Summary
Este protocolo describe el procedimiento para secimiento y cultivo de rebanadas cardíacas humanas para pruebas de fármacos preclínicos y detalla el uso de mapeo óptico para registrar el voltaje transmembrano y las señales de calcio intracelular simultáneamente a partir de estas rebanadas.
Abstract
Recientemente se han desarrollado preparaciones de rebanadas cardíacas humanas como una plataforma para estudios de fisiología humana y pruebas terapéuticas para cerrar la brecha entre los ensayos en animales y clínicos. Numerosos modelos animales y celulares se han utilizado para examinar los efectos de los fármacos, sin embargo, estas respuestas a menudo difieren en los seres humanos. Las rebanadas cardíacas humanas ofrecen una ventaja para las pruebas de drogas, ya que se derivan directamente de corazones humanos viables. Además de haber preservado estructuras multicelulares, acoplamiento de células celulares y entornos de matriz extracelular, las rebanadas de tejido cardíaco humano se pueden utilizar para probar directamente el efecto de innumerables fármacos en la fisiología cardíaca humana adulta. Lo que distingue a este modelo de otras preparaciones del corazón, como corazones enteros o cuñas, es que las rebanadas pueden ser sometidas a cultura a largo plazo. Como tal, las rebanadas cardíacas permiten estudiar los efectos agudos y crónicos de los medicamentos. Además, la capacidad de recoger varios cientos a mil rebanadas de un solo corazón hace de este un modelo de alto rendimiento para probar varios fármacos en diferentes concentraciones y combinaciones con otros medicamentos al mismo tiempo. Las rebanadas se pueden preparar desde cualquier región del corazón. En este protocolo, describimos la preparación de las rodajas ventriculares izquierdas aislando cubos de tejido de la pared libre ventricular izquierda y segándolas en rodajas usando un microtoma vibratorio de alta precisión. Estas rebanadas pueden ser sometidas a experimentos agudos para medir la función electrofisiológica cardíaca basal o cultivadas para estudios de drogas crónicas. Este protocolo también describe el mapeo óptico dual de las rebanadas cardíacas para grabaciones simultáneas de potenciales transmembranas y dinámicas de calcio intracelulares para determinar los efectos de los fármacos que se están investigando.
Introduction
Los modelos animales han sido una herramienta valiosa utilizada para comprender los mecanismos subyacentes de la fisiología humana y la fisiopatología, así como una plataforma para las pruebas preliminares de terapias para tratar diversas enfermedades1. Se han realizado grandes avances en el campo de la investigación biomédica basada en estos estudios en animales2. Sin embargo, existen diferencias interespecíficos significativas entre las fisiologías humanas y animales, incluidos ratones, ratas, conejillos de indias, conejos, ovejas, cerdos y perros3,4. Como resultado, ha habido numerosas terapias farmacológicas, genéticas y celulares que mostraron promesa durante la etapa de pruebas con animales, pero no pudieron estar a la altura de los resultados en los ensayos clínicos5. Para colmar esta brecha, se desarrollaron miocitos cardíacos aislados y células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) como modelos para probar la respuesta de la fisiología humana a diversos fármacos y enfermedades6. Los cardiomiocitos derivados de células madre han sido ampliamente utilizados en sistemas de órgano en un chip como sustituto del corazón6,,7,,8. Sin embargo, la utilidad de los cardiomiocitos derivados del iPSC (iPSC-CM) se ve obstaculizada por su fenotipo relativamente inmaduro y la falta de representación de la subpoblación de cardiomiocitos; el miocardio maduro es una estructura compleja compuesta por varios tipos celulares coexistibles como fibroblastos, neuronas, macrófagos y células endoteliales. Por otro lado, los cardiomiocitos humanos aislados son eléctricamente maduros, y diferentes subpoblaciones de cardiomiocitos se pueden obtener mediante la alteración de los parámetros de cultivo9. Aún así, estos miocitos generalmente exhiben morfologías potenciales de acción alteradas debido a la falta de acoplamiento de células celulares, des-diferenciación rápida, y la ocurrencia de comportamiento proarrítmico in vitro10,11. Algunas de las limitaciones fueron abordadas por modelos de cultivo celular 3D de iPSC-CM y miocitos cardíacos. Estos modelos, que incluyen esferoides, scaffolds de hidrogel encapsulados cultivos 3D, tejidos cardíacos diseñados (EHT) y sistemas de corazón en una ardilla, utilizan múltiples poblaciones de células cardíacas como cardiomiocitos, fibroblastos y células endoteliales. Se automontan o ensamblan a lo largo de un andamio para formar estructuras 3D, y algunos incluso reproducen la compleja naturaleza anisotrópica del miocardio. Se ha notificado que estos modelos tienen células de fenotipos maduros, propiedades contráctiles y perfiles moleculares similares al tejido cardíaco. El sistema de corazón en un chip también permite el estudio de los efectos sistémicos en las pruebas de drogas y los modelos de enfermedades. Sin embargo, los modelos basados en células in vitro carecen de la matriz extracelular nativa y, por lo tanto, no pueden imitar con precisión la electrofisiología a nivel de órgano. Las rebanadas cardíacas humanas, en cambio, tienen una matriz extracelular intacta y contactos nativos de célula a célula, lo que los hace útiles para examinar con mayor precisión las propiedades arritmogénicas del miocardio humano.
