Summary
Ce protocole décrit la procédure de sectionnage et de culture de tranches cardiaques humaines pour les tests de médicaments précliniques et détaille l’utilisation de la cartographie optique pour l’enregistrement de la tension transmembrane et des signaux de calcium intracellulaire simultanément à partir de ces tranches.
Abstract
Des préparations de tranches cardiaques humaines ont récemment été développées comme plate-forme pour les études de physiologie humaine et les tests thérapeutiques afin de combler le fossé entre les essais animaux et cliniques. De nombreux modèles animaux et cellulaires ont été utilisés pour examiner les effets des médicaments, mais ces réponses diffèrent souvent chez l’homme. Les tranches cardiaques humaines offrent un avantage pour le dépistage des drogues en ce qu’elles sont directement dérivées de cœurs humains viables. En plus d’avoir conservé des structures multicellulaires, un couplage cellule-cellule, et des environnements de matrice extracellulaire, les tranches de tissu cardiaque humain peuvent être utilisées pour tester directement l’effet d’innombrables médicaments sur la physiologie cardiaque humaine adulte. Ce qui distingue ce modèle des autres préparations cardiaques, comme les cœurs entiers ou les coins, c’est que les tranches peuvent être soumises à une culture à plus long terme. En tant que tel, les tranches cardiaques permettent d’étudier les effets aigus ainsi que chroniques des médicaments. En outre, la capacité de recueillir plusieurs centaines à mille tranches d’un seul cœur en fait un modèle à haut débit pour tester plusieurs médicaments à des concentrations et des combinaisons variables avec d’autres médicaments en même temps. Des tranches peuvent être préparées à partir de n’importe quelle région du cœur. Dans ce protocole, nous décrivons la préparation des tranches ventriculaires gauches en isolant les cubes de tissu de la paroi libre ventriculaire gauche et en les sectionnant en tranches à l’aide d’un microtome vibrant de haute précision. Ces tranches peuvent alors être soumises à des expériences aiguës pour mesurer la fonction électrophysiologique cardiaque de base ou cultivées pour des études de médicaments chroniques. Ce protocole décrit également la double cartographie optique des tranches cardiaques pour des enregistrements simultanés des potentiels transmembranes et de la dynamique intracellulaire de calcium pour déterminer les effets des drogues étudiées.
Introduction
Les modèles animaux ont été un outil précieux utilisé pour comprendre les mécanismes sous-jacents de la physiologie humaine et de la pathophysiologie, ainsi qu’une plate-forme pour les tests préliminaires des thérapies pour traiter diverses maladies1. De grands progrès ont été réalisés dans le domaine de la recherche biomédicale sur la base de ces études animales2. Cependant, il existe d’importantes différences entre les espèces entre les physiologies humaines et animales, y compris les souris, les rats, les cochons d’Inde, les lapins, les moutons, les porcs et les chiens3,4. En conséquence, il y a eu de nombreuses thérapies médicamenteuses, géniques et cellulaires qui se sont montrées prometteuses au cours de l’étape de l’expérimentation animale, mais qui n’ont pas été à la hauteur des résultats des essais cliniques5. Pour combler cet écart, des myocytes cardiaques isolés et des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC) ont été développés comme modèles pour tester la réponse de la physiologie humaine à divers médicaments et maladies6. Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches ont été largement utilisés dans les systèmes d’organes sur puce comme substitut du cœur6,7,8. Cependant, l’utilité des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC (iPSC-CM) est entravée par leur phénotype relativement immature et le manque de représentation de la sous-population de cardiomyocytes; le myocarde mature est une structure complexe composée de plusieurs types de cellules coexistantes tels que les fibroblastes, les neurones, les macrophages et les cellules endothéliales. D’autre part, les cardiomyocytes humains isolés sont électriquement matures, et différentes sous-populations de cardiomyocytes peuvent être obtenues en modifiant les paramètres de culture9. Pourtant, ces myocytes présentent généralement des morphologies potentielles d’action altérées en raison de l’absence de couplage cellule-cellule, de dé-différenciation rapide, et l’occurrence du comportement proarrhythmique in vitro10,11. Certaines des limitations ont été abordées par les modèles de culture cellulaire 3D des iPSC-CMs et des myocytes cardiaques. Ces modèles, qui incluent les sphéroïdes, les cultures 3D encapsulées d’échafaudage hydrogel, les tissus cardiaques modifiés (EHT) et les systèmes cardiaques sur puce, utilisent de multiples populations de cellules cardiaques telles que les cardiomyocytes, les fibroblastes et les cellules endothéliales. Ils s’auto-assemblent ou s’assemblent le long d’un échafaudage pour former des structures 3D, et certains reproduisent même la nature anisotrope complexe du myocarde. Ces modèles ont été rapportés pour avoir des cellules des phénotypes mûrs, des propriétés contractiles, et des profils moléculaires semblables au tissu cardiaque. Le système heart-on-a-chip permet également l’étude des effets systémiques dans les tests de dépistage de drogues et les modèles de maladies. Cependant, les modèles in vitro à base de cellules n’ont pas la matrice extracellulaire indigène et ne peuvent donc pas imiter avec précision l’électrophysiologie au niveau des organes. Les tranches cardiaques humaines, en revanche, ont une matrice extracellulaire intacte et des contacts cellulaires natifs, ce qui les rend utiles pour examiner plus précisément les propriétés arythmogènes du myocarde humain.
