Summary
Plant morfogene genen kunnen worden gebruikt om de genetische transformatie van recalcitrante genotypes te verbeteren. Hier beschreven is een Agrobacterium-gemedieerde genetische transformatie (QuickCorn) protocol voor drie belangrijke openbare maïs inteelt lijnen.
Abstract
Hier gedemonstreerd is een gedetailleerd protocol voor Agrobacterium-gemedieerde genetische transformatie van maïs inteelt lijnen met behulp van morfogene genen Baby boom (Bbm) en Wuschel2 (Wus2). Bbm wordt gereguleerd door de promotor van het maïsfolipide-overdrachtsgen(Pltp)en Wus2 staat onder controle van een promotor van maïsauxine-inducible(Axig1). Een Agrobacterium stam die deze morfogene genen op overdracht DNA (T-DNA) en extra kopieën van Agrobacterium virulentie(vi)genen worden gebruikt om maïs onrijpe embryo explants infecteren. Somatische embryo's vormen zich op de scutella van geïnfecteerde embryo's en kunnen worden geselecteerd door herbicideresistentie en ontkiemd in planten. Een warmte-geactiveerd cre/loxP recombinatiesysteem ingebouwd in de DNA-constructie maakt het mogelijk om morfogene genen uit het maïsgenoom te verwijderen in een vroeg stadium van het transformatieproces. Transformatiefrequenties van respectievelijk ongeveer 14%, 4% en 4% (aantallen onafhankelijke transgene voorvallen per 100 geïnfecteerde embryo's) kunnen worden bereikt voor W22, B73 en Mo17, met behulp van dit protocol.
Introduction
Transformatie is een fundamenteel instrument voor de evaluatie van vreemde genexpressie in maïs en het produceren van genetisch gemodificeerde maïslijnen voor zowel onderzoeks- als commerciële doeleinden. Toegang tot een hoge doorvoertransformatie kan de toegenomen behoefte aan moleculaire en cellulaire biologiestudies van maïs vergemakkelijken1. Het vermogen om gewassoorten genetisch te transformeren is van vitaal belang voor zowel openbare als particuliere laboratoria. Dit maakt zowel een fundamenteel begrip van genregulatiemechanismen als gewasverbetering op wereldschaal mogelijk om een steeds groeiende bevolking te ondersteunen.
De ontdekking dat onrijpe embryo's van maïs kunnen worden gebruikt voor de productie van regeneratief eelt , is ontstaan in 19752. Sinds deze openbaring hebben de meeste schaalbare maïstransformatieprotocollen callusvorming en selectie vereist voorafgaand aan regeneratie3. Tijdens het proces van genetische transformatie worden agrobacterium-geïnfecteerdeof biolistisch gebombardeerde onrijpe embryo's gekweekt op media voor embryogene eeltinductie. Geïnduceerde calli worden vervolgens gekweekt op selectieve media (bijvoorbeeld, met een herbicide), zodat alleen getransformeerde callus stukken in staat zijn om te overleven. Deze herbicide-resistente vermeende transgene calli worden opgeladen en geregenereerd in planten. Hoewel deze methode effectief is, is het proces lang en arbeidsintensief, en het kan meer dan 3 maanden duren om4te voltooien. Wat nog belangrijker is, conventionele maïstransformatieprotocollen hebben een veel grotere beperking, dat wil zeggen dat slechts een beperkt aantal maïsgenotypen kan worden getransformeerd5,6.
Lowe et al.7,8 rapporteerde eerder een "QuickCorn" transformatiemethode die niet alleen de duur van het transformatieproces sterk verminderde, maar ook de lijst van transformeerbare genotypen uitbreidde. De QuickCorn methode maakt gebruik van maïs orthologs (Zm-Bbm en Zm-Wus2) van de Arabidopsis transcriptie factoren BABY BOOM (BBM)9 en WUSCHEL (WUS)10. Wanneer opgenomen in het transformatievectorsysteem, werken deze genen synergetisch om embryogene groei te stimuleren7.
Het QuickCorn-protocol dat in dit werk werd beschreven, was gebaseerd op het protocol in Jones etal. 11, wat een verdere verbetering was van de door Lowe etal. 7gerapporteerde methode ,8. In deze studie, een Agrobacterium stam LBA4404 (Thy-) herbergen een binaire vector constructie PHP81430 (Figuur 1) en accessoire plasmid PHP7153912 worden gebruikt voor transformatie. Het T-DNA van PHP81430 bevat de volgende moleculaire componenten. (1) De transformatie selectieve marker gen Hra expressie cassette. Het maïs-Hra -gen(Zm-Hra)is een gewijzigd acetolactase synthase (ALS)-gen dat tolerant is voor ALS-remmende herbiciden zoals sulfonylureas en imidazolinones13,14. Het Zm-Hra gen wordt gereguleerd door de sorghum ALS promotor8 en aardappel proteinase inhibitor II(pinII) terminator15. Het T-DNA bevat ook (2) een expressiecassette met het transformatiescreenbare markergen ZsGreen. Dit groene fluorescerende eiwit gen ZsGreen van Zoanthus sp. rif koraal16 wordt gereguleerd door een sorghum ubiquitine promotor / intron en rijst ubiquitine terminator.
