Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Preklinisk hjertelektrofysiologi vurdering av dual spenning og kalsium optisk kartlegging av humane organotypiske hjerteskiver

Published: June 16, 2020 doi: 10.3791/60781
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver prosedyren for snitting og kulturing av menneskelige hjerteskiver for preklinisk narkotikatesting og detaljer bruk av optisk kartlegging for registrering av transmembranespenning og intracellulære kalsiumsignaler samtidig fra disse skivene.

Abstract

Menneskelige hjerteskivepreparater har nylig blitt utviklet som en plattform for humane fysiologistudier og terapitesting for å bygge bro mellom dyre- og kliniske studier. Tallrike dyre- og cellemodeller har blitt brukt til å undersøke effekten av narkotika, men disse svarene varierer ofte hos mennesker. Menneskelige hjerteskiver gir en fordel for narkotikatesting ved at de er direkte avledet fra levedyktige menneskelige hjerter. I tillegg til å ha bevart flercellede strukturer, cellecellekobling og ekstracellulære matrisemiljøer, kan menneskelige hjertevevskiver brukes til å direkte teste effekten av utallige legemidler på voksen menneskelig hjertefysiologi. Det som skiller denne modellen fra andre hjertepreparater, for eksempel hele hjerter eller kiler, er at skiver kan bli utsatt for langsiktig kultur. Som sådan tillater hjerteskiver å studere de akutte så vel som kroniske effektene av narkotika. Videre gjør evnen til å samle flere hundre til tusen skiver fra et enkelt hjerte dette til en høygjennomstrømningsmodell for å teste flere stoffer ved varierende konsentrasjoner og kombinasjoner med andre stoffer samtidig. Skiver kan tilberedes fra en gitt region av hjertet. I denne protokollen beskriver vi utarbeidelsen av venstre ventrikulære skiver ved å isolere vevskuber fra venstre ventrikulær fri vegg og dele dem i skiver ved hjelp av en høy presisjon vibrerende mikrotom. Disse skivene kan da enten bli utsatt for akutte eksperimenter for å måle baseline hjerteelektrofysiologisk funksjon eller dyrket for kroniske legemiddelstudier. Denne protokollen beskriver også to optiske kartlegging av hjerteskiver for samtidige registreringer av transmembbrane potensialer og intracellulær kalsiumdynamikk for å bestemme effekten av narkotika som undersøkes.

Introduction

Dyremodeller har vært et verdifullt verktøy som brukes for å forstå de underliggende mekanismene for menneskelig fysiologi og patofysiologi, samt en plattform for foreløpig testing av terapier for å behandle ulike sykdommer1. Store fremskritt har blitt tatt innen biomedisinsk forskning basert på disse dyrestudier2. Det finnes imidlertid betydelige forskjeller mellom menneske- og dyrefysiologier, inkludert mus, rotter, marsvin, kaniner, sauer, griser og hunder3,,4. Som et resultat har det vært mange legemiddel-, gen- og cellebehandlinger som viste løfte under dyretestingsstadiet, men klarte ikke å leve opp til resultatene i kliniske studier5. For å bygge bro over dette gapet ble isolerte hjertemycytter og humane pluripotente stamceller (iPSCer) utviklet som modeller for å teste responsen av menneskelig fysiologi til ulike stoffer og sykdommer6. Stamcelleavledede kardiomyocytter har vært mye brukt i organ-on-a-chip-systemer som et surrogat i hjertet6,,7,,8. Nytten av iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) er imidlertid hindret av deres relativt umodne fenotype og mangel på representasjon av kardiomyocyte subpopulation; det modne myokardiet er en kompleks struktur som består av flere sameksisterende celletyper som fibroblaster, nevroner, makrofager og endotelceller. På den annen side er isolerte humane kardiomyocytter elektrisk modne, og forskjellige kardiomyocyte subpopulasjoner kan oppnås ved å endre kulturing parametere9. Likevel viser disse myocytter generelt endret handling potensielle morfologier på grunn av mangel på celle-celle kobling, rask de-differensiering, og forekomst av proarrhythmic atferd in vitro10,11. Noen av begrensningene ble adressert av 3D-cellekulturmodeller av iPSC-CMs og hjertemycytter. Disse modellene, som inkluderer sfæroider, hydrogel stillas innkapslet 3D-kulturer, konstruert hjertevev (EHTs), og hjerte-på-en-chip systemer, bruke flere hjertecellepopulasjoner som kardiomyocytter, fibroblaster, og endotelceller. De enten selv montere eller montere langs et stillas for å danne 3D strukturer, og noen selv reprodusere komplekse anisotropisk natur myokardiet. Disse modellene har blitt rapportert å ha celler av modne fenotyper, kontraktile egenskaper, og molekylære profiler som ligner på hjertevev. Hjerte-på-en-chip-systemet tillater også studiet av systemiske effekter i narkotikatesting og sykdomsmodeller. In vitro cellebaserte modeller mangler imidlertid den innfødte ekstracellulære matrisen og kan derfor ikke nøyaktig etterligne organnivåelektrofysiologi. Menneskelige hjerteskiver, derimot, har en intakt ekstracellulær matrise og innfødte celle-til-celle-kontakter, noe som gjør dem nyttige for mer nøyaktig å undersøke arytmogene egenskaper av det menneskelige myokardiet.

