Summary
Denne protokol beskriver proceduren for dyrkning og dyrkning af menneskelige hjerteskiver til præklinisk lægemiddeltest og beskriver brugen af optisk kortlægning til registrering af transmembranespænding og intracellulære calciumsignaler samtidigt fra disse skiver.
Abstract
Human hjerte skive præparater er for nylig blevet udviklet som en platform for human fysiologi undersøgelser og terapi test for at bygge bro mellem dyr og kliniske forsøg. Talrige dyre- og cellemodeller er blevet brugt til at undersøge virkningerne af narkotika, men disse reaktioner er ofte forskellige hos mennesker. Menneskelige hjerte skiver giver en fordel for test af lægemidler i, at de er direkte afledt af levedygtige menneskelige hjerter. Ud over at have bevaret flercellede strukturer, celle-celle kobling, og ekstracellulære matrix miljøer, kan humant hjertevæv skiver bruges til direkte at teste effekten af utallige lægemidler på voksne menneskelige hjertefysiologi. Hvad adskiller denne model fra andre hjerte præparater, såsom hele hjerter eller kiler, er, at skiver kan blive udsat for mere langsigtet kultur. Som sådan, hjerte skiver mulighed for at studere de akutte såvel som kroniske virkninger af narkotika. Endvidere, evnen til at indsamle flere hundrede til tusind skiver fra et enkelt hjerte gør dette til en high-throughput model til at teste flere lægemidler i varierende koncentrationer og kombinationer med andre lægemidler på samme tid. Skiver kan fremstilles fra en given region af hjertet. I denne protokol beskriver vi forberedelsen af venstre ventrikelskiver ved at isolere vævsterninger fra venstre ventrikelfri væg og skære dem i skiver ved hjælp af en højpræcisions vibrerende mikrotom. Disse skiver kan derefter enten blive udsat for akutte eksperimenter til at måle baseline hjerte elektrofysiologiske funktion eller dyrkes for kroniske lægemiddelundersøgelser. Denne protokol beskriver også dobbelt optisk kortlægning af hjerteskiver til samtidige registreringer af transmembrane potentialer og intracellulære calciumdynamik for at bestemme virkningerne af de lægemidler, der undersøges.
Introduction
Dyremodeller har været et værdifuldt redskab, der anvendes til at forstå de underliggende mekanismer i menneskers fysiologi og patofysiologi, samt en platform for indledende test af behandlinger til behandling af forskellige sygdomme1. Der er gjort store fremskridt inden for biomedicinsk forskning baseret på disse dyreforsøg2. Der er dog betydelige forskelle mellem forskelligearter mellem humane og animalske fysiologier, herunder mus, rotter, marsvin, kaniner, får, svin og hunde3,4. Som et resultat, der har været mange lægemidler, gen, og celle behandlinger, der viste lovende under dyreforsøg fase, men undlod at leve op til resultaterne i kliniske forsøg5. At bygge bro over denne kløft, isolerede hjerte myocytter og human induceret pluripotente stamceller (iPSCs) blev udviklet som modeller til at teste reaktionen af human fysiologi til forskellige lægemidler og sygdomme6. Stamcelleafledte kardiomyocytter har været meget udbredt i organ-on-a-chip systemer som et surrogat for hjertet6,7,8. Nytten af iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CMs) hæmmes imidlertid af deres relativt umodne fænotype og den manglende repræsentation af kardiomyocyt-delpopulationen. det modne myokardi er en kompleks struktur bestående af flere samektiske celletyper såsom fibroblaster, neuroner, makrofager og endotelceller. På den anden side, isolerede menneskelige kardiomyocytter er elektrisk modne, og forskellige cardiomyocyt subpopulationer kan opnås ved at ændre dyrkning parametre9. Stadig, disse myocytter generelt udviser ændret handling potentielle morfologier på grund af manglen på celle-celle kobling, hurtig afdædisisering, og forekomsten af proarytmisk adfærd in vitro10,11. Nogle af begrænsningerne blev behandlet af 3D cellekultur modeller af iPSC-CMs og hjerte myocytter. Disse modeller, som omfatter sfæroider, hydrogel stillads indkapslet 3D-kulturer, manipuleret hjertevæv (EHTs), og hjerte-på-en-chip-systemer, bruge flere hjertecellepopulationer såsom kardiomyocytter, fibroblaster, og endotelceller. De enten selvsamle eller samle langs et stillads til at danne 3D-strukturer, og nogle endda reproducere den komplekse anisotropiske karakter af myokardiet. Disse modeller er blevet rapporteret at have celler af modne fænotyper, kontraktile egenskaber, og molekylære profiler svarende til hjertevæv. Hjerte-på-en-chip-systemet giver også mulighed for at studere systemiske virkninger i test af lægemidler og sygdomsmodeller. In vitro-cellebaserede modeller mangler imidlertid den oprindelige ekstracellulære matrix og kan derfor ikke nøjagtigt efterligne elektrofysiologi på organniveau. Menneskelige hjerte skiver, derimod, har en intakt ekstracellulær matrix og indfødte celle-til-celle kontakter, hvilket gør dem nyttige for mere præcist at undersøge arytmogene egenskaber af det menneskelige myokardi.
Forskere har udviklet humane karditoypiske skiver som en fysiologisk præklinisk platform for akut og kronisk lægemiddeltest og til at studere hjerteelektrofysiologi og hjertesygdomsprogression12,13,14,15,16,17,18,19. Sammenlignet med iPSC-afledte kardiomyocytter replikerer humane hjerteskiver mere trofast voksne humane hjerteelektrofysiologi med en moden kardiomyocytfænotype. Sammenlignet med isolerede humane kardiomyocytter udviser hjerteskiver fysiologiske virkningsgrader på grund af den velbevarede cellecellekobling og den iboende eksistens af deres oprindelige intra- og ekstracellulære miljøer.
Denne protokol beskriver processen med at generere menneskelige hjerteskiver fra hele donorhjerter, udføre akut (dvs. timer lange) og kroniske (dvs. dage lange) undersøgelser for at teste hjerteelektrofysiologi parametre via optisk kortlægning. Mens denne protokol beskriver kun brugen af venstre ventrikelvæv (LV), er det blevet anvendt med succes på andre områder af hjertet samt andre arter såsom mus, rotter, marsvin og svin14,,20,,21,22. Vores laboratorium bruger hele menneskelige donor hjerter, der er blevet afvist til transplantation i de sidste 5 år, men det er muligt for de samme procedurer, der skal udføres på enhver donor hjerte prøve væv opnået ved hjælp af alternative midler (f.eks venstre venttrikulær hjælpeenhed [LVAD] implantationer, biopsier, myectomies), så længe væv har evnen til at blive opdelt i terninger. Optisk kortlægning anvendes til analyse i denne undersøgelse på grund af sin evne til samtidig at kortlægge optiske actionpotentialer og calciumtransienter med høj rumlig (100 x 100 pixels) og tidsmæssig (>1.000 frames/s) opløsning. Alternative metoder kan også anvendes, såsom multielektrode arrays (MEAs) eller mikroelektroder, men disse teknikker er begrænset af deres relativt lave rumlige opløsninger. Derudover blev MEA'er designet til brug sammen med cellekulturer, og skarpe mikroelektroder håndteres lettere til brug med hele hjerter eller store vævskiler.
Målet med artiklen er at gøre det muligt for flere forskere at bruge humane hjertevæv til hjerteelektrofysiologiundersøgelser. Det skal bemærkes, at den teknologi, der er beskrevet i denne artikel er relativt enkel og gavnlig for kortsigtede undersøgelser (i størrelsesordenen flere timer til dage). Mere fysiologisk biomimetisk kultur for længerevarende undersøgelser (i ugerækkefølgen) er blevet drøftet og beskrevet i en række andre undersøgelser12,18,23. Elektrisk stimulation, mekanisk belastning, og væv stretching er fordelagtige konditionering mekanismer, der kan hjælpe med at begrænse starten af in vitro væv remodellering12,,18,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne metoder er blevet udført i overensstemmelse med alle institutionelle, nationale og internationale retningslinjer for menneskers velfærd. Forskning blev godkendt af Institution Review Board (IRB) på The George Washington University.
BEMÆRK: Donor menneskelige hjerter blev erhvervet fra Washington Regional Transplant Fællesskabet som afidentificeret kasseret væv med godkendelse fra George Washington University IRB. Explanted hjerter er kardioplegisk anholdt ved at skylle hjertet med en opløsning af iskold kardioplegi (blodet blev ryddet fra hjertet i denne proces) og overføres til laboratoriet under standard organtransplantation betingelser.
1. Udarbejdelse af opløsninger
- For hvert hjerte skal der laves 4 L kardiopædagogisk opløsning (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 1,2 mM CaCl2; pH = 7,4). 3 L opbevares ved 4 °C og de resterende 1 L ved -20 °C.
BEMÆRK: Denne løsning kan laves op til flere dage i forvejen. - Friskbererede 1 L hver af Tyrodes udskæringsopløsning (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2,1,8 mM CaCl2,10 mM glucose, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-butanedion monoxime [BDM]; pH = 7,4) og Tyrodes genvindingsopløsning (140 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 10 mM BDM; pH = 7.4).
BEMÆRK: Både udskærings- og genfindingsløsningerne skal foretages på forsøgsdagen og kan opbevares ved 4 °C. - Forbered stamopløsninger af de fluorescerende farvestoffer. Det spændingsfølsomme farvestof RH237 rekonstitueres ved 1,25 mg/ml i dimethylsulfoxid (DMSO) og opbevares i 30 μL aliquots ved 4 °C. Rekonstituere calciumindikatoren Rhod-2AM ved 1 mg/ml i DMSO. Opbevares i 30 μL aliquot ved -20 °C.
BEMÆRK: Di-4-ANEPPS (stamopløsning ved 1,25 mg/ml i DMSO) kan anvendes i forsøg med enkelt kamerascanning af transmembranepotentialet alene.- Før forsøgets start sonikeres farvestofferne ved hjælp af en ultralydssonicator i mindst 10 min og fortyndes hver aliquot af fluorescerende farvestoffer i 1 ml af genvindingsopløsningen. Der tilsættes Pluronic F-127 (Tabel over materialer)til Rhod-2AM ved et 1:1-forhold før fortynding i genvindingsopløsning.
- Der fremstilles en stamopløsning af excitation-sammentrækningsfrit blebbistatin ved 2 mg/ml opløsning i DMSO. Opbevares i aliquot ved -20 °C. Under optiske kortlægningsforsøg fortyndes bestandsopløsningen af blebbistatin til en arbejdskoncentration på 5−10 μM i Tyrodes genvindingsopløsning.
- Lav frisk kulturmedium ved at supplere medium 199 med 2% penicillin-streptomycin, 1x insulin-transferrin-selen (ITS) flydende medier supplement, og 10 mM BDM. Mediet filtreres med et sterilt filter på 0,2 μm.
BEMÆRK: For farmakologiske ædthedsundersøgelser kan lægemidler føjes direkte til dyrkningsmediet. Dyrkningsmediet kan opbevares ved 37 °C. - Lav en 4% agarose gel til væv montering ved at opløse lav-smeltepunkt agarose i destilleret vand og opvarmning af blandingen i en mikrobølgeovn, indtil helt opløst. Agaen er opstået i en petriskål med en tykkelse på 5 mm og opbevares ved 4 °C.
2. Opsætning af udstyr
- Opsætning af vibrerende mikrotom
- Kalibrer den vibrerende mikrotom før hvert eksperiment.
- Ved hjælp af en vibrerende mikrotom med høj præcision (Tabel over materialer) skal du lægge en keramisk klinge ind i holderen og fastgøre kalibreringsanordningen, der følger med den vibrerende mikrotom. Vælg indstillingen justering af klingen i menuen, og vælg keramik til klingetype.
- Vælg vibreringsindstillingen, kontroller, om der er Z-akseværdien. Hvis denne værdi er <1 μm, skal du afslutte kalibreringsmenuen. Hvis ikke, skal du justere kalibreringsskruen, der er fastgjort til toppen af det vibrerende hoved, og vælge vibreringsindstillingen. Gentag så mange gange, det er nødvendigt for at indstille Z-aksen til <1 μm.
- Indstil vibratomindstillingerne til 400 μm skæretykkelse, 0,02 mm/s forskudshastighed for atrievæv og 0,04 mm/s forskudshastighed for ventrikelvæv, 2 mm vandret vibrationsamplitude og 80 Hz-frekvens.
BEMÆRK: Mens 400 μm er den anbefalede tykkelse for at kompensere for celleskader på skivens afskårne overflader, kan der også fremstilles tyndere skiver. Da iltdiffusionsgrænsen er ca. 150 μm, anvendes der ofte skiver på ca. 300 μm14,17,18,24. - Badet fra den vibrerende mikrotom fyldes med udskæringsopløsning ved 4 °C og temperaturen holdes ved at omgive ydersiden af badet med is og fyldes op efter behov i hele udskæringsprotokollen. Kontinuerligt ilte udskæringsopløsningen i badet ved at boble med 100% ilt under udskæring.
- Opsæt en anden skål med så mange 100 μm nylon mesh cellesier og meshed skiver efter behov (en celle si pr skive). Fyld denne parabol med recovery opløsning og oxygenate det ved boblende med 100% ilt ved stuetemperatur (RT).
BEMÆRK: Denne opløsning vedligeholdes på RT under forsøget.
- Kalibrer den vibrerende mikrotom før hvert eksperiment.
- Opsætning af optisk tilknytning
BEMÆRK: En mere detaljeret beskrivelse af det optiske kortlægningssystem findes i tidligere publikationer16,25,26.- Fastgør et vævsbad med polydimethylsilooxan (PDMS) gellag i bunden (for at fastgøre skiverne) til et perfusionssystem. Cirkulation 1 L af genvindingsopløsningen ved 37 °C og oxygenat med 100% ilt, gennem perfusionssystemet med en strømningshastighed hurtigt nok til at opretholde temperaturen og klar akkumulering af badperfusat.
- Juster fokus og justering af de to CMOS-kameraer (Tabel over Materialer) ved hjælp af et mål.
BEMÆRK: Flere detaljer om tilpasning kan findes i tidligere undersøgelser26. - Brug en grøn LED-lyskilde med en bølgelængde på 520 ± 5 nm til at ophidse de spændingsfølsomme og calciumindikatorfarvestoffer samtidigt.
BEMÆRK: Excitation lyskilden er knyttet til excitation filter terning af den optiske kortlægning system og afspejles fra en 550 nm dichroic spejl for epistrisk belysning. Det udsendte lys opsamles med en 1x linse og opdeles med et andet dichroic spejl ved 630 nm i spændings- og calciumkomponenter, før det filtreres med henholdsvis 690 ± 50 nm og 590 ± 33 nm-filtre, og registreres af de to kameraer.
3. Udskæringsprotokol
- Når du er klar til væv dissektion og eksperimenter, forberede et bad af iskold kardioplegi ved at blande frosne og flydende kardioplegi. Hold hjertet nedsænket i kardioplegibadet, indtil vævsindsamling til udskæring (Figur 1A).
- Lim den præmade agarose gel på bagsiden af metalvæv indehavere af vibratom.
- Identificer den venstre ventrikelfri væg og skær 1 cm3 terninger af væv i kold kardioplegisk opløsning. Derefter monteres vævsblokkene hurtigt på metalvævsholderne med endokarialfladerne opad og fastgør dem til agarosegelen ved hjælp af topisk hudklæbemiddel (Figur 1B).
BEMÆRK: Det valgte vævsområde skal være væk fra store blodkar for at undgå huller i skiverne. Planet af sektioner er omtrent parallelt med fiber orientering i endocardial lag (Figur 1E) og planet af opdeling kunne være i en lille vinkel på grund af roterende anisotropi i et dybere lag af LV væggen. For at øge gennemløbet kan op til to vævsblokke monteres side om side på samme holder. - Overfør metalholderne til vibratombadet fyldt med den iskolde iltede udskæringsopløsning. Sørg for, at vævsterninger er helt nedsænket.
- Flyt klingen til forkanten af vævet og tænd for vibratomen for at begynde at skære med de forudindstillede parametre. Kassér de første adskillige skiver, indtil klingen rækker ud over trabeculae i det glatte endocardialvæv.
- Når hver skive er skåret, forsigtigt overføre skiven til en iltet (100% O2) bad af Tyrode's recovery løsning på RT. Forsigtigt placere hver skive i individuelle 100 μm nylon mesh celleskræmning og dække med meshed skiver for at holde væv skiver fra curling (Figur 1C). Hold skiver i recovery løsning i mindst 20 min.
BEMÆRK: Skiver kan opbevares i badet under disse forhold i op til 3−4 timer uden skadelige elektrofysiologiske virkninger.
4. Skivekultning under statiske forhold
BEMÆRK: For at minimere risikoen for forurening, sterilisere pincet ved hjælp af en perle sterilisator før hver overførsel trin.
- Når du er klar til kultur, skal hver skive omhyggeligt overføres til de enkelte brønde på en 6 brøndplade fyldt med sterilt fosfatbufferet saltvand (PBS). Sten forsigtigt brøndpladen for at skylle skiverne af genfindelsesopløsningen.
BEMÆRK: Fra dette punkt fremad bør skiverne kun eksponeres i en BSL2 laminar flow kultur hætte, og sterile pincet bør anvendes til at håndtere vævet. - Overfør skiverne til brønde af frisk PBS til grundigt at skylle og sterilisere skiver til kultur. Udfør dette vasketrin 3x for at sikre fuldstændig fjernelse af genvindingsopløsningen fra skiverne.
- Skiverne overføres til individuelle brønde af en 6 brøndplade fyldt med 3 ml forvarmt (37 °C) kulturmedium (med eller uden stoffer, figur 1D). Pladerne anbringes på en orbital shaker ved 20 omdrejninger i en befugtet inkubator ved 37 °C med 30% O2 og 5% CO2. Aspirere og erstatte kulturmediet hver 48 h.
5. Funktionel karakterisering – optisk tilknytning
- For optisk kortlægning undersøgelser enten umiddelbart efter udskæring eller efter dyrkning, omhyggeligt overføre skive af interesse til væv bad af perfusionssystemet ved 37 °C med 100% O2 i Tyrode's recovery løsning, og pin ned de fire hjørner til PDMS gel lag samtidig anvende minimal strækning (dvs. lige nok til at holde skiven fra let bevæger sig under flow betingelser). Lad skiverne hvile i dette bad med cirkulerende opsving løsning i ca 10 min.
- Der tilsættes 0,3−0,5 ml af den fortyndede blebbistatin til beholderen, der indeholder genvindingsopløsningen. Lad skiven inkubere med blebbistatin i ca. 10 min.
- 30 μL af det spændingsfølsomme farvestof, RH237, rekonstitueres i 1 ml genvindingsopløsning ved 37 °C. Sluk for pumperne og lad langsomt 0,2−0,3 ml arbejdsfarveopløsning på skivens overflade over en periode på 30 s. Lad skiven inkubere i farvestoffet med pumperne slukket i en periode på op til 90 s, og tænd derefter for pumperne igen for at tillade overskydende farvestof at vaske ud.
BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed for at anvende farvestoffet jævnt over hele skiven. Derudover er meget langsom farvestof ansøgning afgørende for at forhindre farvestoffet i at flyde væk fra skiven. - Gentag trin 5.3 for at rekonstituere stam calciumindikatoren Rhod-2AM og læg den på skive.
- Fokuser kameraerne på skiven ved at justere afstanden af skiven fra linsen.
- Placer en bipolar platin-iridium pacing elektrode, således at dens spids er i kontakt med midten af skiven og anvende pacing stimuli af stigende amplitude til at bestemme den mindste pacing tærskel, der kræves for at fremkalde en elektrisk reaktion. Tempo skiven på 1 Hz med en 2 ms puls bredde varighed på 1,5 x amplituden af den forudbestemte pacing tærskel. Placer en coverslip over vævsskiven.
- Skiven belyses med en 520 ± 5 nm LED excitation lyskilde. Optag de udsendte spændings- og calciumsignaler med de to CMOS-kameraer ved 1.000 billeder/s.
- Kontroller optagelsen for god signalkvalitet og undertrykte bevægelsesartefakter (Figur 1F). Tilføj mere blebbistatin til reservoiret i trin på 0,1 ml, indtil bevægelsen ikke længere producerer artefakter i de optiske signaler. Tilføj mere farvestof, hvis det er nødvendigt, for at forbedre signalkvaliteten.
BEMÆRK: God signalkvalitet henviser til kvalitativt vurderet stor signalamplitude og lav baggrundsstøj i de optagede optiske signaler.
6. Databehandling med RHYTHM1.2
BEMÆRK: RHYTHM1.2 er en MATLAB-baseret brugergrænseflade, der bruges til at vise, tilstande og analysere optiske kortlægningsdata, der er erhvervet af optiske kortsystemer med et enkelt eller to kameraer (Figur 3). Det bruges sammen med billedsystemet.
- Indlæser datafiler
- Indlæs datafilerne i RHYTHM1.2 ved at vælge et af de fire skærmvinduer på skærmen og bruge knapperne Vælg mappe og indlæs.
- Programmet vil bede brugeren om at vælge Kamera 1 eller Kamera 2 data for dobbelt spænding og calcium optagelser. Vælg Kamera 1 til spændingssignalet.
- Gentag processen for at lægge calciumsignalet (kamera 2) til et af de tilstødende displayvinduer.
- Markér afkrydsningsfeltet Sammenkædning af to data mellem de to markerede visningsvinduer for at sammenkæde de to visningsvinduer, da de to datasæt registreres fra det samme område på udsnittet.
BEMÆRK: Alternativt, hvis det samme synsfelt opretholdes, kan denne funktion bruges til at forbinde to billeder, der blev opnået på separate tidspunkter for at se tidsreaktionen i elektrofysiologien af det lægemiddel, der undersøges. Dobbeltklik på et enkelt visningsvindue gør det muligt at maksimere det ene vindue for at gøre det nemt at analysere.
- Signalkonditionering
- Vælg dataanalyse | Betingelsesparametre for at konditionere de optiske kortlægningsdata for spænding og calcium forud for yderligere analyse.
- Brug funktionen "Fjern baggrund" til at fjerne pixel, der ikke indeholder noget signal baseret på en tærskel for fluorescerende intensitet (baggrund [BG] og pixelklyngegrad (excitation [EX] tærskel).
- Udfør rumligt gennemsnit af de optiske tilknytningsdata ved hjælp af funktionen "Bin" for at forbedre signalkvaliteten.
- Filtrer de optiske tilknytningsdata ved hjælp af et båndpasfilter med funktionen "Filter".
- Brug funktionen "Drift" til at fjerne grundlinjens afdrift i det optiske tilknytningssignal.
- Ved hjælp af funktionen "Normaliser" normaliseres de optiske tilknytningsdata fra hver pixel for at have en maksimal amplitude på 1.
- Brug funktionen "Inverse Signal" til at vende calciumsporene til yderligere analyse.
- Klik på Vis bølge for at vælge den betingede sporing fra et givet sted i visningsvinduet og afbilde det i vinduet Bølgeform. Juster signalkonditioneringsparametrene for at opnå optimalt virkningspotentiale og midlertidige spor af calcium.
- Beregning af ledningshastighed (CV)
BEMÆRK: Aktiveringstiden defineres som tidspunktet for det maksimale derivat af det optiske signal (dF/dtmax).- Vælg dataanalyse | Aktiveringstilknytning og angiv et starttidspunkt og sluttidspunkt for at omfatte et enkelt handlingspotentiale i sporingen. Tryk på Beregn, og vælg interesseområdet for at få vist aktiveringskortet for det valgte område (Figur 1G).
- Vælg dataanalyse | CV-kort, og på samme måde skal du vælge Starttidspunkt og Sluttidspunkt. Angiv interpixelopløsningsværdierne baseret på opsætningen.
BEMÆRK: For 1x forstørrelsessystemer er interpixelopløsningen 0,1 mm i X- og Y-retningen. - Tryk på Generate Vec. Kortknap for at vælge et investeringsafkast og få vist CV-vektorer inden for det pågældende område. Middelværdien, medianen, standardafvigelsen og antallet af vektorer, der indgår i analysen, samt den gennemsnitlige udbredelsesvinkel for CV-vektorerne i det valgte område beregnes og vises i afsnittet Statistik.
- Klik på knappen Tegn streg for at tegne en streg langs en given overførselsretning. Alle CV-vektorer i den retning vælges. Klik på Beregn CV for kun at bruge de valgte CV-vektorer til at beregne de statistikker, der skal vises i afsnittet Statistik.
- Beregning af aktionspotentiale (APD) og kalk forbigående varighed (CaTD)
BEMÆRK: APD er en anden grundlæggende parameter i hjertet elektrofysiologi. APD-kort kan genereres ved at bestemme tidsforskellen mellem aktivering og en angivet procentdel af repolarization af hvert optisk handlingspotentiale. APD heterogenitet eller APD forlængelse og afkortning kan bruges til at forudsige arytmi følsomhed.- Hvis du vil beregne APD i RHYTHM1.2, skal du vælge Dataanalyse | APD/Cat-kort.
- Vælg Starttidspunkt og Sluttidspunkt for at omfatte ét fuldt handlingspotentiale. Angiv en minimum- og maksimumværdi for APD/CaTD for at fjerne eventuelle afvigende værdier (f.eks. henholdsvis 0 og 1.000 ms). Angiv den procentaflevering, der skal bestemme APD'en,80f.eks.80 5050
- Klik på Regional APD Calc for at vælge et investeringsafkast og generere APD-kortet. Middelværdien, medianen, standardafvigelsen og antallet af pixel, der er inkluderet i analysen, vises i afsnittet Statistik.
- Stigningstid
BEMÆRK: Stigningstiden er en anden elektrofysiologisk parameter, der kan måles ud fra optiske spændingssignaler og kalktransientespor. Det giver et skøn over, hvor lang tid det tager for depolariserende ionkanaler at udløse et aktionspotentiale, eller hvor lang tid det tager for calcium at blive frigivet i cytoplasmaet fra sarcoplasmic reticulum. Optisk stigningstid er ikke en perfekt erstatning for stigningstider målt ved mikroelektroder og er måske ikke så følsomme over for ændringer i depolarisering, fordi optiske handlingspotentialer er et gennemsnit af mange cellers transmembranepotentiale. Systemets rumlige og tidsmæssige opløsning kan også påvirke optiske stigningstidsværdier. Men, Det kan stadig bruges til at forudsige store ændringer i depolarisering27.- Hvis du vil bestemme stigningstiden, skal du vælge Dataanalyse | Stigning Tid.
- Vælg Starttidspunkt og Sluttidspunkt for at vælge opslaget for et enkelt handlingspotentiale eller kalktransient. Indtast værdierne Start% og End% (typisk 10-90% anbefales til ikke-støjende signaler), som giver brugeren mulighed for at vælge netop de dele af signalet uden at medtage støj i tilfælde af støjende signaler.
- Klik på Beregn for at vælge investeringsafkastet og bestemme middelværdien, medianen, standardafvigelsen og antallet af pixel, der er inkluderet i analysen af stigningstiden.
- Calcium henfald
BEMÆRK: For calciumspor kan tidskonstanten af calciumtransientens henfald bestemmes. Dette giver mulighed for analyse af ændringer i fjernelsen af calciumioner fra cytoplasmaet tilbage i SR.- Vælg dataanalyse | Calcium Henfald og indtast starttids- og sluttidspunktet for at omfatte hele henfaldsdelen af et enkelt calciumtransientsignal.
- Klik på Beregn Tau for at vælge investeringsafkastet og bestemme middelværdien, medianen, standardafvigelsen og antallet af pixel, der indgår i analysen af calcium henfaldstidskonstant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Humane organotypiske skiver blev indsamlet fra venstre hjertekammer af en donor menneskelige hjerte i henhold til protokollen beskrevet ovenfor og illustreret iFigur 1. Et optisk kortsystem med to kameraer som det iFigur 2blev brugt i den opretstående billeddannelse konfiguration til at udføre samtidig optisk kortlægning af spænding og calcium omkring 1 time efter afslutningen af udskæringen protokol. Data blev analyseret ved hjælp af RHYTHM1.2 (Figur 3), et open source optisk kortlægningsdataanalyseværktøj, der tidligere blev offentliggjort af vores laboratorium og frit tilgængelig på Github (https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2). De målte elektrofysiologiske parametre er illustreret iFigur 4. Virkningspotentialet og calciumtransienterne var signalkonditionerede, og repræsentative spor, der blev anvendt ved yderligereFigur 4A. Aktiveringstiderne blev fastsat for hver pixel, og isokrone kort over aktiveringstider, der er bestemt på grundlag af spændings- og calciumspor, er illustreret iFigur 4B,C. Bemærk, at aktiveringen i calciumisokronen halter bagefter spændingens som forventet. CV vektorer afbildet iFigur 4Dblev beregnet ved hjælp af aktiveringstiderne og den kendte interpixelopløsning. Det gennemsnitlige CV i tværgående retning blev bestemt til at være 21,2 cm/s i denne skive. Denne CV-værdi kan sammenlignes med tidligere rapporteret ventrikeltplantrisk CV målt fra eksplantede hele hjerter (24 ± 4 og 28 ± 7 cm/s i hjerter med diffus og spredt fibrose)28. Calciumtransientens henfaldskonstant blev målt ved at montere en polynomial på den rådnende del af calciumsporene, og den gennemsnitlige henfaldskonstant blev bestemt til at være 105,3 ms i denne skive (kort iFigur 4E). Dernæst blev APD og CaTD målt som tidsvarigheden mellem aktiveringstiden og en bestemt procentdel af repolarisering / calcium fjernelse danner cytoplasmaet. Gennemsnitlig APD80og CaTD80343,1 ms og 442,6 ms (Figur 4F,G). Tidligere in vivo humane undersøgelser rapporterer aktivering-recovery interval (ARI) målt fra unipolar elektrogram registreres fra in vivo menneskelige hjerter under steady state pacing på 1 Hz som et surrogat for APD. ARI-værdierne i disse undersøgelser spænder fra 250-450 ms29,30. APD-værdierne fra menneskelige hjerteskiver, der rapporteres her, kan sammenlignes med de tidligere ARI-værdier. Områder med bevægelsesartefakter blev fjernet fra APD- og CaTD-beregninger. Endelig blev stigningstiderne (dvs. varigheden af optrykket) af spændings- og calciumsporene målt og kortlagt. Disse er vist iFigur 4HOgFigur 4IHenholdsvis. Gennemsnitsværdierne blev fastsat til henholdsvis 10,2 ms og 13,3 ms. Artefakterne i kortene til højre for tempoet skyldes pacingwiren inden for synsfeltet. Endelig blev brugen af denne skivemodel i akut drug test påvist, når skiver blev dyrket i 24 timer med doxorubicin (DOX), et kemoterapeutisk middel kendt for at have kardiotoksiske virkninger. Behandling af skiver med 50 μM DOX resulterede i en reduktion af den tværgående ledningshastighed fra 19,4 ± 3,4 cm/s til 9,6 ± 3,2 cm/s, som illustreret af aktiveringskortene iFigur 5A, CV-vektorkort iFigur 5B, og oversigtsdata iFigur 5C. Den mindre stikprøvestørrelse i DOX-gruppen skyldtes et større antal ikke-levedygtige skiver efter DOX-behandling. Øgede bevægelsesartefakter i DOX-behandlede udsnit forhindrede beregningen af nøjagtige APD-værdier. En anden vigtig parameter, der kan måles ved dobbelt spænding og calcium billeddannelse er VM-Ca forsinkelse, at bestemme robust excitation-sammentrækning kobling i vævet31. Forsinkelser eller negative værdier for denne parameter kan være skadelige.
