Summary
Detta protokoll beskriver förfarandet för snittning och odling mänskliga hjärt skivor för prekliniska drogtester och detaljer användningen av optisk kartläggning för registrering transmembrane spänning och intracellulära kalcium signaler samtidigt från dessa skivor.
Abstract
Humana hjärtskivor preparat har nyligen utvecklats som en plattform för mänskliga fysiologi studier och terapi testning för att överbrygga klyftan mellan djur och kliniska prövningar. Många djur- och cellmodeller har använts för att undersöka effekterna av droger, men dessa svar skiljer sig ofta åt hos människor. Mänskliga hjärt skivor erbjuder en fördel för drogtester i att de är direkt härrör från livskraftiga mänskliga hjärtan. Förutom att ha bevarat flercelliga strukturer, cellcellskoppling och extracellulära matrismiljöer, kan mänskliga hjärtvävnadsskivor användas för att direkt testa effekten av otaliga läkemedel på vuxna mänskliga hjärtfysiologi. Det som skiljer denna modell från andra hjärtförberedelser, såsom hela hjärtan eller kilar, är att skivor kan utsättas för långsiktig kultur. Som sådan, hjärt skivor möjliggör att studera de akuta och kroniska effekterna av läkemedel. Dessutom, förmågan att samla flera hundra till tusen skivor från ett enda hjärta gör detta till en hög genomströmning modell för att testa flera läkemedel vid varierande koncentrationer och kombinationer med andra läkemedel på samma gång. Skivor kan förberedas från en viss region i hjärtat. I detta protokoll beskriver vi beredningen av vänster Ventrikulärt skivor genom att isolera vävnad kuber från den vänstra Ventrikulärt fri vägg och snittning dem i skivor med hjälp av en hög precision vibrerande mikrotom. Dessa skivor kan sedan antingen utsättas för akuta experiment för att mäta hjärtelektrofysiologisk funktion vid baslinjen eller odlas för kroniska läkemedelsstudier. Detta protokoll beskriver också dubbla optiska kartläggning av hjärt skivor för samtidiga inspelningar av transmembran potentialer och intracellulära kalcium dynamik för att bestämma effekterna av de läkemedel som undersöks.
Introduction
Djurmodeller har varit ett värdefullt verktyg som används för att förstå de underliggande mekanismerna för människans fysiologi och patofysiologi, samt en plattform för preliminär testning av terapier för behandling av olika sjukdomar1. Stora framsteg har tagits inom området biomedicinsk forskning baserad på dessa djurstudier2. Det finns dock betydande skillnader mellan arter mellan mänskliga och animaliska fysiologi, inklusive möss, råttor, marsvin, kaniner, får, grisar och hundar3,,4. Som ett resultat, Det har varit många läkemedel, gen, och cell terapier som visade lovande under djurförsök skede men misslyckades med att leva upp till resultaten i kliniska prövningar5. För att överbrygga denna klyfta utvecklades isolerade hjärtmyocyter och humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC) som modeller för att testa människans fysiologis svar på olika läkemedel och sjukdomar6. Stamceller-härledda kardiomyocyter har använts i stor utsträckning i organ-on-a-chip system som ett surrogat för hjärtat6,7,8. Nyttan av iPSC-härledda kardiomyocyter (iPSC-CMs) hindras dock av deras relativt omogna fenotyp och bristen på representation av cardiomyocyte subpopulation; mogna hjärtmuskeln är en komplex struktur som består av flera samtidiga celltyper såsom fibroblaster, nervceller, makrofager och endotelceller. Å andra sidan, isolerade mänskliga kardiomyocyter är elektriskt mogna, och olika kardiomyocyte subpopulationer kan erhållas genom att ändra odling parametrar9. Fortfarande, dessa myocyter uppvisar i allmänhet förändrad åtgärd potentiella morfologier på grund av bristen på cell-cell koppling, snabb avdifferentiering, och förekomsten av proarytmic beteende in vitro10,11. Några av begränsningarna togs upp av 3D cell kultur modeller av iPSC-CMs och hjärt myocyter. Dessa modeller, som inkluderar sfäroider, hydrogel byggnadsställning inkapslade 3D-kulturer, konstruerade hjärtvävnader (EHTs), och heart-on-a-chip system, använda flera hjärtcell populationer såsom kardiomyocyter, fibroblaster, och endotelceller. De antingen själv montera eller montera längs en byggnadsställning för att bilda 3D-strukturer, och vissa även återge den komplexa anisotropa karaktären av hjärtmuskeln. Dessa modeller har rapporterats ha celler av mogna fenotyper, kontraktila egenskaper och molekylära profiler som liknar hjärtvävnad. Hjärtat-på-ett-chip systemet möjliggör också studiet av systemiska effekter i drogtester och sjukdomsmodeller. In vitro-cellbaserade modeller saknar dock den inbyggda extracellulära matrisen och kan därför inte exakt efterlikna elektrofysiologi på organnivå. Mänskliga hjärt skivor, däremot, har en intakt extracellulär matris och infödda cell-till-cell kontakter, vilket gör dem användbara för mer exakt undersöka arytmogenic egenskaper hos den mänskliga hjärtmuskeln.