Forskere har utviklet humane hjerteorganotypiske skiver som en fysiologisk preklinisk plattform for akutt og kronisk narkotikatesting og for å studere hjerteelektrofysiologi og hjertesykdomprogresjon12,13,,14,15,16,17,18,19. Sammenlignet med iPSC-avledede kardiomyocytter, humane hjerteskiver mer trofast replikere voksen menneskelig hjerteelektrofysiologi med en moden kardiomyocyte fenotype. Sammenlignet med isolerte humane kardiomyocytter viser hjerteskiver fysiologiske virkningspotensialvarierigheter på grunn av den godt bevarte cellecellekoblingen og den iboende eksistensen av deres innfødte intra- og ekstracellulære miljøer.

Denne protokollen beskriver prosessen med å generere menneskelige hjerteskiver fra hele donorhjerter, utføre akutte (dvs. timer lange) og kroniske (dvs. dager lange) studier for å teste hjerteelektrofysiologiparametere via optisk kartlegging. Mens denne protokollen beskriver bare bruken av venstre ventrikkel (LV) vev, det har blitt brukt til andre regioner av hjertet samt andre arter som mus, rotter, marsvin, og griser14,20,21,22. Vårt laboratorium bruker hele menneskelige donorhjerter som har blitt avvist for transplantasjon de siste 5 årene, men det er mulig for disse samme prosedyrene å bli utført på noen donor hjerte prøve vev oppnådd ved alternative midler (f.eks venstre ventrikulær hjelpeenhet [LVAD] implantasjoner, biopsier, myectomies) så lenge vevet har evnen til å bli delt inn i terninger. Optisk kartlegging er brukt for analyse i denne studien på grunn av sin evne til å samtidig kartlegge optiske handlingspotensialer og kalsiumtransienter med høy romlig (100 x 100 piksler) og temporal (> 1000 rammer / s) oppløsning. Alternative metoder kan også brukes, for eksempel multielectrode arrays (MEAer) eller mikroelektroder, men disse teknikkene er begrenset av deres relativt lave romlige oppløsninger. I tillegg ble MEAer designet for bruk med cellekulturer, og skarpe mikroelektroder håndteres lettere for bruk med hele hjerter eller store vevkiler.

Målet med artikkelen er å gjøre det mulig for flere forskere å bruke humant hjertevev for hjerteelektrofysiologistudier. Det bør bemerkes at teknologien som er beskrevet i denne artikkelen er relativt enkel og gunstig for kortsiktige studier (i størrelsesorden flere timer til dager). Mer fysiologisk biomimetisk kultur for langsiktige studier (i rekkefølge av uker) har blitt diskutert og beskrevet av en rekke andre studier12,18,23. Elektrisk stimulering, mekanisk lasting og vevstrekking er fordelaktige kondisjoneringsmekanismer som kan bidra til å begrense utbruddet av in vitro vevsremodellering12,,18,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet er utført i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd. Forskning ble godkjent av Institution Review Board (IRB) ved George Washington University.

MERK: Donor menneskelige hjerter ble kjøpt fra Washington Regional Transplant Community som deidentifisert kassert vev med godkjenning fra George Washington University IRB. Eksplantede hjerter er kardioplegisk arrestert ved å skylle hjertet med en løsning av iskald kardioplegi (blodet ble ryddet fra hjertet i denne prosessen) og overført til laboratoriet under standard organtransplantasjonsforhold.

1. Utarbeidelse av løsninger

  1. For hvert hjerte, gjør 4 L av kardioplegisk oppløsning (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,1,2 mM CaCl2; pH = 7,4). Oppbevar 3 l ved 4 °C og de resterende 1 l ved -20 °C.
    MERK: Denne løsningen kan gjøres opptil flere dager i forveien.
  2. Klargjør 1 L hver av Tyrodes skjæreoppløsning (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2,1,8 mM CaCl2,10 mM glukose, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-butanedione monoxime [BDM]; pH = 7,4) og Tyrodes gjenvinningsløsning (140 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2,1,8 mM CaCl2,10 mM glukose, 10 mM HEPES, 10 mM BDM; pH = 7,4).
    MERK: Både kutte- og gjenopprettingsløsningene skal gjøres dagen for forsøket og kan lagres ved 4 °C.
  3. Forbered lagerløsninger av fluorescerende fargestoffer. Rekonstituer det spenningsfølsomme fargestoffet RH237 ved 1,25 mg/ml i dimetylsulfoksid (DMSO) og oppbevar det i 30 μL aliquots ved 4 °C. Rekonstituer kalsiumindikatoren Rhod-2AM ved 1 mg/ml i DMSO. Oppbevars i 30 μL aliquots ved -20 °C.
    MERK: Di-4-ANEPPS (lagerløsning ved 1,25 mg/ml i DMSO) kan brukes i eksperimenter for enkeltkameraavbildning av transmembranepotensialet alene.
    1. Før starten av eksperimentet, soniker fargestoffene ved hjelp av en ultralyd sonicator i minst 10 minutter og fortynner hver aliquot av fluorescerende fargestoffer i 1 ml gjenopprettingsløsning. Legg Pluronic F-127 (Tabell over materialer) til Rhod-2AM på et 1:1-forhold før fortynning i gjenopprettingsløsning.
  4. Forbered en lagerløsning av eksitasjon-sammentrekning uncoupler blebbistatin ved 2 mg/ml oppløsning i DMSO. Oppbevars i aliquots ved -20 °C. Under optiske karteksperimenter fortynner du lagerløsningen av blebbistatin til en arbeidskonsentrasjon på 5–10 μM i Tyrodens gjenopprettingsløsning.
  5. Gjør frisk kultur medium ved å supplere medium 199 med 2% penicillin-streptomycin, 1x insulin-transferrin-selen (ITS) flytende media supplement, og 10 mM BDM. Filtrer mediet med et 0,2 μm sterilt filter.
    MERK: For farmakologiske perturbasjonsstudier kan legemidler legges direkte til kulturmediet. Kulturmediet kan lagres ved 37 °C.
  6. Lag en 4% agarose gel for vev montering ved å oppløse lav smeltepunkt agarose i destillert vann og varme blandingen i en mikrobølgeovn til helt oppløst. Cure agarose i en Petri parabolen ved en tykkelse på 5 mm og lagre ved 4 °C.