Les chercheurs ont développé des tranches organotypic cardiaques humaines comme plate-forme préclinique physiologique pour le dépistage aigu et chronique de drogues et pour étudier l’électrophysiologie cardiaque et la progression de la maladie cardiaque12,13,14,15,16,17,18,19. Comparés aux cardiomyocytes dérivés de l’iPSC, les tranches cardiaques humaines reproduisent plus fidèlement l’électrophysiologie cardiaque humaine adulte avec un phénotype cardiomyocyte mature. Par rapport aux cardiomyocytes humains isolés, les tranches cardiaques présentent des durées potentielles d’action physiologique en raison du couplage cellule-cellule bien conservé et de l’existence intrinsèque de leurs environnements intra- et extracellulaires indigènes.
Ce protocole décrit le processus de génération de tranches cardiaques humaines à partir de cœurs donneurs entiers, effectuant des études aiguës (c.-à-d. des heures) et chroniques (c.-à-d. des jours) pour tester les paramètres d’électrophysiologie cardiaque par la cartographie optique. Bien que ce protocole ne décrit que l’utilisation du tissu ventriculaire gauche (LV), il a été appliqué avec succès à d’autres régions du cœur ainsi qu’à d’autres espèces telles que les souris, les rats, les cobayes et les porcs14,20,21,22. Notre laboratoire utilise des cœurs entiers de donneurs humains qui ont été rejetés pour transplantation au cours des 5 dernières années, mais il est possible que ces mêmes procédures soient effectuées sur tous les tissus d’échantillons cardiaques de donneurs obtenus par d’autres moyens (p. ex., implantations, biopsies, myectomies) du dispositif d’assistance ventriculaire gauche [LVAD], tant que les tissus ont la capacité d’être sectionnés en cubes. La cartographie optique est utilisée pour l’analyse dans cette étude en raison de sa capacité à cartographier simultanément les potentiels d’action optique et les transitoires de calcium avec une haute résolution spatiale (100 x 100 pixels) et temporelle (>1 000 images/s). Des méthodes alternatives peuvent également être utilisées, telles que les tableaux multiélectrodes (MEA) ou les microélectrodes, mais ces techniques sont limitées par leurs résolutions spatiales relativement faibles. En outre, les MEA ont été conçus pour une utilisation avec des cultures cellulaires, et les microélectrodes pointues sont plus facilement gérées pour une utilisation avec des cœurs entiers ou de grands coins de tissu.
L’objectif de l’article est de permettre à un plus grand nombre de chercheurs d’utiliser les tissus cardiaques humains pour des études d’électrophysiologie cardiaque. Il convient de noter que la technologie décrite dans cet article est relativement simple et bénéfique pour les études à court terme (de l’ordre de plusieurs heures à plusieurs jours). Une culture biomimétique plus physiologique pour les études à plus long terme (de l’ordre des semaines) a été discutée et décrite par un certain nombre d’autres études12,18,23. La stimulation électrique, la charge mécanique et l’étirement des tissus sont des mécanismes de conditionnement avantageux qui peuvent aider à limiter l’apparition du remodelage des tissus in vitro12,,18,23.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ont été exécutées conformément à toutes les lignes directrices institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain. La recherche a été approuvée par la Commission d’examen des institutions (CISR) de l’Université George Washington.
REMARQUE : Les cœurs humains de donneurs ont été acquis de la communauté régionale de transplantation de Washington en tant que tissu déidentifié jeté avec l’approbation de la CISR de l’Université George Washington. Les cœurs explantés sont arrêtés cardioplégiquement en rinçant le cœur avec une solution de cardioplégie glacée (le sang a été dégagé du cœur dans ce processus) et transféré au laboratoire dans des conditions standard de transplantation d’organes.
1. Préparation de solutions
- Pour chaque cœur, faire 4 L de solution cardioplégique (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 1,2 mM CaCl2; pH = 7,4). Conserver 3 L à 4 °C et les 1 L restants à -20 °C.
REMARQUE : Cette solution peut être faite jusqu’à plusieurs jours à l’avance. - Préparer fraîchement 1 L chacun de la solution de tranchage de Tyrode (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM de glucose, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-butanedione monoxime [BDM]; pH = 7,4) et la solution de récupération de Tyrode (140 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM de glucose, 10 mM HEMES, 10 mM BDM; pH = 7,4).
REMARQUE : Les solutions de tranchage et de récupération doivent être faites le jour de l’expérience et peuvent être stockées à 4 °C. - Préparer des solutions de stock des colorants fluorescents. Reconstituer le colorant sensible à la tension RH237 à 1,25 mg/mL dans le sulfoxyde de diméthyle (DMSO) et le stocker dans des aliquots de 30 μL à 4 °C. Reconstituer l’indicateur de calcium Rhod-2AM à 1 mg/mL dans DMSO. Conserver dans 30 aliquots μL à -20 °C.
