Summary
该协议描述了用于临床前药物测试的人体心脏切片切片和培养过程，并详细介绍了光学映射用于同时记录这些切片的跨膜电压和细胞内钙信号的过程。
Abstract
人类心脏切片制剂最近被开发为人类生理学研究和治疗测试的平台，以弥合动物和临床试验之间的差距。许多动物和细胞模型被用来检查药物的作用，但这些反应在人类中往往不同。人类心脏切片为药物测试提供了一个优势，因为它们直接来自可行的人类心脏。除了保留了多细胞结构、细胞耦合和细胞外基质环境外，人类心脏组织切片还可用于直接测试无数药物对成人心脏生理学的影响。这种模式与其他心脏制剂（如整个心脏或楔形）的区别，是切片可以受长期文化的影响。因此，心脏切片允许研究药物的急性和慢性影响。此外，从一颗心脏收集几百到一千片切片的能力使得这是一种高通量模型，可以同时测试不同浓度和与其他药物组合的几种药物。切片可以从心脏的任何给定区域制备。在此协议中，我们描述了左心室切片的制备，通过将组织立方体从左心室自由壁中分离，并使用高精度振动微孔将它们分割成切片。然后，这些切片可以进行急性实验，以测量基线心脏电生理功能，或培养用于慢性药物研究。该协议还描述了心脏切片的双光学映射，用于同时记录跨膜电位和细胞内钙动力学，以确定被调查药物的影响。
Introduction
动物模型是了解人类生理学和病理生理学基本机制的宝贵工具，也是初步测试治疗各种疾病疗法的平台。基于这些动物研究的生物医学研究领域取得了长足的进步。然而，人类和动物生理之间存在着显著的物种间差异，包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、绵羊、猪和狗33、4。4因此，在动物试验阶段，有许多药物、基因和细胞疗法显示出希望，但未能达到临床试验结果5。为了弥补这一差距，分离的心肌细胞和人类诱导多能干细胞（iPSCs）被开发为模型，以测试人类生理对各种药物和疾病的反应6。干细胞衍生心肌细胞作为心脏66、7、87,8的代用品，已广泛应用于芯片器官系统。然而，iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）的效用因其相对不成熟的表型和心肌细胞亚群的代表性而受到阻碍;成熟的心肌是一种复杂的结构，由多种共存的细胞类型组成，如成纤维细胞、神经元、巨噬细胞和内皮细胞。另一方面，分离的人类心肌细胞在电成熟，通过改变培养参数9，可以获得不同的心肌细胞亚群。然而，由于缺乏细胞-细胞耦合、快速去分化以及体外10、11,11内出现多节律行为，这些肌细胞通常表现出改变的动作潜力形态。iPSC-CM 和心形肌细胞的 3D 细胞培养模型解决了一些限制。这些模型包括球菌、水凝胶支架封装的 3D 培养物、工程心脏组织 （EHT） 和片上心脏系统，使用多个心脏细胞群，如心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞。它们要么自组装，要么沿着脚手架组装形成3D结构，有些甚至重现了心肌的复杂各向异性。据报道，这些模型具有与心脏组织相似的成熟表型、收缩特性和分子轮廓的细胞。片上心脏系统还允许研究药物测试和疾病模型中的系统效应。然而，体外细胞基模型缺乏原生细胞外基质，因此不能准确模拟器官水平电生理学。相比之下，人类心脏切片具有完整的细胞外基质和原生细胞对细胞的接触，因此有助于更准确地检查人类心肌的心律失常特性。
研究人员已开发出人心形器官切片，作为急性和慢性药物测试的生理前临床平台，并研究心脏电生理学和心脏病进展12、13、14、15、16、17、18、19。12,13,14,15,16,17,18,19与 iPSC 衍生的心肌细胞相比，人类心脏切片更忠实地复制了成熟的心肌细胞表型成人心脏电生理学。与分离的人类心肌细胞相比，心脏切片表现出生理作用潜力持续时间，因为细胞耦合保存完好，并且其原生细胞内和细胞外环境存在。
