Summary
Questo protocollo descrive la procedura per sezionare e coltivare fette cardiache umane per test preclinici sui farmaci e descrive in dettaglio l'uso della mappatura ottica per la registrazione simultanea della tensione transmembrana e dei segnali di calcio intracellulare da queste fette.
Abstract
I preparati per fetta cardiaca umana sono stati recentemente sviluppati come piattaforma per gli studi di fisiologia umana e i test terapeutici per colmare il divario tra gli studi sugli animali e quelli clinici. Numerosi modelli animali e cellulari sono stati utilizzati per esaminare gli effetti dei farmaci, ma queste risposte spesso differiscono negli esseri umani. Le fette cardiache umane offrono un vantaggio per i test antidroga in quanto sono direttamente derivate da cuori umani vitali. Oltre ad aver conservato strutture multicellulari, accoppiamento cellulare e ambienti a matrice extracellulare, le fette di tessuto cardiaco umano possono essere utilizzate per testare direttamente l'effetto di innumerevoli farmaci sulla fisiologia cardiaca umana adulta. Ciò che distingue questo modello da altre preparazioni cardiache, come cuori interi o cunei, è che le fette possono essere sottoposte a una cultura a lungo termine. Come tale, fette cardiache consentono di studiare gli effetti acuti e cronici dei farmaci. Inoltre, la capacità di raccogliere diverse centinaia o mille fette da un solo cuore rende questo un modello ad alto throughput per testare diversi farmaci a concentrazioni diverse e combinazioni con altri farmaci allo stesso tempo. Le fette possono essere preparate da qualsiasi regione del cuore. In questo protocollo, descriviamo la preparazione di fette ventricolari a sinistra isolando i cubi di tessuto dalla parete libera ventricolare sinistra e sezionandoli a fette utilizzando un microtoma vibrante di alta precisione. Queste fette possono quindi essere sottoposte a esperimenti acuti per misurare la funzione elettrofisiologica cardiaca di base o coltivate per studi sui farmaci cronici. Questo protocollo descrive anche la doppia mappatura ottica delle fette cardiache per registrazioni simultanee di potenziali transmembrani e dinamiche intracellulari del calcio per determinare gli effetti dei farmaci studiati.
Introduction
I modelli animali sono stati un valido strumento utilizzato per comprendere i meccanismi alla base della fisiologia e della fisiopatologia umana, nonché una piattaforma per la sperimentazione preliminare delle terapie per il trattamento di varie malattie1. Sono stati compiuti grandi passi avanti nel campo della ricerca biomedica basata su questi studi sugli animali2. Tuttavia, esistono differenze significative tra le specie tra le fisiologie umane e animali, tra cui topi, ratti, porcellini d'India, conigli, pecore, maiali e cani3,4. Di conseguenza, ci sono state numerose terapie farmacologiche, geniche e cellulari che hanno mostrato promessa durante la fase di sperimentazione animale, ma non sono riuscite a vivere fino ai risultati negli studi clinici5. Per colmare questa lacuna, sono stati sviluppati come modelli per colmare la risposta della fisiologia umana a vari farmaci e malattie a vari farmaci e malattieindottedall'uomo. I cardiomiociti derivati dalle cellule staminali sono stati ampiamente utilizzati nei sistemi organo-su-chip come surrogato del cuore6,7,8. Tuttavia, l'utilità dei cardiomiociti derivati da iPSC (iPSC-CMs) è ostacolata dal loro fenotipo relativamente immaturo e dalla mancanza di rappresentazione della sottopopolazione cardiomiocita; il miocardio maturo è una struttura complessa composta da diversi tipi di cellule coesistenti come fibroblasti, neuroni, macrofagi e cellule endoteliche. D'altra parte, i cardiomiociti umani isolati sono elettricamente maturi, e diverse sottopopolazioni cardiomiociti possono essere ottenute alterando i parametri di coltura9. Tuttavia, questi miociti mostrano generalmente un'azione alterata potenziali morfologie a causa della mancanza di accoppiamento cellulare, rapida de-differenziazione, e la comparsa di comportamento proaritmico in vitro10,11. Alcune delle limitazioni sono state affrontate da modelli di coltura cellulare 3D di iPSC-CMs e miociti cardiaci. Questi modelli, che includono sferoidi, scaffold idrogel incapsulati colture 3D, tessuti cardiaci ingegnerizzati (EIT) e sistemi cuore su un chip, utilizzano più popolazioni di cellule cardiache come cardiomiociti, fibroblasti e cellule endoteliali. Si auto-assemblano o assemblano lungo un ponteggio per formare strutture 3D, e alcuni riproducono anche la complessa natura anisotropica del miocardio. Questi modelli sono stati segnalati per avere cellule di fenotipi maturi, proprietà contrattuali, e profili molecolari simili al tessuto cardiaco. Il sistema heart-on-a-chip consente anche lo studio degli effetti sistemici nei modelli di droga e malattia. Tuttavia, i modelli a base di cellule in vitro non hanno la matrice extracellulare nativa e quindi non sono in grado di imitare con precisione l'elettrofisiologia a livello di organo. Le fette cardiache umane, al contrario, hanno una matrice extracellulare intatta e contatti autocellulari a cellule, il che li rende utili per esaminare con maggiore precisione le proprietà aritmogene del miocardio umano.