2. Oppsett av utstyr

  1. Vibrerende mikrotomoppsett
    1. Kalibrer den vibrerende mikrotomen før hvert eksperiment.
      1. Bruk en høy presisjon vibrerende mikrotom (Tabell av materialer), laste et keramisk skjæreblad inn i holderen og feste kalibreringsenheten som følger med vibrerende mikrotom. Velg bladjusteringsalternativet fra menyen, og velg keramikk for bladtype.
      2. Velg vibreringsalternativet, se etter Z-akseverdi. Hvis denne verdien er <1 μm, avslutter du kalibreringsmenyen. Hvis ikke, finjuster kalibreringsskruen som er festet til toppen av vibrerende hode, og velg vibreringsalternativet. Gjenta så mange ganger som nødvendig for å sette Z-aksen til <1 μm.
    2. Sett vibratominnstillingene til 400 μm skjæretykkelse, 0,02 mm/s fremgående hastighet for atrievev og 0,04 mm/s fremgående hastighet for ventrikulært vev, 2 mm horisontal vibrasjonsforsterkning og 80 Hz vibrasjonsfrekvens.
      MERK: Mens 400 μm er den anbefalte tykkelsen for å kompensere for celleskader på de kuttede overflatene på skiven, kan tynnere skiver også tilberedes. Gitt at oksygendiffusjonsgrensen er rundt 150 μm, brukes skiver rundt 300 μm ofte14,,17,,18,24.
    3. Fyll badet på vibrerende mikrotom med skjæreløsning ved 4 °C og oppretthold temperaturen ved å omgi utsiden av badet med is, etterfyll etter behov gjennom skjæreprotokollen. Kontinuerlig oksygener kutteoppløsningen i badekaret ved å boble med 100% oksygen under kutting.
    4. Sett opp en ekstra tallerken med så mange 100 μm nylon mesh celle stammere og meshed skiver etter behov (en celle sil per skive). Fyll denne parabolen med gjenvinningsløsning og oksygener den ved å boble med 100% oksygen ved romtemperatur (RT).
      MERK: Denne løsningen opprettholdes ved RT under eksperimentet.
  2. Oppsett av optisk tilordning
    MERK: En mer detaljert beskrivelse av det optiske kartsystemet er gitt i tidligere publikasjoner16,25,26.
    1. Fest et vevbad med polydimetylsiloxane (PDMS) gellag nederst (for å feste skivene) til et perfusjonssystem. Sirkuler 1 L av gjenopprettingsløsningen ved 37 °C og oksygener med 100 % oksygen, gjennom perfusjonssystemet med strømningshastighet raskt nok til å opprettholde temperaturen og klar akkumulering av bad perfusate.
    2. Juster fokus og justering av de to CMOS-kameraene (Tabell over materialer) ved hjelp av et mål.
      MERK: Flere detaljer om justering finnes i tidligere studier26.
    3. Bruk en grønn LED-lyskilde med en bølgelengde på 520 ± 5 nm for å opphisse spenningsfølsomme og kalsiumindikatorfargestoffer samtidig.
      MERK: Eksitasjonslyskilden er festet til eksitasjonsfilterkuben til det optiske kartsystemet og reflekteres av et 550 nm dichroic speil for episentrisk belysning. Det utsendte lyset samles opp av en 1x-linse og deles av et annet dichroic speil på 630 nm i spennings- og kalsiumkomponenter før det filtreres med henholdsvis 690 ± 50 nm og 590 ± 33 nm-filtre, og registreres av de to kameraene.