REMARQUE : Le Di-4-ANEPPS (solution de stock à 1,25 mg/mL dans DMSO) peut être utilisé dans des expériences pour l’imagerie par caméra unique du potentiel transmembrane seul.- Avant le début de l’expérience, soniquer les colorants à l’aide d’un sonicateur d’ultrasons pendant au moins 10 min et diluer chaque aliquot de colorants fluorescents dans 1 mL de la solution de récupération. Ajouter pluronic F-127 (Table des matériaux) à Rhod-2AM à un rapport de 1:1 avant dilution dans la solution de récupération.
- Préparer une solution de stock de l’excitation-contraction uncoupler blebbistatine à 2 mg/mL solution dans DMSO. Conserver dans des aliquots à -20 °C. Au cours d’expériences de cartographie optique, diluer la solution de stock de blebbistatine à une concentration de travail de 5−10 μM dans la solution de récupération du Tyrode.
- Faire le milieu de culture frais en complétant le milieu 199 avec 2% de pénicilline-streptomycine, 1x insuline-transferrin-sélénium (ITS) supplément de milieu liquide, et 10 mM BDM. Filtrer le milieu à l’aide d’un filtre stérile de 0,2 μm.
REMARQUE : Pour les études pharmacologiques de perturbation, les médicaments peuvent être ajoutés directement au milieu de culture. Le milieu de culture peut être stocké à 37 °C. - Faire un gel agarose de 4 % pour le montage des tissus en dissolvant l’agarose à faible point de fusion dans de l’eau distillée et en chauffant le mélange dans un four à micro-ondes jusqu’à dissolution complète. Guérir l’agarose dans une boîte de Pétri à une épaisseur de 5 mm et conserver à 4 °C.
2. Configuration de l’équipement
- Configuration vibrante de microtome
- Calibrer le microtome vibrant avant chaque expérience.
- À l’aide d’un microtome vibrant de haute précision(Table des matériaux),chargez une lame de coupe en céramique dans le support et attachez le dispositif d’étalonnage fourni avec le microtome vibrant. Choisissez l’option de réglage de la lame dans le menu et sélectionnez la céramique pour le type de lame.
- Sélectionnez l’option vibrez, vérifiez la valeur de l’axe Z. Si cette valeur est de 1 μm, quittez le menu étalonnage. Si ce n’est pas le cas, ajuster finement la vis d’étalonnage fixée au sommet de la tête vibrante et sélectionner l’option de vibration. Répétez autant de fois que nécessaire pour définir l’axe Z à <1 μm.
- Réglez les réglages du vibromètre à 400 μm d’épaisseur de coupe, 0,02 mm/s vitesse d’avance pour le tissu auriculaire et 0,04 mm/s vitesse d’avance pour les tissus ventriculaires, amplitude horizontale de vibration de 2 mm et fréquence de vibration de 80 Hz.
REMARQUE : Bien que 400 μm soit l’épaisseur recommandée pour compenser les dommages causés par les cellules sur les surfaces coupées de la tranche, des tranches plus minces peuvent également être préparées. Étant donné que la limite de diffusion de l’oxygène est d’environ 150 μm, les tranches d’environ 300 μm sont souvent utilisées14,,17,18,24. - Remplissez le bain du microtome vibrant avec une solution de tranchage à 4 °C et maintenez la température en entourant l’extérieur du bain avec de la glace, en réapprovisionnant au besoin tout au long du protocole de tranchage. Oxygéner continuellement la solution de tranchage dans le bain en bouillonnant avec 100% d’oxygène pendant le tranchage.
- Installez un deuxième plat avec autant de passoires de cellules en maille de nylon de 100 μm et de rondelles en maille au besoin (une passoire cellulaire par tranche). Remplissez ce plat de solution de récupération et oxygénez-le en bouillonnant de 100% d’oxygène à température ambiante (RT).
REMARQUE : Cette solution est maintenue à RT pendant l’expérience.
- Calibrer le microtome vibrant avant chaque expérience.
- Configuration de mappage optique
REMARQUE : Une description plus détaillée du système de cartographie optique est fournie dans les publications précédentes16,25,26.- Attachez un bain de tissu avec la couche de gel de polydiméthylsiloxane (PDMS) au fond (pour épingler les tranches) à un système de perfusion. Faire circuler 1 L de la solution de récupération à 37 °C et oxygéner avec 100% d’oxygène, à travers le système de perfusion à un débit assez rapide pour maintenir la température et l’accumulation claire de perfusate de bain.
- Réglez la mise au point et l’alignement des deux caméras CMOS (Tableau des matériaux)à l’aide d’une cible.
NOTE: Plus de détails sur l’alignement peuvent être trouvés dans les études précédentes26. - Utilisez une source de lumière LED verte d’une longueur d’onde de 520 ± 5 nm pour exciter simultanément les colorants indicateurs sensibles à la tension et au calcium.
REMARQUE : La source lumineuse d’excitation est attachée au cube de filtre d’excitation du système de cartographie optique et se reflète sur un miroir dichroique de 550 nm pour l’éclairage épicentrique. La lumière émise est recueillie par une lentille 1x et divisée par un deuxième miroir dichroique à 630 nm en composants de tension et de calcium avant d’être filtrée par 690 ± 50 nm et 590 ± 33 nm, respectivement, et enregistrée par les deux caméras.
3. Protocole de découpage
- Lorsque vous êtes prêt pour la dissection et l’expérimentation des tissus, préparez un bain de cardioplégie glacée en mélangeant la cardioplégie congelée et liquide. Gardez le cœur immergé dans le bain de cardioplégie jusqu’à ce que la collecte des tissus pour la coupe (Figure 1A).
- Collez le gel agarose préfayé à l’arrière des supports de tissu métallique du vibratome.
- Identifier la paroi ventriculaire gauche libre et couper 1 cm3 cubes de tissu dans la solution cardioplégique froide. Ensuite, montez rapidement les blocs de tissu sur les supports de tissu métallique avec les surfaces endocardiques orientées vers le haut et les attachent au gel agarose à l’aide d’adhésif topique pour la peau (Figure 1B).
REMARQUE : La région tissulaire sélectionnée doit être éloignée des grands vaisseaux sanguins pour éviter les trous dans les tranches. Le plan de sectionnage est approximativement parallèle à l’orientation de fibre dans la couche endocardiale (figure 1E) et le plan de sectionnage pourrait être à un léger angle dû à l’anisotropie rotationnelle dans une couche plus profonde de la paroi LV. Pour augmenter le débit, jusqu’à deux blocs de tissu peuvent être montés côte à côte sur le même support. - Transférer les supports métalliques dans le bain vibratoire rempli de la solution de tranchage oxygéné. Assurez-vous que les cubes de tissu sont complètement submergés.
- Déplacez la lame sur le bord avant du tissu et allumez le vibratome pour commencer à trancher avec les paramètres prédéfinis. Jeter les premières tranches jusqu’à ce que la lame atteigne au-delà du trabeculae dans le tissu endocardique lisse.
- Une fois chaque tranche coupée, transférer soigneusement la tranche dans un bain oxygéné (100% O2)de la solution de récupération de Tyrode à RT. Placez doucement chaque tranche dans des passoires individuelles de maille de nylon de 100 μm et couvrez-les de rondelles en maille pour empêcher les tranches de tissu de se recroiser (figure 1C). Conserver les tranches dans la solution de récupération pendant au moins 20 min.
REMARQUE : Les tranches peuvent être conservées dans le bain dans ces conditions jusqu’à 3 à 4 h sans effets électrophysiologiques néfastes.
4. La culture de tranches dans des conditions statiques
REMARQUE : Pour minimiser les risques de contamination, stérilisez les forceps à l’aide d’un stérilisateur de perles avant chaque étape de transfert.
- Lorsqu’il est prêt à la culture, transférer soigneusement chaque tranche dans les puits individuels d’une plaque de 6 puits remplie de solution saline stérile tamponnée de phosphate (PBS). Bercer délicatement la plaque de puits pour rincer les tranches de la solution de récupération.
REMARQUE : À partir de ce moment, les tranches ne doivent être exposées que dans un capot de culture de flux laminaire BSL2, et des forceps stériles doivent être utilisés pour manipuler le tissu. - Transférer les tranches dans les puits de PBS frais pour bien rincer et stériliser les tranches pour la culture. Effectuez cette étape de lavage 3x pour assurer le retrait complet de la solution de récupération des tranches.
- Transférer les tranches dans des puits individuels d’une plaque de 6 puits remplie de 3 mL de milieu de culture préguerre (37 °C) (avec ou sans médicaments, figure 1D). Placez les plaques sur un shaker orbital à 20 tr/min dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 30% O2 et 5% CO2. Remplacer et remplacer le milieu de culture tous les 48 h.
5. Caractérisation fonctionnelle- cartographie optique
- Pour les études de cartographie optique immédiatement après le tranchage ou après la culture, transférer soigneusement la tranche d’intérêt dans le bain tissulaire du système de perfusion à 37 °C avec 100% O2 dans la solution de récupération de Tyrode, et épingler les quatre coins à la couche de gel PDMS tout en appliquant un étirement minimal (c.-à-d. juste assez pour empêcher la tranche de se déplacer facilement dans des conditions de débit). Laisser reposer les tranches dans ce bain avec une solution de récupération circulante pendant environ 10 min.
- Ajoutez 0,3−0,5 mL de blebbistatine diluée au réservoir contenant la solution de récupération. Laisser la tranche incuber avec de la blebbistatine pendant environ 10 min.
- Reconstituer 30 μL du colorant sensible à la tension du stock, RH237, en 1 mL de solution de récupération à 37 °C. Éteignez les pompes et chargez lentement 0,2−0,3 mL de solution de teinture de travail sur la surface de la tranche sur une période de 30 s. Laissez la tranche incuber dans le colorant avec les pompes éteintes pendant une période allant jusqu’à 90 s, puis allumez à nouveau les pompes pour permettre à tout excès de colorant de se laver.
REMARQUE : Il faut prendre soin d’appliquer le colorant uniformément sur toute la tranche. En outre, l’application de colorant très lent est cruciale pour empêcher le colorant de flotter loin de la tranche. - Répétez l’étape 5.3 pour reconstituer l’indicateur de calcium de stock Rhod-2AM et le charger sur la tranche.
- Concentrez les caméras sur la tranche en ajustant la distance de la tranche de l’objectif.
- Positionnez une électrode bipolaire de rythme platine-iridium de telle sorte que sa pointe soit en contact avec le milieu de la tranche et appliquez des stimuli de stimulation d’amplitude croissante pour déterminer le seuil minimum de rythme requis pour obtenir une réponse électrique. Rythmez la tranche à 1 Hz avec une durée de 2 ms de largeur d’impulsion à 1,5x l’amplitude du seuil de rythme prédéterminé. Placez un couvercle sur la tranche de tissu.
- Illuminer la tranche à l’aide d’une source lumineuse d’excitation LED de 520 ± 5 nm. Enregistrez la tension émise et les signaux de calcium avec les deux caméras CMOS à 1000 images/s.
- Vérifiez l’enregistrement pour obtenir une bonne qualité de signal et des artefacts de mouvement supprimés (Figure 1F). Ajoutez plus de blebbistatine au réservoir par étapes de 0,1 mL jusqu’à ce que le mouvement ne produise plus d’artefacts dans les signaux optiques. Ajoutez plus de colorant, si nécessaire, pour améliorer la qualité du signal.
REMARQUE : La bonne qualité du signal fait référence à l’amplitude du signal et au faible bruit de fond évalués qualitativement dans les signaux optiques enregistrés.
6. Traitement des données avec RHYTHM1.2
REMARQUE : RHYTHM1.2 est une interface utilisateur basée sur MATLAB qui est utilisée pour afficher, conditionner et analyser les données de cartographie optique acquises par des systèmes de cartographie optique à caméra unique ou double (figure 3). Il est utilisé en conjonction avec le système d’imagerie.
- Chargement de fichiers de données
- Chargez les fichiers de données dans RHYTHM1.2 en sélectionnant l’une des quatre fenêtres d’affichage de l’écran et en utilisant les boutons Sélectionner le répertoire et la charge.
- Le programme invite l’utilisateur à sélectionner les données Camera 1 ou Camera 2 pour les enregistrements à double tension et calcium. Sélectionnez Caméra 1 pour le signal de tension.
- Répétez le processus pour charger le signal de calcium (Caméra 2) à l’une des fenêtres d’affichage adjacentes.
- Activez la case à cocher Liaison de données doubles entre les deux fenêtres d’affichage sélectionnées pour lier les deux fenêtres d’affichage, puisque les deux jeux de données sont enregistrés à partir de la même région sur la tranche.
REMARQUE : Alternativement, si le même champ de vision est maintenu, cette fonction peut être utilisée pour relier deux images qui ont été obtenues à des moments distincts pour voir la réponse temporelle en électrophysiologie du médicament étudié. Le double clic sur n’importe quelle fenêtre d’affichage permet de maximiser cette fenêtre pour faciliter l’analyse.
- Conditionnement du signal
- Sélectionner l’analyse des données | Paramètres de condition pour conditionner les données de cartographie optique de tension et de calcium avant une analyse plus poussée.
- Utilisez la fonction «Supprimer l’arrière-plan» pour supprimer les pixels qui ne contiennent aucun signal basé sur un seuil d’intensité fluorescente (seuil d’arrière-plan [BG] et degré de regroupement de pixels (seuil d’excitation [EX] ).
- Effectuer la moyenne spatiale des données de cartographie optique à l’aide de la fonction «Bin» pour améliorer la qualité du signal.
- Filtrer les données de mappage optique à l’aide d’un filtre de passage de bande avec la fonction «Filtre».
- Utilisez la fonction «Drift» pour éliminer la dérive de base du signal de cartographie optique.
- À l’aide de la fonction «Normaliser», normaliser les données de cartographie optique de chaque pixel pour avoir une amplitude maximale de 1.
- Utilisez la fonction «Signal inverse» pour inverser les traces de calcium pour une analyse plus poussée.
- Cliquez sur Afficher l’onde pour sélectionner la trace conditionnée à partir d’un endroit donné dans la fenêtre d’affichage et la tracer dans la fenêtre Waveform. Ajuster les paramètres de conditionnement du signal pour obtenir un potentiel d’action optimal et des traces transitoires de calcium.
- Calcul de la vitesse de conduction (CV)
REMARQUE : Le temps d’activation est défini comme le temps du dérivé maximal du signal optique (dF/dtmax).- Sélectionner l’analyse des données | Carte d’activation et entrez une heure de début et une heure de fin pour englober un seul potentiel d’action dans la trace. Appuyez sur Calculer et sélectionner la région d’intérêt (ROI) pour afficher la carte d’activation de la région sélectionnée (Figure 1G).