Forskare har utvecklat mänskliga hjärt organotypic skivor som en fysiologisk preklinisk plattform för akuta och kroniska drogtester och att studera hjärt elektrofysiologisk och hjärtsjukdomprogression12,13,14,15,16,17,18,19. Jämfört med iPSC-härledda kardiomyocyter, mänskliga hjärt skivor mer troget replikera vuxna mänskliga hjärt elektrofysiologi med en mogen kardiomyocyte fenotyp. Jämfört med isolerade mänskliga kardiomyocyter uppvisar hjärtskivor fysiologiska åtgärder potentiella varaktigheter på grund av den välbevarade cellcellkopplingen och den inneboende förekomsten av deras inhemska intra- och extracellulära miljöer.
Detta protokoll beskriver processen att generera mänskliga hjärtskivor från hela donatorhjärtan, utför akuta (dvs. timmar långa) och kroniska (dvs. dagar långa) studier för att testa hjärtelektrofysiologiska parametrar via optisk kartläggning. Även om detta protokoll beskriver endast användningen av den vänstra Ventrikulärt (LV) vävnad, det har framgångsrikt tillämpas på andra regioner i hjärtat samt andra arter såsom möss, råttor, marsvin, och grisar14,20,21,22. Vårt laboratorium använder hela mänskliga givare hjärtan som har avvisats för transplantation under de senaste 5 åren, men det är möjligt för samma förfaranden som skall utföras på alla givare hjärtprov vävnader som erhållits på alternativa sätt (t.ex. vänster Ventrikulärt bistå enhet [LVAD] implantationer, tarmbiopsier, myectomies) så länge vävnaderna har förmågan att delas upp i kuber. Optisk kartläggning används för analys i denna studie på grund av dess förmåga att samtidigt kartlägga optiska verkningspotentialer och kalciumtransienter med hög rumslig (100 x 100 pixlar) och tidsmässig (>1 000 ramar/s) upplösning. Alternativa metoder kan också användas, till exempel flerelektrodematriser (MEA) eller mikroelektroder, men dessa tekniker begränsas av deras relativt låga rumsliga upplösningar. Dessutom var MEAs utformade för användning med cellkulturer, och skarpa mikroelektroder hanteras lättare för användning med hela hjärtan eller stora vävnadskilar.
Målet med artikeln är att göra det möjligt för fler forskare att använda mänskliga hjärtvävnader för hjärtelektrofysiologiska studier. Det bör noteras att den teknik som beskrivs i denna artikel är relativt enkel och fördelaktigt för kortsiktiga studier (i ordningen på flera timmar till dagar). Mer fysiologisk biomimetisk kultur för längre långtidsstudier (i ordningen veckor) har diskuterats och beskrivits av ett antal andra studier12,18,23. Elektrisk stimulering, mekanisk belastning och vävnad stretching är fördelaktiga konditioneringsmekanismer som kan bidra till att begränsa uppkomsten av in vitro vävnad remodellering12,18,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla beskrivna metoder har utförts i enlighet med alla institutionella, nationella och internationella riktlinjer för mänsklig välfärd. Forskning godkändes av Institution Review Board (IRB) vid The George Washington University.
OBS: Givare mänskliga hjärtan förvärvades från Washington Regional Transplant gemenskapen som deidentified kasseras vävnad med godkännande från George Washington University IRB. Explanted hjärtan arresteras cardioplegically genom att spola hjärtat med en lösning av iskall cardioplegia (blodet rensades från hjärtat i denna process) och överförs till labbet under standard organtransplantation villkor.
1. Utarbetande av lösningar
- För varje hjärta, gör 4 L kardioplegisk lösning (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2,10 mM NaHCO3, 1,2 mM CaCl2; pH = 7,4). Förvara 3 L vid 4 °C och resterande 1 L vid -20 °C.
Obs: Denna lösning kan göras upp till flera dagar i förväg. - Nyligen förbereda 1 L vardera av Tyrodes skivningslösning (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2,1,8 mM CaCl2, 10 mM glukos, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-butanedione monoxime [BDM]; pH = 7.4) och Tyrodes återställningslösning (140 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2,1,8 mM CaCl2, 10 mM glukos, 10 mM HEPES, 10 mM BDM; pH = 7,4).