3. Slicing protokoll

  1. Når du er klar for vevsdisseksjon og eksperimentering, lag et bad med iskald kardioplegi ved å blande frosset og flytende kardioplegi. Hold hjertet nedsenket i kardioplegibadet til vevsoppsamling for kutting (figur 1A).
  2. Lim den forhåndslagde agarosegelen til baksiden av metallvevsholderne på vibratomen.
  3. Identifiser venstre ventrikkelfri vegg og kutt 1 cm3 terninger vev i kald kardioplegisk løsning. Deretter monterer du raskt vevsblokkene på metallvevsholderne med endokardoverflatene vendt opp og fester dem til agarosegelen ved hjelp av aktuell hudlim (Figur 1B).
    MERK: Det valgte vevsområdet bør være borte fra store blodårer for å unngå hull i skivene. Plan for snitting er omtrent parallelt med fiberorientering i endokardlaget (Figur 1E) og plan for snitting kan være i en liten vinkel på grunn av rotasjonsanisotropi i et dypere lag av LV-veggen. For å øke gjennomstrømningen kan opptil to vevsblokker monteres side om side på samme holder.
  4. Overfør metallholderne inn i vibratomebadet fylt med den iskalde oksygenerte kutteløsningen. Sørg for at vevskuber er helt nedsenket.
  5. Flytt bladet til forkanten av vevet og slå på vibratomen for å begynne å kutte med de forhåndsinnstilte parametrene. Kast de første skivene til bladet når utover trabeculae i det glatte endokardvevet.
  6. Når hver skive er kuttet, forsiktig overføre skive til en oksygenert (100% O2) bad av Tyrode utvinning løsning på RT. Plasser forsiktig hver skive i individuelle 100 μm nylon mesh celle stammere og dekke med meshed skiver for å holde vevskiver fra curling (Figur 1C). Hold skiver i gjenopprettingsløsningen i minst 20 min.
    MERK: Skiver kan oppbevares i badekaret under disse forholdene i opptil 3-4 timer uten skadelige elektrofysiologiske effekter.

4. Skjær kulturing under statiske forhold

MERK: For å minimere sjansen for kontaminering, steriliser tangene ved hjelp av en perlesterilizer før hvert overføringstrinn.

  1. Når du er klar til kultur, overfør forsiktig hver skive til de enkelte brønnene på en 6-brønnplate fylt med steril fosfatbufret saltvann (PBS). Forsiktig stein brønnplaten for å skylle skiver av utvinning løsning.
    MERK: Fra nå av skal skivene kun eksponeres i en bsl2 laminær strømningskulturhette, og sterile tang skal brukes til å håndtere vevet.
  2. Overfør skivene til brønner av fersk PBS for å skylle og sterilisere skivene for kultur grundig. Utfør dette vasketrinn 3x for å sikre fullstendig fjerning av gjenopprettingsløsning fra skivene.
  3. Overfør skivene til individuelle brønner av en 6 brønnplate fylt med 3 ml prewarmed (37 °C) kulturmedium (med eller uten rusmidler, figur 1D). Plasser plater på en orbital shaker ved 20 rpm i en fuktet inkubator ved 37 °C med 30 % O2 og 5 % CO2. Aspirere og erstatte kultur medium hver 48.

5. Funksjonell karakterisering – optisk tilordning

  1. For optiske kartstudier enten umiddelbart etter kutting eller etter dyrking, forsiktig overføre stykke interesse til vevbadet i perfusjonssystemet ved 37 °C med 100% O2 i Tyrodes utvinningsløsning, og pin ned de fire hjørnene til PDMS gellag mens du bruker minimal stretch (dvs. akkurat nok til å holde skiven fra lett å bevege seg under strømningsforhold). La skivene hvile i dette badet med sirkulerende gjenopprettingsløsning i ca. 10 min.
  2. Tilsett 0,3−0,5 ml fortynnet blebbistatin i reservoaret som inneholder gjenvinningsoppløsningen. La skiven inkubere med blebbistatin i ca. 10 min.
  3. Rekonstituer 30 μL av lagerspenningsfølsom fargestoff, RH237, i 1 ml gjenvinningsløsning ved 37 °C. Slå av pumpene og last sakte 0,2-0,3 ml arbeidsfargeoppløsning på overflaten av skiven over en periode på 30 s. La skiven inkubere i fargestoffet med pumpene av i en periode på opptil 90 s, og slå deretter pumpene på igjen for å la overflødig fargestoff vaskes ut.
    MERK: Det må utvises forsiktighet for å påføre fargestoffet jevnt over hele skiven. I tillegg er veldig langsom fargestoffapplikasjon avgjørende for å hindre at fargestoffet flyter bort fra skiven.
  4. Gjenta trinn 5.3 for å rekonstituere lagerkalsiumindikatoren Rhod-2AM og legg den på skive.
  5. Fokuser kameraene på skiven ved å justere avstanden til skiven fra objektivet.
  6. Plasser en bipolar platina-iridium pacing elektrode slik at spissen er i kontakt med midten av stykket og bruke pacing stimuli av økende amplitude for å bestemme minimum pacing terskelen som kreves for å fremkalle en elektrisk respons. Tempor skive på 1 Hz med en 2 ms puls bredde varighet på 1,5x amplituden av den forhåndsbestemte tempoterskelen. Plasser en dekkslip over vevskiven.
  7. Belys skive ved hjelp av en 520 ± 5 nm LED eksitasjon lyskilde. Ta opp de utsendte spennings- og kalsiumsignalene med de to CMOS-kameraene med 1000 bilder/s.
  8. Kontroller opptaket for god signalkvalitet og undertrykte bevegelsesartefakter (Figur 1F). Tilsett mer blebbistatin i reservoaret i trinn på 0,1 ml til bevegelsen ikke lenger produserer gjenstander i de optiske signalene. Legg til mer fargestoff, om nødvendig, for å forbedre signalkvaliteten.
    MERK: God signalkvalitet refererer til kvalitativt vurdert stor signalamplitude og lav bakgrunnsstøy i de registrerte optiske signalene.