Figur 1: Human hjerte organotypic skive forberedelse. (A) Menneskelige hjerter blev opbevaret i en iskold kardioplegic bad (blanding af kardioplegi løsning og kardioplegi is) ved hentning. (B) De 1 cm3 terninger af venstre ventrikelvæv blev skåret og monteret på en metalvævsholder med 4% agarose gel limet til bagvæggen af holderen og overført til et iskoldt bad af iltet udskæring opløsning. (C) Efter snittet blev skiverne overført til iltet genvindingsopløsning ved RT hos individuelle 100 μm nylonnetcellesienter. Meshed skiver dækkede væv for at holde skiver fra curling. (D) For langsigtet kultur blev skiver vasket i PBS og dyrket i 6 brøndplader med 3 ml vævsmedium ved 37 °C. (E)Mason's trichrome farves skive sektion viser fiber orientering. (F) Repræsentativ optisk handling potentiale registreres fra et udsnit. (G) Repræsentativ aktivering kort over en skive tempo i midten (blå). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Optisk kortlægningssystem med to kameraer. Optisk kortlægningssystem med to kameraer i den opretstående billedkonfiguration. Systemdele omfatter: 1) master og slave kameraer til dobbelt kortlægning; 2) væv bad med PDMS gel; 3) filter terninger, der huser excitation og emission filtre og dichroic spejle; 4) linseholdere og linser; og 5) excitation lyskilde (520 nm grøn LED). Indsat på højre detaljer filter og dichroic spejl kombinationer for dobbelt optisk kortlægning af Vm og calcium ved hjælp af RH237 og Rhod-2-AM, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: RHYTHM1.2 grafisk brugergrænseflade (GUI) for open source optisk kortlægningsdataanalyseværktøj til analyse af en enkelt parameter og multiparameter. Indstillingerne for indlæsning af datafil og fillisten vises i det røde felt. Indstillinger for dataanalyse er angivet i rullemenuen til dataanalyse, der er angivet med grønt. Visningsvinduer til visning af datatilknytninger er angivet i mørkeblå. Afkrydsningsfelter til at sammenkæde datafiler med to tilknytninger til samtidig analyse af data med to kameraer er angivet med lilla. Bølgeformvinduet til at afbilde actionpotentiale og kalktransientespor vises med gult. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Transmembrane potentiale og calcium forbigående kortlægning fra et humant organotypic hjerte skive forberedelse. (A) Repræsentativt optisk virkningspotentiale (sort) og calcium forbigående (bordeaux). ( B,C) Aktiveringskort fra henholdsvis Vm og calcium-optagelser. (D) Ledningshastighed (CV) vektor kort. (E) Kort over calciumtransientkondingkonstant (Tau). (F,G) Aktionspotentialevarighed (APD80) og kort over calcium forbigående varighed (CaTD80)kort. (H,I) Kort over stigningstiden for opslaget af handlingspotentialet og calciumtransienten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Doxorubicin behandling bremser tværgående ledningshastighed. (A) Aktiveringskort fra skiver dyrket i 24 timer uden (kontrol) og med doxorubicin ved 50 μM (DOX). (B) Ledningshastighed vektor kort fra kontrol og DOX skiver. (C) Gennemsnitlig tværgående ledningshastighed beregnet på grundlag af kontrol- og DOX-behandlede skiver. *P < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi trin-for-trin metoder til at opnå levedygtige hjerte skiver fra kardioplegically anholdt menneskelige hjerter og funktionelt karakterisere skiver ved hjælp af dobbelt optisk kortlægning af transmembrane potentiale og intracellulære calcium. Med bevaret ekstracellulært miljø og native celle-celle kobling, kan menneskelige hjerteskiver bruges som en nøjagtig model af det menneskelige hjerte for grundlæggende videnskabelig opdagelse og for effektivitet og kardiotoksicitet test af farmakologiske agenser og genterapier. Teknologien giver også mulighed for strukturel-funktionel kortlægning af specifikke regioner i hjertet, såsom sinoatrial node, atrioventrikulær node, og Purkinje fibre. Den protokol, der er beskrevet her, viser grundlæggende trin for generering af hjerteskiver, billeddannelse og analyser, der er bedst til kortvarige undersøgelser. Statisk kultur af væv skiver har vist sig at fremkalde ændringer i hjertevæv over længere perioder, så for længerevarende undersøgelser, opfordrer vi læseren til at indarbejde mere fysiologiske kultur betingelser, såsom elektromekanisk stimulation12,,13,14.
Der bør udvises forsigtighed for en række skridt til at opretholde væv sundhed. For eksempel bør tiden mellem hjertehøst og vævsskæring minimeres. Som vist tidligere21, forlænget længde af kardioplegic anholdelse kan føre til ændret elektrofysiologi. For at bevare integriteten af den ekstracellulære matrix og cellecellekobling bør overdreven håndtering og stræk af skiverne også undgås under skivesamling, dyrkning og funktionelle undersøgelser. Overdreven strækning af skiverne kan resultere i ledningsblokke. Derudover skal alle de løsninger, der er beskrevet i denne protokol, holdes på en pH-værdien på 7,4. Tyrode løsning beskrevet her udnytter HEPES at opretholde den rette pH ved hjælp af 100% O2. Natriumbikarbonat kan anvendes til at kontrollere pH i stedet, men denne opløsning bør bobles med 95% O2 og 5% CO2. Endelig, under transport og udskæring af hjertet, bør man sikre, at kardioplegi og udskæring løsning holdes så tæt på frysepunktet temperatur som muligt for at bevare væv levedygtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Støtte fra NIH (tilskud R21 EB023106, R44 HL139248 og R01 HL126802), af Leducq foundation (projekt RHYTHM) og en American Heart Association Postdoctoral Fellowship (19POST34370122) er taknemmeligt anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
- Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
- Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today's translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
- Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
- Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
- Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
- Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
- Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
- George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
- Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
- Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
- Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).