OBS: Både skivnings- och återställningslösningarna bör göras samma dag som experimentet och kan förvaras vid 4 °C. - Förbered lagerlösningar av fluorescerande färgämnen. Rekonstruera det spänningskänsliga färgämnet RH237 vid 1,25 mg/ml i dimetylsulfaoxid (DMSO) och förvara det i 30 μL alikvoter vid 4 °C. Rekonstruera kalciumindikatorn Rhod-2AM vid 1 mg/ml i DMSO. Förvaras i 30 μL alikvoter vid -20 °C.
OBS: Di-4-ANEPPS (stamlösning på 1,25 mg/ml i DMSO) kan användas i experiment för single camera imaging av transmembranpotentialen ensam.- Före experimentets början, sonikera färgämnena med hjälp av ett ultraljud sonicator i minst 10 min och späda ut varje alikvot av fluorescerande färgämnen i 1 ml av återställningslösningen. Tillsätt Pluronic F-127(Tabell av material) till Rhod-2AM vid en 1:1 förhållande före utspädning i återvinning lösning.
- Förbered en stamlösning av excitation-contraction uncoupler blebbistatin vid 2 mg/ml-lösning i DMSO. Förvaras i alikvoter vid -20 °C. Under optiska kartläggningsexperiment späder du stamlösningen av blebbistatin till en arbetskoncentration på 5−10 μM i Tyrondes återställningslösning.
- Gör färsk odling medium genom att komplettera medium 199 med 2% penicillin-streptomycin, 1x insulin-transferrin-selen (ITS) flytande media tillägg, och 10 mM BDM. Filtrera mediet med ett 0,2 μm sterilt filter.
OBS: För farmakologiska störningsstudier kan läkemedel läggas direkt till odlingsmediet. Odlingsmediet kan lagras vid 37 °C. - Gör en 4% agaros gel för vävnad montering genom att lösa upp låg smältpunkt agaros i destillerat vatten och uppvärmning blandningen i en mikrovågsugn tills helt upplöst. Härda agarose i en petriskål med en tjocklek av 5 mm och förvara på 4 °C.
2. Utrustning setup
- Vibrerande mikrotominställning
- Kalibrera den vibrerande mikrotomen före varje experiment.
- Använd en vibrerande mikrotom med hög precision (Tabell över material) ladda ett keramiskt skärblad i hållaren och fäst den kalibreringsanordning som medföljer den vibrerande mikrotomen. Välj bladjusteringsalternativet på menyn och välj keramik för typ av blad.
- Välj vibrera alternativet, leta efter Z axel värde. Om det här värdet är <1 μm lämnar du kalibreringsmenyn. Om inte, justera kalibreringsskruven som är fäst högst upp på det vibrerande huvudet och välj vibrera alternativet. Upprepa så många gånger som behövs för att ställa in Z-axeln på <1 μm.
- Ställ in vibrationsinställningarna på 400 μm skärtjocklek, 0,02 mm/s förhastighet för förmaksvävnad och 0,04 mm/s förhastighet för ventrikulär vävnad, 2 mm horisontell vibrationsamplitud och 80 Hz vibrationsfrekvens.
OBS: Medan 400 μm är den rekommenderade tjockleken för att kompensera för cellskador på skivas skurna ytor, kan även tunnare skivor beredas. Med tanke på att syrespridningsgränsen ligger runt 150 μm används skivor runt 300 μm ofta14,,17,,18,24. - Fyll badet på den vibrerande mikrotomen med skivningslösning vid 4 °C och håll temperaturen genom att omge utsidan av badet med is, och fyll på vid behov i hela skivningsprotokollet. Kontinuerligt syresätta skivningslösningen i badet genom att bubbla med 100% syre under skivning.
- Ställ in en andra maträtt med så många 100 μm nylonmaskcellssiler och meshade brickor som behövs (en cellsil per skiva). Fyll denna maträtt med återvinning lösning och syresätta den genom att bubbla med 100% syre vid rumstemperatur (RT).
Obs: Denna lösning underhålls på RT under experimentet.
- Kalibrera den vibrerande mikrotomen före varje experiment.
- Inställningar för optisk mappning
Obs: En mer detaljerad beskrivning av det optiska kartsystemet finns i tidigare publikationer16,,25,26.- Fäst ett vävnadsbad med polydimetylsiloxan (PDMS) gelskikt i botten (för att fästa skivorna) på ett perfusionssystem. Cirkulera 1 L av återvinningslösningen vid 37 °C och syresätta med 100% syre, genom perfusionssystemet i en flödeshastighet tillräckligt snabbt för att bibehålla temperaturen och tydlig ansamling av badperfusat.
- Justera fokus och justering av de två CMOS-kamerorna (Tabell över material) med hjälp av ett mål.
OBS: Mer information om anpassning finns i tidigare studier26. - Använd en grön LED-ljuskälla med en våglängd på 520 ± 5 nm för att excitera spänningskänsliga och kalciumindikatorfärger samtidigt.
OBS: Excitationsljuskällan är fäst vid excitationsfilterkuben i det optiska kartsystemet och reflekteras av en 550 nm dichroic spegel för epicentrisk belysning. Det avgivna ljuset samlas upp av en 1x lins och delas av en andra dikroisk spegel vid 630 nm i spännings- och kalciumkomponenter innan det filtreras med 690 ± 50 nm respektive 590 ± 33 nm filter och registreras av de två kamerorna.
3. Skivningsprotokoll
- När du är redo för vävnad dissekering och experiment, förbereda ett bad av iskall cardioplegia genom att blanda fryst och flytande cardioplegia. Håll hjärtat nedsänkt i kardioplegibadet tills vävnadssamlingen för skivning (figur 1A).
- Limma den färdiga agarose gelen på baksidan av metallvävnadshållarna i vibratomen.
- Identifiera den vänstra ventrikulära fria väggen och skär 1 cm3 kuber av vävnad i kall cardioplegic lösning. Montera sedan snabbt vävnadsblocken på vävnadshållarna med de endokardiella ytorna uppåt och fäst dem på agarosgelen med hjälp av utvärtes hudlim (figur 1B).
OBS: Den valda vävnadsregionen bör vara borta från stora blodkärl för att undvika hål i skivorna. Delningens plan är ungefär parallellt med fiberorienteringen i endokardiellskiktet (figur 1E) och snittningsplanet kan vara i en liten vinkel på grund av roterande anisotropi i ett djupare lager av LV-väggen. För att öka genomströmningen kan upp till två vävnadsblock monteras sida vid sida på samma hållare. - Överför metallhållarna till vibratombadet fyllt med den iskalla syresatt skivlösningen. Se till att vävnadskuberna är helt nedsänkta.
- Flytta bladet till vävnadens framkant och slå på vibrationen för att börja skära med de förinställda parametrarna. Kasta de första flera skivorna tills bladet når bortom trabeculae i den släta endokardiell vävnad.
- När varje skiva skärs, överför försiktigt skivan till ett syresatt (100 % O2)bad med Tyrondes återhämtningslösning vid RT. Placera försiktigt varje skiva i enskilda 100 μm nylonmaskcellssiler och täck med maskade brickor för att hålla vävnadsskivorna från curling (figur 1C). Håll skivor i återställningslösningen i minst 20 minuter.
OBS: Skivor kan förvaras i badet under dessa förhållanden i upp till 3−4 timmar utan skadliga elektrofysiologiska effekter.
4. Skiva odling under statiska förhållanden
OBS: För att minimera risken för kontaminering, sterilisera pincetterna med hjälp av en pärla autoklav före varje överföring steg.
- När du är redo att odla, överför försiktigt varje skiva till de enskilda brunnarna på en 6-brunnsplatta fylld med steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Klipp försiktigt brunnsplattan för att skölja skivorna av återhämtningslösningen.
OBS: Från och med nu bör skivorna endast exponeras i en BSL2 laminärflödesodlingshuva, och sterila pincett bör användas för att hantera vävnaden. - Överför skivorna till brunnar av färska PBS för att skölja noggrant och sterilisera skivorna för kultur. Utför detta tvättsteg 3x för att säkerställa fullständig borttagning av återställningslösning från skivorna.
- Överför skivorna till enskilda brunnar av en 6-brunnsplatta fylld med 3 ml förkrigskulturmedium (37 °C) (med eller utan droger, figur 1D). Placera plattorna på en orbital shaker vid 20 varv/min i en fuktad inkubator vid 37 °C med 30% O2 och 5% CO2. Aspirera och byt ut odlingsmedium var 48:e timme.
5. Funktionell karakterisering – optisk mappning
- För optiska kartläggningsstudier antingen omedelbart efter skivning eller efter odling, överför försiktigt den del av intresse till perfusionssystemets vävnadsbad vid 37 °C med 100% O2 i Tyrondes återhämtningslösning och fäst de fyra hörnen till PDMS gelskikt samtidigt som minimal stretch (dvs. precis tillräckligt för att hålla skivan från att enkelt röra sig under flödesförhållanden). Låt skivorna vila i detta bad med cirkulerande återhämtningslösning i ca 10 min.
- Tillsätt 0,3−0,5 ml av den utspädda blebbistatin till behållaren som innehåller återvinningslösningen. Låt skivan ruva med blebbistatin i ca 10 min.
- Rekonstruera 30 μL av det spänningskänsliga färgämnet RH237, i 1 ml återvinningslösning vid 37 °C. Stäng av pumparna och lasta långsamt 0,2−0,3 ml arbetsfärgningsmedel på skivans yta under en period av 30 s. Låt skivan ruva i färgämnet med pumparna avstängda under en period upp till 90 s, slå sedan på pumparna igen så att eventuellt överflödigt färgämne kan sköljas ut.
OBS: Försiktighet bör iakttas för att applicera färgen jämnt över hela skivan. Dessutom är mycket långsam färgämne ansökan avgörande för att förhindra att färgen flyter bort från segmentet. - Upprepa steg 5.3 för att rekonstruera beståndet kalcium indikator Rhod-2AM och ladda den på skiva.
- Fokusera kamerorna på segmentet genom att justera avståndet på skivan från linsen.
- Placera en bipolär platina-iridium pacing elektrod så att dess spets är i kontakt med mitten av skivan och tillämpa pacing stimuli av ökande amplitud för att bestämma den lägsta pacing tröskel som krävs för att framkalla en elektrisk reaktion. Stega in segmentet på 1 Hz med en varaktighet på 2 ms pulsbredd vid 1,5 x amplituden för den förutbestämda tempotröskeln. Placera ett täckglas över vävnadsskivan.
- Tänd skivan med en ljuskälla på 520 ± 5 nm LED.Illuminate the slice using a 520 ± 5 nm LED excitation light source. Registrera de avgivna spännings- och kalciumsignalerna med de två CMOS-kamerorna på 1 000 bildrutor/s.
- Kontrollera att inspelningen inte är god signalkvalitet och undertryckta rörelseartefakter (figur 1F). Lägg till mer blebbistatin till behållaren i steg om 0,1 ml tills rörelsen inte längre producerar artefakter i de optiska signalerna. Lägg till mer färg, om det behövs, för att förbättra signalkvaliteten.
OBS: God signalkvalitet avser kvalitativt bedömd stor signalamplitud och lågt bakgrundsljud i de inspelade optiska signalerna.
6. Databehandling med RHYTHM1.2
OBS: RHYTHM1.2 är ett MATLAB-baserat användargränssnitt som används för att visa, villkora och analysera optiska kartdata som förvärvats av optiska kartsystem med en eller två kameror (figur 3). Det används tillsammans med bildsystemet.
- Läsa in datafiler
- Ladda datafilerna i RHYTHM1.2 genom att välja något av de fyra visningsfönstren på skärmen och med hjälp av knapparna Välj katalog och läs in.
- Programmet kommer att uppmana användaren att välja Kamera 1 eller Kamera 2 data för dubbla spänning och kalcium inspelningar. Välj Kamera 1 för spänningssignalen.
- Upprepa processen för att ladda kalciumsignalen (kamera 2) till ett av de intilliggande visningsfönstren.
- Markera kryssrutan Dubbel datalänkning mellan de två markerade visningsfönstren för att länka de två visningsfönstren, eftersom de två datauppsättningarna registreras från samma region på segmentet.
OBS: Alternativt, om samma synfält bibehålls, kan denna funktion användas för att länka två bilder som erhölls vid separata tidpunkter för att se tidssvaret i elektrofysiologologin hos läkemedlet som undersöks. Dubbelklicka på ett ett visningsfönster gör att ett fönster kan maximeras för att underlätta analys.
- Signal konditionering
- Välj dataanalys | Villkor Parametrar för att villkora spänning och kalcium optiska kartdata före ytterligare analys.
- Använd funktionen "Ta bort bakgrund" för att ta bort pixlar som inte innehåller någon signal baserat på ett tröskelvärde för fluorescerande intensitet (bakgrundströskeln (BG] och graden av pixelkluster (excitation [EX]-tröskel).
- Utför rumsligt genomsnitt av de optiska kartdata som används med hjälp av funktionen "Bin" för att förbättra signalkvaliteten.
- Filtrera optiska mappningsdata med hjälp av ett bandpassfilter med funktionen "Filter".
- Använd funktionen "Drift" för att ta bort baslinjeavdriften i den optiska kartsignalen.
- Med hjälp av funktionenNormalisera" normaliserar du de optiska kartdata från varje pixel för att ha en maximal amplitud på 1.
- Använd funktionen "Invert signal" för att invertera kalciumspåren för vidare analys.
- Klicka på Visa våg om du vill välja den konditionerade spårningen från en viss plats i visningsfönstret och rita den i vågformsfönstret. Justera signalkonditioneringsparametrarna för att få optimal verkan och kalciumövergående spår.
- Beräkning av resistivhastighet (CV)
Aktiveringstiden definieras som tiden för maximal derivat av den optiska signalen (dF/dtmax).- Välj dataanalys | Aktiveringskarta och ange en starttid och sluttid för att omfatta en enda åtgärdspotential i spårningen. Tryck på Beräkna och välj intresseområde (ROI) för att visa aktiveringskartan för det valda området (bild 1G).
- Välj dataanalys | CV-karta och på samma sätt väljer du starttid och sluttid. Ange interpixelupplösningsvärdena baserat på inställningarna.
Obs: För 1x förstoringssystem är interpixelupplösningen 0,1 mm i X- och Y-riktningen. - Tryck på Generera Vec. Kartknappen för att välja en ROI och visa CV-vektorer inom det området. Medelvärdet, median-, standardavvikelsen och antalet vektorer som ingår i analysen samt den genomsnittliga spridningsvinkeln för CV-vektorerna i det valda området beräknas och visas i avsnittet Statistik.
- Klicka på knappen Rita rad om du vill rita en linje längs en viss spridningsriktning. Alla CV-vektorer i den riktningen kommer att väljas. Klicka på Beräkna CV om du bara vill använda de valda CV-vektorerna för att beräkna den statistik som ska visas i avsnittet Statistik.
- Beräkning av potentiell åtgärdslängd (APD) och kalkyltransient varaktighet (CaTD)
OBS: APD är en annan grundläggande parameter i hjärtelektrofysiologologi. APD-kartor kan genereras genom att bestämma tidsskillnaden mellan aktivering och en angiven procentandel av repolariseringen av varje optisk åtgärdspotential. APD-heterogenitet eller APD förlängning och förkortning kan användas för att förutsäga arytmi känslighet.- Om du vill beräkna APD i RHYTHM1.2 väljer du Dataanalys | APD/CaT Karta.
- Välj starttid och sluttid för att omfatta en fullständig åtgärdspotential. Ange ett lägsta och högsta värde för APD/CaTD för att ta bort eventuella extremvärden (till exempel 0 respektive 1 000 ms). Ange procentuell ompolarisering som avgör APD, till exempel 0,8 för APD80/CaTD80 eller 0,5 för APD50/CaTD50.
- Klicka på Regional APD Calc för att välja en ROI och generera APD-kartan. Medelvärdet, medianen, standardavvikelsen och antalet pixlar som ingår i analysen visas i avsnittet Statistik.
- Stig upp tid
OBS: Stigtiden är en annan elektrofysiologisk parameter som kan mätas från optiska signaler av spänning och kalciumtransienta spår. Det ger en uppskattning för hur lång tid det tar för depolariserande jonkanaler att utlösa en åtgärd potential, eller hur lång tid det tar för kalcium att släppas ut i cytoplasman från sarkoplasmatiska reticulum. Optisk stigtid är inte ett perfekt substitut för stigtider mätta med mikroelektroder och kanske inte är lika känsliga för förändringar i depolarisering, eftersom optiska handlingspotentialer är ett genomsnitt av transmembranpotentialen hos många celler. Systemets rumsliga och tidsmässiga upplösning kan också påverka optiska stigtidsvärden. Det kan dock fortfarande användas för att förutsäga stora förändringar i depolarisering27.- Om du vill bestämma uppstegstiden väljer du Dataanalys | Upp stigtid.
- Välj Starttid och Sluttid om du vill välja uppryckningen för en enskild åtgärdspotential eller kalciumtransient. Ange värdena för Start% och End% (vanligtvis rekommenderas 10–90 % för icke-bullriga signaler), vilket gör att användaren kan välja bara de delar av signalen utan att inkludera brus när det gäller bullriga signaler.
- Klicka på Beräkna om du vill välja avkastning på avkastningen och bestämma medelvärdet, medianvärdet, standardavvikelsen och antalet pixlar som ingår i analysen av stigtiden.
- Kalcium sönderfall
OBS: För kalciumspår kan tidskonstanten för kalciumtransientens sönderfall bestämmas. Detta möjliggör analys av förändringar i avlägsnandet av kalciumjoner från cytoplasman tillbaka till SR.- Välj dataanalys | Kalcium Sönderfall och ange starttid och sluttid för att omfatta hela sönderfallet del av en enda kalcium övergående signal.
- Klicka på Beräkna Tau för att välja avkastningen på avkastning och bestämma medelvärdet, medianvärdet, standardavvikelsen och antalet pixlar som ingår i analysen av kalciumsöndriska tidskonstanten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mänskliga organotypiska skivor samlades in från den vänstra ventrikeln i en givare mänskligt hjärta enligt protokollet som beskrivs ovan och illustreras iBild 1. Ett optiskt kartsystem med dubbla kameror som det iBild 2användes i den upprättstående bildkonfigurationen för att utföra samtidig optisk kartläggning av spänning och kalcium ca 1 h efter slutförandet av skivning protokollet. Data analyserades med RHYTHM1.2 (Bild 3), ett optiskt kartdataanalysverktyg med öppen källkod som tidigare publicerats av vårt laboratorium och fritt tillgängligt på Github (https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2). De elektrofysiologiska parametrar som mäts illustreras iBild 4. De möjliga åtgärds- och kalciumövergående spåren var signalkonditionerade och representativa spår som används vid ytterligare analys illustreras iBild 4A. Aktiveringstiderna fastställdes för varje pixel och isochronala kartor över aktiveringstider som bestäms av spänning och kalciumspår illustreras iFigur 4B,C. Observera att aktivering i kalciumisochronen ligger efter spänningens som förväntat. CV-vektorer ritas inBild 4Dberäknades med hjälp av aktiveringstiderna och den kända interpixelupplösningen. Det genomsnittliga CV:t i tvärgående riktning bestämdes vara 21,2 cm/s i denna skiva. Detta CV-värde är jämförbart med tidigare rapporterade ventrikulära tvärgående CV mätt från explanterade hela människohjärtan (24 ± 4 och 28 ± 7 cm/s i hjärtan med diffus och ojämn fibros)28. Kalcium övergående sönderfall konstant mättes genom montering en polynom till ruttnande del av kalcium spår och genomsnittliga sönderfall konstant bestämdes vara 105,3 ms i denna skiva (karta iFigur 4E). Därefter mättes APD och CaTD som tidsvaraktigheten mellan aktiveringstiden och en angiven procent av repolarisering/kalciumborttagning bildar cytoplasman. Genomsnittlig APD80och CaTD80343,1 ms respektive 442,6 ms (Figur 4F,G). Tidigare in vivo studier på människa rapporterar aktivering-recovery intervall (ARI) mätt från unipolära elektrogram registreras från in vivo mänskliga hjärtan under steady state pacing på 1 Hz som ett surrogat för APD. ARI-värden i dessa studier varierar från 250–450 ms29,30. Apd-värdena från mänskliga hjärtskivor som rapporteras här är jämförbara med de tidigare ARI-värdena. Regioner med rörelseartefakter togs bort från APD- och CaTD-beräkningar. Slutligen mättes och kartlades spännings- och kalciumspårens stigtider (dvs. varaktigheten av uppsimningen). Dessa visas iFigur 4HOchBild 4IRespektive. Medelvärdena fastställdes till 10,2 ms respektive 13,3 ms. Artefakterna i kartorna till höger om den punkt i pacing beror på pacing tråd inom synfältet. Slutligen, användningen av denna skiva modell i akut drogtester visades när skivor odlades för 24 h med doxorubicin (DOX), ett kemoterapeutiskt medel som är kända för att ha kardiotoxiska effekter. Behandling av skivor med 50 μM DOX resulterade i en minskning av tvärgående ledningshastighet från 19,4 ± 3,4 cm/s till 9,6 ± 3,2 cm/s, vilket illustreras av aktiveringskartorna iBild 5A, CV vektorkartor iFigur 5B, och sammanfattande data iBild 5C. Den mindre provstorleken i DOX-gruppen berodde på ett högre antal icke-avlönbara skivor efter DOX-behandling. Ökade rörelseartefakter i DOX-behandlade segment förhindrade beräkningen av korrekta APD-värden. En annan viktig parameter som kan mätas med dubbel spänning och kalciumavbildning är VM-Ca fördröjning, för att bestämma robust excitation-kontraktion koppling i vävnaden31. Fördröjningar eller negativa värden för den här parametern kan vara skadliga.
Figur 1: Humant hjärtorganotypiskt skiva preparat. (A)Mänskliga hjärtan förvarades i ett iskall kardioplegiskt bad (blandning av kardioplegilösning och kardioplegi is) vid hämtning. (B)De 1 cm3 kuber av vänster ventrikulär vävnad skars och monterades på en metallvävnadshållare med 4% agarosgel limmad på hållarens bakvägg och överfördes till ett iskall bad med syresatt skivlösning. (C)När skivorna väl hade skurits överfördes de till den syresatta återvinningslösningen vid RT i enskilda 100 μm nätcellssiler i nylonmaskor. Meshed brickor täckte vävnaderna för att hålla skivorna från curling. (D)För långsiktig kultur tvättades skivor i PBS och odlades i 6 brunnsplattor med 3 ml vävnadsmedel vid 37 °C. Mason'strichrome färgade skiva avsnitt som visar fiberorientering. F)Representativ optisk åtgärdspotential som registrerats från ett segment. (G) Representativ aktivering karta över en skiva tempo i mitten (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Optiskt kartsystem med dubbla kameror. Optiskt kartsystem med dubbla kameror i den upprättstående bildkonfigurationen. Systemdelar inkluderar: 1) master- och slavkameror för dubbelkartläggning; 2) vävnadsbad med PDMS gel; 3) filterkuber som rymmer excitations- och utsläppsfilter och dikroa speglar; 4) lins hållare och linser; och 5) excitationsljuskälla (520 nm grön LED). Infälld på rätt detaljer filter och dichroic spegel kombinationer för dubbla optisk kartläggning av Vm och kalcium med RH237 och Rhod-2-AM, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: RHYTHM1.2 grafiskt användargränssnitt (GUI) för det optiska kartdataanalysverktyget med öppen källkod för en parameter- och multiparameteranalys. Alternativen för datafilsinläsning och fillistan visas i den röda rutan. Alternativ för dataanalys visas i den nedrullningsbarhetsmenyn för dataanalys som anges i grönt. Visningsfönster för att visa datakartor visas i mörkblått. Kryssrutor för att länka datafiler med dubbla mappningar för samtidig analys av data med dubbla kameror visas i lila. Vågformsfönstret för att rita handlingspotential och kalciumövergående spår visas i gult. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Transmembranpotential och kalciumtransienter kartläggning från en mänsklig organotypic hjärt skiva förberedelse. (A)Representativ optisk verkan potential (svart) och kalcium övergående (vinrött). (B,C) Aktiveringskartor som erhållits från Vm respektive kalciuminspelningar. (D)Resistionshastighet (CV) vektorkarta. (E) Kalcium övergående sönderfall konstant (Tau) karta. (F,G) Åtgärdspotential (APD80) och karta över transienta kalcium (CaTD80). (H,I) Kartor över löneförhöjningstiden för den potentiella upptakten av handling och kalciumtransienten, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Doxorubicin behandling saktar tvärgående ledning hastighet. (A) Aktiveringskartor från skivor odlade i 24 timmar utan (kontroll) och med doxorubicin vid 50 μM (DOX). (B)Resistiv hastighet vektor kartor från kontroll och DOX skivor. (C)Genomsnittlig tvärgående ledningshastighet beräknad från kontroll- och DOX-behandlade skivor. *P & 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi steg-för-steg-metoder för att få livskraftiga hjärt skivor från kardioplegically arresterade mänskliga hjärtan och att funktionellt karakterisera skivor med dubbla optiska kartläggning av transmembran potential och intracellulära kalcium. Med bevarad extracellulär miljö och infödd cellcellskoppling kan mänskliga hjärtskivor användas som en exakt modell av det mänskliga hjärtat för grundläggande vetenskaplig upptäckt och för effektivitets- och kardiotoxicitetstestning av farmakologiska medel och genterapier. Tekniken möjliggör också strukturell-funktionell kartläggning av specifika regioner i hjärtat, såsom sinoatrial noden, atrioventricular nod, och Purkinje fibrer. Det protokoll som beskrivs här listar grundläggande steg för hjärtsegmentgenerering, bildbehandling och analyser som är bäst för korttidsstudier. Statisk odling av vävnadsskivor har visat sig inducera förändringar i hjärtvävnad under längre tidsperioder, så för långsiktiga studier uppmuntrar vi läsaren att införliva mer fysiologiska kulturförhållanden, såsom elektromekaniskstimulering 12,13,14.
Försiktighet bör iakttas för ett antal åtgärder för att upprätthålla vävnadshälsa. Till exempel bör tiden mellan hjärtskörd och vävnadsslicering minimeras. Som tidigare visat21, förlängd längd av kardioplegiska gripandet kan leda till förändrad elektrofysiologologi. För att bevara integriteten hos den extracellulära matrisen och cellcellkopplingen bör överdriven hantering och sträckning av skivorna undvikas under skivauppsamling, odling och funktionella studier. Överdriven sträckning av skivorna kan resultera i ledningsblock. Dessutom bör alla lösningar som beskrivs i detta protokoll hållas vid ett pH-kort på 7.4. Den Tyrode lösning som beskrivs här använder HEPES för att upprätthålla rätt pH med 100% O2. Natriumbikarbonat kan användas för att kontrollera pH istället, men denna lösning bör bubblas med 95% O2 och 5% CO2. Slutligen, under transport och skivning av hjärtat, bör man se till att kardioplegi och skivning lösning hålls så nära frystemperaturen som möjligt för att bevara vävnadsflaska.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering av NIH (bidrag R21 EB023106, R44 HL139248 och R01 HL126802), av Leducq foundation (projekt RHYTHM) och en American Heart Association Postdoc Fellowship (19POST34370122) är tacksamt erkända.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
- Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
- Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today's translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
- Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
- Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
- Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
- Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
- Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
- George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
- Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
- Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
- Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).