6. Databehandling med RHYTHM1.2

MERK: RHYTHM1.2 er et MATLAB-basert brukergrensesnitt som brukes til å vise, balsamere og analysere optiske kartdata innhentet av optiske kartsystemer for ett eller dobbelt kamera (figur 3). Den brukes sammen med bildesystemet.

  1. Laste inn datafiler
    1. Last datafilene inn i RHYTHM1.2 ved å velge en av de fire skjermvinduene på skjermen og bruke knappene Velg katalog og last.
    2. Programmet vil be brukeren om å velge Kamera 1- eller Kamera 2-data for tospennings- og kalsiumopptak. Velg Kamera 1 for spenningssignalet.
    3. Gjenta prosessen for å laste kalsiumsignalet (Kamera 2) til en av de tilstøtende skjermvinduene.
    4. Merk av for Dobbel datakobling mellom de to valgte skjermvinduene for å koble de to skjermvinduene, siden de to datasettene registreres fra samme område i sektoren.
      MERK: Alternativt, hvis det samme synsfeltet opprettholdes, kan denne funksjonen brukes til å koble to bilder som ble oppnådd på hvert tidspunkt, for å se tidsresponsen i elektrofysiologien til stoffet som undersøkes. Hvis du dobbeltklikker på ett visningsvindu, kan det finnes ett vindu som kan maksimeres for å muliggjøre enkel analyse.
  2. Signalkondisjonering
    1. Velg Dataanalyse | Tilstand Parametere for å tilstand spenning og kalsium optisk kartlegging data før videre analyse.
    2. Bruk funksjonen"Fjern bakgrunn"til å fjerne piksler som ikke inneholder noe signal basert på en fluorescerende intensitetsterskel (bakgrunnsterskel [BG] og grad av pikselklynger (eksitasjon [EX]-terskel).
    3. Utfør romlig snitt av de optiske kartdataene ved hjelp av"Bin"-funksjonenfor å forbedre signalkvaliteten.
    4. Filtrer de optiske kartdataene ved hjelp av et båndpassfilter med funksjonen"Filter".
    5. BrukfunksjonenDrift " til å fjerne grunnlinjedriften i det optiske kartsignalet.
    6. Bruk funksjonen "Normaliser" normaliser den optiske kartdataene fra hver piksel for å ha en maksimal amplitude på 1.
    7. Bruk funksjonen "Inverse Signal" til å invertere kalsiumsporene for videre analyse.
    8. Klikk på Vis bølge for å velge den betingede sporingen fra et gitt sted i visningsvinduet og tegne den inn i Bølgeform-vinduet. Juster signalkondisjoneringsparametrene for å oppnå optimalt virkningspotensial og kalsiumtransientspor.
  3. Beregning av ledningshastighet (CV)
    MERK: Aktiveringstiden er definert som tidspunktet for maksimalt derivat av det optiske signalet (dF/dtmax).
    1. Velg Dataanalyse | Aktiveringskart og angi et starttidspunkt og sluttidspunkt for å omfatte ett enkelt handlingspotensial i sporingen. Trykk beregn, og velg interesseområdet (ROI) for å vise aktiveringskartet for det valgte området (Figur 1G).
    2. Velg Dataanalyse | CV-kart, og velg på samme måte Starttidspunkt og Sluttidspunkt. Angi verdiene for interpixeloppløsning basert på oppsettet.
      MERK: For 1x forstørrelsessystemer er interpikslers oppløsning 0,1 mm i X- og Y-retningen.
    3. Trykk på Generer Vec. Kart-knappen for å velge en avkastning og vise CV-vektorer i dette området. Gjennomsnittlig, median, standardavvik og antall vektorer som inngår i analysen, samt den gjennomsnittlige forplantningsvinkelen til CV-vektorene i det valgte området, beregnes og vises i Statistikk-delen.
    4. Klikk Tegn linje-knappen for å tegne en linje langs en gitt retning av forplantning. Alle CV-vektorer i den retningen velges. Klikk på Beregn CV for å bruke bare de valgte CV-vektorene til å beregne statistikken som skal vises i Statistikk-delen.
  4. Beregning av handlingspotensialvarighet (APD) og kalsiumtransientvarighet (CaTD)
    MERK: APD er en annen grunnleggende parameter for hjerteelektrofysiologien. APD-kart kan genereres ved å bestemme tidsforskjellen mellom aktivering og en spesifisert prosentandel av repolarisering av hvert optisk handlingspotensial. APD heterogenitet eller APD forlengelse og forkortelse kan brukes til å forutsi arytmi mottakelighet.
    1. Hvis du vil beregne APD i RHYTHM1.2, velger du Dataanalyse | APD/CaT Kart.
    2. Velg Starttids- og sluttidspunkt for å omfatte ett fullt handlingspotensial. Angi en minimums- og maksimumsverdi for APD/CaTD for å fjerne eventuelle avvik (for eksempel henholdsvis 0 og 1000 ms). Angi prosentrepolarization som vil bestemme APD, for eksempel 0,8 for APD80/CaTD80 eller 0,5 for APD50/CaTD50.
    3. Klikk Regional APD Calc for å velge en avkastning og generere APD-kartet. Gjennomsnittlig, median, standardavvik og antall piksler som inngår i analysen, vises i Statistikk-delen.
  5. Stigningstid
    MERK: Stigningstiden er en annen elektrofysiologisk parameter som kan måles fra optiske signaler av spenning og kalsium forbigående spor. Det gir et estimat for hvor lang tid det tar for depolarizing ion kanaler å utløse et handlingspotensial, eller hvor lang tid det tar for kalsium å bli sluppet ut i cytoplasma fra sarcoplasmic reticulum. Optisk økningstid er ikke en perfekt erstatning for stigningstider målt ved mikroelekroder og kan ikke være så følsom for endringer i depolarisering, fordi optiske handlingspotensialer er et gjennomsnitt av transmembranepotensialet til mange celler. Romlig og temporal oppløsning av systemet kan også påvirke optiske stigetidsverdier. Det kan imidlertid fortsatt brukes til å forutsi store endringer i depolarisering27.