Los investigadores han desarrollado rebanadas organotípicas cardíacas humanas como plataforma fisiológica preclínica para pruebas de fármacos agudos y crónicos y para estudiar la electrofisiología cardíaca y la progresión de enfermedades cardíacas12,,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19. En comparación con los cardiomiocitos derivados de iPSC, las rebanadas cardíacas humanas replican más fielmente la electrofisiología cardíaca humana adulta con un fenotipo maduro de cardiomiocitos. En comparación con los cardiomiocitos humanos aislados, las rebanadas cardíacas exhiben duraciones potenciales de acción fisiológica debido al acoplamiento de células celulares bien conservado y la existencia intrínseca de sus ambientes intra y extracelulares nativos.
Este protocolo describe el proceso de generación de rebanadas cardíacas humanas a partir de corazones de donantes enteros, realizando estudios agudos (es decir, de horas de duración) y crónicos (es decir, de días de duración) para probar parámetros de electrofisiología cardíaca a través de mapeo óptico. Si bien este protocolo describe sólo el uso del tejido ventricular izquierdo (LV), se ha aplicado con éxito a otras regiones del corazón, así como a otras especies como ratones, ratas, conejillos de indias y cerdos14,,20,,21,,22. Nuestro laboratorio utiliza corazones de donantes humanos enteros que han sido rechazados para el trasplante durante los últimos 5 años, pero es factible que estos mismos procedimientos se lleven a cabo en cualquier tejido de muestra de corazón del donante obtenido por medios alternativos (por ejemplo, implantes de dispositivo de asistencia ventricular izquierda [LVAD], biopsias, mitomigenes) siempre y cuando los tejidos tengan la capacidad de ser seccionados en cubos. El mapeo óptico se emplea para el análisis en este estudio debido a su capacidad para mapear simultáneamente potenciales de acción óptica y transitorios de calcio con alta resolución espacial (100 x 100 píxeles) y temporal (>1.000 fotogramas/s). También se pueden utilizar métodos alternativos, como matrices multielectrodas (AMA) o microelectrodos, pero estas técnicas están limitadas por sus resoluciones espaciales relativamente bajas. Además, los MEA se diseñaron para su uso con cultivos celulares, y los microelectrodos afilados se gestionan más fácilmente para su uso con corazones enteros o cuñas de tejido grandes.
El objetivo del artículo es permitir que más investigadores utilicen tejidos cardíacos humanos para estudios de electrofisiología cardíaca. Cabe señalar que la tecnología descrita en este artículo es relativamente simple y beneficioso para estudios a corto plazo (en el orden de varias horas a días). Más cultivo biomimético fisiológico para estudios a largo plazo (sobre el orden de las semanas) ha sido discutido y descrito por un número de otros estudios12,18,23. La estimulación eléctrica, la carga mecánica y el estiramiento de tejidos son mecanismos de acondicionamiento ventajosos que pueden ayudar a limitar la aparición de la remodelación in vitro del tejido12,,18,,23.
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Protocol
Todos los métodos descritos se han realizado de conformidad con todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. La investigación fue aprobada por la Junta de Revisión de Instituciones (IRB) en la Universidad George Washington.
NOTA: Los corazones humanos de los donantes fueron adquiridos de la Comunidad Regional de Trasplantes de Washington como tejido desechado desidentificado con la aprobación del IRB de la Universidad George Washington. Los corazones explantados se detienen cardioplegódicamente al lavar el corazón con una solución de cardioplejia helada (la sangre se despejó del corazón en este proceso) y se transfiere al laboratorio en condiciones estándar de trasplante de órganos.
1. Preparación de soluciones
- Para cada corazón, haga 4 L de solución cardiopléjica (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 1,2 mM CaCl2; pH a 7,4). Almacene 3 L a 4oC y las 1 L restantes a -20oC.
NOTA: Esta solución se puede hacer con hasta varios días de antelación. - Recién preparado 1 L cada una de la solución de corte de Tyrode (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 10 mM de glucosa, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-butanedione monoxime [BDM]; pH a 7,4) y la solución de recuperación de Tyrode (140 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM de glucosa, 10 mM HEPES, 10 mM BDM; pH a 7,4).
NOTA: Tanto las soluciones de corte como las de recuperación deben realizarse el día del experimento y se pueden almacenar a 4 oC. - Preparar soluciones de stock de los tintes fluorescentes. Reconstituir el tinte sensible a la tensión RH237 a 1,25 mg/ml en dimetil sulfóxido (DMSO) y almacenarlo en alícuotas de 30 ml a 4 oC. Reconstituir el indicador de calcio Rhod-2AM a 1 mg/ml en DMSO. Conservar en alícuotas de 30 l a -20oC.
NOTA: Di-4-ANEPPS (solución de stock a 1,25 mg/ml en DMSO) se puede utilizar en experimentos para imágenes de cámara única del potencial transmembrano solo.- Antes del inicio del experimento, sonicar los tintes usando un sonicador de ultrasonido durante al menos 10 minutos y diluir cada alícuota de colorantes fluorescentes en 1 ml de la solución de recuperación. Añadir Pluronic F-127(Tabla de Materiales)a Rhod-2AM en una proporción de 1:1 antes de la dilución en la solución de recuperación.
- Preparar una solución en stock del desacoplador de excitación-contracción blebbistatina a 2 mg/ml de solución en DMSO. Conservar en alícuotas a -20oC. Durante los experimentos de mapeo óptico, diluya la solución de blebbistatina a una concentración de trabajo de 5-10 m en la solución de recuperación del Tyrode.
- Hacer medio de cultivo fresco complementando el medio 199 con 2% penicilina-estreptomicina, 1x suplemento de medios líquidos de insulina-transferrina-selenio (ITS), y 10 mM BDM. Filtrar el medio con un filtro estéril de 0,2 m.
NOTA: Para los estudios de perturbación farmacológica, los medicamentos se pueden agregar directamente al medio de cultivo. El medio de cultivo se puede almacenar a 37 oC. - Haga un gel de agarosa al 4% para el montaje de tejido disolviendo la agarosa de punto de fusión baja en agua destilada y calentando la mezcla en un microondas hasta que se disuelva por completo. Curar la agarosa en un plato de Petri a un espesor de 5 mm y conservar a 4 oC.
2. Configuración del equipo
- Configuración de microtomos vibratorias
- Calibre el microtoma vibratorio antes de cada experimento.
- Usando un microtoma vibratorio de alta precisión (Tabla de Materiales), cargue una cuchilla de corte de cerámica en el soporte y conecte el dispositivo de calibración provisto del microtomo vibratorio. Elija la opción de ajuste de hoja en el menú y seleccione cerámica para el tipo de hoja.
- Seleccione la opción de vibración, compruebe si hay valor del eje Z. Si este valor es <1 m, salga del menú de calibración. Si no es así, ajuste con precisión el tornillo de calibración conectado a la parte superior del cabezal vibratorio y seleccione la opción de vibración. Repita tantas veces como sea necesario para establecer el eje Z en <1 m.
- Ajuste los ajustes del vibratoma a un espesor de corte de 400 m, una velocidad de avance de 0,02 mm/s para el tejido auricular y una velocidad de avance de 0,04 mm/s para el tejido ventricular, la amplitud de vibración horizontal de 2 mm y la frecuencia de vibración de 80 Hz.
NOTA: Mientras que el espesor recomendado es de 400 m para compensar el daño celular en las superficies de corte de la rebanada, también se pueden preparar rodajas más delgadas. Dado que el límite de difusión de oxígeno es de alrededor de 150 m, las rodajas de alrededor de 300 m se utilizan a menudo14,17,18,24. - Llenar el baño del microtomo vibratorio con solución de corte a 4 oC y mantener la temperatura rodeando el exterior del baño con hielo, reponiendo según sea necesario en todo el protocolo de corte. Oxigenar continuamente la solución de corte en el baño burbujeando con 100% de oxígeno durante el corte.
- Configure un segundo plato con tantos coladores de células de malla de nylon de 100 m y arandelas malladas según sea necesario (un colador celular por rebanada). Llene este plato con solución de recuperación y oxigenarlo burbujeando con 100% de oxígeno a temperatura ambiente (RT).
NOTA: Esta solución se mantiene en RT durante el experimento.
- Calibre el microtoma vibratorio antes de cada experimento.
- Configuración de mapeo óptico
NOTA: En las publicaciones anteriores 16,25 ,,26se proporciona una descripción más detallada del sistema de mapeo óptico.1625- Adjunte un baño de tejido con una capa de gel de polidimetilsiloxano (PDMS) en la parte inferior (para fijar las rodajas) a un sistema de perfusión. Circule 1 L de la solución de recuperación a 37oC y oxigene con oxígeno al 100%, a través del sistema de perfusión a un caudal lo suficientemente rápido como para mantener la temperatura y la acumulación clara de baño perfunde.
- Ajuste el enfoque y la alineación de las dos cámaras CMOS (Tabla de materiales) utilizando un objetivo.
NOTA: Más detalles sobre la alineación se pueden encontrar en estudios anteriores26. - Utilice una fuente de luz LED verde con una longitud de onda de 520 a 5 nm para excitar simultáneamente los tintes indicadores de calcio y sensibles al voltaje.
NOTA: La fuente de luz de excitación está conectada al cubo de filtro de excitación del sistema de mapeo óptico y se refleja en un espejo dicroico de 550 nm para la iluminación epicéntrica. La luz emitida es recogida por una lente 1x y dividida por un segundo espejo dicroico a 630 nm en componentes de voltaje y calcio antes de que se filtre por filtros de 690 x 50 nm y 590 a 33 nm, respectivamente, y grabado por las dos cámaras.
3. Protocolo de corte
- Cuando esté listo para la disección y la experimentación de tejidos, prepare un baño de cardioplejia helada mezclando cardioplegia congelada y líquida. Mantener el corazón sumergido en el baño de cardioplegia hasta la acumulación de tejido para cortar (Figura 1A).
- Pega el gel de agarosa prefabricado en la parte posterior de los soportes de tejido metálico del vibratomo.
- Identifique la pared libre ventricular izquierda y corte 1 cm3 cubos de tejido en solución cardiopléjica fría. A continuación, monte rápidamente los bloques de tejido en los soportes de tejido metálico con las superficies endocardial hacia arriba y adjúntelos al gel de agarosa utilizando adhesivo tópico para la piel(Figura 1B).
NOTA: La región del tejido seleccionada debe estar lejos de los vasos sanguíneos grandes para evitar agujeros en las rodajas. El plano de seccionamiento es aproximadamente paralelo a la orientación de la fibra en la capa endocardial (Figura 1E) y el plano de seccionamiento podría estar en un ángulo leve debido a la anisotropía rotacional en una capa más profunda de la pared LV. Para aumentar el rendimiento, se pueden montar hasta dos bloques de tejido uno al lado del otro en el mismo soporte. - Transfiera los soportes metálicos al baño vibratomo lleno de la solución de corte oxigenado helada. Asegúrese de que los cubos de tejido estén completamente sumergidos.
- Mueva la hoja al borde frontal del tejido y encienda el vibratome para comenzar a cortar con los parámetros preestablecidos. Deseche las primeras rodajas hasta que la hoja alcance más allá del trabeculado en el tejido endocardio liso.
- Una vez cortada cada rebanada, transfiera cuidadosamente la rebanada a un baño oxigenado (100% O2)de la solución de recuperación de Tyrode en RT. Coloque suavemente cada rebanada en coladores individuales de células de malla de nylon de 100 m y cúbrala con arandelas de malla para evitar que las rodajas de tejido se enrosquen(Figura 1C). Mantenga los sectores en la solución de recuperación durante al menos 20 minutos.
NOTA: Los rodajas se pueden mantener en el baño en estas condiciones durante un máximo de 3 x 4 h sin efectos electrofisiológicos perjudiciales.
4. Cultivo de cortes en condiciones estáticas
NOTA: Para minimizar la posibilidad de contaminación, esterilizar los fórceps utilizando un esterilizador de perlas antes de cada paso de transferencia.
- Cuando esté listo para el cultivo, transfiera cuidadosamente cada rebanada a los pozos individuales de una placa de 6 pozos llena de solución salina estéril tamponada por fosfato (PBS). Mece suavemente la placa del pozo para enjuagar las rodajas de solución de recuperación.
NOTA: A partir de este momento, las rodajas sólo deben exponerse en una capucha de cultivo de flujo laminar BSL2, y se deben utilizar fórceps estériles para manejar el tejido. - Transfiera las rodajas a pozos de PBS fresco para enjuagar y esterilizar a fondo las rodajas para su cultivo. Realice este paso de lavado 3x para garantizar la eliminación completa de la solución de recuperación de los sectores.
- Transfiera las rodajas a pozos individuales de una placa de 6 pozos llena con 3 ml de medio de cultivo precalentado (37 oC) (con o sin drogas, Figura 1D). Colocar las placas en un agitador orbital a 20 rpm en una incubadora humidificada a 37oC con 30% O2 y 5% de CO2. Aspirar y reemplazar el medio de cultivo cada 48 h.
5. Caracterización funcional: mapeo óptico
- Para estudios de mapeo óptico inmediatamente después del corte o después del cultivo, transfiera cuidadosamente la rebanada de interés al baño de tejido del sistema de perfusión a 37 oC con 100% O2 en la solución de recuperación de Tyrode, y ancle las cuatro esquinas a la capa de gel PDMS mientras aplica un estiramiento mínimo (es decir, lo suficiente para evitar que la rebanada se mueva fácilmente en condiciones de flujo). Deje reposar las rodajas en este baño con solución de recuperación circulante durante aproximadamente 10 minutos.
- Añadir 0,3 x 0,5 ml de la blebbistatina diluida al depósito que contiene la solución de recuperación. Dejar incubar la rodaja con blebbistatina durante aproximadamente 10 min.
- Reconstituir 30 l del tinte sensible al voltaje de la población, RH237, en 1 ml de solución de recuperación a 37 oC. Apague las bombas y cargue lentamente 0,2 x 0,3 ml de solución de tinte de trabajo sobre la superficie de la rebanada durante un período de 30 s. Deje que la rebanada se incuba en el tinte con las bombas apagadas durante un período de hasta 90 s, luego encienda las bombas de nuevo para permitir que se lave cualquier exceso de tinte.
NOTA: Se debe tener cuidado de aplicar el tinte uniformemente en toda la rebanada. Además, la aplicación de tinte muy lenta es crucial para evitar que el tinte flote lejos de la rebanada. - Repita el paso 5.3 para reconstituir el indicador de calcio de stock Rhod-2AM y cargarlo en rodajas.
- Enfoque las cámaras en la rebanada ajustando la distancia de la rebanada desde la lente.
- Coloque un electrodo bipolar de ritmo de platino-iridio de manera que su punta esté en contacto con la mitad de la rebanada y aplique estímulos de ritmo de amplitud creciente para determinar el umbral de ritmo mínimo necesario para obtener una respuesta eléctrica. El ritmo de la rebanada a 1 Hz con una duración de ancho de pulso de 2 ms a 1,5 veces la amplitud del umbral de ritmo predeterminado. Coloque un cubreobjetos sobre la rebanada de tejido.
- Ilumina la rebanada con una fuente de luz de excitación LED de 520 x 5 nm. Grabe las señales de voltaje y calcio emitidas con las dos cámaras CMOS a 1.000 fotogramas/s.
- Compruebe la grabación para una buena calidad de la señal y artefactos de movimiento suprimidos (Figura 1F). Agregue más blebbistatina al depósito en pasos de 0,1 ml hasta que el movimiento ya no produzca artefactos en las señales ópticas. Agregue más tinte, si es necesario, para mejorar la calidad de la señal.
NOTA: La buena calidad de la señal se refiere a la gran amplitud de señal evaluada cualitativamente y al bajo ruido de fondo en las señales ópticas registradas.
6. Procesamiento de datos con RHYTHM1.2
NOTA: RHYTHM1.2 es una interfaz de usuario basada en MATLAB que se utiliza para mostrar, condicionar y analizar datos de mapeo óptico adquiridos por sistemas de mapeo óptico de cámara simple o dual(Figura 3). Se utiliza junto con el sistema de imágenes.
- Carga de archivos de datos
- Cargue los archivos de datos en RHYTHM1.2 seleccionando cualquiera de las cuatro ventanas de visualización en la pantalla y utilizando los botones Seleccionar directorio y Cargar.
- El programa le pedirá al usuario que seleccione los datos de la cámara 1 o de la cámara 2 para las grabaciones de doble voltaje y calcio. Seleccione La cámara 1 para la señal de tensión.
- Repita el proceso para cargar la señal de calcio (Cámara 2) en una de las ventanas de visualización adyacentes.
- Seleccione la casilla de verificación Vinculación de datos duales entre las dos ventanas de visualización seleccionadas para vincular las dos ventanas de visualización, ya que los dos conjuntos de datos se registran desde la misma región en el sector.
NOTA: Alternativamente, si se mantiene el mismo campo de visión, esta función se puede utilizar para vincular dos imágenes que se obtuvieron en puntos de tiempo separados para ver la respuesta de tiempo en electrofisiología del fármaco que se está investigando. Al hacer doble clic en cualquier ventana de visualización, se puede maximizar esa ventana para facilitar el análisis.
- Acondicionamiento de la señal
- Seleccione Análisis de datos ? Condición Parámetros para acondicionar los datos de mapeo óptico de voltaje y calcio antes de un análisis posterior.
- Utilice la función"Eliminar fondo"para eliminar píxeles que no contengan ninguna señal basada en un umbral de intensidad fluorescente (umbral de fondo [BG]) y grado de agrupación en clústeres de píxeles (umbral de excitación [EX]).
- Realice un promedio espacial de los datos de asignación óptica utilizando la función "Bin" para mejorar la calidad de la señal.
- Filtre los datos de asignación óptica utilizando un filtro de paso de banda con la función"Filtro".
- Utilice la función"Drift"para eliminar la deriva de línea base en la señal de asignación óptica.
- Usando la función"Normalizar",normalice los datos de asignación óptica de cada píxel para tener una amplitud máxima de 1.
- Utilice la función"Señal inversa"para invertir los rastros de calcio para su posterior análisis.
- Haga clic en Mostrar onda para seleccionar el seguimiento condicionado desde cualquier punto dado en la ventana de visualización y trazarlo en la ventana Forma de onda. Ajuste los parámetros de acondicionamiento de la señal para obtener un potencial de acción óptimo y trazas transitorias de calcio.
- Cálculo de la velocidad de conducción (CV)
NOTA: El tiempo de activación se define como el tiempo de derivación máxima de la señal óptica (dF/dtmax).- Seleccione Análisis de datos ? Mapa de activación e introduzca una hora de inicio y una hora de finalización para abarcar un único potencial de acción en el seguimiento. Pulse Calcular y seleccione la región de interés (ROI) para mostrar el mapa de activación de la región seleccionada (Figura 1G).
- Seleccione Análisis de datos ? CV y, de forma similar, elija la hora de inicio y la hora de finalización. Introduzca los valores de resolución entre píxeles en función de la configuración.
NOTA: Para los sistemas de aumento 1x, la resolución de interpíxeles es de 0,1 mm en la dirección X e Y. - Pulse generar vec. Botón Asignar para seleccionar un ROI y mostrar vectores CV dentro de esa región. La media, la mediana, la desviación estándar y el número de vectores incluidos en el análisis, así como el ángulo medio de propagación de los vectores CV en la región seleccionada se calculan y se muestran en la sección Estadísticas.
- Haga clic en el botón Dibujar línea para dibujar una línea a lo largo de una dirección de propagación determinada. Se seleccionarán todos los vectores CV en esa dirección. Haga clic en Calcular CV para utilizar solo los vectores CV seleccionados para calcular las estadísticas que se mostrarán en la sección Estadísticas.
- Duración potencial de acción (APD) y cálculo de la duración transitoria de calcio (CaTD)
NOTA: El TPA es otro parámetro fundamental de la electrofisiología cardíaca. Los mapas APD se pueden generar determinando la diferencia de tiempo entre la activación y un porcentaje especificado de repolarización de cada potencial de acción óptica. La heterogeneidad del TPA o la prolongación y acortamiento del TPA se pueden utilizar para predecir la susceptibilidad a la arritmia.- Para calcular el TPA en RHYTHM1.2, seleccione Análisis de datos ? Mapa APD/CaT.
- Seleccione la Hora de inicio y la Hora de finalización para abarcar un potencial de acción completo. Establezca un valor mínimo y máximo de APD/CaTD para eliminar los valores atípicos (por ejemplo, 0 y 1.000 ms, respectivamente). Introduzca el porcentaje de repolarización que determinará el APD, por ejemplo, 0,8 para APD80/CaTD80 o 0,5 para APD50/CaTD50.
- Haga clic en Calc APD regional para seleccionar un ROI y generar el mapa APD. La media, la mediana, la desviación estándar y el número de píxeles incluidos en el análisis se mostrarán en la sección Estadísticas.
- Tiempo de subida
NOTA: El tiempo de subida es otro parámetro electrofisiológico que se puede medir a partir de señales ópticas de tensión y trazas transitorias de calcio. Proporciona una estimación de cuánto tiempo tardan los canales iónicos despolarizantes en desencadenar un potencial de acción, o cuánto tiempo tarda el calcio en ser liberado en el citoplasma del retículo sarcoplasmático. El tiempo de subida óptica no es un sustituto perfecto de los tiempos de subida medidos por microelectrodos y puede no ser tan sensible a los cambios en la despolarización, porque los potenciales de acción óptica son un promedio del potencial transmembrano de muchas células. La resolución espacial y temporal del sistema también puede afectar a los valores de tiempo de subida óptica. Sin embargo, todavía se puede utilizar para predecir grandes cambios en la despolarización27.- Para determinar el tiempo de subida, seleccione Análisis de datos ? Tiempo de subida.
- Seleccione Hora de inicio y Hora de finalización para seleccionar el máximo de un solo potencial de acción o transitorio de calcio. Introduzca los valores de Start% y End% (normalmente se recomienda entre el 10 y el 90 % para señales no ruidosas), lo que permite al usuario seleccionar solo las partes de la señal sin incluir ruido en el caso de señales ruidosas.
- Haga clic en Calcular para seleccionar el ROI y determinar la media, la mediana, la desviación estándar y el número de píxeles incluidos en el análisis del tiempo de subida.
- Caries de calcio
NOTA: Para los rastros de calcio, se puede determinar la constante de tiempo de la caries del transitorio de calcio. Esto permite el análisis de los cambios en la eliminación de iones de calcio del citoplasma de vuelta en el SR.- Seleccione Análisis de datos ? Decaimiento de calcio e introduzca la hora de inicio y la hora de finalización para abarcar toda la porción de descomposición de una sola señal transitoria de calcio.
- Haga clic en Calcular Tau para seleccionar el ROI y determinar la media, la mediana, la desviación estándar y el número de píxeles incluidos en el análisis de la constante de tiempo de decaimiento de calcio.
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Representative Results
Las rebanadas organotípicas humanas se recogieron del ventrículo izquierdo de un corazón humano donante de acuerdo con el protocolo detallado anteriormente e ilustrado enFigura 1. Un sistema de mapeo óptico de cámara dual como ese enFigura 2se utilizó en la configuración de imágenes verticales para realizar el mapeo óptico simultáneo de voltaje y calcio aproximadamente 1 h después de la finalización del protocolo de corte. Los datos se analizaron utilizando RHYTHM1.2 (Figura 3), una herramienta de análisis de datos de mapeo óptico de código abierto publicada previamente por nuestro laboratorio y disponible libremente en Github (https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2). Los parámetros electrofisiológicos medidos se ilustran enFigura 4. El potencial de acción y los rastros transitorios de calcio fueron condicionados por la señal y se ilustran los rastros representativos utilizados en análisisFigura 4A. Los tiempos de activación se determinaron para cada píxel y los mapas isócronos de los tiempos de activación determinados a partir de la tensión y los rastros de calcio se ilustran enFigura 4B,C. Tenga en cuenta que la activación en el calcio isochrona se retrasa por detrás de la tensión como se esperaba. Vectores CV trazados enFigura 4Dse calcularon utilizando los tiempos de activación y la resolución interpíxel conocida. Se determinó que el CV medio en la dirección transversal era de 21,2 cm/s en esta rebanada. Este valor DE CV es comparable al CV transversal ventricular previamente reportado medido a partir de corazones humanos enteros explantados (24 x 4 y 28 x 7 cm/s en corazones con fibrosis difusa y irregular)28. La constante de descomposición transitoria de calcio se midió ajustando un polinomio a la porción en descomposición de los rastros de calcio y se determinó que la constante de descomposición media era de 105,3 ms en esta rebanada (mapa enFigura 4E). A continuación, APD y CaTD se midieron como la duración del tiempo entre el tiempo de activación y un porcentaje especificado de repolarización/eliminación de calcio forma el citoplasma. APD promedio80y CaTD80se determinó que eran 343,1 ms y 442,6 ms, respectivamente (Figura 4F,G). Estudios humanos in vivo anteriores informan del intervalo de activación-recuperación (ARI) medido a partir de electrogramas unipolares registrados desde corazones humanos in vivo durante el ritmo de estado estacionario a 1 Hz como sustituto de APD. Los valores ARI en estos estudios oscilan entre 250–450 ms29,30. Los valores de TPA de las rebanadas cardíacas humanas notificadas aquí son comparables a los valores anteriores de ARI. Las regiones con artefactos de movimiento se eliminaron de los cálculos de APD y CaTD. Finalmente, se midieron y mapearon los tiempos de subida (es decir, la duración del upstroke) de las trazas de tensión y calcio. Estos se muestran enFigura 4HYFigura 4IRespectivamente. Se determinó que los valores medios eran 10,2 ms y 13,3 ms, respectivamente. Los artefactos en los mapas a la derecha del punto de ritmo se deben al cable de ritmo dentro del campo de visión. Finalmente, se demostró el uso de este modelo de rebanada en pruebas de drogas agudas cuando se cultivaron rodajas durante 24 h con doxorubicina (DOX), un agente quimioterapéutico conocido por tener efectos cardiotóxicos. El tratamiento de las rodajas con DOX de 50 m dio lugar a una reducción de la velocidad de conducción transversal de 19,4 a 3,4 cm/s a 9,6 x 3,2 cm/s, como lo ilustran los mapas de activación enFigura 5A, mapas vectoriales CV enFigura 5B, y los datos resumidos enFigura 5C. El tamaño de muestra más pequeño en el grupo DOX se debió a un mayor número de rodajas no viables después del tratamiento con DOX. El aumento de los artefactos de movimiento en los sectores tratados con DOX impidió el cálculo de valores de TPA precisos. Otro parámetro importante que se puede medir mediante imágenes de doble voltaje y calcio es VM-Ca retraso, para determinar el acoplamiento robusto excitación-contracción en el tejido31. Los retrasos o valores negativos de este parámetro podrían ser perjudiciales.
Figura 1: Preparación de la rebanada organotípica cardíaca humana. (A) Los corazones humanos se almacenaron en un baño cardiopléjico helado (mezcla de solución de cardioplegia y hielo cardioplegia) tras la recuperación. (B) Los 1 cm3 cubos del tejido ventricular izquierdo fueron cortados y montados en un soporte de tejido metálico con 4% de gel de agarosa pegado a la pared posterior del soporte y transferidos a un baño helado de solución de corte oxigenado. (C) Una vez cortadas, las rodajas se transfirieron a la solución de recuperación oxigenada en RT en coladores de células de malla de nylon individuales de 100 m. Las arandelas malladas cubrían los tejidos para evitar que las rodajas se enroscaran. (D) Para el cultivo a largo plazo, las rodajas se lavaron en PBS y se cultivaron en placas de 6 pozos con 3 ml de medio tisú a 37 oC. (E) La sección de rebanada tricroma teñida de Mason que muestra la orientación de la fibra. (F) Potencial de acción óptica representativa registrado desde una rebanada. (G) Mapa de activación representativo de un sector en el centro (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Sistema de mapeo óptico de cámara dual. Sistema de mapeo óptico de cámara dual en la configuración de imágenes verticales. Las piezas del sistema incluyen: 1) cámaras maestras y esclavas para la asignación dual; 2) baño de tejido con gel PDMS; 3) cubos de filtro que albergan los filtros de excitación y emisión y espejos dicroicos; 4) portaobjentes y lentes; y 5) fuente de luz de excitación (520 nm LED verde). Inserción en los detalles derecho filtro y combinaciones de espejo dicroico para el mapeo óptico dual de Vm y calcio utilizando RH237 y Rhod-2-AM, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Interfaz gráfica de usuario (GUI) RHYTHM1.2 de la herramienta de análisis de datos de asignación óptica de código abierto para el análisis de parámetro único y multiparámetro. Las opciones de carga del archivo de datos y la lista de archivos se muestran en el cuadro rojo. Las opciones de análisis de datos se enumeran en el menú desplegable de análisis de datos indicado en verde. Las ventanas de visualización para mostrar mapas de datos se indican en azul oscuro. Las casillas de verificación para vincular archivos de datos de mapeo dual para el análisis simultáneo de los datos de la cámara dual se indican en púrpura. La ventana de forma de onda para trazar el potencial de acción y las trazas transitorias de calcio se muestran en amarillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El potencial de transmembrana y el mapeo de transitorios de calcio a partir de una preparación de la rebanada cardíaca organotípica humana. (A) Potencial de acción óptica representativa (negro) y transitorio de calcio (burgundy). (B,C) Mapas de activación obtenidos a partir de grabaciones de Vm y calcio, respectivamente. (D) Mapa vectorial de velocidad de conducción (CV). (E) Mapa constante de descomposición transitoria de calcio (Tau). (F,G) La duración potencial de la acción (APD80)y la duración transitoria del calcio (CaTD80)se asignan, respectivamente. (H,I) Mapas del tiempo de subida de los aumentos del potencial de acción y el transitorio de calcio, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El tratamiento con doxorubicina ralentiza la velocidad de conducción transversal. (A) Mapas de activación a partir de sectores cultivados durante 24 horas sin (control) y con doxorubicina a 50 m (DOX). (B) Mapas vectoriales de velocidad de conducción de cortes de control y rodajas DOX. (C) Velocidad media de conducción transversal calculada a partir del control y los cortes tratados con DOX. *P < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, presentamos métodos paso a paso para obtener rebanadas cardíacas viables de corazones humanos cardioplególo y para caracterizar funcionalmente las rebanadas utilizando el mapeo óptico dual del potencial transmembrano y el calcio intracelular. Con un ambiente extracelular preservado y acoplamiento de células celulares nativas, las rebanadas cardíacas humanas se pueden utilizar como un modelo preciso del corazón humano para el descubrimiento científico fundamental y para pruebas de eficacia y cardiotoxicidad de agentes farmacológicos y terapias génicas. La tecnología también permite el mapeo estructural-funcional de regiones específicas del corazón, como el nodo sinoauricionado, el nodo auriculoventricular y las fibras de Purkinje. El protocolo descrito aquí enumera los pasos básicos para la generación de rebanadas cardíacas, imágenes y análisis que son mejores para estudios a corto plazo. Se ha demostrado que el cultivo estático de rebanadas de tejido induce cambios en el tejido cardíaco durante períodos prolongados de tiempo, por lo que para estudios a largo plazo, animamos al lector a incorporar más condiciones fisiológicas de cultivo, como la estimulación electromecánica12,,13,,14.
Se debe tener cuidado de una serie de medidas para mantener la salud de los tejidos. Por ejemplo, se debe minimizar el tiempo entre la cosecha del corazón y el corte de tejido. Como se ha demostrado anteriormente21,la longitud prolongada de la detención cardiopléjica puede conducir a una electrofisiología alterada. Además, para preservar la integridad de la matriz extracelular y el acoplamiento de células celulares, se debe evitar el manejo excesivo y el estiramiento de las rodajas durante la recolección de rebanadas, el cultivo y los estudios funcionales. El estiramiento excesivo de los sectores podría dar lugar a bloques de conducción. Además, todas las soluciones descritas en este protocolo deben mantenerse a un pH de 7.4. La solución de Tyrode descrita aquí utiliza HEPES para mantener el pH adecuado usando 100% O2. El bicarbonato de sodio se puede utilizar para controlar el pH en su lugar, pero esta solución debe ser burbujeada con 95% O2 y 5% CO2. Por último, durante el transporte y el corte del corazón, uno debe asegurarse de que la cardioplejia y la solución de corte se mantengan lo más cerca posible de la temperatura de congelación para preservar la viabilidad del tejido.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Se agradece con gratitud la financiación de NIH (becas R21 EB023106, R44 HL139248 y R01 HL126802), por la fundación Leducq (proyecto RHYTHM) y una beca postdoctoral de la Asociación Americana del Corazón (19POST34370122).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
- Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
- Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today's translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
- Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
- Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
- Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
- Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
- Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
- George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
- Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
- Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
- Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).