- Sélectionner l’analyse des données | Carte CV et de même, choisissez l’heure de début et l’heure de fin. Entrez les valeurs de résolution interpixels basées sur la configuration.
REMARQUE : Pour les systèmes de grossissement 1x, la résolution interpixels est de 0,1 mm dans la direction X et Y. - Appuyez sur le Générer Vec. Bouton Mapper pour sélectionner un retour sur investissement et afficher les vecteurs CV dans cette région. Le moyen, le médian, l’écart-type et le nombre de vecteurs inclus dans l’analyse ainsi que l’angle moyen de propagation des vecteurs CV dans la région sélectionnée sont calculés et affichés dans la section Statistiques.
- Cliquez sur le bouton Ligne de dessin pour tracer une ligne le long d’une direction donnée de propagation. Tous les vecteurs CV dans cette direction seront sélectionnés. Cliquez sur Calculer le CV pour utiliser uniquement les vecteurs cv sélectionnés pour calculer les statistiques qui seront affichées dans la section Statistiques.
- Durée potentielle d’action (APD) et calcul de la durée transitoire du calcium (CaTD)
REMARQUE : L’APD est un autre paramètre fondamental de l’électrophysiologie cardiaque. Les cartes APD peuvent être générées en déterminant le décalage horaire entre l’activation et un pourcentage spécifié de repolarisation de chaque potentiel d’action optique. L’hétérogénéité de l’APD ou la prolongation et le raccourcissement de l’APD peuvent être utilisés pour prédire la susceptibilité à l’arythmie.- Pour calculer apd dans RHYTHM1.2, sélectionnez Analyse des données | Carte APD/CaT.
- Sélectionnez l’heure de début et l’heure de fin pour englober un potentiel d’action complet. Définissez une valeur minimale et maximale d’APD/CaTD pour supprimer toutes les valeurs aberrantes (par exemple, 0 et 1 000 ms, respectivement). Entrez la répolarisation en pourcentage qui déterminera l’APD, par exemple, 0,8 pour APD80/CaTD80 ou 0,5 pour APD50/CaTD50.
- Cliquez sur Calc APD régional pour sélectionner un retour sur investissement et générer la carte APD. La moyenne, la médiane, l’écart-type et le nombre de pixels inclus dans l’analyse seront affichés dans la section Statistiques.
- Temps de montée
REMARQUE : Le temps de montée est un autre paramètre électrophysiologique qui peut être mesuré à partir de signaux optiques de tension et de traces transitoires de calcium. Il fournit une estimation du temps qu’il faut pour que les canaux ions dépolarisants déclenchent un potentiel d’action, ou combien de temps il faut pour que le calcium soit libéré dans le cytoplasme du réticulum sarcoplasmique. Le temps d’élévation optique n’est pas un substitut parfait aux temps de montée mesurés par les microélectrodes et peut ne pas être aussi sensible aux changements dans la dépolarisation, parce que les potentiels d’action optique sont une moyenne du potentiel transmembrane de nombreuses cellules. La résolution spatiale et temporelle du système peut également affecter les valeurs de temps d’élévation optique. Cependant, il peut encore être utilisé pour prédire de grands changements dans la dépolarisation27.- Pour déterminer l’heure d’élévation, sélectionnez Analyse des données | Heure de montée.
- Sélectionnez Heure de début et heure de fin pour sélectionner le coup d’envoi d’un seul potentiel d’action ou de calcium transitoire. Entrez les valeurs de Start% et End% (généralement 10 à 90% est recommandé pour les signaux non bruyants), ce qui permet à l’utilisateur de sélectionner uniquement les parties du signal sans inclure le bruit dans le cas de signaux bruyants.
- Cliquez sur Calculer pour sélectionner le roi et déterminer la moyenne, la médiane, l’écart-type et le nombre de pixels inclus dans l’analyse du temps de montée.
- La décomposition du calcium
REMARQUE : Pour les traces de calcium, la constante de temps de la décomposition du calcium transitoire peut être déterminée. Cela permet l’analyse des changements dans l’élimination des ions de calcium du cytoplasme dans le SR.- Sélectionner l’analyse des données | Calcium Decay et entrez l’heure de début et l’heure de fin pour englober la partie entière de décomposition d’un seul signal transitoire de calcium.
- Cliquez sur Calculer tau pour sélectionner le retour sur investissement et déterminer la moyenne, la médiane, l’écart-type et le nombre de pixels inclus dans l’analyse de la constante de temps de décomposition du calcium.
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Representative Results
Des tranches organotypic humaines ont été prélevées dans le ventricule gauche d’un cœur humain donneur selon le protocole détaillé ci-dessus et illustré dansFigure 1. Un système de cartographie optique à double caméra comme celui deFigure 2a été utilisé dans la configuration d’imagerie verticale pour effectuer la cartographie optique simultanée de la tension et du calcium environ 1 h après l’achèvement du protocole de tranchage. Les données ont été analysées à l’aide de RHYTHM1.2 (Figure 3), un outil d’analyse de données de cartographie optique open source précédemment publié par notre laboratoire et disponible gratuitement sur Github (https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2). Les paramètres électrophysiologiques mesurés sont illustrésFigure 4. Le potentiel d’action et les traces transitoires de calcium ont été conditionnés par le signal et des traces représentatives utilisées dans des analyses plus poussées sontFigure 4A. Les temps d’activation ont été déterminés pour chaque pixel et les cartes isochronales des temps d’activation déterminés à partir des traces de tension et de calcium sont illustrées dansFigure 4B,C. Notez que l’activation de l’isochrone de calcium est en retard par rapport à celle de la tension comme prévu. Vecteurs CV tracés dansFigure 4Dont été calculés à l’aide des temps d’activation et de la résolution interpixels connue. Le CV moyen dans la direction transversale a été déterminé à 21,2 cm/s dans cette tranche. Cette valeur cv est comparable au CV transversal ventriculaire précédemment rapporté mesuré à partir de cœurs humains entiers explantés (24 ± 4 et 28 ± 7 cm/s dans les cœurs atteints de fibrose diffuse et inégale)28. La constante transitoire de décomposition du calcium a été mesurée en ajustant un polynomial à la partie en décomposition des traces de calcium et la constante moyenne de décomposition a été déterminée à 105,3 ms dans cette tranche (carte dansFigure 4E). Ensuite, l’APD et le CaTD ont été mesurés comme la durée entre le temps d’activation et un pourcentage spécifié de la répolarisation/élimination du calcium forme le cytoplasme. APD moyenne80et CaTD80ont été déterminés à 343,1 ms et 442,6 ms, respectivement (Figure 4F,G). Les études humaines in vivo précédentes rapportent l’intervalle d’activation-récupération (ARI) mesuré à partir d’électrogrammes unipolaires enregistrés à partir de coeurs humains in vivo pendant le rythme d’état régulier à 1 Hz comme substitut pour apd. Les valeurs ARI dans ces études varient de 250 à 450 ms29,30. Les valeurs apd des tranches cardiaques humaines rapportées ici sont comparables aux valeurs précédentes d’ARI. Les régions avec des artefacts de mouvement ont été supprimées des calculs apd et catd. Enfin, les temps d’élévation (c’est-à-dire la durée de la montée) des traces de tension et de calcium ont été mesurés et cartographiés. Ceux-ci sont indiqués dansFigure 4HEtFigure 4IRespectivement. Les valeurs moyennes ont été déterminées à 10,2 ms et 13,3 ms, respectivement. Les artefacts dans les cartes à droite du point de marche sont dus au fil de marche dans le champ de vision. Enfin, l’utilisation de ce modèle de tranche dans le dépistage aigu des drogues a été démontrée lorsque des tranches ont été cultivées pendant 24 h avec la doxorubicine (DOX), un agent chimiothérapeutique connu pour avoir des effets cardiotoxiques. Le traitement des tranches avec 50 μM DOX a entraîné une réduction de la vitesse de conduction transversale de 19,4 ± 3,4 cm/s à 9,6 ± 3,2 cm/s, comme l’illustrent les cartes d’activationFigure 5A, cartes vectorielles CV dansFigure 5B, et les données récapitulatives dansFigure 5C. La plus petite taille de l’échantillon dans le groupe DOX était due à un plus grand nombre de tranches non viables après le traitement DOX. L’augmentation des artefacts de mouvement dans les tranches traitées par DOX a empêché le calcul de valeurs apd précises. Un autre paramètre important qui peut être mesuré par la double tension et l’imagerie du calcium est VM-Ca retard, pour déterminer l’excitation robuste-contraction couplage dans le tissu31. Les retards ou les valeurs négatives de ce paramètre peuvent être préjudiciables.
Figure 1 : Préparation de tranches organotypic cardiaques humaines. (A) Les cœurs humains ont été stockés dans un bain cardioplégique glacé (mélange de solution de cardioplégie et de glace de cardioplégie) après récupération. (B) Les 1 cm3 cubes de tissu ventriculaire gauche ont été coupés et montés sur un support de tissu métallique avec 4% gel agarose collé à la paroi arrière du support et transféré à un bain glacé de solution de tranchage oxygéné. (C) Une fois coupées, les tranches ont été transférées à la solution de récupération oxygénée à RT dans les passoires individuelles de cellules en maille de nylon de 100 μm. Les rondelles en maille ont recouvert les tissus pour empêcher les tranches de curling. (D) Pour la culture à long terme, les tranches ont été lavées en PBS et cultivées dans 6 assiettes de puits avec 3 mL de milieu tissulaire à 37 °C. (E) Section de tranche tachée trichrome de Mason montrant l’orientation de fibre. (F) Potentiel d’action optique représentatif enregistré à partir d’une tranche. (G) Carte d’activation représentative d’une tranche rythmée au centre (bleu). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Système de cartographie optique à double caméra. Système de cartographie optique à double caméra dans la configuration d’imagerie verticale. Les pièces du système comprennent : 1) des caméras de maître et d’esclave pour la double cartographie; 2) bain de tissu avec gel PDMS; 3) les cubes de filtre qui abritent les filtres d’excitation et d’émission et les miroirs dichroiques; 4) porte-lentilles et lentilles; et 5) source lumineuse d’excitation (520 nm de LED vert). Encastré sur les détails droits filtre et combinaisons miroir dichroique pour la double cartographie optique de Vm et le calcium en utilisant RH237 et Rhod-2-AM, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : interface utilisateur graphique (GUI) RHYTHM1.2 de l’outil d’analyse de données de cartographie optique open source pour l’analyse des paramètres uniques et des multiparamètres. Les options de chargement des fichiers de données et la liste de fichiers s’affichent dans la zone rouge. Les options d’analyse des données sont répertoriées dans le menu déroulant analyse des données indiqué en vert. Les fenêtres d’affichage pour l’affichage des cartes de données sont indiquées en bleu foncé. Les cases à cocher pour lier les fichiers de données de mappage double pour l’analyse simultanée des données de double caméra sont indiquées en violet. La fenêtre de forme d’onde pour tracer le potentiel d’action et les traces transitoires de calcium est affichée en jaune. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Potentiel transmembrane et transitoires de calcium cartographiant à partir d’une préparation de tranche cardiaque organotypic humaine. (A) Potentiel d’action optique représentatif (noir) et transitoire de calcium (bourgogne). (B,C) Cartes d’activation obtenues à partird’enregistrements V m et calcium, respectivement. (D) Carte vectorielle de vitesse de conduction (CV). (E) Carte de la constante transitoire de décomposition du calcium (Tau). (F,G) Durée potentielle d’action (APD80) et durée transitoire de calcium (CaTD80)carte, respectivement. (H,I) Cartes du temps de montée des montées du potentiel d’action et du calcium transitoire, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Le traitement par doxorubicine ralentit la vitesse de conduction transversale. (A) Cartes d’activation à partir de tranches cultivées pendant 24 heures sans (contrôle) et avec la doxorubicine à 50 μM (DOX). (B) Cartes vectorielles de vitesse de conduction à partir des tranches de contrôle et de DOX. (C) Vitesse de conduction transversale moyenne calculée à partir de tranches de contrôle et traitées par DOX. *P < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici, nous présentons des méthodes étape par étape pour obtenir des tranches cardiaques viables des coeurs humains cardioplegically arrêtés et pour caractériser fonctionnellement les tranches utilisant la double cartographie optique du potentiel transmembrane et du calcium intracellulaire. Avec l’environnement extracellulaire préservé et le couplage cellulaire indigène-cellule, les tranches cardiaques humaines peuvent être employées comme modèle précis du coeur humain pour la découverte scientifique fondamentale et pour l’essai d’efficacité et de cardiotoxicité des agents pharmacologiques et des thérapies géniques. La technologie permet également la cartographie structurelle-fonctionnelle de régions spécifiques du cœur, telles que le nœud sinoatrial, le nœud atrioventriculaire, et les fibres purkinje. Le protocole décrit ici répertorie les étapes de base pour la génération de tranches cardiaques, l’imagerie et les analyses qui sont les meilleures pour les études à court terme. La culture statique des tranches de tissu ont été montrés pour induire des changements dans les tissus cardiaques sur de longues périodes de temps, donc pour des études à plus long terme, nous encourageons le lecteur à intégrer des conditions de culture plus physiologiques, telles que la stimulation électromécanique12,13,14.
Il faut prendre soin d’un certain nombre de mesures visant à maintenir la santé des tissus. Par exemple, le temps entre la récolte cardiaque et le tranchage des tissus doit être réduit au minimum. Comme indiqué précédemment21, la longueur prolongée de l’arrêt cardioplégique peut mener à l’électrophysiologie altérée. En outre, pour préserver l’intégrité de la matrice extracellulaire et le couplage cellule-cellule, la manipulation excessive et l’étirement des tranches doivent être évitées pendant la collecte de tranches, la culture, et les études fonctionnelles. L’étirement excessif des tranches pourrait entraîner des blocs de conduction. En outre, toutes les solutions décrites dans ce protocole doivent être maintenues à un pH de 7,4. La solution du Tyrode décrite ici utilise HEPES pour maintenir le pH approprié en utilisant 100% O2. Le bicarbonate de sodium peut être utilisé pour contrôler le pH à la place, mais cette solution devrait être bulled avec 95% O2 et 5% CO2. Enfin, pendant le transport et le découpage du cœur, il faut s’assurer que la solution de cardioplégie et de tranchage est maintenue aussi près que possible de la température de congélation pour préserver la viabilité des tissus.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le financement des NIH (subventions R21 EB023106, R44 HL139248 et R01 HL126802), de la fondation Leducq (projet RHYTHM) et d’une bourse postdoctorale de l’American Heart Association (19POST34370122) est reconnu avec gratitude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
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