    1. Hvis du vil fastslå stigningstiden, velger du Dataanalyse | Rise Tid.
    2. Velg Starttid og Sluttidspunkt for å velge oppslag for ett enkelt virkningspotensial eller kalsiumtransient. Angi verdiene for Start% og End% (vanligvis 10–90 % anbefales for ikke-støyende signaler), som gjør det mulig for brukeren å velge bare delene av signalet uten å inkludere støy i tilfelle støyende signaler.
    3. Klikk på Beregn for å velge avkastningen, og bestem gjennomsnittet, medianen, standardavviket og antall piksler som er inkludert i analysen av opphavstid.
  6. Kalsium forfall
    MERK: For kalsiumspor kan tiden konstant av forfallet av kalsiumtransient bestemmes. Dette gjør det mulig å analysere endringer i fjerning av kalsiumioner fra cytoplasma tilbake til SR.
    1. Velg Dataanalyse | Kalsiumråte og angi starttid og sluttid for å omfatte hele forfallsdelen av et enkelt kalsiumtransient signal.
    2. Klikk Beregn tau for å velge avkastningen og bestemme gjennomsnittlig, median, standardavvik og antall piksler som er inkludert i analysen av kalsiumforfallstid konstant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Humane organotypiske skiver ble samlet inn fra venstre ventrikkel av et donormenneskelig hjerte i henhold til protokollen som er beskrevet ovenfor og illustrert iFigur 1. Et optisk kartsystem med to kameraer som det iFigur 2ble brukt i den oppreist bildekonfigurasjonen for å utføre samtidig optisk kartlegging av spenning og kalsium ca 1 timer etter ferdigstillelse av kutteprotokollen. Data ble analysert ved hjelp av RHYTHM1.2 (Figur 3), et åpen kildekode optisk kartdataanalyseverktøy som tidligere ble publisert av laboratoriet vårt og fritt tilgjengelig på Github (https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2). De elektrofysiologiske parametrene som måles, er illustrert iFigur 4. Virkningspotensialet og kalsiumtransientsporene var signalkondisjonerte og representative spor som brukes i videre analyse er illustrert iFigur 4A. Aktiveringstidene ble bestemt for hver piksel og isokronale kart over aktiveringstider bestemt fra spennings- og kalsiumspor er illustrert iFigur 4B,C. Vær oppmerksom på at aktivering i kalsiumet ligger bak spenningen som forventet. CV-vektorer som er tegnet inn iFigur 4Dble beregnet ved hjelp av aktiveringstidene og den kjente interpixel-oppløsningen. Den gjennomsnittlige CVen i tverrgående retning ble fastslått å være 21,2 cm/ s i denne skive. Denne CV-verdien kan sammenlignes med tidligere rapportert ventrikulær tverrgående CV målt fra eksplantet hele menneskers hjerter (24 ± 4 og 28 ± 7 cm/s i hjerter med diffus og usammenhengende fibrose)28. Kalsiumtransient forfall konstant ble målt ved å montere en polynom til den råtnende delen av kalsiumspor og gjennomsnittlig forfall konstant ble fastslått å være 105,3 ms i denne delen (kart iFigur 4E). Deretter ble APD og CaTD målt som tidsvarigheten mellom aktiveringstiden og en spesifisert prosentandel av repolarisering / kalsiumfjerning danner cytoplasma. Gjennomsnittlig APD80og CaTD80var fast bestemt på å være henholdsvis 343,1 ms og 442,6 ms (Figur 4F,G). Tidligere in vivo menneskelige studier rapporterer aktivering-utvinning intervall (ARI) målt fra unipolar elektrogram registrert fra in vivo menneskelige hjerter under steady state pacing på 1 Hz som et surrogat for APD. ARI-verdiene i disse studiene varierer fra 250–450 ms29,30. APD-verdiene fra menneskelige hjerteskiver rapportert her er sammenlignbare med de tidligere ARI-verdiene. Områder med bevegelsesartefakter ble fjernet fra APD- og CaTD-beregninger. Til slutt ble stigningstidene (dvs. varigheten av oppslaget) av spennings- og kalsiumsporene målt og kartlagt. Disse vises iFigur 4HOgFigur 4IHenholdsvis. Gjennomsnittsverdiene ble fastslått å være henholdsvis 10,2 ms og 13,3 ms. Artefakter i kartene til høyre for tempoet skyldes pacing wire innenfor synsfeltet. Til slutt ble bruken av denne skivemodellen i akutt narkotikatesting demonstrert da skiver ble dyrket i 24 timer med doksorubicin (DOX), et kjemoterapeutisk middel som er kjent for å ha kardiotoksiske effekter. Behandling av skiver med 50 μM DOX resulterte i en reduksjon av tverrgående ledningshastighet fra 19,4 ± 3,4 cm/s til 9,6 ± 3,2 cm/s, som illustrert av aktiveringskartene iFigur 5A, CV vektorkart iFigur 5Bog sammendragsdata iFigur 5C. Den mindre utvalgsstørrelsen i DOX-gruppen skyldtes et høyere antall ikke-levedyktige skiver etter DOX-behandling. Økte bevegelsesartefakter i DOX-behandlede skiver forhindret beregning av nøyaktige APD-verdier. En annen viktig parameter som kan måles ved dobbel spenning og kalsiumavbildning er VM-Ca forsinkelse, for å bestemme robust eksitasjon-sammentrekning kobling i vevet31. Forsinkelser eller negative verdier for denne parameteren kan være skadelig.

