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Bioengineering

मानव ऑर्गेनोटिपिक कार्डियक स्लाइस के ड्यूल वोल्टेज और कैल्शियम ऑप्टिकल मैपिंग द्वारा प्रीक्लिनिकल कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मूल्यांकन

Published: June 16, 2020 doi: 10.3791/60781
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, The George Washington University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रीक्लिनिकल दवा परीक्षण के लिए मानव हृदय स्लाइस को खंडित करने और बनाने की प्रक्रिया का वर्णन करता है और इन स्लाइस से एक साथ ट्रांसमेम्ब्रान वोल्टेज और इंट्रासेलुलर कैल्शियम संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए ऑप्टिकल मैपिंग के उपयोग का विवरण देता है।

Abstract

मानव हृदय टुकड़ा तैयारी हाल ही में पशु और नैदानिक परीक्षणों के बीच अंतर को पाटने के लिए मानव शरीर विज्ञान अध्ययन और चिकित्सा परीक्षण के लिए एक मंच के रूप में विकसित किया गया है । दवाओं के प्रभावों की जांच करने के लिए कई पशु और सेल मॉडल का उपयोग किया गया है, फिर भी ये प्रतिक्रियाएं अक्सर मनुष्यों में भिन्न होती हैं। मानव हृदय स्लाइस दवा परीक्षण के लिए एक लाभ प्रदान करते हैं कि वे सीधे व्यवहार्य मानव दिलों से प्राप्त होते हैं। संरक्षित बहुकोशिकीय संरचनाओं, सेल-सेल युग्मन, और बाह्य मैट्रिक्स वातावरण होने के अलावा, मानव हृदय ऊतक स्लाइस का उपयोग वयस्क मानव हृदय शरीर विज्ञान पर असंख्य दवाओं के प्रभाव का सीधे परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। क्या इस मॉडल को अन्य दिल की तैयारी से अलग करता है, जैसे कि पूरे दिल या वेजेज, यह है कि स्लाइस को दीर्घकालिक संस्कृति के अधीन किया जा सकता है। जैसे, हृदय स्लाइस दवाओं के तीव्र और साथ ही पुराने प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, एक ही दिल से एक हजार स्लाइस के लिए कई सौ इकट्ठा करने की क्षमता यह एक उच्च थ्रूपुट मॉडल बनाता है एक ही समय में अंय दवाओं के साथ अलग सांद्रता और संयोजन पर कई दवाओं का परीक्षण करने के लिए । स्लाइस दिल के किसी भी क्षेत्र से तैयार किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम बाएं वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार से ऊतक क्यूब्स को अलग करके बाएं वेंट्रिकुलर स्लाइस की तैयारी का वर्णन करते हैं और उन्हें एक उच्च सटीक कंपन माइक्रोटॉम का उपयोग करके स्लाइस में विभाजित करते हैं। इन स्लाइस तो या तो बेसलाइन हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल समारोह को मापने के लिए तीव्र प्रयोगों के अधीन किया जा सकता है या पुरानी दवा अध्ययन के लिए सुसंस्कृत । यह प्रोटोकॉल जांच की जा रही दवाओं के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए ट्रांसमेम्ब्रान क्षमता और इंट्रासेलुलर कैल्शियम गतिशीलता की एक साथ रिकॉर्डिंग के लिए कार्डियक स्लाइस के दोहरे ऑप्टिकल मानचित्रण का भी वर्णन करता है।

Introduction

पशु मॉडल मानव शरीर विज्ञान और रोगविज्ञान के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक मूल्यवान उपकरण रहा है, साथ ही विभिन्न रोगों के इलाज के लिए उपचारों के प्रारंभिक परीक्षण के लिए एक मंच1। इन पशुअध्ययनोंके आधार पर जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में काफी प्रगति हुई है । हालांकि, चूहों, चूहों, गिनी सूअरों, खरगोशों, भेड़, सूअरों औरकुत्तों,सहित मानव और पशु शारीरिक विज्ञान के बीच महत्वपूर्ण अंतरप्रजाति मतभेद मौजूदहैं। नतीजतन, कई दवा, जीन और सेल उपचार हुए हैं जिन्होंने पशु परीक्षण चरण के दौरान वादा दिखाया लेकिन नैदानिक परीक्षणों में परिणामों तक खरा बनने में विफल रहे5। इस अंतर को पाटने के लिए, विभिन्न दवाओं औररोगोंके लिए मानव शरीर विज्ञान की प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए अलग-अलग कार्डियक मायोसाइट्स और मानव प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) को मॉडल के रूप में विकसित किया गया था। स्टेम सेल से व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का व्यापक रूप से अंग-ऑन-ए-चिप सिस्टम,में हृदय6,,7,8के किराए के रूप में उपयोग किया गया है। हालांकि, आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) की उपयोगिता उनके अपेक्षाकृत अपरिपक्व फेनोटाइप और कार्डियोमायोसाइट उपजनसंख्या के प्रतिनिधित्व की कमी से बाधित होती है; परिपक्व मायोकार्डियम एक जटिल संरचना है जिसमें फाइब्रोब्लास्ट, न्यूरॉन्स, मैक्रोफेज और एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे कई सह-अस्तित्व वाले सेल प्रकार शामिल हैं। दूसरी ओर, अलग-थलग मानव कार्डियोमायोसाइट्स विद्युत रूप से परिपक्व होते हैं, और विभिन्न कार्डियोमायोसाइट उप-जनसंख्याको 9गुणों को बदलकर प्राप्त किया जा सकता है। फिर भी, ये मायोसाइट्स आम तौर पर सेल-सेल कपलिंग, तेजी से डी-विभेदन, और विट्रो10, 11,में प्रोरेथिक व्यवहार की कमी के कारण कार्रवाई संभावित मॉर्फोलोजी को बदलदेतेहैं। कुछ सीमाओं को आईपीएससी-सीएम और कार्डियक मायोसाइट्स के 3डी सेल कल्चर मॉडल द्वारा संबोधित किया गया था। ये मॉडल, जिनमें स्पेरोइड्स, हाइड्रोगेल पाड़ ने 3डी संस्कृतियों, इंजीनियर हार्ट टिश्यू (ईएचटी) और हार्ट-ऑन-ए-चिप सिस्टम को समझाया, कार्डियोमायोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे कई कार्डियक सेल आबादी का उपयोग करें। वे या तो 3 डी संरचनाओं को बनाने के लिए एक पाड़ के साथ स्वयं इकट्ठा होते हैं या इकट्ठा होते हैं, और कुछ मायोकार्डियम की जटिल एनिसोट्रोपिक प्रकृति को भी पुन: पेश करते हैं। इन मॉडलों में कार्डियक टिश्यू के समान परिपक्व फेनोटाइप, अनुबंध गुण और आणविक प्रोफाइल की कोशिकाएं बताई गई हैं। हार्ट-ऑन-ए-चिप सिस्टम भी दवा परीक्षण और रोग मॉडल में प्रणालीगत प्रभावों के अध्ययन की अनुमति देता है। हालांकि, इन विट्रो सेल-आधारित मॉडल में देशी एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स की कमी है और इसलिए अंग स्तर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की सही नकल नहीं कर सकते हैं। इसके विपरीत, मानव हृदय स्लाइस में एक अक्षुण्ण बाह्य मैट्रिक्स और देशी सेल-टू-सेल संपर्क होते हैं, जिससे वे मानव मायोकार्डियम के अतालताजनक गुणों की अधिक सटीक जांच के लिए उपयोगी होते हैं।