该协议描述了从整个供体心脏生成人类心脏切片的过程，进行急性（即数小时）和慢性（即数天）研究，通过光学映射测试心脏电生理学参数的过程。虽然该协议只描述了左心室（LV）组织的使用，但它已成功应用于心脏的其他地区以及其他物种，如小鼠、大鼠、豚鼠和猪14、20、21、22。14,20,21,22我们的实验室使用过去5年被拒绝移植的全身供体心脏，但只要组织能够分割成立方体，这些相同的程序可以用于通过其他手段获得的任何供体心脏样本组织（例如左心室辅助装置[LVAD]植入、活检、骨髓切除术）。光学映射用于本研究的分析，因为光学映射具有高空间（100 x 100 像素）和时间（>1，000 帧/秒）分辨率的光学动作电位和钙瞬变。也可以使用替代方法，例如多电极阵列 （MEA） 或微电极，但这些技术受到空间分辨率相对较低的限制。此外，MEA 被设计为用于细胞培养物，锋利的微电极更易于管理，用于整个心脏或大型组织楔块。
本文的目标是让更多的研究人员使用人类心脏组织进行心脏电生理学研究。需要注意的是，本文中描述的技术相对简单，对短期研究（按几个小时到几天的顺序）有益。其他一些研究12、18、23,18,23已经讨论和描述了用于长期研究的更多生理生物仿生培养（周数）。电刺激、机械加载和组织拉伸是有利的调节机制，可以帮助限制体外组织重塑12、18、2318,23的12发病。
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Protocol
所述的所有方法都符合所有机构、国家和国际人类福利准则。研究得到了乔治华盛顿大学机构审查委员会（IRB）的批准。
注：经乔治华盛顿大学IRB批准，从华盛顿地区移植社区获得捐赠人的心脏作为被解认的废弃组织。通过用冰冷心性心肌痛溶液冲洗心脏（在此过程中血液从心脏被清除），并在标准器官移植条件下转移到实验室，使心脏被心肺复苏。
1. 准备解决方案
- 对于每个心脏，制作4L的心肺结核溶液（110 mM NaCl，16 mM KCl，16 mM MgCl2，10mM NaHCO 3，1.2 mM CaCl2;pH= 7.4）。3在 4 °C 下储存 3 升，在 -20 °C 下将剩余的 1 升储存在 -20 °C 下。
注：此解决方案可以提前几天进行。 - 新鲜准备 1 L 每个 Tyrode 的切片溶液 （140 mM NaCl， 6 mM KCl， 1 mM MgCl2， 1.8 mM CaCl2， 10 mM 葡萄糖， 10 mM HEPES、10 mM 2、3-异丙酮单溪 [BDM];pH = 7.4）和 Tyrode 的回收解决方案（140 mM NaCl、4.5 mM KCl、1 mM MgCl 2、1.8 mM CaCl2、10mM 葡萄糖、10 mM HEPES、10mM BDM;pH = 7.4）。2
注：切片和恢复解决方案应在实验当天制作，并可储存在4°C。 - 准备荧光染料的库存溶液。在二甲基亚硫酸盐（DMSO）中，以1.25mg/mL的1.25mg/mL重新重组对电压敏感染料RH237，并将其储存在4°C的30μL等位物中。在 DMSO 中以 1 mg/mL 的 1 mg/mL 重新组成钙指示器 Rhod-2AM。以 -20 °C 储存在 30 μL 等分。
注：Di-4-ANEPPS（DMSO中1.25mg/mL的库存溶液）可用于单相机成像跨膜电位的实验。- 在实验开始前，使用超声波声波器对染料进行声波至少10分钟，并在恢复溶液的1 mL中稀释每个荧光染料的分量。在恢复溶液稀释前，将 Pluronic F-127 （材料表） 以 1：1 的比例添加到 Rhod-2AM 中。
- 在 DMSO 中 2 mg/mL 溶液中制备激励-收缩无耦合剂布比他塔丁的库存溶液。以 -20°C 的等号存储。在光学映射实验中，在Tyrode的回收溶液中，将布比斯塔廷的库存溶液稀释到工作浓度为5~10μM。
- 通过补充中型199与2%青霉素-链霉素，1倍胰岛素转移-硒（ITS）液体介质补充剂，和10 mM BDM，使新鲜培养基。使用 0.2 μm 无菌过滤器过滤介质。
注：对于药理扰动研究，药物可以直接添加到培养介质中。培养介质可储存在37°C。 - 通过在蒸馏水中溶解低熔点琼脂，并在微波炉中加热混合物，直到完全溶解，制作4%的琼脂胶凝胶，用于组织安装。在厚度为 5 mm 的培养皿中固化琼脂，并在 4 °C 下储存。
2. 设备设置
- 振动微震设置
- 在每个实验之前校准振动微音。
- 使用高精度振动微音（材料表），将陶瓷切割刀片装入支架，并附加振动微度提供的校准装置。从菜单中选择刀片调整选项，并为刀片类型选择陶瓷。
- 选择振动选项，检查 Z 轴值。如果此值为 <1 μm，则退出校准菜单。如果没有，请微调连接到振动头顶部的校准螺钉，然后选择振动选项。根据需要重复多次将 Z 轴设置为 <1 μm。
- 将振动设置设置为 400 μm 切割厚度、心房组织前进速度 0.02 mm/s 和心室组织预速 0.04 mm/s、2 mm 水平振动振幅和 80 Hz 振动频率。
注：虽然 400 μm 是建议厚度，以补偿切片切割表面的细胞损伤，但也可以制备更薄的切片。鉴于氧扩散极限约为150μm，通常使用约300μm的切片14、17、18、24。14,17,18,24 - 在4°C时用切片溶液填充振动微孔的浴缸，并通过用冰包围浴场外侧来保持温度，并在整个切片协议中根据需要补充。在切片过程中，使用 100% 氧气冒泡，持续氧化浴缸中的切片溶液。
- 根据需要设置第二个带有多达 100 μm 尼龙网状电池滤网和网状洗注的洗盘（每片一个细胞滤网）。在室温 （RT） 下，用回收溶液填充此盘，并吸氧 100% 氧气。
注：此解决方案在实验期间保持在 RT 上。
- 在每个实验之前校准振动微音。
- 光学映射设置
注：前一份出版物16、25、26,26对光学16,制图系统作了更详细的说明。- 将底部（固定切片）的带聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 凝胶层的组织浴连接到灌注系统。在37°C下循环1L的回收溶液，用100%氧气氧氧氧气循环1L，以足够快的速度通过灌注系统，保持温度和浴缸渗透液的清晰积累。
- 使用目标调整两个 CMOS 摄像机 （材料表） 的对焦和对齐方式。
注：有关对齐的更多详细信息，请参阅以前的研究26。 - 使用波长为 520 ± 5 nm 的绿色 LED 光源同时激发电压敏感和钙指示器染料。
注：激发光源连接到光学映射系统的激励滤波器立方体，从 550 nm 二色镜上反射，用于同心照明。发射光由 1x 透镜收集，并在 630 nm 时由第二次二色镜分割成电压和钙成分，然后分别由 690 × 50 nm 和 590 × 33 nm 滤光片过滤，并由两个摄像机记录。
3. 切片协议
- 准备进行组织解剖和实验时，通过混合冷冻和液体心胸痛来准备冰冷心肌瘫。将心脏浸入心绞痛浴中，直到组织收集切片（图1A）。
- 将预制的琼脂胶凝胶粘附到振动器的金属组织支架的背面。
- 识别左心室自由壁，在冷心肺溶液中切割1厘米3块组织。然后，快速将组织块安装到金属组织支架上，内皮表面朝上，并用局部皮肤粘合剂将其附着在琼脂胶上（图1B）。
注：所选组织区域应远离大血管，以避免切片中出现孔洞。切片平面与内卡层中的光纤方向大致平行（图1E），由于LV壁较深层的旋转各向异性，切片平面可能处于轻微角度。为了提高吞吐量，可并排安装两个组织块。 - 将金属支架转移到充满冰冷氧切片溶液的振动槽中。确保组织立方体完全淹没。
- 将刀片移到组织的前边缘，然后打开振动器，开始使用预设参数切片。丢弃前几片，直到刀片到达超过曲贝球到光滑的内皮组织。
- 切下每个切片后，小心地将切片转移到TYrode在RT的恢复溶液的含氧（100%O2）浴液中。 轻轻地将每个切片放入单独的100μm尼龙网状细胞滤网器中，用网状洗包盖住，以防止组织切片卷曲（图1C）。将切片保存在恢复解决方案中至少 20 分钟。
注：切片可在这些条件下保存在浴缸中，持续3⁄4小时，无有害的电生理效应。
4. 静态条件下的切片培养
注：为了尽量减少污染的可能性，在每个转移步骤之前，使用珠消毒器对钳子进行消毒。
- 准备培养时，小心地将每片转移到6口井的单个井中，这些孔装满了无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。轻轻摇动井板以冲洗回收溶液的切片。
注：从这一点开始，切片应只暴露在BSL2层流培养罩中，并且无菌钳子应用于处理组织。 - 将切片转移到新鲜PBS的井中，彻底冲洗和消毒切片以进行培养。执行此洗涤步骤 3x，以确保从切片中完全删除恢复溶液。
- 将切片转移到6口孔的单个孔中，填充3 mL预热（37°C）培养介质（有或不含药物，图1D）。将板以20rpm的速度放在37°C的加湿培养箱中，温度为20°C，CO2和CO2为30%。2每 48 小时吸气并更换培养介质。
5. 功能特性+光学映射
- 对于切片后立即或培养后的光学映射研究，在 Tyrode 的恢复溶液中，在 37 °C 下小心地将感兴趣的切片转移到灌注系统组织浴处，在 Tyrode 的恢复溶液中采用 100% O2，同时将四个角固定到 PDMS 凝胶层，同时应用最小拉伸（即，足以防止切片在流动条件下轻松移动）。使用循环回收溶液，让切片在此浴缸中休息约 10 分钟。
- 将稀释的百溴二丁0.3~0.5 mL添加到包含回收溶液的储液罐中。让切片孵育与布比斯塔丁约10分钟。
- 在37°C的1 mL回收溶液中重组30μL的库存电压敏感染料RH237。关闭泵，在30s期间将0.2~0.3 mL的工作染料溶液缓慢加载到切片表面。
注：应注意将染料均匀涂抹在切片上。此外，非常缓慢的染料应用对于防止染料从切片中飘离至关重要。 - 重复步骤 5.3 以重组库存钙指示器 Rhod-2AM 并将其加载到切片上。
- 通过调整切片与镜头的距离，将摄像机聚焦到切片上。
- 定位双极铂-碘起搏电极，使其尖端与切片中间接触，并应用增加振幅的起搏刺激，以确定引起电气响应所需的最小起搏阈值。以 1 Hz 的速度对切片进行步调，脉冲宽度持续时间为 2 ms，其振幅为预定起搏阈值的 1.5 倍。在组织片上放置盖玻片。
- 使用 520 × 5 nm LED 激励光源照亮切片。使用两台 CMOS 摄像机以 1，000 帧/秒的速度记录发射的电压和钙信号。
- 检查记录是否良好的信号质量和抑制运动伪影（图1F）。以 0.1 mL 的步长向储层添加更多 bbbistatin，直到运动不再在光信号中产生伪影。如果需要，添加更多染料以提高信号质量。
注：良好的信号质量是指在记录的光信号中经过定性评估的大信号振幅和低背景噪声。
6. 使用 RHYTHM1.2 进行数据处理
注： RHYTHM1.2 是基于 MATLAB 的用户界面，用于显示、条件和分析单置或双摄像头光学映射系统获取的光学映射数据（图 3）。它与成像系统结合使用。
- 正在加载数据文件
- 通过选择屏幕上四个显示窗口之一并使用"选择目录"和"加载"按钮将数据文件加载到 RHYTHM1.2 中。
- 该程序将提示用户选择相机1或相机2数据的双电压和钙记录。为电压信号选择摄像机 1。
- 重复此过程将钙信号（相机 2）加载到相邻的显示窗口之一。
- 选择两个选定显示窗口之间的"双数据链接"复选框以链接两个显示窗口，因为两个数据集是从切片上的同一区域记录的。
注： 或者，如果保持相同的视场，此功能可用于链接在不同时间点获得的两个图像，以查看被调查药物的电生理学中的时间响应。双击任意一个显示窗口允许最大化该窗口，以便便于分析。
- 信号调节
- 选择数据分析|条件参数条件，以条件电压和钙光学映射数据之前，进一步分析。
- 使用"删除背景"功能删除不包含任何信号的像素，这些像素基于荧光强度阈值（背景 [BG] 阈值）和像素聚类程度（激发 [EX] 阈值）。
- 使用"Bin"功能对光学映射数据进行空间平均，以提高信号质量。
- 使用具有"过滤器"功能的带通滤波器筛选光学映射数据。
- 使用"漂移"功能移除光学映射信号中的基线漂移。
- 使用"规范化"函数，使每个像素的光学映射数据规范化，使最大振幅为 1。
- 使用"反向信号"功能反转钙痕迹以进行进一步分析。
- 单击"显示波"从显示窗口中的任何给定点选择条件跟踪，并在 Wave 形窗口中绘制该曲线。调整信号调理参数，获得最佳作用电位和钙瞬态痕迹。
- 传导速度 （CV） 计算
注： 激活时间定义为光信号的最大导数时间 （dF/dt最大值）。- 选择数据分析|激活映射并输入开始时间和结束时间，以包含跟踪中的单个操作潜在可能。按"计算并选择感兴趣区域 （ROI））"以显示所选区域的激活映射（图 1G）。
- 选择数据分析|CV 地图，同样，选择开始时间和结束时间。根据设置输入像素间分辨率值。
注：对于 1 倍放大系统，X 和 Y 方向的像素间分辨率为 0.1 mm。 - 按生成 Vec。映射按钮以选择 ROI 并在该区域内显示 CV 矢量。计算分析中包含的平均、中位、标准差和矢量数，以及所选区域中 CV 矢量传播的平均角度，并在"统计"部分中显示。
- 单击"绘制线"按钮沿给定的传播方向绘制一条线。将选择该方向的所有 CV 矢量。单击"计算 CV"仅使用这些选定的 CV 矢量来计算将在"统计信息"部分中显示的统计信息。
- 动作电位持续时间 （APD） 和钙瞬态持续时间 （CaTD） 计算
注：APD是心脏电生理学的另一个基本参数。通过确定激活和每个光学动作电位的指定百分比再极化之间的时差，可以生成 APD 贴图。APD异质性或APD延长和缩短可用于预测心律失常易感性。- 要在 RHYTHM1.2 中计算 APD，请选择数据分析|APD/CaT 地图。
- 选择"开始时间和结束时间"以包含一个完整操作潜力。设置 APD/CaTD 的最小值和最大值以删除任何异常值（例如，分别为 0 和 1，000 毫秒）。输入确定 APD 的再极化百分比，例如，APD80/CaTD80为 0.8，APD50/CaTD50为 0.5。
- 单击区域 APD Calc以选择 ROI 并生成 APD 地图。分析中包含的平均值、中位数、标准差和像素数将显示在"统计"部分中。
- 上升时间
注：上升时间是另一个电生理参数，可以从电压和钙瞬态痕迹的光信号中测量。它提供了一个估计，需要多长时间去极化电离通道触发行动潜力，或钙从肉质视网膜释放到细胞质需要多长时间。光上升时间不是微电极测量的上升时间的完美替代品，并且可能不太敏感于去极化的变化，因为光学作用电位是许多细胞的跨膜电位的平均值。系统的空间和时间分辨率也会影响光学上升时间值。然而，它仍然可以用来预测去极化27的巨大变化。- 要确定上升时间，请选择数据分析|上升时间。
- 选择开始时间和结束时间以选择单个动作电位或钙瞬态的上冲程。输入 Start%和 End% 的值（通常建议 10-90% 用于非噪声信号），这允许用户只选择信号部分，而不会在噪声信号时包含噪声。
- 单击"计算"以选择 ROI 并确定上升时间分析中包含的平均值、中位数、标准差和像素数。
- 钙衰变
注：对于钙的痕迹，可以确定钙瞬变衰变的时间常数。这允许分析从细胞质中去除钙离子的变化回SR。- 选择数据分析|钙衰减并进入开始时间和结束时间，以包括单个钙瞬态信号的整个衰变部分。
- 单击"计算 Tau"以选择 ROI 并确定钙衰减时间常数分析中包含的平均值、中位数、标准差和像素数。
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Representative Results
根据上面详述的规程，从供体人类心脏的左心室收集人体器官切片，并图中所示图 1.双摄像头光学映射系统，如图 2用于直立成像配置，在切片协议完成后约 1 小时对电压和钙进行同步光学映射。使用 RHYTHM1.2 对数据进行分析（图 3），一个开源光学映射数据分析工具，以前由我们的实验室发布，可在 Github （https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2） 上免费获得。测量的电生理参数图示如下：图 4.作用电位和钙瞬态痕迹是信号条件，在进一步分析中使用的代表性痕迹在图4A.每个像素都确定了激活时间，从电压和钙痕迹确定的激活时间等位图如图所示图4B,C.请注意，钙异丙酮的激活落后于预期电压。绘制的 CV 矢量图 4D使用激活时间和已知的像素间分辨率计算。在这个切片中，横向的平均 CV 被确定为 21.2 厘米/s。此 CV 值可与先前报告的心室横向 CV 相当，从已外植入的整个人类心脏（24 × 4 和 28 = 7 厘米/s 在心脏中扩散和零碎纤维化）28.钙瞬态衰减常数是通过将多项式拟合到钙痕迹的衰变部分来测量的，平均衰减常数被确定为 105.3 ms（映射在图 4E).接下来，APD和CaTD被测量为激活时间和细胞质中指定百分比的再极化/钙去除之间的持续时间。平均 APD80和 CaTD80被确定为分别为 343.1 毫秒和 442.6 毫秒（图 4F,G).之前的体内人类研究报告激活-恢复间隔（ARI）从从体内人类心脏记录的单极电图中测得，在稳定状态起搏时为1 Hz，作为APD的代数。这些研究中的 ARI 值范围为 250~450 毫秒29,30.此处报告的人类心脏切片的 APD 值与以前的 ARI 值相当。从 APD 和 CaTD 计算中删除具有运动伪影的区域。最后，测量并映射电压和钙痕迹的上升时间（即上冲程的持续时间）。这些显示在图 4H和图4I分别。平均值分别确定为 10.2 毫秒和 13.3 毫秒。起搏点右侧地图中的伪影是由于视野中的起搏线造成的。最后，当切片与多索鲁比辛（DOX）一种已知具有心毒性作用的化疗剂培养为24小时时，演示了在急性药物测试中使用这种切片模型。处理 50 μM DOX 的切片可降低横向传导速度，从 19.4 ± 3.4 厘米/s 到 9.6 ± 3.2 cm/s，如激活图所示图 5A，CV 矢量映射在图5B和 中的摘要数据图 5C.DOX 组中的样本量较小是由于 DOX 处理后不可行切片数量增加。DOX 处理切片中增加的运动伪影阻止了准确 APD 值的计算。另一个重要参数，可以通过双电压和钙成像测量是V米-Ca 延迟，以确定组织中健壮的激发收缩耦合31.此参数的延迟或负值可能有害。
图1：人体心脏器官切片制剂。（A） 人类心脏在取回后被储存在冰冷的心足浴（心足溶液和心胸冰的混合物中）。（B） 左心室组织的 1 厘米3立方体被切割并安装到金属组织支架上，4% 的琼脂胶粘附在支架的后壁上，并转移到含氧切片溶液的冰冷浴中。（C） 切割后，切片被转移到单个 100 μm 尼龙网细胞滤网滤网的 RT 中氧回收溶液。网状的被网格覆盖组织，以防止切片卷曲。（D） 长期培养时，在PBS中洗涤切片，并在37°C时用3 mL的组织介质在6个孔板中培养切片。（E） 梅森的三色染色切片部分显示纤维方向。（F） 从切片中记录的代表性光学作用电位。（G） 中心节奏的切片（蓝色）的代表性激活图。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：双摄像头光学映射系统。双摄像头光学映射系统处于直立成像配置中。系统部件包括：1）主和从机相机用于双映射;2）用PDMS凝胶组织浴;3） 过滤器立方体，容纳激励和发射过滤器和二色镜;4） 镜头支架和镜头;和 5） 激发光源（520 nm 绿色 LED）。分别在右侧细节滤波器和二色镜组合上，分别使用RH237和Rhod-2-AM对Vm和钙进行双光学映射。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：用于单一参数和多参数分析的开源光学映射数据分析工具的RHYTHM1.2图形用户界面（GUI）。数据文件加载选项和文件列表显示在红色框中。数据分析选项列在以绿色表示的数据分析下拉菜单中。显示数据映射的窗口以深蓝色表示。用于链接双映射数据文件的复选框，用于同时分析双摄像头数据，以紫色表示。绘制动作势和钙瞬态痕迹的波形窗口显示为黄色。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：从人体器官性心脏切片制剂绘制的透膜电位和钙瞬变图。（A） 代表光学作用电位（黑色）和钙瞬态（酒红色）。（B，C）分别从 Vm和钙记录中获得的激活图。（D） 传导速度 （CV） 矢量贴图。（E） 钙瞬变常数 （Tau） 映射。（F，G）动作电位持续时间（APD80）和钙瞬态持续时间（CaTD80）图。（H，I）分别绘制动作潜力和钙瞬态的上升时间图。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：多索鲁比辛治疗减缓横向传导速度。（A） 从切片中激活映射，培养 24 小时，无需（控制），并在 50 μM （DOX） 处使用多索鲁比辛。（B） 从控制和 DOX 切片的传导速度矢量映射。（C） 从对照片和 DOX 处理切片计算的平均横向传导速度。*P < 0.05。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
在这里，我们提出了分步的方法，从心肌梗活的人类心脏获得可行的心脏切片，并使用跨膜电位和细胞内钙的双重光学映射功能地描述切片。通过保存的细胞外环境和原生细胞耦合，人类心脏切片可用作人类心脏的准确模型，用于基本科学发现，以及药理剂和基因疗法的疗效和心毒性测试。该技术还允许对心脏的特定区域进行结构功能映射，如心体节点、三角结和Purkinje纤维。此处描述的协议列出了心脏切片生成、成像和分析的基本步骤，这些步骤最适合短期研究。组织切片的静态培养已被证明能长期诱导心脏组织的变化，因此，对于长期研究，我们鼓励读者结合更多的生理培养条件，如机电刺激12，13，14。12,13,14
应注意采取一系列措施来保持组织健康。例如，心脏采集和组织切片之间的时间应最小化。如前21所示，延长心肌骤停时间可导致电生理改变。此外，为了保持细胞外基质和细胞-细胞耦合的完整性，在切片收集、培养和功能研究期间应避免过度处理和拉伸切片。切片过度拉伸可能导致传导块。此外，该协议中描述的所有解决方案都应保持在 7.4 的 pH。此处描述的 Tyrode 解决方案使用 HEPES 使用 100% O2保持适当的 pH。碳酸氢钠可用于控制pH，但此溶液应用95%O2和5%的CO2泡。最后，在心脏的运输和切片过程中，应确保心绞痛和切片溶液尽可能保持在接近冰点的温度，以保持组织活力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
由NIH资助（资助R21 EB023106，R44 HL139248和R01 HL126802），由利杜克基金会（项目RHYTHM）和美国心脏协会博士后奖学金（19POST34370122）感谢。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
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