Figure 1
Figur 1: Humant hjerteorganotypisk skivepreparat. (A) Menneskelige hjerter ble lagret i et iskaldt kardioplegisk bad (blanding av kardioplegiløsning og kardioplegiis) ved gjenfinning. (B) De 1 cm3 kuber av venstre ventrikulær vev ble kuttet og montert på en metallvevsholder med 4% agarose gel limt til baksiden av holderen og overført til et iskaldt bad av oksygenert kutting løsning. (C) Når de er kuttet, ble skiver overført til oksygenert gjenopprettingsløsning ved RT i individuelle 100 μm nylon mesh cellesiler. Maskerte skiver dekket vevet for å holde skivene fra curling. (D) For langsiktig kultur ble skiver vasket i PBS og dyrket i 6 brønnplater med 3 ml vevmedium ved 37 °C. Masonstrichrome-fargede skiveseksjon som viser fiberorientering. (F)Representativ optisk handlingspotensial registrert fra et stykke. (G)Representativ aktiveringskart over et stykke i midten (blå). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Optisk kartsystem for to kameraer. Optisk kartsystem med to kameraer i den oppreist bildekonfigurasjonen. Systemdeler inkluderer: 1) master og slave kameraer for dual mapping; 2) vev bad med PDMS gel; 3) filter kuber som huser eksitasjon og utslipp filtre og dichroic speil; 4) linseholdere og linser; og 5) eksitasjon lyskilde (520 nm grønn LED). Innfelt på høyre detaljfilter og dichroic speil kombinasjoner for dobbel optisk kartlegging av Vm og kalsium ved hjelp av HENHOLDSVIS RH237 og Rhod-2-AM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: RHYTHM1.2 grafisk brukergrensesnitt (GUI) for det optiske kartdataanalyseverktøyet med åpen kildekode for enkeltparameter- og multiparameteranalyse. Alternativene for innlasting av datafilen og fillisten vises i den røde boksen. Alternativer for dataanalyse er oppført i rullegardinmenyen for dataanalyse som er angitt i grønt. Visningsvinduer for visning av datakart er angitt i mørkeblått. Avmerkingsbokser for å koble to kartdatafiler for samtidig analyse av to kameradata er angitt i lilla. Bølgeformvinduet for å plotte handlingspotensial og kalsiumtransient spor vises i gult. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Transmembrane potensial og kalsium transienterer kartlegging fra et humant organotypisk hjerteskivepreparat. (A) Representativ optisk virkningspotensial (svart) og kalsiumtransient (burgunder). -BJeg harikke noe valg. Aktiveringskart hentet fra henholdsvis Vm og kalsiumopptak. (D) Ledningshastighet (CV) vektorkart. (E) Kalsium forbigående forfall konstant (Tau) kart. -FJeg harikke noe valg. Handlingspotensial varighet (APD80) og kalsiumtransient varighet (CaTD80) kart, henholdsvis. - Jeg harikkenoe valg. Kart over økningen av oppturene av handlingspotensial og kalsiumtransient, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Behandling av doksorubicin bremser tverrgående ledningshastighet. (A) Aktivering kart fra skiver dyrket i 24 timer uten (kontroll) og med doksorubicin på 50 μM (DOX). (B)Ledningshastighet vektor kart fra kontroll og DOX skiver. (C) Gjennomsnittlig tverrgående ledningshastighet beregnet fra kontroll og DOX-behandlede skiver. *P < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi trinnvise metoder for å oppnå levedyktige hjerteskiver fra kardioplegisk arresterte menneskelige hjerter og for å funksjonelt karakterisere skivene ved hjelp av dobbel optisk kartlegging av transmembranepotensial og intracellulært kalsium. Med bevart ekstracellulært miljø og innfødt cellecellekobling kan menneskelige hjerteskiver brukes som en nøyaktig modell av det menneskelige hjerte for grunnleggende vitenskapelig oppdagelse og for effekt- og kardiotoksisitetstesting av farmakologiske midler og genterapi. Teknologien åpner også for strukturell-funksjonell kartlegging av bestemte områder av hjertet, som sinoatrial node, atrioventrikulær node og Purkinje fibre. Protokollen som er beskrevet her, viser grunnleggende trinn for hjerteskivegenerering, bildebehandling og analyser som er best for kortsiktige studier. Statisk kultur av vevskiver har vist seg å indusere endringer i hjertevev over lengre perioder, så for langsiktige studier oppfordrer vi leseren til å innlemme mer fysiologiske kulturforhold, for eksempel elektromekaniskstimulering 12,13,14.