I ricercatori hanno sviluppato fette di organotipiche cardiache umane come piattaforma preclinica fisiologica per test sui farmaci acuti e cronici e per studiare l'elettrofisiologia cardiaca e la progressione delle malattie cardiache12,13,14,15,16,17,18,19. Rispetto ai cardiomiociti derivati da iPSC, le fette cardiache umane replicano più fedelmente l'elettrofisiologia cardiaca umana adulta con un fenotipo cardiomiocito maturo. Rispetto ai cardiomiociti umani isolati, le fette cardiache presentano durate potenziali di azione fisiologica a causa dell'accoppiamento cellula-cellula ben conservato e dell'esistenza intrinseca dei loro ambienti nativi intra ed extracellulari.
Questo protocollo descrive il processo di generazione di fette cardiache umane da cuori interi donatori, eseguendo studi acuti (cioè di ore) e cronici (cioè giorni lunghi) per testare i parametri di elettrofisiologia cardiaca tramite mappatura ottica. Mentre questo protocollo descrive solo l'uso del tessuto ventricolare sinistro (LV), è stato applicato con successo ad altre regioni del cuore così come altre specie come topi, ratti, porcellini d'India e maiali14,20,2121,22. Il nostro laboratorio utilizza interi cuori donatrici che sono stati respinti per il trapianto negli ultimi 5 anni, ma è possibile che queste stesse procedure vengano eseguite su qualsiasi tessuti campione di cuore donatore ottenuti con mezzi alternativi (ad esempio, impianti di assistenza ventricolare sinistra [LVAD], biopsie, miectomie) purché i tessuti abbiano la capacità di essere sezionati in cubi. La mappatura ottica viene utilizzata per l'analisi in questo studio a causa della sua capacità di mappare simultaneamente potenziali di azione ottica e transitori di calcio con alta risoluzione spaziale (100 x 100 pixel) e temporale (>1,000 fotogrammi/s). È anche possibile utilizzare metodi alternativi, come gli array multielettrodi (MEA) o i microelettrodi, ma queste tecniche sono limitate dalle loro risoluzioni spaziali relativamente basse. Inoltre, i MEA sono stati progettati per l'uso con le colture cellulari e i microelettrodi taglienti sono più facilmente gestiti per l'uso con cuori interi o grandi cunei di tessuto.
L'obiettivo dell'articolo è quello di consentire a più ricercatori di utilizzare tessuti cardiaci umani per studi di elettrofisiologia cardiaca. Va notato che la tecnologia descritta in questo articolo è relativamente semplice e vantaggiosa per gli studi a breve termine (nell'ordine di diverse ore a giorni). Più fisiologica cultura biomimetica per studi a lungo termine (nell'ordine di settimane) è stato discusso e descritto da una serie di altri studi12,18,23. Stimolazione elettrica, carico meccanico e stretching dei tessuti sono meccanismi di condizionamento vantaggiosi che possono aiutare a limitare l'insorgenza del rimodellamento del tessuto in vitro12,18,23.
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Protocol
Tutti i metodi descritti sono stati eseguiti nel rispetto di tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. La ricerca è stata approvata dall'Institution Review Board (IRB) della George Washington University.
NOTA: I cuori umani dei donatori sono stati acquisiti dalla Washington Regional Transplant Community come tessuto scartato deidentificato con l'approvazione della George Washington University IRB. I cuori espulsi vengono arrestati cardioplericamente sciaccando il cuore con una soluzione di cardioplegia ghiacciata (il sangue è stato ripulito dal cuore in questo processo) e trasferiti in laboratorio in condizioni standard di trapianto di organo.
1. Preparazione delle soluzioni
- Per ogni cuore, fare 4 L di soluzione cardioplegica (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 1,2 mM CaCl2; pH - 7.4). Conservare 3 L a 4 gradi centigradi e il rimanente 1 L a -20 gradi centigradi.
NOTA: questa soluzione può essere effettuata con diversi giorni di anticipo. - Prepara da appena 1 L ciascuna delle soluzioni di slicing di Tyrode (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM di glucosio, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-butanedione monoxime [BDM]; pH 7.4) e soluzione di recupero di Tyrode (140 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM di glucosio, 10 m HEPES, 10 mM BDM;
NOTA: Entrambe le soluzioni di affettatura e recupero devono essere effettuate il giorno dell'esperimento e possono essere conservate a 4 gradi centigradi. - Preparare le soluzioni stock dei coloranti fluorescenti. Ricostituire il colorante sensibile alla tensione RH237 a 1,25 mg/mL in solissione dimetilo (DMSO) e conservarlo in 30 aliquote lismicate a 4 gradi centigradi. Ricostituire l'indicatore di calcio Rhod-2AM a 1 mg/mL in DMSO. Conservare in 30 aliquote l.C. a -20 gradi centigradi.