शोधकर्ताओं ने मानव हृदय ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस को तीव्र और पुरानी दवा परीक्षण के लिए एक शारीरिक पूर्व नैदानिक मंच के रूप में विकसित किया है और कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और हृदय रोग प्रगति 12 ,13, 14,,15,16,,17,16,18,19,,19का अध्ययन किया है । जब आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के साथ तुलना की जाती है, तो मानव हृदय स्लाइस वयस्क मानव हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को परिपक्व कार्डियोमायोसाइट फेनोटाइप के साथ अधिक ईमानदारी से दोहराते हैं। अलग-थलग मानव कार्डियोमायोसाइट्स के साथ तुलना किए जाने पर, कार्डियक स्लाइस अच्छी तरह से संरक्षित सेल-सेल कपलिंग और उनके मूल अंतर-और बाह्य वातावरण के आंतरिक अस्तित्व के कारण शारीरिक कार्रवाई संभावित अवधि प्रदर्शित करते हैं।

यह प्रोटोकॉल ऑप्टिकल मैपिंग के माध्यम से हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मापदंडों का परीक्षण करने के लिए तीव्र (यानी, घंटे भर) और पुरानी (यानी, दिन भर) अध्ययन करने, पूरे दाता दिलों से मानव हृदय स्लाइस पैदा करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। जबकि यह प्रोटोकॉल केवल बाएं वेंट्रिकुलर (एलवी) ऊतक के उपयोग का वर्णन करता है, यह सफलतापूर्वक दिल के अन्य क्षेत्रों के साथ-साथ चूहों, चूहों, गिनी,सूअरों औरसूअरों 14,20, 21,,22जैसे अन्य प्रजातियों पर लागू किया गया है।,21 हमारी प्रयोगशाला पूरे मानव दाता दिलों का उपयोग करती है जिन्हें पिछले 5 वर्षों से प्रत्यारोपण के लिए अस्वीकार कर दिया गया है, लेकिन वैकल्पिक साधनों द्वारा प्राप्त किसी भी दाता हृदय नमूना ऊतकों पर किया जाना संभव है (उदाहरण के लिए, बाएं वेंट्रिकुलर असिस्ट डिवाइस [एलवीएडी] प्रत्यारोपण, बायोप्सी, मायमैक्टॉमी) जब तक ऊतकों में क्यूब्स में अनुभागित होने की क्षमता होती है। ऑप्टिकल मैपिंग को इस अध्ययन में विश्लेषण के लिए नियोजित किया गया है क्योंकि इसकी क्षमता के साथ-साथ ऑप्टिकल एक्शन क्षमता और कैल्शियम यात्रियों को उच्च स्थानिक (१०० x १०० पिक्सल) और लौकिक (>1,000 फ्रेम/एस) रिज़ॉल्यूशन के साथ मैप करने की क्षमता है । वैकल्पिक तरीकों का भी उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) या माइक्रोइलेक्ट्रोड, लेकिन ये तकनीकें उनके अपेक्षाकृत कम स्थानिक संकल्पों द्वारा सीमित हैं। इसके अतिरिक्त, MEAs सेल संस्कृतियों के साथ उपयोग के लिए डिजाइन किए गए थे, और तेज माइक्रोइलेक्ट्रोड पूरे दिल या बड़े ऊतक वेजेज के साथ उपयोग के लिए अधिक आसानी से प्रबंधित किए जाते हैं।

लेख का लक्ष्य अधिक शोधकर्ताओं को हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन के लिए मानव हृदय ऊतकों का उपयोग करने में सक्षम बनाना है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस लेख में वर्णित तकनीक अल्पकालिक अध्ययनों (कई घंटों से दिनों के आदेश पर) के लिए अपेक्षाकृत सरल और फायदेमंद है। दीर्घकालिक अध्ययनों (सप्ताहों के आदेश पर) के लिए अधिक शारीरिक बायोमिमेटिक संस्कृति पर चर्चा की गई है और कई अन्य अध्ययनों द्वारा वर्णित किया गया है12,,18,,23। विद्युत उत्तेजना, यांत्रिक लोडिंग और ऊतक खींचने वाले लाभप्रद कंडीशनिंग तंत्र हैं जो इन विट्रो ऊतक रिमॉडलिंग12, 18, 23,18की शुरुआत को सीमित करने में मदद करसकते23हैं।

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Protocol

वर्णित सभी तरीकों को मानव कल्याण के लिए सभी संस्थागत, राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा-निर्देशों के अनुपालन में किया गया है । जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय में इंस्टीट्यूशन रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुसंधान को मंजूरी दी गई थी ।

नोट: दाता मानव दिल वॉशिंगटन क्षेत्रीय प्रत्यारोपण समुदाय से अधिग्रहीत के रूप में जॉर्ज वॉशिंगटन विश्वविद्यालय आईआरबी से अनुमोदन के साथ deidentified खारिज ऊतक थे । निकाले गए दिलों को बर्फ-ठंडे कार्डियोप्लेजिया के समाधान के साथ दिल को फ्लश करके गिरफ्तार किया जाता है (इस प्रक्रिया में दिल से रक्त को मंजूरी दे दी गई थी) और मानक अंग प्रत्यारोपण की स्थिति के तहत प्रयोगशाला में स्थानांतरित कर दिया जाता है।

1. समाधान की तैयारी

  1. प्रत्येक हृदय के लिए, कार्डियोप्लेजिक समाधान के 4 एल (110 mm NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,1.2 mM CaCl2,पीएच = 7.4) बनाओ। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 एल और शेष 1 एल -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यह समाधान कई दिनों पहले तक बनाया जा सकता है।
  2. टाइरोड के स्लाइसिंग सॉल्यूशन (140 एमएमएम एनएसीएल, 6 एमएमएम केसीएल, 1 एमएमएम एमजीसीएल2,1.8 एमएमएम सीसीएल2,10 एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम एचईपीई, 10 एमएम 2,3-ब्यूटानेडियन मोनोक्सिमे [बीडीएम]; पीएच = 7.4) और टायरोडे का रिकवरी सॉल्यूशन (140 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl2,1.8 mM CaCl2,10 mM ग्लूकोज, 10 mM HEPES, 10 mm BDM; पीएच = 7.4) ।
    नोट: स्लाइसिंग और रिकवरी समाधान दोनों को प्रयोग का दिन बनाया जाना चाहिए और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. फ्लोरोसेंट रंगों के स्टॉक समाधान तैयार करें। डिमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में 1.25 मिलीग्राम/एमएल पर वोल्टेज-सेंसिटिव डाई आरएच237 का पुनर्गठन करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 माइक्रोल एलिकोट्स में स्टोर करें। डीएमएसओ में 1 मिलीग्राम/एमएल पर कैल्शियम इंडिकेटर रोड-2AM का पुनर्गठन करें । -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 μL aliquots में स्टोर करें।
    नोट: Di-4-ANEPPS (DMSO में १.२५ मिलीग्राम/mL पर स्टॉक समाधान) अकेले ट्रांसमेम्ब्रान क्षमता के एकल कैमरा इमेजिंग के लिए प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. प्रयोग की शुरुआत से पहले, कम से कम 10 मिनट के लिए अल्ट्रासाउंड सोनिकेटर का उपयोग करके रंगों को सोनिकेट करें और वसूली समाधान के 1 एमएल में फ्लोरोसेंट रंगों के प्रत्येक एलिकोट को पतला करें। वसूली समाधान में कमजोर पड़ने से पहले 1:1 अनुपात में रोड-2AM में अनुरोनिक एफ-127(सामग्री की तालिका)जोड़ें।
  4. डीएमएसओ में 2 मिलीग्राम/एमएल समाधान पर उत्तेजना-संकुचन अनकूपलर ब्लेबिस्टिन का स्टॉक समाधान तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में स्टोर करें। ऑप्टिकल मैपिंग प्रयोगों के दौरान, ब्लेबिस्टिन के स्टॉक समाधान को टायरोड के रिकवरी समाधान में 5−10 माइक्रोन की कामकाजी एकाग्रता में पतला करें।
  5. 2% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1x इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम (आईटीएस) लिक्विड मीडिया सप्लीमेंट और 10 एमएम बीडीएम के साथ मीडियम 199 को सप्लीमेंट करके फ्रेश कल्चर मीडियम बनाएं। 0.2 माइक्रोन बाँझ फिल्टर का उपयोग करके माध्यम को फ़िल्टर करें।
    नोट: औषधीय क्षोभ अध्ययन के लिए, दवाओं को सीधे संस्कृति माध्यम में जोड़ा जा सकता है। संस्कृति माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  6. आसुत पानी में कम पिघलने वाले बिंदु को भंग करके और मिश्रण को माइक्रोवेव में पूरी तरह से भंग होने तक गर्म करके बढ़ते ऊतकों के लिए 4% एगर उठे जेल बनाएं। 5 मिमी की मोटाई पर एक पेट्री डिश में एगरेज़ को ठीक करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. उपकरण सेटअप

  1. कंपन माइक्रोटॉम सेटअप
    1. प्रत्येक प्रयोग से पहले कंपन माइक्रोटॉम को कैलिब्रेट करें।
      1. एक उच्च सटीक कंपन माइक्रोटॉम(सामग्री की तालिका) काउपयोग करना, धारक में एक सिरेमिक कटिंग ब्लेड लोड करें और कंपन माइक्रोटॉम के साथ प्रदान किए गए कैलिब्रैटिंग डिवाइस को संलग्न करें। मेनू से ब्लेड समायोजन विकल्प चुनें और ब्लेड के प्रकार के लिए सिरेमिक का चयन करें।
      2. कंपन विकल्प का चयन करें, जेड एक्सिस मूल्य की जांच करें। यदि यह मूल्य <1 μm है, तो अंशांकन मेनू से बाहर निकलें। यदि नहीं, तो कंपन सिर के शीर्ष से जुड़े अंशांकन पेंच को बारीक समायोजित करें और कंपन विकल्प का चयन करें। जेड एक्सिस को <1 माइक्रोन सेट करने के लिए जितनी बार जरूरत हो उतनी बार दोहराएं।
    2. 400 माइक्रोन कटिंग मोटाई, एट्रियल टिश्यू के लिए 0.02 मिमी/एस एडवांस स्पीड और वेंट्रिकुलर टिश्यू के लिए 0.04 मिमी/एस एडवांस स्पीड, 2 एमएम क्षैतिज कंपन आयाम और 80 हर्ट्ज कंपन फ्रीक्वेंसी के लिए वाइब्रेटम सेटिंग्स सेट करें।
      नोट: जबकि 400 माइक्रोन स्लाइस की कट सतहों पर सेल क्षति की भरपाई करने के लिए अनुशंसित मोटाई है, पतले स्लाइस भी तैयार किए जा सकते हैं। यह देखते हुए कि ऑक्सीजन प्रसार की सीमा लगभग 150 माइक्रोन है, लगभग 300 माइक्रोन स्लाइस का उपयोग अक्सर14, 17,,18,,24कियाजाता,है।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर टुकड़ा करने की क्रिया समाधान के साथ कंपन माइक्रोटॉम के स्नान को भरें और बर्फ के साथ स्नान के बाहर आसपास के द्वारा तापमान को बनाए रखने, टुकड़ा करने की क्रिया प्रोटोकॉल भर में जरूरत के रूप में भरपाई । स्लाइसिंग के दौरान 100% ऑक्सीजन के साथ बुदबुदाते हुए स्नान में लगातार स्लाइसिंग समाधान को ऑक्सीजन दें।
    4. जरूरत के अनुसार कई 100 माइक्रोन नायलॉन जाल सेल छींदन और मेशेड वाशर (प्रति टुकड़ा एक सेल छलनी) के साथ एक दूसरी डिश सेट करें। इस डिश को रिकवरी सॉल्यूशन से भरें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 100% ऑक्सीजन के साथ बुदबुदाते हुए इसे ऑक्सीजनित करें।
      नोट: यह समाधान प्रयोग के दौरान आरटी में बनाए रखा जाता है।
  2. ऑप्टिकल मैपिंग सेटअप
    नोट: ऑप्टिकल मैपिंग प्रणाली का अधिक विस्तृत विवरण पिछले प्रकाशनों16,25, 26,में प्रदान कियागयाहै ।,
    1. एक परफ्यूजन सिस्टम के लिए नीचे (स्लाइस पिन करने के लिए) नीचे पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) जेल परत के साथ एक ऊतक स्नान संलग्न करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर वसूली समाधान के 1 एल प्रसारित करें और 100% ऑक्सीजन के साथ ऑक्सीजनेट करें, एक प्रवाह दर पर परफ्यूजन प्रणाली के माध्यम से पर्याप्त तेजी से तापमान और स्नान perfusate के स्पष्ट संचय को बनाए रखने के लिए।
    2. लक्ष्य का उपयोग करके दो सीएमओएस कैमरों(सामग्री की तालिका) काध्यान और संरेखण समायोजित करें।
      नोट: संरेखण के बारे में अधिक जानकारी पिछले अध्ययनों में पाया जा सकता है26।
    3. वोल्टेज के प्रति संवेदनशील और कैल्शियम संकेतक रंगों को एक साथ उत्तेजित करने के लिए 520 ± 5 एनएम की तरंगदैर्ध्य के साथ एक हरे एलईडी प्रकाश स्रोत का उपयोग करें।
      नोट: उत्तेजना प्रकाश स्रोत ऑप्टिकल मैपिंग प्रणाली के उत्तेजना फिल्टर घन से जुड़ा हुआ है और एपिमेट्रिक रोशनी के लिए 550 एनएम डिक्रोइक मिरर से परिलक्षित होता है। उत्सर्जित प्रकाश को 1x लेंस द्वारा एकत्र किया जाता है और 630 एनएम पर एक दूसरे डिक्रोइक मिरर द्वारा वोल्टेज और कैल्शियम घटकों में विभाजित किया जाता है, इससे पहले कि इसे क्रमशः 690 ± 50 एनएम और 590 ± 33 एनएम फिल्टर द्वारा फ़िल्टर किया जाता है, और दो कैमरों द्वारा रिकॉर्ड किया जाता है।

3. स्लाइसिंग प्रोटोकॉल

  1. ऊतक विच्छेदन और प्रयोग के लिए तैयार होने पर, जमे हुए और तरल कार्डियोप्लेजिया को मिलाकर बर्फ-ठंडे कार्डियोप्लेजिया का स्नान तैयार करें। दिल को टुकड़ा करने की क्रिया के लिए ऊतक संग्रह तक कार्डियोप्लेजिया स्नान में डूबे रखें(चित्रा 1A)।
  2. कंपन के धातु ऊतक धारकों के पीछे प्रीमेड एगर उठे जेल को गोंद करें।
  3. बाएं वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार की पहचान करें और ठंडे कार्डियोप्लेजिक समाधान में ऊतक के 1 सेमी3 क्यूब्स काटें। फिर, जल्दी से एंडोकार्डियल सतहों का सामना करना पड़ रहा है और सामयिक त्वचा चिपकने वाला(चित्रा 1B)का उपयोग कर agarose जेल के लिए उन्हें संलग्न के साथ धातु ऊतक धारकों पर ऊतक ब्लॉक माउंट।
    नोट: चयनित ऊतक क्षेत्र स्लाइस में छेद से बचने के लिए बड़ी रक्त वाहिकाओं से दूर होना चाहिए। सेक्शनिंग का विमान एंडोकार्डियल लेयर(चित्रा 1E)में फाइबर ओरिएंटेशन के समानांतर है और एलवी दीवार की गहरी परत में घूर्णन एनिसोट्रोपी के कारण सेक्शनिंग का विमान मामूली कोण पर हो सकता है। थ्रूपुट बढ़ाने के लिए, एक ही धारक पर दो ऊतक ब्लॉकों को साथ-साथ रखा जा सकता है।
  4. धातु धारकों को बर्फ-ठंडे ऑक्सीजनयुक्त टुकड़ा करने की क्रिया समाधान से भरे वाइब्रेकोम स्नान में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि ऊतक क्यूब्स पूरी तरह से जलमग्न हैं।
  5. ब्लेड को ऊतक के सामने के किनारे पर ले जाएं और पूर्व निर्धारित मापदंडों के साथ टुकड़ा करने की क्रिया शुरू करने के लिए वाइब्रेकोम चालू करें। पहले कई स्लाइस को तब तक छोड़ दें जब तक कि ब्लेड ट्राबेकुला से परे चिकनी एंडोकार्डियल ऊतक में न पहुंच जाए।
  6. एक बार प्रत्येक टुकड़ा कट जाने के बाद, स्लाइस को2आर टी में टायरोड के रिकवरी समाधान के स्नान में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। धीरे-धीरे प्रत्येक स्लाइस को व्यक्तिगत 100 माइक्रोन नायलॉन जाल सेल छेनरों में रखें और ऊतकों के स्लाइस को कर्लिंग(चित्रा 1C)से रखने के लिए मेशेड वाशर के साथ कवर करें। कम से कम 20 मिनट के लिए वसूली समाधान में स्लाइस रखें।
    नोट: स्लाइस को हानिकारक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रभावों के बिना 3−4 घंटे तक इन स्थितियों के तहत स्नान में रखा जा सकता है।

4. स्थिर परिस्थितियों में स्लाइस पुलिया

नोट: संदूषण की संभावना को कम करने के लिए, प्रत्येक हस्तांतरण चरण से पहले एक मनका स्टरलाइजर का उपयोग कर संदंश को स्टरलाइज करें।

  1. जब संस्कृति के लिए तैयार है, तो प्रत्येक स्लाइस को बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) से भरी 6 अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में सावधानी से स्थानांतरित करें। वसूली समाधान के स्लाइस कुल्ला करने के लिए अच्छी तरह से थाली रॉक।
    नोट: इस बिंदु से आगे, स्लाइस केवल एक BSL2 laminar प्रवाह संस्कृति हुड में उजागर किया जाना चाहिए, और बाँझ संदंश ऊतक को संभालने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  2. स्लाइस को ताजा पीबीएस के कुओं में स्थानांतरित करने के लिए अच्छी तरह से कुल्ला और संस्कृति के लिए स्लाइस बंध्याकरण । स्लाइस से वसूली समाधान को पूरी तरह से हटाने को सुनिश्चित करने के लिए इस वॉश स्टेप 3x को करें।
  3. स्लाइस को प्रीवार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) संस्कृति माध्यम (दवाओं के साथ या बिना, चित्रा 1D)के 3 एमएल से भरे 6 अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करें। 30% ओ 2 और 5%सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में20 आरपीएम पर एक कक्षीय शेखर पर प्लेटें रखें। हर 48 घंटे में संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट और प्रतिस्थापित करें।

5. कार्यात्मक लक्षण वर्णन-ऑप्टिकल मैपिंग

  1. ऑप्टिकल मैपिंग अध्ययन के लिए या तो तुरंत टुकड़ा करने की क्रिया के बाद या खेती के बाद, ध्यान से 37 डिग्री सेल्सियस पर परफ्यूजन प्रणाली के ऊतक स्नान करने के लिए ब्याज का टुकड़ा स्थानांतरित करने के साथ १००% O2 Tyrode वसूली समाधान में, और PDMS जेल परत के लिए चार कोनों नीचे पिन जबकि खिंचाव लागू (यानी, बस प्रवाह की स्थिति के तहत आसानी से चलती से टुकड़ा रखने के लिए पर्याप्त) । स्लाइस लगभग 10 मिनट के लिए परिसंचारी वसूली समाधान के साथ इस स्नान में आराम करने के लिए अनुमति दें ।
  2. रिकवरी समाधान वाले जलाशय में पतला ब्लेबिस्टिन का 0.3−0.5 एमएल जोड़ें। स्लाइस को लगभग 10 मिनट के लिए ब्लेबिस्टिन के साथ इनक्यूबेट करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर रिकवरी समाधान के 1 मिलील में स्टॉक वोल्टेज सेंसिटिव डाई आरएच237 के 30 माइक्रोन का पुनर्गठन करें। पंपों को बंद कर दें और धीरे-धीरे 30 एस की अवधि में स्लाइस की सतह पर 0.2−0.3 मिलियन का काम कर रहे डाई समाधान को लोड करें। स्लाइस को 90 एस तक की अवधि के लिए पंपों के साथ डाई में इनक्यूबेट करने की अनुमति दें, फिर पंपों को फिर से चालू करें ताकि किसी भी अतिरिक्त डाई को धोने की अनुमति दी जा सके।
    नोट: सभी टुकड़ा पर समान रूप से डाई लागू करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए । इसके अतिरिक्त, बहुत धीमी गति से डाई आवेदन टुकड़ा से दूर तैरने से डाई को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
  4. स्टॉक कैल्शियम इंडिकेटर रोड-2 AM का पुनर्गठन करने के लिए चरण 5.3 दोहराएं और इसे स्लाइस पर लोड करें।
  5. लेंस से स्लाइस की दूरी को समायोजित करके स्लाइस पर कैमरों को केंद्रित करें।
  6. एक द्विध्रुवी प्लेटिनम-इरिडियम पेसिंग इलेक्ट्रोड की स्थिति ऐसी है कि इसकी नोक स्लाइस के बीच के संपर्क में है और विद्युत प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए आवश्यक न्यूनतम पेसिंग सीमा निर्धारित करने के लिए आयाम बढ़ाने की पेसिंग उत्तेजनाएं लागू करें। पूर्व निर्धारित पेसिंग सीमा के आयाम 1.5x पर 2 एमएस पल्स चौड़ाई अवधि के साथ 1 हर्ट्ज पर स्लाइस को गति दें। टिश्यू स्लाइस के ऊपर एक कवरलिप रखें।
  7. 520 ± 5 एनएम एलईडी एक्सिटेशन प्रकाश स्रोत का उपयोग करके स्लाइस को रोशन करें। उत्सर्जित वोल्टेज और कैल्शियम के संकेतों को 1,000 फ्रेम/एस पर दो सीएमओएस कैमरों के साथ रिकॉर्ड करें।
  8. अच्छी सिग्नल गुणवत्ता और दबाई गई गति कलाकृतियों(चित्रा 1F) केलिए रिकॉर्डिंग की जांच करें। 0.1 एमएल के चरणों में जलाशय में अधिक ब्लेबिस्टिन जोड़ें जब तक कि गति अब ऑप्टिकल संकेतों में कलाकृतियों का उत्पादन न कर दे। सिग्नल की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, यदि आवश्यक हो तो अधिक डाई जोड़ें।
    नोट: अच्छा संकेत गुणवत्ता दर्ज ऑप्टिकल संकेतों में गुणात्मक रूप से मूल्यांकन बड़े संकेत आयाम और कम पृष्ठभूमि शोर को संदर्भित करता है।

6. लय के साथ डेटा प्रोसेसिंग 1.2

नोट: रिदम1.2 एक मैटलैब आधारित यूजर इंटरफेस है जिसका उपयोग एकल या डुअल कैमरा ऑप्टिकल मैपिंग सिस्टम(चित्रा 3)द्वारा प्राप्त ऑप्टिकल मैपिंग डेटा को प्रदर्शित करने, स्थिति और विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। इसका उपयोग इमेजिंग सिस्टम के साथ मिलकर किया जाता है।

  1. डेटा फ़ाइलें लोड करना
    1. स्क्रीन पर चार डिस्प्ले खिड़कियों में से किसी एक का चयन करके और चुनिंदा निर्देशिका और लोड बटन का उपयोग करके डेटा फ़ाइलों को लय1.2 में लोड करें।
    2. यह प्रोग्राम यूजर को ड्यूल वोल्टेज और कैल्शियम रिकॉर्डिंग के लिए कैमरा 1 या कैमरा 2 डेटा चुनने का संकेत देगा । वोल्टेज सिग्नल के लिए कैमरा 1 चुनें।
    3. आसन्न डिस्प्ले खिड़कियों में से एक में कैल्शियम सिग्नल (कैमरा 2) लोड करने की प्रक्रिया दोहराएं।
    4. दो डिस्प्ले विंडो को लिंक करने के लिए दो चयनित डिस्प्ले विंडो के बीच ड्यूल डेटा लिंकिंग चेकबॉक्स चुनें, क्योंकि स्लाइस पर दो डेटा सेट एक ही क्षेत्र से दर्ज किए जाते हैं।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, यदि देखने का एक ही क्षेत्र बनाए रखा जाता है, तो इस फ़ंक्शन का उपयोग दो छवियों को लिंक करने के लिए किया जा सकता है जो दवा की जांच की जा रही इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में समय-प्रतिक्रिया देखने के लिए अलग-अलग समय बिंदुओं पर प्राप्त किए गए थे। किसी भी एक डिस्प्ले विंडो पर डबल क्लिक करने से विश्लेषण में आसानी के लिए अनुमति देने के लिए एक विंडो को अधिकतम करने की अनुमति है।
  2. सिग्नल कंडीशनिंग
    1. डेटा विश्लेषण का चयन करें । आगे के विश्लेषण से पहले वोल्टेज और कैल्शियम ऑप्टिकल मैपिंग डेटा को कंडीशन करने के लिए स्थिति पैरामीटर।
    2. पिक्सल को हटाने के लिए"रिमूवल बैकग्राउंड"फ़ंक्शन का उपयोग करें जिसमें फ्लोरोसेंट तीव्रता सीमा (पृष्ठभूमि [बीजी] सीमा) और पिक्सेल क्लस्टरिंग (उत्तेजन [EX] सीमा) की डिग्री के आधार पर कोई संकेत नहीं है।
    3. सिग्नल की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए"बिन"फ़ंक्शन का उपयोग करके ऑप्टिकल मैपिंग डेटा का स्थानिक औसत करें।
    4. "फ़िल्टर" फ़ंक्शन के साथ बैंड पास फ़िल्टर का उपयोग करके ऑप्टिकल मैपिंग डेटाको फ़िल्टर करें।
    5. ऑप्टिकल मैपिंग सिग्नल में बेसलाइन बहाव को हटाने के लिए"बहाव"फ़ंक्शन का उपयोग करें।
    6. "सामान्य"फ़ंक्शन का उपयोग करके, प्रत्येक पिक्सेल से ऑप्टिकल मैपिंग डेटा को सामान्य करें ताकि 1 का अधिकतम आयाम हो।
    7. आगे के विश्लेषण के लिए कैल्शियम के निशान को उलटा करने के लिए"इनवर्स सिग्नल"फ़ंक्शन का उपयोग करें।
    8. डिस्प्ले विंडो में किसी भी स्थान से वातानुकूलित ट्रेस का चयन करने के लिए डिस्प्ले वेव पर क्लिक करें और इसे वेवरफॉर्म विंडो में प्लॉट करें। इष्टतम कार्रवाई क्षमता और कैल्शियम क्षणिक निशान प्राप्त करने के लिए सिग्नल कंडीशनिंग मापदंडों को समायोजित करें।
  3. चालन वेग (सीवी) गणना
    नोट: सक्रियण समय ऑप्टिकल सिग्नल (dF/dtअधिकतम)के अधिकतम व्युत्पन्न के समय के रूप में परिभाषित किया गया है ।
    1. डेटा विश्लेषण का चयन करें । सक्रियण मानचित्र और ट्रेस में एक ही कार्रवाई क्षमता को शामिल करने के लिए एक स्टार्ट टाइम और एंड टाइम दर्ज करें। चयनित क्षेत्र(चित्रा 1G)के सक्रियण मानचित्र को प्रदर्शित करने के लिए रुचि के क्षेत्र (आरओआई) की गणना करें और उसका चयन करें।
    2. डेटा विश्लेषण का चयन करें । सीवी मैप और इसी तरह, स्टार्ट टाइम और एंड टाइम चुनें। सेटअप के आधार पर इंटरपिक्सेल रिज़ॉल्यूशन मान दर्ज करें।
      नोट: 1x आवर्धन प्रणालियों के लिए, एक्स और वाई दिशा में इंटरपिक्सल रिज़ॉल्यूशन 0.1 मिमी है।
    3. उत्पन्न वीईसी दबाएँ। एक आरओआई का चयन करने और उस क्षेत्र के भीतर सीवी वैक्टर प्रदर्शित करने के लिए मानचित्र बटन। विश्लेषण में शामिल औसत, औसत, मानक विचलन और वैक्टर की संख्या के साथ-साथ चयनित क्षेत्र में सीवी वैक्टर के प्रचार के औसत कोण की गणना और सांख्यिकी अनुभाग में प्रदर्शित किया जाता है।
    4. प्रचार की दी गई दिशा के साथ एक लाइन खींचने के लिए ड्रा लाइन बटन पर क्लिक करें। उस दिशा में सभी सीवी वैक्टर का चयन किया जाएगा। स्टैटिस्टिक्स सेक्शन में प्रदर्शित होने वाले आंकड़ों की गणना करने के लिए केवल उन चयनित सीवी वैक्टर का उपयोग करने के लिए सीवी की गणना करें क्लिक करें।
  4. कार्रवाई संभावित अवधि (एपीडी) और कैल्शियम क्षणिक अवधि (सीएटीडी) गणना
    नोट: एपीडी कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का एक और मौलिक पैरामीटर है। एपीडी मानचित्र सक्रियण और प्रत्येक ऑप्टिकल कार्रवाई क्षमता के पुनर्ध्रुवीकरण के एक निर्दिष्ट प्रतिशत के बीच समय अंतर का निर्धारण करके उत्पन्न किया जा सकता है। एपीडी विषमता या एपीडी दीर्घीकरण और छोटा करने का उपयोग अतालता संवेदनशीलता की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है।
    1. RHYTHM1.2 में APD की गणना करने के लिए, डेटा विश्लेषण का चयन करें । एपीडी/सीएटी मैप।
    2. एक पूर्ण कार्रवाई क्षमता को शामिल करने के लिए प्रारंभ समय और अंत समय का चयन करें। किसी भी आउटलर्स (उदाहरण के लिए, क्रमशः 0 और 1,000 एमएस) को हटाने के लिए एपीडी/सीएटीडी का न्यूनतम और अधिकतम मूल्य निर्धारित करें। प्रतिशत पुनर्ध्रुवीकरण दर्ज करें जो एपीडी का निर्धारण करेगा, उदाहरण के लिए, एपीडी80/CaTD 80या 0.5 के लिए एपीडी 50 /CaTD 50 के लिए80 0.8।50
    3. एक आरओआई का चयन करने और एपीडी मानचित्र उत्पन्न करने के लिए क्षेत्रीय एपीडी कैल्क पर क्लिक करें। विश्लेषण में शामिल पिक्सल का मतलब, औसत, मानक विचलन और संख्या सांख्यिकी अनुभाग में प्रदर्शित की जाएगी।
  5. उठने का समय
    नोट: वृद्धि का समय एक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल पैरामीटर है जिसे वोल्टेज और कैल्शियम क्षणिक निशान के ऑप्टिकल संकेतों से मापा जा सकता है। यह एक अनुमान प्रदान करता है कि एक कार्य क्षमता को ट्रिगर करने के लिए डिपोलेराइजिंग आयन चैनलों के लिए कितना समय लगता है, या कैल्शियम को सरकोप्लाज्म रेटिकुलम से साइटोप्लाज्म में जारी होने में कितना समय लगता है। ऑप्टिकल वृद्धि का समय माइक्रोइलेक्ट्रोड्स द्वारा मापा गया वृद्धि समय का एक आदर्श विकल्प नहीं है और यह डीपोलराइजेशन में परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील नहीं हो सकता है, क्योंकि ऑप्टिकल एक्शन क्षमता कई कोशिकाओं की ट्रांसमेम्ब्रान क्षमता का औसत है। सिस्टम का स्थानिक और लौकिक संकल्प ऑप्टिकल वृद्धि समय मूल्यों को भी प्रभावित कर सकता है। हालांकि, इसका उपयोग अभी भी27के ध्रुवीकरण में बड़े बदलावों की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है।
    1. वृद्धि के समय को निर्धारित करने के लिए, डेटा विश्लेषण का चयन करें । उठो समय।
    2. एक एकल कार्रवाई क्षमता या कैल्शियम क्षणिक के अपस्ट्रोक का चयन करने के लिए स्टार्ट टाइम और एंड टाइम चुनें। स्टार्ट% और एंड% के मूल्यों को दर्ज करें (आमतौर पर गैर-शोर संकेतों के लिए 10-90% की सिफारिश की जाती है), जो उपयोगकर्ता को शोर संकेतों के मामले में शोर को शामिल किए बिना सिग्नल के सिर्फ भागों का चयन करने की अनुमति देता है।
    3. आरओआई का चयन करने और वृद्धि समय के विश्लेषण में शामिल पिक्सल के मतलब, औसत, मानक विचलन और संख्या निर्धारित करने के लिए गणना पर क्लिक करें।
  6. कैल्शियम क्षय
    नोट: कैल्शियम के निशान के लिए, कैल्शियम क्षणिक के क्षय का समय स्थिर निर्धारित किया जा सकता है। यह साइटोप्लाज्म से कैल्शियम आयनों को हटाने में परिवर्तनों के विश्लेषण के लिए एसआर में वापस अनुमति देता है।
    1. डेटा विश्लेषण का चयन करें । कैल्शियम क्षय और एक कैल्शियम क्षणिक संकेत के पूरे क्षय भाग को शामिल करने के लिए शुरू समय और अंत समय दर्ज करें।
    2. क्लिक करें आरओआई का चयन करने और कैल्शियम क्षय समय स्थिर के विश्लेषण में शामिल पिक्सल के मतलब, औसत, मानक विचलन और संख्या निर्धारित करने के लिए ताऊ की गणना करें।

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Representative Results

मानव ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल के अनुसार एक दाता मानव दिल के बाएं वेंट्रिकल से एकत्र किए गए थे और इसमें सचित्र थेअंक 1. इस तरह एक ड्यूल कैमरा ऑप्टिकल मैपिंग सिस्टमअंक 2स्लाइसिंग प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद वोल्टेज और कैल्शियम के एक साथ ऑप्टिकल मानचित्रण करने के लिए ईमानदार इमेजिंग विन्यास में उपयोग किया गया था। रिदम1.2 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था (अंक 3), एक खुला स्रोत ऑप्टिकल मानचित्रण डेटा विश्लेषण उपकरण पहले हमारी प्रयोगशाला द्वारा प्रकाशित और Github (https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2) पर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है । मापा गया इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल पैरामीटर में सचित्र हैंअंक 4. कार्रवाई की क्षमता और कैल्शियम क्षणिक निशान संकेत वातानुकूलित थे और प्रतिनिधि निशान आगे के विश्लेषण में इस्तेमाल किया में सचित्र हैचित्रा 4A. सक्रियण समय प्रत्येक पिक्सेल के लिए निर्धारित किया गया था और वोल्टेज और कैल्शियम निशान से निर्धारित सक्रियण समय के आइसोक्रोनल नक्शे में सचित्र हैंचित्रा 4B,सी. ध्यान दें कि कैल्शियम आइसोक्रोन में सक्रियण वोल्टेज के पीछे है जैसा कि उम्मीद थी। सीवी वैक्टर में साजिश रचीचित्रा 4Dसक्रियण समय और ज्ञात इंटरपिक्सेल संकल्प का उपयोग करके गणना की गई थी। ट्रांसवर्स दिशा में औसत सीवी इस टुकड़े में २१.२ सेमी/एस होना निर्धारित किया गया था । यह सीवी मूल्य पहले से सूचित वेंट्रिकुलर ट्रांसवर्स सीवी के बराबर है जो पूरे मानव दिलों से मापा गया है (24 ± 4 और 28 ± 7 सेमी/28. कैल्शियम क्षणिक क्षय स्थिर कैल्शियम निशान के खस्ताहाल हिस्से के लिए एक पॉलीनोमियल फिटिंग द्वारा मापा गया था और औसत क्षय स्थिर इस टुकड़ा में १०५.३ एमएस होना निर्धारित किया गया था (में नक्शाचित्रा 4E). इसके बाद, एपीडी और सीएटीडी को सक्रियण समय और पुनर्ध्रुवीकरण/कैल्शियम हटाने के एक निर्दिष्ट प्रतिशत के बीच समय अवधि के रूप में मापा गया था। औसत एपीडी80और सीएटीडी80क्रमशः 343.1 एमएस और 442.6 एमएस होने की ठान ली थी (चित्रा 4F,जी). वीवो मानव अध्ययन में पिछले सक्रियण-वसूली अंतराल (एआरआई) को एपीडी के लिए किराए के रूप में 1 हर्ट्ज पर स्थिर राज्य पेसिंग के दौरान वीवो मानव हृदयों में से दर्ज एकध्रुवीय इलेक्ट्रोग्राम से मापा जाता है। इन अध्ययनों में एआरआई मान 250-450 एमएस से लेकर29,30. मानव हृदय स्लाइस से APD मूल्यों यहां रिपोर्ट पिछले अरी मूल्यों के बराबर हैं । गति कलाकृतियों वाले क्षेत्रों को एपीडी और सीएटीडी गणनाओं से हटा दिया गया था। अंत में, वोल्टेज और कैल्शियम के निशान के उदय समय (यानी, अपस्ट्रोक की अवधि) को मापा और मैप किया गया। ये दिखाए गए हैंचित्रा 4Hऔरअंक 4Iक्रमशः. औसत मूल्य क्रमशः १०.२ एमएस और १३.३ एमएस होने की ठान ली गई । पेसिंग के बिंदु के दाईं ओर नक्शों में कलाकृतियों को देखने के क्षेत्र के भीतर पेसिंग तार के कारण कर रहे हैं । अंत में, तीव्र दवा परीक्षण में इस स्लाइस मॉडल के उपयोग का प्रदर्शन किया गया था जब स्लाइस डॉक्सोरुबिसिन (DOX), एक कीमोथैरेप्टिक एजेंट के साथ 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे कार्डियोटॉक्सिक प्रभाव के लिए जाना जाता है । 50 माइक्रोन डॉक्स के साथ स्लाइस के उपचार के परिणामस्वरूप 19.4 ± 3.4 सेमी/s से 9.6 ± 3.2 सेमी/एस तक ट्रांसवर्स चालन वेग की कमी हुई, जैसा कि सक्रियण मानचित्रों द्वारा दर्शाया गया है।चित्रा 5A, सीवी वेक्टर नक्शे मेंचित्रा 5B, और सारांश डेटा मेंचित्रा 5C. DOX समूह में छोटे नमूना आकार DOX उपचार के बाद अकांक्षा स्लाइस की एक उच्च संख्या के कारण था । DOX-इलाज स्लाइस में गति कलाकृतियों में वृद्धि सटीक APD मूल्यों की गणना को रोका । एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर जिसे दोहरी वोल्टेज और कैल्शियम इमेजिंग द्वारा मापा जा सकता है, वी हैएम-Ca देरी, ऊतक में मजबूत उत्तेजना-संकुचन युग्मन निर्धारित करने के लिए31. इस पैरामीटर की देरी या नकारात्मक मूल्य हानिकारक हो सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: मानव हृदय ऑर्गेनोटीपिक स्लाइस तैयारी। (क)मानव हृदयों को पुनः प्राप्त होने पर बर्फ से ठंडे कार्डियोप्लेजिक बाथ (कार्डियोप्लेजिया समाधान और कार्डियोप्लेजिया आइस का मिश्रण) में संग्रहित किया गया था । (ख)बाएं वेंट्रिकुलर ऊतक के 1 सेमी3 क्यूब्स को काटकर एक धातु ऊतक धारक पर रखा गया था जिसमें धारक की पिछली दीवार से चिपके 4% एगर उठे हुए जेल थे और ऑक्सीजनयुक्त टुकड़ा करने की क्रिया समाधान के बर्फ-ठंडे स्नान में स्थानांतरित कर दिए गए थे। (ग)एक बार कटौती के बाद, स्लाइस को अलग-अलग 100 माइक्रोन नायलॉन जाल सेल छलनी में आरटी में ऑक्सीजनयुक्त वसूली समाधान में स्थानांतरित कर दिया गया था। मेशेड वाशर ने स्लाइस को कर्लिंग से रखने के लिए ऊतकों को कवर किया । (घ)दीर्घकालिक संस्कृति के लिए, स्लाइस पीबीएस में धोया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक माध्यम के 3 एमएल के साथ 6 अच्छी तरह से प्लेटों में सुसंस्कृत । (ई)मेसन का ट्राइक्रोम दाग टुकड़ा अनुभाग जिसमें फाइबर ओरिएंटेशन दिखाया गया है। (च)प्रतिनिधि ऑप्टिकल एक्शन क्षमता एक स्लाइस से दर्ज की गई । (जी)केंद्र (नीला) में पुस्तक एक टुकड़ा के प्रतिनिधि सक्रियण नक्शा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ड्यूल कैमरा ऑप्टिकल मैपिंग सिस्टम। सीधा इमेजिंग कॉन्फ़िगरेशन में ड्यूल कैमरा ऑप्टिकल मैपिंग सिस्टम। सिस्टम भागों में शामिल हैं: 1) दोहरी मानचित्रण के लिए मास्टर और गुलाम कैमरे; 2) पीडीएमएस जेल के साथ ऊतक स्नान; 3) क्यूब्स को फ़िल्टर करें जो उत्तेजन और उत्सर्जन फिल्टर और डिक्रोइक दर्पण को घर करते हैं; 4) लेंस धारकों और लेंस; और 5) उत्तेजन प्रकाश स्रोत (520 एनएम ग्रीन एलईडी)। क्रमशः RH237 और रोड-2-एएम का उपयोग करके वीएम और कैल्शियम की दोहरी ऑप्टिकल मैपिंग के लिए सही विवरण फिल्टर और डिक्रोइक मिरर संयोजनों पर इनसेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एकल पैरामीटर और मल्टीपैमीटर विश्लेषण के लिए ओपन सोर्स ऑप्टिकल मैपिंग डेटा विश्लेषण उपकरण का लय1.2 ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई)। डेटा फ़ाइल लोडिंग विकल्प और फ़ाइल सूची लाल बॉक्स में प्रदर्शित कर रहे हैं। डेटा विश्लेषण विकल्प हरे रंग में इंगित डेटा विश्लेषण ड्रॉपडाउन मेनू में सूचीबद्ध हैं। डेटा मैप्स प्रदर्शित करने के लिए डिस्प्ले विंडो गहरे नीले रंग में इंगित की जाती हैं। दोहरी कैमरा डेटा के एक साथ विश्लेषण के लिए दोहरी मानचित्रण डेटा फ़ाइलों को जोड़ने के लिए चेकबॉक्स बैंगनी में इंगित किए गए हैं। कार्रवाई क्षमता और कैल्शियम क्षणिक निशान साजिश करने के लिए तरंग खिड़की पीले रंग में प्रदर्शित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता और कैल्शियम एक मानव ऑर्गेनोटिक कार्डियक स्लाइस तैयारी से मानचित्रण यात्रियों। (A)प्रतिनिधि ऑप्टिकल एक्शन पोटेंशियल (काला) और कैल्शियम क्षणिक (बरगंडी)। ((B,C) क्रमशः वीएम और कैल्शियम रिकॉर्डिंग से प्राप्त सक्रियण नक्शे। (घ)चालन वेग (सीवी) वेक्टर नक्शा। (ई)कैल्शियम क्षणिक क्षय स्थिर (ताऊ) नक्शा। (एफ,जी) कार्रवाई संभावित अवधि (एपीडी80)और कैल्शियम क्षणिक अवधि (सीएटीडी80)मानचित्र क्रमशः। (एच,मैं) क्रमशः कार्रवाई क्षमता और कैल्शियम क्षणिक के अपस्ट्रोक के वृद्धि समय के नक्शे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: डॉक्सोरुबिकिन उपचार ट्रांसवर्स चालन वेग को धीमा कर देता है। (A)स्लाइस से सक्रियण नक्शे (नियंत्रण) के बिना 24 घंटे के लिए और ५० μM (DOX) पर doxorubicin के साथ सुसंस्कृत । (ख)नियंत्रण और DOX स्लाइस से चालन वेग वेक्टर नक्शे । (ग)नियंत्रण और DOX-इलाज स्लाइस से गणना औसत ट्रांसवर्स चालन वेग । * पी एंड एलटी; 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां, हम कार्डियोप्लेग्ली रूप से गिरफ्तार मानव हृदयों से व्यवहार्य हृदय स्लाइस प्राप्त करने और ट्रांसमेम्ब्रान क्षमता और इंट्रासेलुलर कैल्शियम के दोहरे ऑप्टिकल मानचित्रण का उपयोग करके स्लाइस को कार्यात्मक रूप से चित्रित करने के लिए कदम-दर-कदम तरीके प्रस्तुत करते हैं। संरक्षित बाह्य पर्यावरण और देशी सेल-सेल युग्मन के साथ, मानव हृदय स्लाइस का उपयोग मौलिक वैज्ञानिक खोज के लिए मानव हृदय के सटीक मॉडल के रूप में और औषधीय एजेंटों और जीन चिकित्सा के प्रभावकारिता और कार्डियोटॉक्सीसिटी परीक्षण के लिए किया जा सकता है। यह तकनीक दिल के विशिष्ट क्षेत्रों के संरचनात्मक-कार्यात्मक मानचित्रण की भी अनुमति देती है, जैसे कि सिनोट्रायल नोड, एट्रिओवेंट्रिकुलर नोड और पुरकिंजे फाइबर। यहां वर्णित प्रोटोकॉल हृदय टुकड़ा पीढ़ी, इमेजिंग, और विश्लेषण है कि अल्पकालिक अध्ययन के लिए सबसे अच्छा कर रहे है के लिए बुनियादी कदम सूचीबद्ध करता है । ऊतक स्लाइस की स्थिर संस्कृति को लंबे समय तक हृदय ऊतक में परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है, इसलिए दीर्घकालिक अध्ययनों के लिए, हम पाठक को अधिक शारीरिक संस्कृति स्थितियों को शामिल करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं, जैसे कि इलेक्ट्रोमैकेनिकल उत्तेजना12,13,,14।,

ऊतक स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए कई चरणों के लिए देखभाल की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, हृदय संचयन और ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया के बीच के समय को कम किया जाना चाहिए। जैसा कि पहले21दिखाया गया है, कार्डियोप्लेजिक गिरफ्तारी की विस्तारित लंबाई बदल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का कारण बन सकती है। इसके अलावा, एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स और सेल-सेल कपलिंग की अखंडता को बनाए रखने के लिए स्लाइस संग्रह, संस्कृति और कार्यात्मक अध्ययनों के दौरान स्लाइस की अत्यधिक हैंडलिंग और स्ट्रेचिंग से बचा जाना चाहिए। स्लाइस के अत्यधिक खींच चालन ब्लॉकों में परिणाम सकता है । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी समाधानों को 7.4 के पीएच पर रखा जाना चाहिए। यहां वर्णित टायरोड का समाधान 100% ओ2का उपयोग करके उचित पीएच बनाए रखने के लिए एचईपीई का उपयोग करता है। सोडियम बाइकार्बोनेट के बजाय पीएच को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस समाधान ९५% O2 और 5% सीओ2के साथ बुलबुला किया जाना चाहिए । अंत में, परिवहन और दिल की टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान, एक यह सुनिश्चित करना चाहिए कि कार्डियोप्लेजिया और टुकड़ा करने की क्रिया समाधान के रूप में ऊतक व्यवहार्यता की रक्षा के लिए संभव के रूप में ठंड के तापमान के करीब रखा जाता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

NIH द्वारा धन (अनुदान R21 EB023106, R44 HL139248, और R01 HL126802), Leducq फाउंडेशन (परियोजना ताल) और एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (19POST34370122) द्वारा कृतज्ञता से स्वीकार कर रहे हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1mL BD Syringe Thomas Scientific 309597
2,3-butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
6 well culture plates Corning 3516
Biosafety cabinet ThermoFisher Scientific 1377
Blebbistatin Cayman 13186
Bubble Trap Radnoti 130149
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Corning Cell Strainers Fisher Scientific 07-201-432
Di-4-ANEPPS Biotium stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Dumont #3c Forceps Fine Science Tools 11231-20
Emission dichroic mirror Chroma T630LPXR-UF1
Emission filter (RH237) Chroma ET690/50m
Emission Filter (Rhod2AM) Chroma ET590/33m
Excitation dichroic mirror Chroma T550LPXR-UF1
Excitation Filter Chroma ET500/40x
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Heat exchanger Radnoti 158821
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Incubator ThermoFisher Scientific 50145502
Insulin Transferrin Selenium (ITS) Sigma-Aldrich I3146
LED excitation light source Prizmatix UHP-Mic-LED-520
Magnessium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M9272
Medium 199 ThermoFisher Scientific 11150059
Micam Ultima L type CMOS camera Scimedia N/A
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-10
Pennicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic Pump Cole Parmer EW-07522-20
Platinum pacing wire Alfa Aesar 43275
Pluronic F127 ThermoFisher Scientific P6867 nonionic, surfactant polyol
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911
Powerlab data acquisition and stimulator AD Instruments Powerlab 4/26
RH237 Biotium 61018
Rhod2AM ThermoFisher Scientific R1245MP
Rhod-2AM Invitrogen, Carlsbad, CA
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
Sterilizer, dry bead Sigma-Aldrich Z378550
Stone Oxygen Diffuser Waterwood B00O0NUVM0
TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive gobiomed AESCULAP
UltraPure Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520100
Ultrasound sonicator Branson 1800
Vibratome Campden Instruments 7000 smz

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References

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मानव ऑर्गेनोटिपिक कार्डियक स्लाइस के ड्यूल वोल्टेज और कैल्शियम ऑप्टिकल मैपिंग द्वारा प्रीक्लिनिकल कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मूल्यांकन
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George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices. J. Vis. Exp. (160), e60781, doi:10.3791/60781 (2020).

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