Forsiktighet bør tas for en rekke trinn for å opprettholde vev helse. For eksempel bør tiden mellom hjertehøsting og vevslicing minimeres. Som vist tidligere21, kan utvidet lengde av kardioplegisk arrest føre til endret elektrofysiologi. Også for å bevare integriteten til den ekstracellulære matrisen og cellecellekoblingen, bør overdreven håndtering og strekking av skivene unngås under skivesamling, kulturing og funksjonelle studier. Overdreven strekking av skivene kan føre til ledningsblokker. I tillegg bør alle løsninger som er beskrevet i denne protokollen, oppbevare på en pH på 7,4. Tyrodes løsning som er beskrevet her benytter HEPES for å opprettholde riktig pH ved hjelp av 100% O2. Natriumbikarbonat kan brukes til å kontrollere pH i stedet, men denne løsningen skal bobles med 95 % O2 og 5 % CO2. Til slutt, under transport og kutting av hjertet, bør man sørge for at kardioplegien og kutteoppløsningen holdes så nær frysetemperatur som mulig for å bevare vevs levedyktighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Støtte fra NIH (tilskudd R21 EB023106, R44 HL139248 og R01 HL126802), av Leducq foundation (prosjekt RHYTHM) og en American Heart Association Postdoctoral Fellowship (19POST34370122) er takknemlig anerkjent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1mL BD Syringe Thomas Scientific 309597
2,3-butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
6 well culture plates Corning 3516
Biosafety cabinet ThermoFisher Scientific 1377
Blebbistatin Cayman 13186
Bubble Trap Radnoti 130149
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Corning Cell Strainers Fisher Scientific 07-201-432
Di-4-ANEPPS Biotium stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Dumont #3c Forceps Fine Science Tools 11231-20
Emission dichroic mirror Chroma T630LPXR-UF1
Emission filter (RH237) Chroma ET690/50m
Emission Filter (Rhod2AM) Chroma ET590/33m
Excitation dichroic mirror Chroma T550LPXR-UF1
Excitation Filter Chroma ET500/40x
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Heat exchanger Radnoti 158821
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Incubator ThermoFisher Scientific 50145502
Insulin Transferrin Selenium (ITS) Sigma-Aldrich I3146
LED excitation light source Prizmatix UHP-Mic-LED-520
Magnessium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M9272
Medium 199 ThermoFisher Scientific 11150059
Micam Ultima L type CMOS camera Scimedia N/A
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-10
Pennicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic Pump Cole Parmer EW-07522-20
Platinum pacing wire Alfa Aesar 43275
Pluronic F127 ThermoFisher Scientific P6867 nonionic, surfactant polyol
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911
Powerlab data acquisition and stimulator AD Instruments Powerlab 4/26
RH237 Biotium 61018
Rhod2AM ThermoFisher Scientific R1245MP
Rhod-2AM Invitrogen, Carlsbad, CA
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
Sterilizer, dry bead Sigma-Aldrich Z378550
Stone Oxygen Diffuser Waterwood B00O0NUVM0
TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive gobiomed AESCULAP
UltraPure Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520100
Ultrasound sonicator Branson 1800
Vibratome Campden Instruments 7000 smz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
  2. Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today's translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
  3. Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
  4. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  5. Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
  6. Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
  7. Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
  10. Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
  12. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
  13. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
  14. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  15. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
  16. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
  17. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
  18. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  20. Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
  21. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
  22. Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
  23. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
  24. Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
  25. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
  26. Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
  27. George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
  28. Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
  29. Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
  30. Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
  31. Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).

Tags

Bioengineering Utgave 160 menneskehjerte organotypisk kultur hjerteskiver optisk kartlegging elektrofysiologi spenning kalsium narkotikatesting
Preklinisk hjertelektrofysiologi vurdering av dual spenning og kalsium optisk kartlegging av humane organotypiske hjerteskiver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

George, S. A., Brennan, J. A.,More

George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices. J. Vis. Exp. (160), e60781, doi:10.3791/60781 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter