíaco humano podem ser usadas para testar diretamente o efeito de inúmeras drogas na fisiologia cardíaca humana adulta. O que distingue esse modelo de outras preparações cardíacas, como corações inteiros ou cunhas, é que as fatias podem ser submetidas à cultura de longo prazo. Como tal, as fatias cardíacas permitem estudar os efeitos agudos e crônicos das drogas. Além disso, a capacidade de coletar várias centenas a mil fatias de um único coração faz deste um modelo de alta produtividade para testar várias drogas em diferentes concentrações e combinações com outras drogas ao mesmo tempo. As fatias podem ser preparadas de qualquer região do coração. Neste protocolo, descrevemos a preparação de fatias ventriculares esquerdas isolando cubos de tecido da parede livre ventricular esquerda e seccionando-as em fatias usando um microtoma vibratório de alta precisão. Essas fatias podem então ser submetidas a experimentos agudos para medir a função eletrofisiológica cardíaca da linha de base ou cultivadas para estudos crônicos de drogas. Este protocolo também descreve o mapeamento óptico duplo de fatias cardíacas para gravações simultâneas de potenciais transmembranos e dinâmicas intracelulares de cálcio para determinar os efeitos das drogas que estão sendo investigadas.
Introduction
Os modelos animais têm sido uma ferramenta valiosa usada para compreender os mecanismos subjacentes da fisiologia humana e da fisiopatologia, bem como uma plataforma para testes preliminares de terapias para tratar várias doenças1. Grandes avanços foram dados no campo da pesquisa biomédica com base nesses estudos em animais2. No entanto, existem diferenças significativas entre fisiologias humanas e animais, incluindo camundongos, ratos, cobaias, coelhos, ovelhas, porcos e cães3,4. Como resultado, houve inúmeras terapias medicamentosas, genéticas e celulares que se mostraram promissoras durante a fase de testes em animais, mas não conseguiram fazer jus aos resultados nos ensaios clínicos5. Para preencher essa lacuna, miócitos cardíacos isolados e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) foram desenvolvidos como modelos para testar a resposta da fisiologia humana a várias drogas e doenças6. Cardiomiócitos derivados de células-tronco têm sido amplamente utilizados em sistemas de órgãos em um chip como um substituto do coração6,,7,,8. No entanto, a utilidade dos cardiomiócitos derivados do iPSC (iPSC-CMs) é impedida por seu fenótipo relativamente imaturo e pela falta de representação da subpopulação do cardiomiócito; o miocárdio maduro é uma estrutura complexa composta por vários tipos de células coexistitivas, como fibroblastos, neurônios, macrófagos e células endoteliais. Por outro lado, os cardiomiócitos humanos isolados são eletricamente maduros, e diferentes subpopulações de cardiomiócitos podem ser obtidas alterando os parâmetros de cultivo9. Ainda assim, esses miócitos geralmente apresentam morfologias potenciais de ação alteradas devido à falta de acoplamento de células celulares, rápida deseferição e ocorrência de comportamento proarrítmico in vitro10,11. Algumas das limitações foram abordadas por modelos de cultura celular 3D de iPSC-CMs e miócitos cardíacos. Esses modelos, que incluem esferoides, andaimes de hidrogel encapsulados culturas 3D, tecidos cardíacos projetados (EHTs) e sistemas de coração-em-um-chip, usam múltiplas populações de células cardíacas, como cardiomiócitos, fibroblastos e células endoteliais. Eles se auto-montam ou se reúnem ao longo de um andaime para formar estruturas 3D, e alguns até reproduzem a natureza anisotropica complexa do miocárdio. Esses modelos têm sido relatados como ter células de fenótipos maduros, propriedades conjunturais e perfis moleculares semelhantes ao tecido cardíaco. O sistema coração-em-um-chip também permite o estudo de efeitos sistêmicos em testes de drogas e modelos de doenças. No entanto, os modelos in vitro baseados em células não possuem a matriz extracelular nativa e, portanto, não podem imitar com precisão a eletrofisiologia do nível dos órgãos. As fatias cardíacas humanas, em contraste, têm uma matriz extracelular intacta e contatos nativos célula-célula, tornando-as úteis para examinar com mais precisão as propriedades arritmogênicas do miocárdio humano.
Pesquisadores desenvolveram fatias organotípicas cardíacas humanas como plataforma pré-clínica fisiológica para testes de drogas agudas e crônicas e para estudar eletrofisiologia cardíaca e progressão de doença cardíaca12,,13,14,,15,,16,,17,18,,19. Quando comparadas com cardiomiócitos derivados do iPSC, as fatias cardíacas humanas replicam mais fielmente a eletrofisiologia cardíaca humana adulta com um fenótipo de cardiomiócito maduro. Quando comparadas com cardiomiócitos humanos isolados, as fatias cardíacas apresentam durações potenciais de ação fisiológica devido ao acoplamento bem preservado celular-célula e à existência intrínseca de seus ambientes intra e extracelulares nativos.
Este protocolo descreve o processo de geração de fatias cardíacas humanas de corações doadores inteiros, realizando estudos agudos (ou seja, horas de duração) e crônicos (ou seja, dias de duração) para testar parâmetros de eletrofisiologia cardíaca através de mapeamento óptico. Embora este protocolo descreva apenas o uso do tecido ventricular esquerdo (LV), ele foi aplicado com sucesso a outras regiões do coração, bem como outras espécies como ratos, ratos, cobaias e suínos14,,20,,21,22. Nosso laboratório utiliza corações inteiros de doadores humanos que foram rejeitados para transplante nos últimos 5 anos, mas é viável que esses mesmos procedimentos sejam realizados em qualquer tecido de amostra de coração doador obtido por meios alternativos (por exemplo, implantes de dispositivo de assistência ventricular esquerda [LVAD], biópsias, miectomias) desde que os tecidos tenham a capacidade de serem seccionados em cubos. O mapeamento óptico é utilizado para análise neste estudo devido à sua capacidade de mapear simultaneamente potenciais de ação óptica e transitórios de cálcio com alta resolução espacial (100 x 100 pixels) e temporal (>1.000 quadros/s). Métodos alternativos também podem ser usados, como matrizes multieletrísmos (MEAs) ou microeletrodos, mas essas técnicas são limitadas por suas resoluções espaciais relativamente baixas. Além disso, os MEAs foram projetados para uso com culturas celulares, e microeletrodos afiados são mais facilmente gerenciados para uso com corações inteiros ou grandes cunhas de tecido.
O objetivo do artigo é permitir que mais pesquisadores usem tecidos cardíacos humanos para estudos de eletrofisiologia cardíaca. Deve-se notar que a tecnologia descrita neste artigo é relativamente simples e benéfica para estudos de curto prazo (na ordem de várias horas a dias). Cultura biomimética mais fisiológica para estudos de longo prazo (na ordem das semanas) tem sido discutida e descrita por uma série de outros estudos12,,18,23. Estimulação elétrica, carga mecânica e alongamento tecidual são mecanismos de condicionamento vantajosos que podem ajudar a limitar o aparecimento de remodelagem de tecido in vitro12,,18,23.
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Protocol
Todos os métodos descritos foram realizados em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. A pesquisa foi aprovada pelo Institution Review Board (IRB) da Universidade George Washington.
NOTA: Corações humanos doadores foram adquiridos da Comunidade Regional de Transplantes de Washington como tecido descartado identificado com aprovação do IRB da Universidade George Washington. Corações explantados são presos cardioplegicamente por lavar o coração com uma solução de cardioplegia gelada (o sangue foi retirado do coração neste processo) e transferidos para o laboratório sob condições padrão de transplante de órgãos.
1. Preparação de soluções
- Para cada coração, faça 4 L de solução cardioplégica (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 1,2 mM CaCl2; pH = 7,4). Armazene 3 L a 4 °C e o restante 1 L a -20 °C.
NOTA: Esta solução pode ser feita com até vários dias de antecedência. - Prepare recentemente 1 L cada uma das soluções de fatiamento de Tyrode (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM de glicose, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-butanedione monoxime [BDM]; pH = 7,4) e solução de recuperação da Tyrode (140 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM de glicose, 10 mM HEPES, 10 mM BDM; pH = 7,4).
NOTA: Ambas as soluções de corte e recuperação devem ser feitas no dia do experimento e podem ser armazenadas a 4 °C. - Prepare soluções de estoque dos corantes fluorescentes. Reconstitua o corante sensível à tensão RH237 a 1,25 mg/mL em sulfóxido de dimetila (DMSO) e armazene-o em alíquotas de 30 μL a 4 °C. Reconstitua o indicador de cálcio Rhod-2AM a 1 mg/mL em DMSO. Armazene em 30 alíquotas μL a -20 °C.
NOTA: Di-4-ANEPPS (solução de estoque a 1,25 mg/mL em DMSO) pode ser usado em experimentos para imagens de câmera única do potencial transmembrano sozinho.- Antes do início do experimento, sonicar os corantes usando um sônico de ultrassom por pelo menos 10 minutos e diluir cada alíquota de corantes fluorescentes em 1 mL da solução de recuperação. Adicione Pluronic F-127 (Tabela de Materiais) ao Rhod-2AM em uma proporção de 1:1 antes da diluição na solução de recuperação.
- Prepare uma solução de estoque da solução uncoupler de excitação-contração blebbistatin em 2 mg/mL solução em DMSO. Armazene em alíquotas a -20 °C. Durante os experimentos de mapeamento óptico, diluir a solução de estoque de blebbistatina para uma concentração de trabalho de 5-10 μM na solução de recuperação do Tyrode.
- Torne a cultura fresca meio suplementando o médio 199 com 2% de penicilina-estreptomicina, 1x suplemento de mídia líquida insulina-transferrina-selênio (ITS) e 10 mM BDM. Filtre o meio usando um filtro estéril de 0,2 μm.
NOTA: Para estudos de perturbação farmacológica, os medicamentos podem ser adicionados diretamente ao meio da cultura. O meio de cultura pode ser armazenado a 37 °C. - Faça um gel de 4% de agarose para montagem de tecido, dissolvendo o ponto de derretimento baixo agarose em água destilada e aquecendo a mistura em um micro-ondas até dissolver totalmente. Cure a ágarose em uma placa de Petri com uma espessura de 5 mm e armazene a 4 °C.
2. Configuração do equipamento
- Configuração vibratória de microtome
- Calibrar o microtoma vibratório antes de cada experimento.
- Utilizando um microtome vibratório de alta precisão(Tabela de Materiais),carregue uma lâmina de corte de cerâmica no suporte e conecte o dispositivo de calibração fornecido com o microtome vibratório. Escolha a opção de ajuste da lâmina no menu e selecione cerâmica para tipo de lâmina.
- Selecione a opção vibrar, verifique se há valor do eixo Z. Se esse valor for <1 μm, saia do menu de calibração. Caso contrário, ajuste bem o parafuso de calibração preso à parte superior da cabeça vibratória e selecione a opção vibrar. Repita quantas vezes necessário para definir o eixo Z para <1 μm.
- Ajuste as configurações do vibratome para 400 μm de espessura de corte, velocidade de avanço de 0,02 mm/s para tecido atrial e velocidade de avanço de 0,04 mm/s para tecido ventricular, amplitude de vibração horizontal de 2 mm e frequência de vibração de 80 Hz.
NOTA: Enquanto 400 μm é a espessura recomendada para compensar os danos celulares nas superfícies cortadas da fatia, fatias mais finas também podem ser preparadas. Dado que o limite de difusão de oxigênio é de cerca de 150 μm, fatias em torno de 300 μm são frequentemente usadas14,17,18,24. - Encha o banho do microtóm meste vibratório com solução de corte a 4 °C e mantenha a temperatura ao redor do exterior do banho com gelo, reabastecendo conforme necessário durante todo o protocolo de corte. Oxigene continuamente a solução de corte no banho borbulhando com 100% de oxigênio durante o corte.
- Configure um segundo prato com até 100 μm de filtros de células de malha de nylon e arruelas em malha conforme necessário (um coador de célula por fatia). Encha este prato com solução de recuperação e oxigene-o borbulhando com 100% de oxigênio à temperatura ambiente (RT).
NOTA: Esta solução é mantida no RT durante o experimento.
- Calibrar o microtoma vibratório antes de cada experimento.
- Configuração de mapeamento óptico
NOTA: Uma descrição mais detalhada do sistema de mapeamento óptico é fornecida em publicações anteriores16,,25,26.- Conecte um banho de tecido com camada de gel de polidimtilsiloxano (PDMS) na parte inferior (para fixar as fatias) a um sistema de perfusão. Circule 1 L da solução de recuperação a 37 °C e oxigene com 100% de oxigênio, através do sistema de perfusão a uma vazão rápida o suficiente para manter a temperatura e o acúmulo claro de banho perfusado.
- Ajuste o foco e o alinhamento das duas câmeras CMOS(Tabela de Materiais)utilizando um alvo.
NOTA: Mais detalhes sobre o alinhamento podem ser encontrados em estudos anteriores26. - Use uma fonte de luz LED verde com um comprimento de onda de 520 ± 5 nm para excitar os corantes sensíveis à tensão e indicadores de cálcio simultaneamente.
NOTA: A fonte de luz de excitação é anexada ao cubo do filtro de excitação do sistema de mapeamento óptico e é refletida a partir de um espelho dicroico de 550 nm para iluminação epicêntrica. A luz emitida é coletada por uma lente de 1x e dividida por um segundo espelho dicroico a 630 nm em componentes de tensão e cálcio antes de ser filtrada por 690 ± 50 nm e 590 ± 33 nm filtros, respectivamente, e gravada pelas duas câmeras.
3. Protocolo de corte
- Quando estiver pronto para dissecção e experimentação tecidual, prepare um banho de cardioplegia gelada misturando cardioplegia congelada e líquida. Mantenha o coração submerso no banho de cardioplegia até a coleta de tecido para fatiar(Figura 1A).
- Cole o gel de agarose pré-feito na parte de trás dos suportes de tecido metálico do vibratome.
- Identifique a parede livre ventricular esquerda e corte 1 cm3 cubos de tecido em solução cardioplégica fria. Em seguida, monte rapidamente os blocos de tecido sobre os suportes de tecido metálico com as superfícies do endocárdia voltadas para cima e anexá-los ao gel de agarose usando adesivo de pele tópico(Figura 1B).
NOTA: A região do tecido selecionada deve estar longe dos vasos sanguíneos grandes para evitar furos nas fatias. O plano de secção é aproximadamente paralelo à orientação da fibra na camada endocárdial(Figura 1E) e o plano de secção pode estar em um pequeno ângulo devido à anisotropia rotacional em uma camada mais profunda da parede LV. Para aumentar o rendimento, até dois blocos de tecido podem ser montados lado a lado no mesmo suporte. - Transfira os suportes metálicos para o banho de vibratome cheio com a solução de corte oxigenado gelado. Certifique-se de que os cubos de tecido estão completamente submersos.
- Mova a lâmina para a borda frontal do tecido e ligue o vibratome para começar a cortar com os parâmetros predefinidos. Descarte as primeiras fatias até que a lâmina atinja além da trabecula no tecido endocárdio liso.
- Uma vez que cada fatia seja cortada, transfira cuidadosamente a fatia para um banho oxigenado (100% O2) da solução de recuperação de Tyrode na RT. Coloque suavemente cada fatia em filtros de células de malha de nylon individuais de 100 μm e cubra com arruelas em malha para evitar que as fatias de tecido se enrolem(Figura 1C). Mantenha fatias na solução de recuperação por pelo menos 20 minutos.
NOTA: As fatias podem ser mantidas no banho nessas condições por até 3-4 h sem efeitos eletrofisiológicos prejudiciais.
4. Cortar culminar em condições estáticas
NOTA: Para minimizar a chance de contaminação, esterilize os fórceps usando um esterilizador de contas antes de cada etapa de transferência.
- Quando estiver pronto para a cultura, transfira cuidadosamente cada fatia para os poços individuais de uma placa de 6 poços cheia de soro fisco estéril tamponado (PBS). Balance suavemente a placa do poço para enxaguar as fatias da solução de recuperação.
NOTA: A partir deste ponto, as fatias só devem ser expostas em uma capa de cultura de fluxo de fluxo BSL2, e fórceps estéreis devem ser usados para manusear o tecido. - Transfira as fatias para poços de PBS frescos para enxaguar e esterilizar as fatias para a cultura. Realize esta etapa de lavagem 3x para garantir a remoção completa da solução de recuperação das fatias.
- Transfira as fatias para poços individuais de uma placa de 6 poços cheias de 3 mL de meio de cultura pré-armado (37 °C) (com ou sem drogas, Figura 1D). Coloque as placas em um agitador orbital a 20 rpm em uma incubadora umidificada a 37 °C com 30% O2 e 5% CO2. Aspire e substitua o meio cultural a cada 48 h.
5. Caracterização funcional –mapeamento óptico
- Para estudos de mapeamento óptico imediatamente após o corte ou após a colheita, transfira cuidadosamente a fatia de interesse para o banho de tecido do sistema de perfusão a 37 °C com 100% O2 na solução de recuperação de Tyrode, e fixe os quatro cantos para a camada de gel PDMS enquanto aplica estiramento mínimo (ou seja, apenas o suficiente para evitar que a fatia se mova facilmente sob condições de fluxo). Deixe as fatias descansarem neste banho com solução de recuperação circulante por aproximadamente 10 minutos.
- Adicione 0,3-0,5 mL da sangria diluída ao reservatório contendo a solução de recuperação. Deixe a fatia incubar com blebbistatina por aproximadamente 10 minutos.
- Reconstituir 30 μL do corante sensível à tensão do estoque, RH237, em 1 mL de solução de recuperação a 37 °C. Desligue as bombas e carregue lentamente 0,2-0,3 mL de solução de corante de trabalho na superfície da fatia durante um período de 30 s. Deixe a fatia incubar no corante com as bombas desligada por um período de até 90 s, em seguida, ligue as bombas novamente para permitir que qualquer corante em excesso se lave.
NOTA: Deve-se tomar cuidado para aplicar o corante uniformemente por toda a fatia. Além disso, a aplicação de corante muito lento é crucial para evitar que o corante flutuasse para longe da fatia. - Repita o passo 5.3 para reconstituir o indicador de cálcio de estoque Rhod-2AM e carregá-lo na fatia.
- Concentre as câmeras na fatia ajustando a distância da fatia da lente.
- Posicione um eletrodo bipolar de ritmo de platina-irídio de tal forma que sua ponta esteja em contato com o meio da fatia e aplique estímulos de ritmo de amplitude crescente para determinar o limiar mínimo de ritmo necessário para obter uma resposta elétrica. Acelere a fatia a 1 Hz com uma duração de largura de pulso de 2 ms a 1,5x a amplitude do limiar de ritmo predeterminado. Coloque uma mancha sobre a fatia de tecido.
- Ilumine a fatia usando uma fonte de luz led de 520 ± 5 nm. Registo os sinais de tensão e cálcio emitidos com as duas câmeras CMOS a 1.000 quadros/s.
- Verifique a gravação quanto à boa qualidade do sinal e artefatos de movimento suprimidos(Figura 1F). Adicione mais blebbistatina ao reservatório em passos de 0,1 mL até que o movimento não produz mais artefatos nos sinais ópticos. Adicione mais corante, se necessário, para melhorar a qualidade do sinal.
NOTA: A boa qualidade do sinal refere-se à amplitude de sinal de grande qualidade avaliada qualitativamente e ao baixo ruído de fundo nos sinais ópticos gravados.
6. Processamento de dados com RHYTHM1.2
NOTA: RHYTHM1.2 é uma interface de usuário baseada em MATLAB que é usada para exibir, condicionar e analisar dados de mapeamento óptico adquiridos por sistemas de mapeamento óptico de câmera única ou dupla(Figura 3). É usado em conjunto com o sistema de imagem.
- Carregando arquivos de dados
- Carregue os arquivos de dados em RHYTHM1.2 selecionando qualquer uma das quatro janelas de exibição na tela e usando os botões Select Directory and Load.
- O programa solicitará ao usuário que selecione os dados da Câmera 1 ou da Câmera 2 para as gravações de dupla tensão e cálcio. Selecione a câmera 1 para o sinal de tensão.
- Repita o processo para carregar o sinal de cálcio (Câmera 2) em uma das janelas de exibição adjacentes.
- Selecione a caixa de seleção de link de dados duplos entre as duas janelas de exibição selecionadas para vincular as duas janelas de exibição, uma vez que os dois conjuntos de dados são registrados da mesma região na fatia.
NOTA: Alternativamente, se o mesmo campo de visão for mantido, esta função pode ser usada para vincular duas imagens que foram obtidas em pontos de tempo separados para ver o tempo-resposta na eletrofisiologia da droga que está sendo investigada. Clicar duas vezes em qualquer janela de exibição permite que essa janela seja maximizada para permitir a facilidade de análise.
- Condicionamento de sinal
- Selecione Análise de Dados | Parâmetros da condição para condicionar os dados de mapeamento óptico de tensão e cálcio antes de uma análise mais aprofundada.
- Use a função "Remover fundo" para remover pixels que não contenham nenhum sinal com base em um limiar de intensidade fluorescente (limiar de fundo [BG] e grau de agrupamento de pixels (limiar de excitação [EX]).
- Realize a média espacial dos dados de mapeamento óptico usando a função "Bin" para melhorar a qualidade do sinal.
- Filtre os dados de mapeamento óptico usando um filtro de passe de banda com a função "Filtro".
- Use a função "Drift" para remover a deriva da linha de base no sinal de mapeamento óptico.
- Usando a função "Normalizar", normalize os dados de mapeamento óptico de cada pixel para ter uma amplitude máxima de 1.
- Use a função "Sinal Inverso" para inverter os traços de cálcio para análise suplementar.
- Clique em Exibir onda para selecionar o traço condicionado de qualquer ponto da janela de exibição e plotá-lo na janela Forma de onda. Ajuste os parâmetros de condicionamento do sinal para obter o potencial de ação ideal e traços transitórios de cálcio.
- Cálculo da velocidade de condução (CV)
NOTA: O tempo de ativação é definido como o tempo de derivativo máximo do sinal óptico (dF/dtmax).- Selecione Análise de Dados | Mapa de ativação e digite um tempo de início e tempo de término para englobar um único potencial de ação no rastreamento. Pressione Calcular e selecionar a região de interesse (ROI) para exibir o mapa de ativação da região selecionada (Figura 1G).
- Selecione Análise de Dados | Mapa CV e, da mesma forma, escolha o Tempo de Início e o Tempo de Término. Digite os valores de resolução do interpixel com base na configuração.
NOTA: Para sistemas de ampliação de 1x, a resolução interpixel é de 0,1 mm na direção X e Y. - Pressione o Gerar Vec. Botão de mapa para selecionar um ROI e exibir vetores CV dentro dessa região. A média, mediana, desvio padrão e número de vetores incluídos na análise, bem como o ângulo médio de propagação dos vetores cv na região selecionada é calculado e exibido na seção Estatísticas.
- Clique no botão Desenhar linha para desenhar uma linha ao longo de uma determinada direção de propagação. Todos os vetores cv nessa direção serão selecionados. Clique em Calcular CV para usar apenas os vetores de CV selecionados para calcular as estatísticas que serão exibidas na seção Estatísticas.
- Cálculo de duração potencial de ação (APD) e duração transitória de cálcio (CaTD)
NOTA: O APD é outro parâmetro fundamental da eletrofisiologia cardíaca. Mapas APD podem ser gerados determinando a diferença de tempo entre ativação e uma porcentagem especificada de repolarização de cada potencial de ação óptica. Heterogeneidade APD ou prolongamento e encurtamento de APD podem ser usados para prever a suscetibilidade da arritmia.- Para calcular APD em RHYTHM1.2, selecione Análise de Dados | Mapa APD/CaT.
- Selecione o Tempo de Início e o Tempo de Término para englobar um potencial de ação completo. Defina um valor mínimo e máximo de APD/CaTD para remover quaisquer outliers (por exemplo, 0 e 1.000 ms, respectivamente). Insira a repolarização percentual que determinará o APD, por exemplo, 0,8 para APD80/CaTD80 ou 0,5 para APD50/CaTD50.
- Clique em APD Calc regional para selecionar um ROI e gerar o mapa APD. O desvio médio, mediano, padrão e o número de pixels incluídos na análise serão exibidos na seção Estatísticas.
- Tempo de ascensão
NOTA: O tempo de elevação é outro parâmetro eletrofisiológico que pode ser medido a partir de sinais ópticos de voltagem e traços transitórios de cálcio. Ele fornece uma estimativa de quanto tempo leva para os canais de íons despolarizantes para desencadear um potencial de ação, ou quanto tempo leva para o cálcio ser liberado no citoplasma a partir do tiquelúlum sarcoplasm. O tempo de elevação óptica não é um substituto perfeito para os tempos de elevação medidos pelos microeletrodos e pode não ser tão sensível às mudanças na despolarização, pois os potenciais de ação óptica são uma média do potencial transmembrano de muitas células. A resolução espacial e temporal do sistema também pode afetar os valores de tempo de elevação óptica. No entanto, ainda pode ser usado para prever grandes mudanças na despolarização27.- Para determinar o tempo de aumento, selecione Análise de Dados | Tempo de Ascensão.
- Selecione Tempo de início e tempo final para selecionar o upstroke de um único potencial de ação ou transitório de cálcio. Digite os valores de Start% e End% (normalmente 10-90% é recomendado para sinais não barulhentos), o que permite ao usuário selecionar apenas as porções do sinal sem incluir ruído no caso de sinais barulhentos.
- Clique em Calcular para selecionar o ROI e determinar a média, mediana, desvio padrão e número de pixels incluídos na análise do tempo de elevação.
- Decomposição de cálcio
NOTA: Para traços de cálcio, a constante de tempo da decomposição do transitório de cálcio pode ser determinada. Isso permite a análise de alterações na remoção de íons de cálcio do citoplasma de volta para a RS.- Selecione Análise de Dados | Decomposição de cálcio e entre no tempo de início e no fim para abranger toda a porção de decomposição de um único sinal transitório de cálcio.
- Clique em Calcular Tau para selecionar o ROI e determinar a média, mediana, desvio padrão e número de pixels incluídos na análise da constante de tempo de decomposição do cálcio.
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Representative Results
Fatias organotípicas humanas foram coletadas do ventrículo esquerdo de um coração humano doador de acordo com o protocolo detalhado acima e ilustrado emFigura 1. Um sistema de mapeamento óptico de câmera dupla como esse emFigura 2foi utilizado na configuração de imagem vertical para realizar mapeamento óptico simultâneo de tensão e cálcio cerca de 1 h após a conclusão do protocolo de corte. Os dados foram analisados utilizando-se o RHYTHM1.2 (Figura 3), uma ferramenta de análise de dados de mapeamento óptico de código aberto publicada anteriormente pelo nosso laboratório e disponível livremente no Github (https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2). Os parâmetros eletrofisiológicos medidos são ilustrados emFigura 4. O potencial de ação e os traços transitórios de cálcio foram condicionados ao sinal e traços representativos utilizados em análises posteriores são ilustrados emFigura 4A. Os tempos de ativação foram determinados para cada pixel e mapas isoquironais dos tempos de ativação determinados a partir de traços de tensão e cálcio são ilustrados emFigura 4B,C. Note que a ativação no isochrone de cálcio fica atrás da tensão como esperado. Vetores cv plotados emFigura 4Dforam calculados utilizando-se os tempos de ativação e a conhecida resolução interpixel. O CV médio na direção transversal foi determinado como sendo de 21,2 cm/s nesta fatia. Este valor cv é comparável ao CV transverso ventricular previamente relatado medido a partir de corações humanos inteiros explantados (24 ± 4 e 28 ± 7 cm/s em corações com fibrose difusa e irregular)28. A constante de decaimento transitório de cálcio foi medida mediante a montagem de um polinômio à porção em decomposição dos traços de cálcio e a constante média de decaimento foi determinada como sendo de 105,3 ms nesta fatia (mapa emFigura 4E). Em seguida, APD e CaTD foram medidos como a duração do tempo entre o tempo de ativação e uma porcentagem especificada de remoção de repolarização/cálcio formam o citoplasma. APD médio80e CaTD80foram determinados 343,1 ms e 442,6 ms, respectivamente (Figura 4F,G). Estudos humanos in vivo anteriores relatam o intervalo de ativação-recuperação (ARI) medido a partir de eletrogramas unipolares registrados a partir de corações humanos in vivo durante o ritmo de estado estável a 1 Hz como substituto para APD. Os valores da RRI nesses estudos variam de 250 a 450 ms29,30. Os valores de APD de fatias cardíacas humanas relatadas aqui são comparáveis aos valores anteriores de ARI. Regiões com artefatos de movimento foram removidas dos cálculos apd e catd. Finalmente, os tempos de elevação (ou seja, a duração da tostroke) dos traços de tensão e cálcio foram medidos e mapeados. Estes são mostrados emFigura 4HEFigura 4IRespectivamente. Os valores médios foram determinados em 10,2 ms e 13,3 ms, respectivamente. Os artefatos nos mapas à direita do ponto de ritmo são devido ao fio de ritmo dentro do campo de visão. Finalmente, o uso deste modelo de fatia em testes de drogas agudas foi demonstrado quando as fatias foram cultivadas por 24 h com doxorubicina (DOX), um agente quimioterápico conhecido por ter efeitos cardiotóxicos. O tratamento de fatias com DOX de 50 μM resultou em uma redução da velocidade de condução transversa de 19,4 ± 3,4 cm/s para 9,6 ± 3,2 cm/s, conforme ilustrado pelos mapas de ativação emFigura 5A, mapas vetoriais cv emFigura 5B, e dados de resumo emFigura 5C. O menor tamanho amostral do grupo DOX deveu-se a um maior número de fatias não viáveis após o tratamento do DOX. O aumento dos artefatos de movimento em fatias tratadas com DOX impediu o cálculo de valores apd precisos. Outro parâmetro importante que pode ser medido por dupla tensão e imagem de cálcio é VM-Atraso de ca, para determinar o acoplamento robusto excitação-contração no tecido31. Atrasos ou valores negativos deste parâmetro podem ser prejudiciais.
Figura 1: Preparação de fatia organotípica cardíaca humana. (A) Os corações humanos foram armazenados em um banho cardioplégico gelado (mistura de solução cardioplegia e gelo cardioplegia) após a recuperação. (B) Os 1 cm3 cubos de tecido ventricular esquerdo foram cortados e montados em um suporte de tecido metálico com gel de 4% de agarose colado na parede traseira do suporte e transferido para um banho gelado de solução de corte oxigenado. (C) Uma vez cortadas, as fatias foram transferidas para a solução de recuperação oxigenada em RT em coador de células de malha de nylon individuais de 100 μm. Lavadoras de malha cobriram os tecidos para evitar que as fatias se enrolem. (D) Para a cultura de longo prazo, as fatias foram lavadas em PBS e cultivadas em 6 placas de poço com 3 mL de meio tecido a 37 °C. (E) Seção de fatia manchada de tricromo de Mason mostrando orientação de fibras. (F) Potencial de ação óptica representativa registrado a partir de uma fatia. (G) Mapa de ativação representativa de uma fatia andada no centro (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sistema de mapeamento óptico de câmera dupla. Sistema de mapeamento óptico de câmera dupla na configuração de imagem vertical. As peças do sistema incluem: 1) câmeras mestres e escravas para mapeamento duplo; 2) banho de tecido com gel PDMS; 3) cubos de filtro que abrigam os filtros de excitação e emissão e espelhosdicróicos; 4) porta-lentes e lentes; e 5) fonte de luz de excitação (LED verde de 520 nm). Inset em detalhes certos filtro e combinações de espelhodicróico para mapeamento óptico duplo de Vm e cálcio usando RH237 e Rhod-2-AM, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Interface gráfica de usuário (GUI) de código aberto para análise de dados de mapeamento óptico de código único para análise de parâmetros e multiparmetros. As opções de carregamento de arquivos de dados e lista de arquivos são exibidas na caixa vermelha. As opções de análise de dados estão listadas no menu suspenso de análise de dados indicado em verde. As janelas de exibição para exibição de mapas de dados são indicadas em azul escuro. As caixas de seleção para vincular arquivos de dados de mapeamento duplo para análise simultânea de dados de câmera dupla são indicadas em roxo. A janela de forma de onda para traçar o potencial de ação e traços transitórios de cálcio é exibida em amarelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Potencial transmembrano e transitórios de cálcio mapeando a partir de uma preparação de fatias cardíacas organotípicas humanas. (A) Potencial de ação óptica representativa (preto) e transitório de cálcio (borgonha). (B,C) Mapas de ativação obtidos a partir de gravações Vm e cálcio, respectivamente. (D) Mapa vetorial de velocidade de condução (CV). (E) Mapa constante da decadência transitória de cálcio (Tau). (F,G) Temperatura potencial de ação (APD80) e duração transitória de cálcio (CaTD80) mapa, respectivamente. (H,I) Mapas do tempo de ascensão dos aumentos do potencial de ação e do transitório de cálcio, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: O tratamento com doxorubicina diminui a velocidade de condução transversal. (A) Mapas de ativação de fatias cultivadas por 24 horas sem (controle) e com doxorubicina a 50 μM (DOX). (B) Mapas vetores de velocidade de condução a partir do controle e das fatias DOX. (C) Velocidade média de condução transversa calculada a partir do controle e fatias tratadas com DOX. *P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, apresentamos métodos passo a passo para obter fatias cardíacas viáveis de corações humanos presos cardioplegicamente e caracterizar funcionalmente as fatias usando mapeamento óptico duplo do potencial transmembrano e do cálcio intracelular. Com ambiente extracelular preservado e acoplamento de células nativas, as fatias cardíacas humanas podem ser usadas como um modelo preciso do coração humano para descoberta científica fundamental e para testes de eficácia e cardiotoxicidade de agentes farmacológicos e terapias genéticas. A tecnologia também permite o mapeamento estrutural-funcional de regiões específicas do coração, como o nódulo sinoatrial, o nódulo atrioventricular e as fibras Purkinje. O protocolo descrito aqui lista passos básicos para geração de fatias cardíacas, imagens e análises que são melhores para estudos de curto prazo. A cultura estática das fatias de tecido tem sido demonstrada para induzir alterações no tecido cardíaco durante períodos prolongados de tempo, por isso, para estudos de longo prazo, incentivamos o leitor a incorporar condições mais fisiológicas de cultura, como a estimulação eletromecânica12,,13,,14.
Deve-se tomar cuidado para uma série de medidas para manter a saúde do tecido. Por exemplo, o tempo entre a colheita do coração e o corte de tecidos deve ser minimizado. Como mostrado anteriormente21, o longo tempo de parada cardioplégica pode levar a eletrofisiologia alterada. Além disso, para preservar a integridade da matriz extracelular e do acoplamento celular, o manuseio excessivo e o alongamento das fatias devem ser evitados durante a coleta de fatias, cultivo e estudos funcionais. O alongamento excessivo das fatias pode resultar em blocos de condução. Além disso, todas as soluções descritas neste protocolo devem ser mantidas em um pH de 7,4. A solução da Tyrode descrita aqui utiliza o HEPES para manter o pH adequado usando 100% O2. O bicarbonato de sódio pode ser usado para controlar o pH em vez disso, mas esta solução deve ser borbulhada com 95% O2 e 5% DE CO2. Finalmente, durante o transporte e corte do coração, deve-se garantir que a solução de cardioplegia e corte sejam mantidas o mais próximo possível da temperatura de congelamento possível para preservar a viabilidade do tecido.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Financiamento pelo NIH (subsídios R21 EB023106, R44 HL139248 e R01 HL126802), pela Fundação Leducq (projeto RHYTHM) e uma Bolsa de Pós-Doutorado da American Heart Association (19POST34370122) são reconhecidos com gratidão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
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