NOTA: Di-4-ANEPPS (soluzione stock a 1,25 mg/mL in DMSO) può essere utilizzato negli esperimenti per l'imaging a singola fotocamera del singolo potenziale della transmembrana.- Prima dell'inizio dell'esperimento, sonicare i coloranti utilizzando un sonicatore ad ultrasuoni per almeno 10 min e diluire ogni aliquota di coloranti fluorescenti in 1 mL della soluzione di recupero. Aggiungere Pluronic F-127 (Table of Materials) a Rhod-2AM con un rapporto 1:1 prima della diluizione nella soluzione di recupero.
- Preparare una soluzione di riserva della blebbistatin di disaccoppiamento a contrazione eccitazione a 2 soluzione mg/mL in DMSO. Conservare in aliquote a -20 gradi centigradi. Durante gli esperimenti di mappatura ottica, diluire la soluzione di riserva di blebbistatin a una concentrazione di lavoro di 5-10 M nella soluzione di recupero di Tyrode.
- Rendere medio di coltura fresca completando medio 199 con 2% penicillina-streptomycin, 1x insulino-trasferiscitrice-selenio (ITS) integratore di media liquidi, e 10 mM BDM. Filtrare il mezzo utilizzando un filtro sterile da 0,2 m.
NOTA: Per gli studi di perturbazione farmacologica, i farmaci possono essere aggiunti direttamente al mezzo di coltura. Il mezzo di coltura può essere immagazzinato a 37 gradi centigradi. - Fare un 4% gel di agarose per il montaggio dei tessuti sciogliendo il punto di fusione a bassa fusione in acqua distillata e riscaldando la miscela in un forno a microonde fino a completa dissoluzione. Curare l'agarose in un piatto Petri con uno spessore di 5 mm e conservare a 4 gradi centigradi.
2. Configurazione dell'attrezzatura
- Impostazione vibrante del microtoma
- Calibrare il microtoma vibrante prima di ogni esperimento.
- Utilizzando un microtoma vibrante di alta precisione (Tabella dei materiali),caricare una lama di taglio in ceramica nel supporto e collegare il dispositivo di calibrazione fornito con il microtoma vibrante. Scegliere l'opzione di regolazione della lama dal menu e selezionare ceramica per il tipo di lama.
- Selezionare l'opzione vibrazione, verificare il valore dell'asse . Se questo valore è <1 m, uscire dal menu di calibrazione. In caso contrario, regolare finemente la vite di calibrazione attaccata alla parte superiore della testa vibrante e selezionare l'opzione vibrazione. Ripetere il numero di volte necessario per impostare l'asse z su <1 m.
- Impostare le impostazioni del vibratome su 400 m spessore di taglio, 0,02 mm/ s velocità di avanzamento per il tessuto atriale e 0,04 mm/ velocità di avanzamento per il tessuto ventricolare, 2 mm di ampiezza di vibrazione orizzontale e frequenza di vibrazione 80 Hz.
NOTA: Mentre lo spessore raccomandato è di 400 m per compensare i danni alle cellule sulle superfici tagliate della fetta, è possibile preparare anche le fette più sottili. Dato che il limite di diffusione dell'ossigeno è di circa 150 m, le fette intorno ai 300 m sono spesso utilizzate14,17,18,24. - Riempire il bagno del microtoma vibrante con soluzione di affettatura a 4 gradi centigradi e mantenere la temperatura circondando l'esterno del bagno con ghiaccio, ricostificando se necessario per tutto il protocollo di affettatura. Ossigenare continuamente la soluzione di affettatura nella vasca da gorgogliare con ossigeno al 100% durante il taglio.
- Impostare un secondo piatto con ben 100 sgherne di cellule di nylon e lavatrici a maglie necessarie (un colino cellulare per fetta). Riempire questo piatto con soluzione di recupero e ossigenarlo spumando con ossigeno al 100% a temperatura ambiente (RT).
NOTA: questa soluzione viene mantenuta in RT durante l'esperimento.
- Calibrare il microtoma vibrante prima di ogni esperimento.
- Configurazione della mappatura ottica
NOTA: Una descrizione più dettagliata del sistema di mappatura ottica è fornita nelle pubblicazioni precedenti16,25,26.- Attaccare un bagno di tessuto con strato di gel polidimetiloxane (PDMS) nella parte inferiore (per fissare le fette) a un sistema di perfusione. Circola 1 L della soluzione di recupero a 37 gradi centigradi e ossigena con ossigeno al 100%, attraverso il sistema di perfusione ad una portata abbastanza veloce da mantenere la temperatura e l'accumulo chiaro di vasca perfusate.
- Regolare la messa a fuoco e l'allineamento delle due telecamere CMOS (Tabella dei materiali) utilizzando un obiettivo.
NOTA: Ulteriori dettagli sull'allineamento possono essere trovati negli studi precedenti26. - Utilizzare una sorgente luminosa a LED verde con una lunghezza d'onda di 520 x 5 nm per eccitare contemporaneamente i coloranti sensibili alla tensione e all'indicatore di calcio.
NOTA: La sorgente di luce di eccitazione è collegata al cubo del filtro di eccitazione del sistema di mappatura ottica e viene riflessa da uno specchio dicroico da 550 nm per l'illuminazione epicentrica. La luce emessa viene raccolta da un obiettivo 1x e divisa da un secondo specchio dicromatico a 630 nm in componenti di tensione e calcio prima di essere filtrata rispettivamente da filtri da 690 e 590 nm e registrata dalle due telecamere.
3. Protocollo di sezionamento
- Quando sei pronto per la dissezione e la sperimentazione dei tessuti, prepara un bagno di cardioplegia ghiacciata mescolando cardioplegia congelata e liquida. Mantenere il cuore immerso nel bagno cardioplegia fino alla raccolta dei tessuti per affettare (Figura 1A).
- Incollare il gel di agarose prefatto sul retro dei supporti di tessuto metallico del vibratoma.
- Identificare la parete libera ventricolare sinistra e tagliare 1 cm3 cubetti di tessuto in soluzione cardioplegica fredda. Quindi, montare rapidamente i blocchi di tessuto sui supporti di tessuto metallico con le superfici endocardiali rivolte verso l'alto e attaccarli al gel di agarose utilizzando l'adesivo topico della pelle (Figura 1B).
NOTA: La regione del tessuto selezionata deve essere lontana dai grandi vasi sanguigni per evitare fori nelle fette. Il piano di sezionamento è approssimativamente parallelo all'orientamento della fibra nello strato endocardico (Figura 1E) e il piano di sezionamento potrebbe essere ad una leggera angolazione a causa dell'anisotropia rotazionale in uno strato più profondo della parete LV. Per aumentare la produttività, fino a due blocchi di tessuto possono essere montati fianco a fianco sullo stesso supporto. - Trasferire i supporti metallici nel bagno vibratoma riempito con la soluzione di affettare ossigenata ghiacciata. Assicurarsi che i cubi di tessuto siano completamente sommersi.
- Spostare la lama sul bordo anteriore del tessuto e attivare il vibratoma per iniziare a affettare con i parametri preimpostati. Scartare le prime diverse fette fino a quando la lama raggiunge oltre le trabeculae nel tessuto endocardico liscio.
- Una volta tagliata ogni fetta, trasferire con attenzione la fetta a un bagno ossigenato (100% O2) della soluzione di recupero di Tyrode a RT. Posizionare delicatamente ogni fetta in singoli colino a rete di nylon da 100 m e coprire con vele a rete per evitare che le fette di tessuto si arricciano (Figura 1C). Conservare le sezioni nella soluzione di recupero per almeno 20 min.
NOTA: Le fette possono essere conservate nella vasca da bagno in queste condizioni per un massimo di 3/4 h senza effetti elettrofisiologici dannosi.
4. Affettare la coltura in condizioni statiche
NOTA: Per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione, sterilizzare le pinze utilizzando uno sterilizzatore di perline prima di ogni passaggio di trasferimento.
- Quando si è pronti alla coltura, trasferire con attenzione ogni fetta ai singoli pozzi di un 6 ben piastra riempito con salina sterile (PBS) con buffer di fosfato. Cullare delicatamente la piastra del pozzo per sciacquare le fette di soluzione di recupero.
NOTA: Da questo punto in avanti, le fette devono essere esposte solo in una cappa di coltura del flusso laminare BSL2 e le pinze sterili devono essere utilizzate per gestire il tessuto. - Trasferire le fette in pozze di PBS fresco per sciacquare e sterilizzare accuratamente le fette per la coltura. Eseguire questo passaggio di lavaggio 3x per garantire la rimozione completa della soluzione di recupero dalle fette.
- Trasferire le fette a singoli pozze di un 6 pozzetto riempito con 3 mL di preriscaldato (37 gradi centigradi) mezzo di coltura (con o senza droghe, Figura 1D). Posizionare le piastre su uno shaker orbitale a 20 giri in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi con il 30% O2 e 5% di CO2. Aspirati e sostituisci il mezzo di coltura ogni 48 h.
5. Caratterizzazione funzionale: mappatura ottica
- Per gli studi di mappatura ottica immediatamente dopo la milazione o dopo la coltura, trasferire con attenzione la fetta di interesse al bagno di tessuto del sistema di perfusione a 37 gradi centigradi con 100% O2 nella soluzione di recupero di Tyrode, e individuare i quattro angoli allo strato di gel PDMS mentre si applica un tratto minimo (cioè, quanto basta per evitare che la fetta si muova facilmente in condizioni di flusso). Lasciare riposare le fette in questo bagno con soluzione di recupero circolante per circa 10 min.
- Aggiungere al serbatoio la soluzione di recupero pari a 0,3,5 mL della blebbistatin diluita. Lasciare affettare con blebbistatin per circa 10 min.
- Ricostituire 30 l del coloranti sensibile alla tensione di magazzino, RH237, in 1 mL di soluzione di recupero a 37 gradi centigradi. Spegnere le pompe e caricare lentamente 0,2-0,3 mL di soluzione di tintura di lavoro sulla superficie della fetta per un periodo di 30 s. Lasciare che la fetta incubare nel colorare con le pompe spente per un periodo fino a 90 s, quindi accendere nuovamente le pompe per consentire qualsiasi coloranti da lavare.
NOTA: Occorre prestare attenzione ad applicare il tinrito in modo uniforme su tutta la fetta. Inoltre, l'applicazione di tinri molto lenta è fondamentale per evitare che il tinri fluttuare dalla fetta. - Ripetere il passaggio 5.3 per ricostituire l'indicatore di calcio di riserva Rhod-2AM e caricarlo su affettare.
- Mettere a fuoco le telecamere sulla sezione regolando la distanza della sezione dall'obiettivo.
- Posizionare un elettrodo di stimolazione bipolare platino-iridio in modo che la sua punta sia a contatto con il centro della fetta e applicare stimoli di stimolazione di ampiezza crescente per determinare la soglia minima di stimolazione necessaria per provocare una risposta elettrica. Passo la sezione a 1 Hz con una durata della larghezza dell'impulso di 2 ms a 1,5 x l'ampiezza della soglia di stimolazione predeterminata. Posizionare un coperchio sopra la fetta di tessuto.
- Illuminare la fetta utilizzando una fonte di luce di eccitazione LED da 520 x 5 nm. Registrare la tensione e i segnali di calcio emessi con le due telecamere CMOS a 1.000 fotogrammi/s.
- Controllare la registrazione per una buona qualità del segnale e artefatti di movimento soppressi(Figura 1F). Aggiungere più blebbistatina al serbatoio in gradini di 0,1 mL fino a quando il movimento non produce più artefatti nei segnali ottici. Aggiungere più tinri, se necessario, per migliorare la qualità del segnale.
NOTA: Una buona qualità del segnale si riferisce all'ampiezza del segnale di grandi dimensioni valutata qualitativamente e al basso rumore di fondo nei segnali ottici registrati.
6. Elaborazione dei dati con RHYTHM1.2
NOTA: RHYTHM1.2 è un'interfaccia utente basata su MATLAB utilizzata per visualizzare, condizionare e analizzare i dati di mappatura ottica acquisiti da sistemi dimappaturaottica a fotocamera singola o doppia ( Figura 3 ). Viene utilizzato in combinazione con il sistema di imaging.
- Caricamento dei file di dati
- Caricare i file di dati in RHYTHM1.2 selezionando una delle quattro finestre di visualizzazione sullo schermo e utilizzando i pulsanti Seleziona directory e Carica.
- Il programma richiederà all'utente di selezionare i dati della telecamera 1 o della fotocamera 2 per le registrazioni a doppia tensione e calcio. Selezionare Camera 1 per il segnale di tensione.
- Ripetere il processo per caricare il segnale di calcio (Camera 2) in una delle finestre di visualizzazione adiacenti.
- Selezionare la casella di controllo Dual Data Linking tra le due finestre di visualizzazione selezionate per collegare le due finestre di visualizzazione, poiché i due set di dati vengono registrati dalla stessa area nella sezione.
NOTA: In alternativa, se viene mantenuto lo stesso campo visivo, questa funzione può essere utilizzata per collegare due immagini ottenute in punti temporali separati per vedere la risposta temporale in elettrofisiologia del farmaco in da studiare. Fare doppio clic su una finestra di visualizzazione consente di ingrandire una finestra per facilitare l'analisi.
- Condizionamento del segnale
- Selezione dell'analisi dei dati Condizione Parametri per la condizione dei dati di mappatura ottica di tensione e calcio prima di un'ulteriore analisi.
- Utilizzare la funzione "Rimuovi sfondo" per rimuovere i pixel che non contengono alcun segnale in base a una soglia di intensità fluorescente (soglia di scarico [BG]) e grado di clustering dei pixel (soglia di eccitazione [EX]).
- Eseguire la media spaziale dei dati di mappatura ottica utilizzando la funzione "Bin" per migliorare la qualità del segnale.
- Filtrare i dati di mappatura ottica utilizzando un filtro passa banda con la funzione "Filtro".
- Utilizzare la funzione "Drift" per rimuovere la deriva della linea di base nel segnale di mappatura ottico.
- Utilizzando la funzione "Normalizza", normalizzare i dati di mappatura ottica di ogni pixel per avere un'ampiezza massima di 1.
- Utilizzare la funzione "Segnale inverso" per invertire le tracce di calcio per ulteriori analisi.
- Fare clic su Mostra ondata per selezionare la traccia condizionata da un determinato punto della finestra di visualizzazione e stamparla nella finestra Forma d'onda. Regolare i parametri di condizionamento del segnale per ottenere un potenziale di azione ottimale e tracce transitorie di calcio.
- Calcolo della velocità di conduzione (CV)
NOTA: il tempo di attivazione è definito come il tempo di derivazione massima del segnale ottico (dF/dtmax).- Selezione dell'analisi dei dati Mappa di attivazione e immettere un'ora di inizio e un'ora di fine per includere un singolo potenziale di azione nella traccia. Premere Calcola e selezionare la regione di interesse (ROI) per visualizzare la mappa di attivazione della regione selezionata (Figura 1G).
- Selezione dell'analisi dei dati Mappa CV e allo stesso modo, scegliere l'ora di inizio e l'ora di fine. Immettere i valori di risoluzione interpixel in base alla configurazione.
NOTA: per i sistemi di ingrandimento 1x, la risoluzione interpixel è 0,1 mm nella direzione X e Y. - Premere il pulsante Genera Vec. Pulsante Mappa per selezionare un ROI e visualizzare i vettori CV all'interno di tale regione. La media, la mediana, la deviazione standard e il numero di vettori inclusi nell'analisi, nonché l'angolo medio di propagazione dei vettori CV nella regione selezionata vengono calcolati e visualizzati nella sezione Statistiche.
- Fare clic sul pulsante Disegna linea per disegnare una linea lungo una determinata direzione di propagazione. Verranno selezionati tutti i vettori CV in quella direzione. Fare clic su Calcola CV per utilizzare solo i vettori CV selezionati per calcolare le statistiche che verranno visualizzate nella sezione Statistiche.
- Azione durata potenziale (APD) e calcio transitorio durata (CaTD) calcolo
NOTA: L'APD è un altro parametro fondamentale dell'elettrofisiologia cardiaca. Le mappe APD possono essere generate determinando la differenza di tempo tra l'attivazione e una percentuale specificata di ripolarizzazione di ogni potenziale di azione ottica. L'eterogeneità APD o il prolungamento e l'accorciamento dell'APD possono essere utilizzati per prevedere la suscettibilità all'aritmia.- Per calcolare APD in RHYTHM1.2, selezionare Analisi dei dati Mappa APD/CaT.
- Selezionare l'ora di inizio e l'ora di fine per includere un potenziale di azione completo. Impostare un valore minimo e massimo di APD/CaTD per rimuovere eventuali outlier (ad esempio, 0 e 1.000 ms, rispettivamente). Immettere la percentuale di ricorsiva che determinerà l'APD, ad esempio 0,8 per APD80/CaTD80 o 0,5 per APD50/CaTD50.
- Fare clic su Calc APD regionale per selezionare un ROI e generare la mappa APD. La media, la mediana, la deviazione standard e il numero di pixel inclusi nell'analisi verranno visualizzati nella sezione Statistiche.
- Tempo di salita
NOTA: Il tempo di aumento è un altro parametro elettrofisiologico che può essere misurato dai segnali ottici di tensione e tracce transitorie di calcio. Fornisce una stima di quanto tempo ci vuole per i canali ionici depolarizzanti per innescare un potenziale di azione, o quanto tempo ci vuole per il calcio per essere rilasciato nel citoplasma dal reticolo sarccoplasmico. Il tempo di ascesa ottico non è un sostituto perfetto per i tempi di ascesa misurati dai microelettrodi e potrebbe non essere così sensibile ai cambiamenti nella depolarizzazione, perché i potenziali di azione ottica sono una media del potenziale transmembrana di molte cellule. La risoluzione spaziale e temporale del sistema può anche influenzare i valori del tempo di aumento ottico. Tuttavia, può ancora essere utilizzato per prevedere grandi cambiamenti nella depolarizzazione27.- Per determinare il tempo di aumento, selezionare Analisi dei dati Tempo di salita.
- Selezionare Ora di inizio e Ora di fine per selezionare l'upstroke di una singola azione potenziale o transitorio di calcio. Immettere i valori di Start% e End% (in genere 10-90% è consigliato per i segnali non rumorosi), che consente all'utente di selezionare solo le parti del segnale senza includere il rumore nel caso di segnali rumorosi.
- Fare clic su Calcola per selezionare il ROI e determinare la media, la mediana, la deviazione standard e il numero di pixel inclusi nell'analisi del tempo di salita.
- Decadimento del calcio
NOTA: Per le tracce di calcio, è possibile determinare la costante temporale del decadimento del calcio transitorio. Ciò consente l'analisi dei cambiamenti nella rimozione degli ioni di calcio dal citoplasma nella SR.- Selezione dell'analisi dei dati Calcio Decay ed entrare nell'ora di inizio e all'ora di fine per includere l'intera porzione di decadimento di un singolo segnale transitorio di calcio.
- Fare clic su Calcola Tau per selezionare il ROI e determinare la media, la mediana, la deviazione standard e il numero di pixel inclusi nell'analisi della costante del tempo di decadimento del calcio.
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Representative Results
Le fette organotpice umane sono state raccolte dal ventricolo sinistro di un cuore umano del donatore secondo il protocollo descritto sopra e illustrato inFigura 1. Un sistema di mappatura ottica a doppia fotocamera come quello inFigura 2è stato utilizzato nella configurazione di imaging verticale per eseguire la mappatura ottica simultanea di tensione e calcio circa 1 h dopo il completamento del protocollo di taglio. I dati sono stati analizzati utilizzando RHYTHM1.2 (Figura 3), uno strumento di analisi dei dati di mappatura ottica open source precedentemente pubblicato dal nostro laboratorio e liberamente disponibile su Github (https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2). I parametri elettrofisiologici misurati sono illustrati inFigura 4. Il potenziale d'azione e le tracce transitorie di calcio sono state condizionate dal segnale e le tracce rappresentative utilizzate in un'ulteriore analisi sono illustrate inFigura 4A. I tempi di attivazione sono stati determinati per ogni pixel e le mappe isocroniche dei tempi di attivazione determinati dalla tensione e le tracce di calcio sono illustrate inFigura 4B,C. Si noti che l'attivazione nell'isochno di calcio è in ritardo rispetto a quella della tensione come previsto. Vettori CV tracciati inFigura 4Dsono stati calcolati utilizzando i tempi di attivazione e la risoluzione interpixel nota. Il CV medio nella direzione trasversale è stato determinato per essere 21,2 cm / s in questa fetta. Questo valore CV è paragonabile al CV trasverso ventricolare precedentemente riportato misurato da cuori interi esoppiantati (24 , 4 e 28 cm / s nei cuori con fibrosi diffusa e irregolare)28. La costante di decadimento transitorio del calcio è stata misurata adattando un polinomio alla porzione decrescente delle tracce di calcio e la costante di decadimento medio è stata determinata per essere 105,3 ms in questa fetta (mappa inFigura 4E). Successivamente, APD e CaTD sono stati misurati come la durata del tempo tra il tempo di attivazione e una percentuale specificata di rimozione di ripolarizzazione/calcio formano il citoplasma. APD medio80e CaTD80sono stati determinati rispettivamente a 343,1 ms e 442,6 stati (Figura 4F,G). Precedenti studi umani in vivo riportano l'intervallo di attivazione-recupero (ARI) misurato da elettrogrammi unipolari registrati da cuori umani in vivo durante la pacizzazione a stato costante a 1 Hz come surrogato per APD. I valori ARI in questi studi vanno da 250 a 450 ms29,30. I valori di APD delle fette cardiache umane riportate qui sono paragonabili ai precedenti valori ARI. Le regioni con artefatti di movimento sono state rimosse dai calcoli APD e CaTD. Infine, sono stati misurati e mappati i tempi di salita (cioè la durata dell'upstroke) delle tracce di tensione e calcio. Questi sono mostrati inFigura 4HEFigura 4IRispettivamente. I valori medi sono stati determinati rispettivamente a 10,2 ms e 13,3 ms. Gli artefatti nelle mappe a destra del punto di stimolazione sono dovuti al filo di stimolazione all'interno del campo visivo. Infine, l'uso di questo modello di fette nei test antidroga acuti è stato dimostrato quando le fette sono state coltivate per 24 h con doxorubicina (DOX), un agente chemioterapico noto per avere effetti cardiotossici. Il trattamento delle fette con 50 m DOX ha comportato una riduzione della velocità di conduzione trasversale da 19,4 x 3,4 cm/s a 9,6 cm/s, come illustrato dalle mappe di attivazioneFigura 5A, mappe vettoriali CV inFigura 5Be i dati di riepilogo inFigura 5C. La dimensione del campione più piccola nel gruppo DOX era dovuta a un maggior numero di fette non vitali dopo il trattamento DOX. L'aumento degli artefatti di movimento nelle sezioni trattate con DOX ha impedito il calcolo di valori APD accurati. Un altro parametro importante che può essere misurato con la doppia tensione e l'imaging del calcio è VM-Ca ritardo, per determinare robusto accoppiamento eccitazione-contrazione nel tessuto31. Ritardi o valori negativi di questo parametro potrebbero essere dannosi.
Figura 1: Preparazione della fetta organotipica cardiaca umana. (A) I cuori umani sono stati conservati in un bagno cardioplegico ghiacciato (miscela di soluzione di cardioplegia e ghiaccio cardioplegia) al momento del recupero. (B) I 1 cm3 cubetti di tessuto ventricolare sinistro sono stati tagliati e montati su un supporto di tessuto metallico con 4% gel di agarose incollato alla parete posteriore del supporto e trasferito in un bagno ghiacciato di soluzione di taglio ossigenato. (C) Una volta tagliate, le fette sono state trasferite alla soluzione di recupero ossigenata a RT in singoli colinatore di cellule di nylon da 100 m. Le lavatrici a maglie coprivano i tessuti per evitare che le fette si arricciasse. (D) Per la coltura a lungo termine, le fette sono state lavate in PBS e coltivate in 6 piastre di pozzo con 3 mL di mezzo tissutale a 37 gradi centigradi. (E) La sezione di fette colorate tricromatica di Mason che mostra l'orientamento della fibra. (F) Potenziale di azione ottica rappresentativo registrato da una fetta. (G) Rappresentante mappa di attivazione di una fetta ritmo al centro (blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sistema di mappatura ottica a doppia fotocamera. Sistema di mappatura ottica a doppia fotocamera nella configurazione di imaging verticale. Le parti del sistema includono: 1) telecamere master e slave per la doppia mappatura; 2) bagno di tessuto con gel PDMS; 3) filtrare i cubi che ospitano i filtri di eccitazione e emissione e specchi dicroici; 4) porta lenti e lenti; e 5) sorgente luminosa di eccitazione (520 nm LED verde). Inset su dettagli a destra filtro e combinazioni di specchio dicroico per doppia mappatura ottica di Vm e calcio utilizzando RH237 e Rhod-2-AM, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: interfaccia utente grafica (GUI) di RITMO1.2 dello strumento di analisi dei dati di mappatura ottica open source per l'analisi di dati a singolo parametro e multiparametro. Le opzioni di caricamento dei file di dati e l'elenco dei file vengono visualizzati nella casella rossa. Le opzioni di analisi dei dati sono elencate nel menu a discesa dell'analisi dei dati indicato in verde. Le finestre di visualizzazione per la visualizzazione delle mappe dati sono indicate in blu scuro. Le caselle di controllo per collegare i file di dati dual mapping per l'analisi simultanea dei dati della doppia fotocamera sono indicate in viola. La finestra di forma d'onda per tracciare il potenziale di azione e le tracce transitorie di calcio vengono visualizzate in giallo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Potenziale transmembrano e mappatura dei transitori di calcio da una preparazione di fette cardiache organotipiche umane. (A) Potenziale di azione ottica rappresentativo (nero) e calcio transitorio (bordeaux). (B,C) Mappe di attivazione ottenute rispettivamente da registrazioni Vm e calcio. (D) Mappa vettoriale della velocità di conduzione (CV). (E) Calcio decadimento transitorio mappa (Tau). (F,G) Azione durata potenziale (APD80) e durata transitoria di calcio (CaTD80)mappa, rispettivamente. (H,I) Mappe del tempo di aumento delle upstrokes del potenziale d'azione e del calcio transitorio, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Il trattamento della Doxorubina rallenta la velocità di conduzione trasversale. (A) Mappe di attivazione da fette coltivate per 24 ore senza (controllo) e con doxorubicina a 50 M (DOX). (B) Mappe vettoriali della velocità di conduzione dalle sezioni di controllo e DOX. (C) Velocità media di conduzione trasversale calcolata dal controllo e dalle fette trattate con DOX. < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, presentiamo metodi passo-passo per ottenere fette cardiache vitali da cuori umani arrestati cardioplegically e per caratterizzare funzionalmente le fette utilizzando la doppia mappatura ottica del potenziale transmembrana e del calcio intracellulare. Con l'ambiente extracellulare preservato e l'accoppiamento nativo delle cellule cellulari, le fette cardiache umane possono essere utilizzate come modello accurato del cuore umano per la scoperta scientifica fondamentale e per i test di efficacia e cardiotossicità di agenti farmacologici e terapie geniche. La tecnologia consente anche la mappatura strutturale-funzionale di specifiche regioni del cuore, come il nodo sinoatriale, il nodo atrioventricolare e le fibre Purkinje. Il protocollo descritto di seguito elenca i passaggi di base per la generazione di sezioni cardiache, l'imaging e le analisi che sono più adatti per gli studi a breve termine. La coltura statica delle fette di tessuto ha dimostrato di indurre cambiamenti nel tessuto cardiaco per periodi di tempo prolungati, quindi per gli studi a lungo termine, incoraggiamo il lettore a incorporare condizioni di coltura più fisiologiche, come la stimolazione elettromeccanica12,13,14.
Occorre prestare attenzione per una serie di misure per mantenere la salute dei tessuti. Ad esempio, il tempo tra la raccolta del cuore e il taglio dei tessuti dovrebbe essere ridotto al minimo. Come mostrato in precedenza21, la lunghezza estesa dell'arresto cardioplegico può portare a un'elettrofisiologia alterata. Inoltre, per preservare l'integrità della matrice extracellulare e l'accoppiamento cellulare, l'eccessiva manipolazione e stiramento delle fette dovrebbe essere evitato durante la raccolta delle fette, la coltura e gli studi funzionali. Un'eccessiva stiramento delle fette potrebbe causare blocchi di conduzione. Inoltre, tutte le soluzioni descritte in questo protocollo devono essere mantenute a un pH di 7.4. La soluzione del Tyrode qui descritta utilizza HEPES per mantenere il pH corretto utilizzando 100% O2. Il bicarbonato di sodio può essere utilizzato per controllare il pH, ma questa soluzione dovrebbe essere bollita con 95% O2 e 5% CO2. Infine, durante il trasporto e il taglio del cuore, si dovrebbe garantire che la soluzione di cardioplegia e affettatura siano mantenute il più vicino possibile alla temperatura di congelamento per preservare la vitalità dei tessuti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
I finanziamenti di NIH (sovvenzioni R21 EB023106, R44 HL139248 e R01 HL126802), della fondazione Leducq (progetto RHYTHM) e di una borsa di studio post-dottorato dell'American Heart Association (19POST34370122) sono riconosciuti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
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