Daarnaast bevat het T-DNA (3) het morfogene gen Bbm expressiecassette. Bbm is een transcriptiefactor in verband met embryoontwikkeling9,17. Bbm wordt gereguleerd door de maïs fosfolipide transferase eiwit(Pltp) promotor8 en rijst T28 terminator18. Zm-Pltp is een gen met sterke expressie in het embryo scutellar epitheel, zijdeharen en bladdochtercellen (flankerende de wachtcellen), lage expressie in voortplantingsorganen en geen expressie in wortels8. Het bevat ook (4) het morfogene gen Wus2 expressie cassette. Wus2 is een andere transcriptiefactor in verband met het onderhoud van de apicale meristem19. Zm-Wus2 staat onder toezicht van een maïsauxin-inducible promoter (Zm-Axig1)20 en maïs In2-1 terminator21. Ten slotte bevat het T-DNA (5) het cre-loxP recombination systeem. De cre recombinase gen22 is onder de controle van maïs hitte schok eiwit 17.7 (Hsp17.7)23 promotor en aardappel pinII terminator. Twee loxP-sites (in dezelfde oriëntatie)24 flankvier genexpressiecassettes waaronder ZsGreen, cre, Bbm en Wus2.
Omdat de aanwezigheid van de morfogene genen niet gewenst is voor de rijpheid van de plant en het daaropvolgende nageslacht, werd het warmte-geïnduceerde cre-loxP-recombinatiesysteem ingebouwd in het T-DNA om morfogene genen uit het maïsgenoom te verwijderen om normale callusregeneratie en plantenontwikkeling mogelijk te maken. Bij warmtebehandeling verwijdert de expressie van CRE-eiwit alle transgenen, behalve het Hra-selectiegen. Succesvolle transformatoren moeten herbicide-resistent, maar ZsGreen-negatief. Om de transformatiefrequentie verder te verbeteren, herbergt de Agrobacterium-stam ook een extra accessoire plasmid (PHP71539) dat extra kopieën heeft van Agrobacterium virulentie(vi)genen12.
De QuickCorn-methode verschilt van conventionele maïstransformatieprotocollen, omdat het geen callusinductiestap tijdens de transformatie inhoudt. Tijdens de eerste week na infectie met Agrobacteriumontwikkelen somatische embryo's zich op het scutellar epitheel van de geïnfecteerde onrijpe embryo's. De embryo's worden vervolgens overgebracht naar een medium met hormonen die embryorijping en schietvorming aanmoedigen. Het snel overbrengen van de somatische embryo's op rijpings-/scheutvormingsmedium slaat het traditionele eeltstadium over dat eerder werd gebruikt voor maïstransformatie en maakt directe generatie van T0-planten mogelijk8. In vergelijking met eerder gepubliceerde maïstransformatiemethoden6is de QuickCorn-methode sneller, efficiënter en minder genotype-afhankelijk. Met behulp van deze methode, gewortelde planten zijn meestal klaar om over te dragen aan de bodem in slechts 5-7 weken, in plaats van de drie of meer maanden vereist door de traditionele protocollen. Het doel van dit artikel is om een diepgaande beschrijving en demonstratie van de methode te bieden, waardoor gemakkelijker replicatie in een laboratorium omgeving meestal gevonden in de meeste academische instellingen.
Protocol
1. Groei media voorbereiding
- Voor exacte groei medium recepten voor dit protocol, verwijzen wij u naar tabel 1.
- Voor de voorbereiding van 1 L van de media, plaats een 2 L beker op een roerplaat en plaats een roerstaaf binnen.
- Vul het bekerglas met 900 mL gedestilleerd water en zet de roerplaat aan. De roerstaaf moet op een gemiddelde snelheid draaien.
- Weeg alle ingrediënten in poedervorm af en los op in een beker.
- Meet alle vloeibare ingrediënten, indien aanwezig, en voeg toe aan het bekerglas.
- Breng het uiteindelijke volume naar 1 L met gedestilleerd water.
- Meet de pH en pas aan de receptspecificaties aan.
- Bij het formuleren van een vloeibaar groeimedium wordt er geen agar toegevoegd. Bevestig een filtersterilisator aan een vacuümpomp en giet het vloeibare groeimedium door het filter. Zet de pomp aan en wacht tot alle vloeistof erdoor getrokken is. Plaats een dop op de container en bevestig een etiket.
- Als het formuleren van een solide groeimedium, nadat de pH is aangepast, voeg agar direct toe in een fles of kolf.
- Giet het 1 L vloeibare groeimedium in een 2 L Erlenmeyer-kolf, of verdeel het in twee 1 L autoclavable flessen (elk 500 mL). Als twee flessen worden gebruikt, verdeel de agar en voeg direct toe aan de flessen.
- Dek de kolf af met een ademende hoes, zoals twee lagen aluminiumfolie, zodat stoom kan ontsnappen. Bij gebruik van een fles, losjes dop de schroef deksel op de top.
- Autoclave bij 121 °C gedurende 25 min.
- Na het autoclaven, verwijder het groeimedium uit het autoclave en koel tot 55-60 °C (een waterbad ingesteld op 55 °C kan dit gemakkelijker maken). Houd het groeimedium een paar uur in vloeibare toestand totdat het handig is om platen te gieten.
- Zodra afgekoeld, voeg alle post sterilisatie additieven (zie tabel 1) en meng grondig.
- Nadat alle ingrediënten zijn toegevoegd, giet het aangewezen volume in de container van keuze in een laminaire stroomkap.
- Groeimedium kan handmatig in gewenste petrischaaltjes worden gegoten of met behulp van een vloeibaar doseerapparaat. Bij het handmatig gieten wordt aanbevolen om een groot volume autoclaved medium over te brengen in een kleiner steriel bekerglas (500 mL) voor het gemak van handling.
- Laat groeimedium afkoelen en stollen.
- Het groeimedium zal beschikbaar zijn voor gebruik zodra het solide wordt en het best wordt gebruikt de volgende dag na het drogen lichtjes 's nachts in een steriele stroomkap als stapels dekselplaten. Na 's nachts drogen, breng de platen in plastic mouwen, vouw over het losse uiteinde, en houd dit op zijn plaats met een klein beetje tape. Dit voorkomt overmatig drogen. Medium kan maximaal 1 maand in een koele, donkere en schone omgeving (4-16 °C) worden bewaard.
2. Het kweken van donorplanten en het oogsten van onrijpe oren
- Kweek alle ingeteelde maïs (d.w.z. B73, Mo17 of W22) in een kas in potten van 5,9 L met een bodemloos substraat. Gebruik een fotoperiode van 16/8 (dag/nacht), met gemiddelde temperaturen van 25,5 °C overdag en 20 °C 's nachts.
- Planten worden naar behoefte bewaterd en bevrucht met een gecontroleerde afgifte meststof (N-P-K van 15-9-12), die kan worden opgenomen in de bodem mix of toegevoegd aan het oppervlak na het planten.
- Het duurt meestal ongeveer 70-90 dagen na zaad ontkieming voor oren te voorschijn komen. Als oorscheuten ontstaan, bedek ze met een schietzak om ongecontroleerde bestuiving te voorkomen.
- Ongeveer 2-3 dagen nadat zijde is ontstaan en als stuifmeel de volgende dag beschikbaar zal zijn, snijd de zijde met behulp van een schaar die zijn gesteriliseerd in 70% ethanol. Snijd de zijde en schil ongeveer 2,5 cm onder het einde van de kaf bladeren, waar de zijde ontstaan. Bestuiving kan de volgende dag worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat u de schaar tussen elk oor opnieuw steriliseert.
- Zodra anthers uit een kwast tevoorschijn komen, bedek de kwast met een kwastzak en niet-slip paperclip aan de basis van de zak rond de stengel.
- De volgende ochtend, buig de plant voorzichtig over en tik op de zak om stuifmeel aan te moedigen om vrij te komen.
- Verwijder de kwastzak en vouw de bovenkant van de zak om te voorkomen dat stuifmeel ontsnapt. Het is over het algemeen het beste om de kwast zak 1 dag voordat het zal worden gebruikt (om te voorkomen dat de opbouw van dode pollen en schuur anthers). Vers stuifmeel kan worden verzameld uit kwasten voor ongeveer 3-5 dagen. Wanneer anthers uit de binnenste roosjes aan de voet van de kwast tevoorschijn komen, zal die kwast waarschijnlijk de volgende dag geen levensvatbaar stuifmeel produceren.
- Gebruik het stuifmeel van dezelfde plant (zelf) of uit een andere plant van dezelfde inteelt (sibbing).
- Verwijder de zak of snijd het uiteinde van de zak om de zijde bloot te leggen, giet dan snel stuifmeel uit de kwastzak op de zijde.
- Bedek het oor met de kwastzak onmiddellijk en nieten de basis van de zak rond de stengel om het te beveiligen. Het kan nuttig zijn om de plant fysiek te isoleren van bloeiende planten van verschillende genotypes tijdens de bestuiving om kruisbestuiving te voorkomen. Laat de kwastzak op het oor tot het onrijpe oor klaar is om te oogsten.
- 9-12 dagen na bestuiving, screen oren voor embryogrootte. Schuif de bestuivingszak in de stengel om het oor bloot te leggen. Trek voorzichtig de schil naar beneden om kernels bloot op ongeveer een derde tot een vierde van de omtrek van het oor en ongeveer een derde van de afstand langs het oor. Pitten in de buurt van de tip zijn niet representatief voor de gemiddelde embryogrootte.
- Met behulp van een scalpel, snijd de dop van een enkele kernel die lijkt op de meerderheid van de andere kernels in grootte en kleur.
- Gebruik een spatel (met een liniaal) om het embryo te verwijderen zoals beschreven in stap 4.6. Meet de lengte van het embryo met behulp van een ingebouwde liniaal op de spatel of een digitale remklauw. Als het embryo tussen 1,5-2,0 mm ligt, moet u het oor oogsten. Als het ~ 1,3 mm, kan het oor klaar zijn om later op de dag te oogsten en kan opnieuw worden gecontroleerd in ongeveer 7-8 uur.
3. Voorbereiding Agrobacterium schorsing cultuur voor infectie
OPMERKING: De Agrobacterium stam LBA4404(Thy-) met PHP81430 (Figuur 1) en PHP7153912 wordt opgeslagen als een glycerol voorraad op -80 °C. Deze materialen zijn verkrijgbaar bij Corteva Agriscience via een Material Transfer Agreement. LBA4404(Thy-) is een auxotrofische soort die thymidine geleverd in de groeimedia nodig heeft. Het primaire nut van de auxotroph Agro stam is voor biocontainment doeleinden. Het heeft het extra voordeel van het verminderen van agro overgroei. De auxotrofische Agro stam groeit niet zonder aanvullende thymidine. Niettemin kan thymidine (vermoedelijk) worden geleverd door stervend plantweefsel in de cultuur. Daarom is er nog steeds behoefte aan een antibioticum in het medium om de auxotrofische Agro volledig te controleren. Echter, het zal gemakkelijker te controleren als gevolg van gecompromitteerde groei van de auxotrofische stam in de afwezigheid van thymidine.
- Vier dagen voor de datum van infectie, initiëren van een "moeder" plaat uit de glycerol voorraad door strepen van de bacteriën op een YP plaat met 50 mg/L thymidine, 50 mg/L gentamicin, en 50 mg/L spectinomycine (Tabel 1). Bebroed de "moeder" plaat in een 20 °C incubator gedurende 3 dagen.
- Een dag voor de infectie experiment, bereiden een "werkende" plaat door het selecteren van een tot vijf kolonies uit de "moeder" plaat en strepen de bacteriën van de "moeder" plaat naar een nieuwe YP plaat (met thymidine, gentamycine, en spectinomycine; Tabel 1).
- Streep de dagelijkse "werkende" plaat in sequentiële kwadranten en voer de lus 1x door het net-gestreepte gebied in het opeenvolgende kwadrant, herhalen om kwadranten die zijn seriële verdund vormen. Incubeer de "werkende" plaat 's nachts in een couveuse van 27 °C.
- Gebruik na het voltooien van embryodissectie (stap 4.8) een lus of soortgelijk gereedschap om Agrobacterium te verzamelen uit een gebied van de "werkende" plaat waar bacteriële groei zichtbaar is als dunne strepen van kolonies.
OPMERKING: Vermijd gebieden van de plaat met een dicht gazon van bacteriële groei. De Agrobacterium groei is waarschijnlijk al begonnen te dalen in dichte gebieden, terwijl in de gebieden met zichtbare kolonies de bacteriën zijn in de juiste groeifase voor infectie. - Hang de verzamelde bacteriën op in een buis van 50 mL met 10 mL vloeistofmedium van 700A(tabel 1). Vortex om de bacteriecultuur volledig op te schorten.
- Meet de optische dichtheid op een golflengte van 550 nm. Pas het volume aan tot de OD tussen 0,35-0,45 ligt, waarbij 0,4 de optimale waarde is.
OPMERKING: Als de OD hoger is dan 0,45, voegt u meer 700A-vloeistofmedium toe. Als OD lager is dan 0.35, inoculeren meer De kolonies van agro in de opschortingscultuur.
4. Embryodissectie, infectie en co-teelt
- Geschikte oren selecteren voor transformatie-experimenten; deze moeten een goede zaadset hebben en embryo's hebben die variëren in grootte van 1,5-2,0 mm. Ze worden meestal geoogst tussen 9-12 dagen na bestuiving. Geoogste oren kunnen vers worden gebruikt of gedurende 1-4 dagen bij 4 °C worden opgeslagen, hoewel de kwaliteit van de respons waarschijnlijk geleidelijk zal degraderen met langdurige opslag na de eerste dag.
- Verwijder de kaften en zijde. Steek een handvat in de basis of de bovenkant van het oor. Het handvat kan een paar tangen, schroevendraaier, enz.
- Plaats oren in een grote container (bijvoorbeeld 2 L bekerglas met het handvat naar boven, vul de container met desinfectieoplossing. Desinfectie oplossing is 1,8 L van 20% commercieel bleekmiddel (1,65% natrium hypochloriet) en een paar druppels oppervlakteactieve Tween 20.
- Steriliseer de oren in een laminaire flow bank. Na 20 min, leeg de bleekmiddel oplossing en spoel de oren 3x (5 min elk) met behulp van een royale hoeveelheid steriel gedestilleerd water. Verwijder het water en laat de oren enkele minuten drogen.
LET OP: Het is belangrijk dat de oren volledig worden ondergedompeld in de bleekoplossing voor 20 min. Beweeg de oren voorzichtig rond in de bleekmiddeloplossing af en toe om luchtbellen los te maken. - Bereid een 2 mL microcentrifuge buis gevuld met 700A vloeibaar medium. Deze buis zal worden gebruikt om de onrijpe embryo's te verzamelen.
- Neem het oor en met behulp van een steriele scalpel, verwijder de bovenste 1-2 mm van de kernel kronen om het endosperm bloot te stellen. Gebruik een microspatel om het onrijpe zygotische embryo (IZE) te verwijderen. De IZE zal zich in de kernel bevinden, aan de zijkant naar het puntje van het oor, en in de buurt van de bevestiging aan de kolf. Met behulp van de spatel, steek het in het endosperm in de pericarp verst weg van het embryo, draai dan voorzichtig omhoog om het endosperm los te maken en laat het embryo verwijderen (figuur 2).
- Breng het embryo met behulp van de spatel over in de buis met het vloeibare medium 700A. Blijf dit doen totdat er maximaal 100 embryo's zijn verzameld. Meerdere buizen kunnen worden gevuld (~ 100 embryo's / buis) alvorens door te gaan naar de volgende stap. Op dit punt moet de Agrobacterium-suspensie worden voorbereid (zie stap 3.5).
- Verwijder het 700A vloeistofmedium uit de embryobuis met een pipet van 1 mL. Voeg verse 700A medium om de embryo's te wassen, verwijder dan die media ook.
- Voeg 1 mL van de Agrobacterium suspensie en vortex toe op een lage stand (3/10) voor 30 s of invert tube 12x-15x om te mengen. Laat deze buis 5 min horizontaal op de bank rusten.
- Breng na 5 min de gehele buis embryo's en Agrobacterium-suspensie over op een plaat van 562V co-teeltmedium ( tabel1). Dit kan worden bereikt door de plaat op de bank te plaatsen en de inhoud van de buis snel op de plaat te gieten. Draai de plaat voorzichtig om de embryo's te verdelen en verwijder de Agrobacterium suspensie met behulp van een 1 mL pipet.
- Zorg ervoor dat de embryo's worden geplaatst met de scutellum (ronde) zijde naar boven. Gebruik indien nodig een vergrootglas of een ontleedruimte. Plaats platen in kunststof dozen (19 cm x 28 cm x 5,1 cm) en incubeer de platen 's nachts 16-18 uur bij 21 °C in het donker. Er is geen individuele plaatverpakking nodig met paraffinefolie of ventilatietape.
- Na 's nachts co-teelt, verplaats de geïnfecteerde embryo's, scutellum kant omhoog, op rustmedium 605T (Tabel 1). Plaats ongeveer 30 embryo's per plaat. Incubeer de platen bij 26-28 °C in het donker.
- Incubeer voor 4-10 dagen (7 dagen heeft de voorkeur). Op dit moment kan de ontwikkeling van somatische embryo's worden waargenomen op het oppervlak van het zygotische scutellum (figuur 3).
5. Selectie, warmtebehandeling en regeneratie
- Na de rustperiode schokt de hitte de embryo's. Plaats de doos met de platen van embryo's in een couveuse van 45 °C met een relatieve luchtvochtigheid van 70% gedurende 2 uur. Verwijder vervolgens de doos uit de couveuse van 45 °C en plaats in de donkere couveuse van 26-28 °C gedurende 1-2 uur.
OPMERKING: Als u niet in staat is om 70% vochtigheid in een couveuse te bereiken, voeg dan een dubbele laag autoclaved papieren handdoeken toe aan de bodem van de plaatdoos en geniet met autoclaved water om de luchtvochtigheid in de doos te behouden. Breng de platen terug naar de doos bovenop de papieren handdoeken en sluit het deksel af voordat u op 45 °C wordt geplaatst. Gebruik een kleine digitale hygrometer/thermometer om de temperatuur en vochtigheid te controleren. - Breng de met warmte behandelde IzE's over van het rustmedium naar het scheutvormingsmedium (13329A) dat 0,05 mg/L imazapyr als selectief middel bevat (tabel 1). Bij het overbrengen, verwijder coleoptiles, indien aanwezig, met behulp van fijne tip tangen of chirurgische schaar.
- Plaats 10-15 embryo's per plaat om overbevolking te voorkomen. Bewaar de embryo's 2 weken in dit medium in de 26 °C donkere couveuse.
- Breng de embryo's over naar het bewortelmedium (13158; Tabel 1) 1-2 weken. Plaats ongeveer acht stuks per plaat en incubeer in een lichte kamer of lichtkamer (16 dagen/8 nacht, 20-150 μmol/m2/s) bij 27 °C.
- Als plantjes ontwikkelen, plaats sterkere plantjes met zowel scheuten als krachtige wortels op nieuwe platen van beworteling medium, plaats een plant per plaat. Dit zal zorgen voor een sterkere plantenlet groei. Plaats de borden nog 7-14 dagen in de lichtkamer of lichtkamer.
LET OP: Verwijder zorgvuldig alle eeltstukken die aan de plantlet zijn gekoppeld om ervoor te zorgen dat deze in goed contact staat met het medium. - Als de plant krachtiger wordt, verwijder de plant van het wortelmedium en spoel de wortels met leidingwater om agar te verwijderen.
- Transplanteer individuele planten in 3 in2 (~ 19 cm2)potten met een voorbevochtigd bodemloos substraat. Plaats de potten in een lade (27 cm x 54 cm) met afvoergaten en bedek de flat met een plastic vochtigheidskoepel. Deze acclimatisatiestap kan worden bereikt in de groeikamer of in de kas met groeivoorwaarden als beschreven in punt 2 (stap 2.1) hierboven.
6. Transplantatie naar de kas en de productie van T1 zaden
- Controleer de planten 2x per dag. Water als dat nodig is. Zorg ervoor dat de planten niet worden uitgedroogd of overwaterd. Het handhaven van een licht droog substraat stimuleert wortelgroei.
LET OP: De vochtigheidskoepel kan 4-7 dagen na transplantatie worden verwijderd. Planten moeten worden gekweekt in deze kleine potten totdat ze zichtbaar zijn hersteld van de stress van transplantatie naar de bodem. Dit duurt ongeveer 9-14 dagen. - Transplanteer de gehele bodemloze stekker en plantlet in een pot van 1,5 gal (5,9 L). Handhaven in de kas en water wanneer de bodem voelt droog aan te raken.
- Voeg een gecontroleerde afgifte meststof met N-P-K van 15-9-12 aan de pot, die kan worden opgenomen in het substraat mix of toegepast op het oppervlak.
- Wanneer oorscheuten beginnen te ontstaan uit de plant, gebruik maken van een shoot bag om de oorscheuten te dekken. Zorg ervoor dat u een zak die semi-transparant is te gebruiken, zodat de opkomende zijde kan worden waargenomen zonder verwijdering van de zak. De schietzak zorgt voor gecontroleerde bestuiving. Het is belangrijk om altijd zak transgene kwasten.
- Nadat de zijde tevoorschijn komt (1-2 dagen), trim de ontstaanzijde tot een uniforme lengte. Dit zal ongeveer 2,5 cm onder de bovenkant van de kaf bladeren. Gebruik een schone schaar die zijn gesteriliseerd in 70% ethanol. Door het trimmen van de zijde, een uniforme plukje ontwikkelt zich de volgende dag voor bestuiving optreden.
- Voor een meerderheid van maïs genotypes, de optimale tijd voor bestuiving is 2-3 dagen na kwast of zijde opkomst.
- Verzamel het stuifmeel van dezelfde plant (als het zelf bestuivde) of van een wild-type van dezelfde inteelt (indien outcrossing of kruising).
- Verzamel het stuifmeel in een kwastzak en breng het aan op het plukje zijde van de T0-plant. Als het stuifmeel afkomstig is van een wild-type (niet-transgene) plant, plaats het stuifmeel in een gewone bruine kwastzak. Als het stuifmeel afkomstig is van een transgene plant, plaats het stuifmeel in een groen gestreepte zak om aan te geven dat het stuifmeel transgeen is.
- Volg stappen 2.5-2.10 voor bestuivingsgegevens.
- Ongeveer 2 weken na bestuiving, verwijder de kwastzakken uit de oren en laat het droogvallen om te beginnen. Om te helpen afdrogen, stoppen met het besproeien van de plant 21-25 dagen na bestuiving. U ook terug te trekken de kaf bladeren om het zaad bloot. Deze praktijk helpt ook voorkomen dat schimmel.
- Ongeveer 45 dagen na bestuiving, oogst zaden en bewaar in koelopslag bij 4-12 °C.
Representative Results
Hier aangetoond is een stap-voor-stap protocol voor Agrobacterium-gemedieerde genetische transformatie van drie openbare maïs inteelt lijnen (B73, Mo17, en W22) die zijn significant op het gebied van maïs genetica. De transformatie van de drie inteeltlijnen kon niet worden bereikt met behulp van conventionele maïstransformatieprotocollen5. Figuur 1 en figuur 2 tonen de constructie en uitgangsmaterialen, die hier worden gebruikt. Oren worden over het algemeen geoogst 9-12 dagen na bestuiving. Ize's met lengtes variërend tussen 1,5-2,0 mm zijn de beste explants voor transformatie voor dit protocol (figuur 2).
Acht dagen na infectie werden ZsGreen-uitdrukkendesomatische embryo's gevisualiseerd onder het GFP-kanaal van een fluorescerende microscoop (figuur 3). Geïnfecteerde Ize's werden 8 dagen na infectie aan een warmtebehandeling onderworpen (stappen 5.1 en 5.2). Deze behandeling leidde tot de uitdrukking van CRE recombinase dat de Bbm, Wus2, cre,en ZsGreen expressie cassettes geflankeerd tussen de twee loxP sites (figuur 1) uitgesneden. De warmtebehandelde weefsels werden vervolgens gekweekt op scheutvorming medium met het herbicide imazapyr voor de selectie van getransformeerd weefsel na morfogene genverwijdering.
Het vermenigvuldigen van weefsels met rijpende embryo's of schietknoppen die resistent waren tegen imazapyr werden ongeveer 3-4 weken na infectie waargenomen(figuur 4). Sommige imazapyr-resistente weefsels waren negatief voor ZsGreen, wat suggereert dat cre-gemedieerde excisie waarschijnlijk in deze weefsels(figuur 4) heeft plaatsgevonden. Nadat de weefsels werden verplaatst naar wroetende medium en licht incubatie, scheuten begon te ontwikkelen (Figuur 5). Gezonde en krachtige groeischeuten met goed ontwikkelde wortels werden geoogst (figuur 5). Sommige weefsels bleken meerdere scheuten te hebben (Figuur 5E,F,G). Dit type "grasachtige" regenerant kan te wijten zijn aan klonale planten met identieke transgene integratie patronen. Moleculaire biologische analyse is nodig om deze planten te genotypen.
Alle drie de openbare inteelt lijnen reageerden goed met behulp van dit protocol, evenals de constructie gebruikt in dit werk. W22 produceerde de hoogste frequentie van imazapyr-resistente scheuten, met een frequentie van ongeveer 14% (ongeveer 14 transgene scheuten per 100 geïnfecteerde onrijpe embryo's). Zowel B73 als Mo17 produceerden ongeveer 4% transgene scheuten. Deze frequenties geven alle transgene scheuten aan, inclusief zowel planten die de morfogene genen dragen als planten met het morfogene gen dat door de CRE-gemedieerde excisie wordt verwijderd.
Figuur 1: Schematische weergave van het T-DNA-gebied van de binaire plasmid PHP81430. RB = rechter T-DNA grens; loxP = CRE recombinase doelsite; Axig1pro:Wus2 = maïs auxine-inducible promotor (Zm-Axig1) + Zm-Wus2 + maïs In2-1 terminator; Pltppro:Zm-Bbm = maïsfolipide transferase eiwit (Zm-Pltp) promotor + Zm-Bbm + rijst T28 terminator (Os-T28); Hsppro:cre = maize heat shock protein 17.7 promoter (Zm-Hsp17.7) + cre recombinase gen + potato proteinase inhibitor II(pinII)terminator; Ubipro:ZsGreen = sorghum ubiquitine promotor/intron (Sb-Ubi) + groen fluorescerend eiwit ZsGreen gen + rijstubiquitinterminator(Os-Ubi); Hra cassette = sorghum acetolactase synthase (Sb-Als) promotor + maïs Hra (Zm-Hra) gen + pinII terminator; LB = linker T-DNA-grens; colE1, replicatieoorsprong van plasmid ColE125; SpecR = spectinomycineresistent gen aadA1 uit Tn21 voor bacterieselectie26; Rep A,B,C = replicatie oorsprong uit pRiA4 van Agrobacterium rhizogenes27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Uitgangsmateriaal. B73 oren geoogst 12 dagen na bestuiving (A). Onrijpe embryo's van B73 (B), Mo17 (C) en W22 (D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Weefselontwikkeling op rustmedium 1 week na infectie. Embryo's (8 dagen na infectie) onder een florescentiemicroscoop (GFP-filter) met GFP die somatische embryo's van Mo17 (A) en W22 (B)uitdrukt . Ontwikkelen van weefsel (B73) onder helder veld(C) en GFP-filter(D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Weefselontwikkeling op rijpingsmedium met selectie. Een W22 rijpingsplaat (A). Ontwikkeling van weefsel (Mo17, 15 dagen na infectie) onder helder veld(B) en GFP filter(C). Ontwikkelen van weefsel (Mo17, 28 dagen na infectie) onder helder veld(D) en GFP filter(E). Pijlen wijzen op het regenereren van weefsels die geen GFP-expressie hebben, wat de excisie van ZsGreen-gen suggereert tussen de loxP-sites na warmte-geïnduceerde CRE-eiwitactiviteit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Weefselontwikkeling op basismedia. Scheuten van W22 (A), B73 (B), en Mo17 (C,D). Evenement met meerdere scheuten (grasachtige regenerants) van B73 (E) en W22 (F,G). Scheuten met wortels van B73 (H) en W22 (I). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: Mediacomposities voor maïstransformatie. Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Discussion
Traditionele protocollen voor maïstransformatie volgen het paradigma van het isoleren van onrijpe zygotische embryo's om transgeen eeltweefsel te produceren, dat wordt geregenereerd tot vruchtbare planten4,6. Hoewel dit effectief is, kunnen callus-gebaseerde protocollen tijdrovend zijn, en het duurt vaak tot 3 maanden voor het weefselkweekproces om planten te produceren. Wat maakt de hier gepresenteerde methode belangrijk is dat het callus-vrij, efficiënt, snel, en zorgt voor de regeneratie van T0 planten in ongeveer de helft van het tijdsbestek. Het lijkt ook minder genotype-afhankelijk en kan dus effectief zijn voor de meeste openbaar beschikbare inteelten 8,11.
Hoewel alle stappen effectief moeten worden gevolgd, is een correcte voorbereiding van de groeimedia noodzakelijk. Groeimediacomponenten moeten in de juiste stadia worden toegevoegd, zowel voor- als na het autoclaven, om ervoor te zorgen dat het plantmateriaal de juiste concentratie van chemicaliën ontvangt. Dit zal ervoor zorgen dat gevoelige verbindingen zoals antibiotica niet afbreken. Het is ook belangrijk dat plantaardig materiaal in elke fase op het juiste groeimedium wordt geplaatst, zoals aangegeven in het protocol. Het niet plaatsen van materiaal op het juiste groeimedium kan leiden tot materiële dood. Bovendien moet het plaatsen van te veel embryo's of het ontwikkelen van weefsels op platen worden vermeden. Terwijl het plaatsen van twee keer zoveel weefsel stukken kan de kosten van chemicaliën en petrischaaltjes (en zelfs incubator ruimte) te besparen, kan de groei van weefsel in overvolle platen ernstig worden geremd. Tijdens het uitvoeren van de infectie moet ervoor worden gezorgd dat de optische dichtheid van de Agrobacterium-suspensie geschikt is. Als de bacteriële suspensiedichtheid te laag is, kan een goede infectie niet optreden.
De kwaliteit van uitgangsmaterialen is essentieel voor succes in transformatieprotocollen. Oren die worden gebruikt voor embryodissectie moeten gezond zijn, wat betekent dat de plant die ze produceert gezond is. Ze moeten ook beschikken over een voldoende zaadset en ongedierte- en ziektevrij zijn. Ook mag oude Agrobacterium niet worden gebruikt. De "moeder" plaat mag niet meer dan 2 weken oud zijn. Na dit punt, een nieuwe "moeder" plaat moet worden gestreept om nieuwe experimenten te beginnen.
Hoewel is aangetoond dat deze methode minder genotype-afhankelijk is, kan niet worden aangenomen dat alle regels even succesvol zullen zijn. Er kan nog steeds variatie tussen de lijnen en verschillen in succes op basis van de constructie wordt gebruikt. Oor-tot-oor variabiliteit is ook onvermijdelijk bij het werken met onrijpe embryo's, dus idealiter experimenten moeten meerdere oren gebruiken om dit te verantwoorden. In dit werk presteerde inteelt W22 het beste, met een transformatiefrequentie van meer dan ~ 14%, gevolgd door B73 en Mo17 (~ 4% per stuk). Lowe et al.8 gemeld met behulp van de QuickCorn protocol voor B73 en Mo17 transformatie. In dit werk varieerden de transformatiefrequenties van 9%-50% voor B73 en 15%-35% voor Mo17.
Een mogelijkheid voor de lagere transformatiefrequenties voor B73 en Mo17 waargenomen in dit werk kan worden toegeschreven aan seizoensgebonden oor kwaliteit fluctuatie. Een ander verschil tussen dit werk en dat van Lowe et al.8 is dat hier verschillende vectorconstructies werden gebruikt. In Lowe's werk werden morfogene genen niet verwijderd uit de getransformeerde planten, maar in de latere stadia ontwikkelingshet zwijgen opgelegd. In dit werk werden de morfogene genen 8 dagen na de infectie verwijderd. Het is mogelijk dat B73 en Mo17 een langere aanwezigheid van Bbm/Wus2 nodig hebben voor de ontwikkeling van somatische embryo's.
Met behulp van deze methode is er een mogelijkheid om niet-transgene ontsnappingsinstallaties, multimeric invoegingen en niet-weggesneden transgenen te verkrijgen. Deze planten zullen geen merkbaar verschillend fenotype hebben, dus detectie door PCR is nodig om te bepalen of een plant transgeen is. Om dit te bereiken, PCR primers binnen de accijnsregio en primers flankeren de accijnsregio kan worden gebruikt. Meerdere onafhankelijke transformaties kunnen ook planten produceren uit hetzelfde onrijpe embryo, waardoor de bepaling van de totale onafhankelijke transformatieve herstelsnelheid moeilijk is. Onze standaard is het berekenen van een transformatiesnelheid op basis van het bemonsteren van een plant uit elk onvolwassen embryo dat planten produceerde en dit deelde door het aantal geïnfecteerde embryo's. Deze methode onderschat vrijwel zeker het werkelijke aantal onafhankelijke gebeurtenissen teruggewonnen als plantenbakken. Discriminatie tussen onafhankelijke gebeurtenissen uit hetzelfde embryo vereist het rangschikken van grensregio's rond transgenen, en dit zal voor de meeste toepassingen onbetaalbaar en tijdrovend zijn; er kunnen echter gevallen zijn waarin deze gegevens nuttig zijn.
Deze methode van weefselkweektransformatie heeft bewezen zeer effectief te zijn, maar er kunnen nog steeds problemen optreden. Als plantaardig materiaal niet reageert, is het mogelijk dat er een probleem is met de specifieke inteeltlijn, wat suggereert dat variabelen zoals de samenstelling van de groeimedia en het tijdstip van subculturing aanpassingen vereisen. Een andere variabele is een goed vectorontwerp en nauwkeurige vectorconstructie, als de oorspronkelijke vector wordt gewijzigd. Er kunnen ook problemen zijn met imazapyr-gevoeligheid, omdat sommige lijnen gevoeliger zijn dan andere, en de concentratie van imazapyr moet mogelijk worden aangepast om succesvol getransformeerde planten te bereiken.
In de afgelopen 30 jaar zijn de maïsweefselkweek en transformatieprotocollen veranderd en gevorderd; en er wordt aangenomen dat dit verkorte protocol deze vooruitgang zal bevorderen. Deze methode is effectief voor academische instellingen omdat het minder tijdrovend is dan traditionele methoden. Bovendien vraagt het niet om hoog opgeleide exploitanten, waardoor zij vatbaarder is voor een wijdverbreide distributie in vergelijking met traditionele methoden. In de toekomst kan deze methode worden gecombineerd met nieuwe technologieën zoals genoomengineering.
Disclosures
Alicia Masters, William Gordon-Kamm, en Todd Jones zijn medewerkers van Corteva Agriscience die het protocol en maïs oren van B73, Mo17, en W22 gebruikt in dit artikel geleverd. De auteurs Minjeong Kang, Morgan McCaw, Jacob Zobrist en Kan Wang hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de Corteva kas team voor het verstrekken van maïs onvolwassen oren, de Corteva media prep lab voor het verstrekken van hulp bij het maken van media, Ning Wang uit Corteva voor hulp met de Agrobacterium constructie, en Keunsub Lee van Iowa State University voor hulp. Dit project werd gedeeltelijk ondersteund door National Science Foundation Plant Genome Research Program Grant 1725122 en 1917138 aan K.W., door Predictive Plant Phenomics Research Traineeship Program (National Science Foundation Grant DGE-1545453) aan J.Z., door het USDA NIFA Hatch-project #IOW04341, door staat sein iowa fondsen, en door Crop Bioengineering Center van Iowa State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4-D | Millipore Sigma | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (BAP) | Millipore Sigma | B3408 | |
| Acetosyringone | Millipore Sigma | D134406 | |
| Agar | Millipore Sigma | A7921 | |
| Aluminum foil | To cover the flask | ||
| Ammonium Sulfate | Millipore Sigma | A4418 | |
| Analytical balance | To weigh small quantities of chemicals | ||
| Autocalve | Primus (Omaha, NE) | PSS5-K | To autoclave media and tools |
| Bacterial culture loop (10 µl) | Fisher scientific | 22-363-597 | Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid |
| Bactoagar | BD bioscience | 214030 | |
| Beakers (1 L, 2 L, 4 L) | To mix the chemicals for media | ||
| Benomyl | Millipore Sigma | #45339 | |
| Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) | Clorox | For seed sterilization | |
| Boric Acid | Millipore Sigma | B6768 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | |
| Carbenicillin | Millipore Sigma | C3416 | |
| Casein Hydrolysate | Phytotech | C184 | |
| Cefotaxime | Phytotech | C380 | |
| Conical tube (50 mL) | Fisher scientific | 06-443-19 | Contain liquid medium and Agro suspension |
| Cuvette (Semi-micro) | Fisher scientific | 14955127 | To hold liquid for measuring OD |
| Dicamba | Phytotech | D159 | |
| Digital hygrometer | Checking temperature and humidity for heat treatment | ||
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Millipore Sigma | 324503 | |
| Eppendorf tube (2.0 mL) | ThermoFischer Scientific | AM12475 | |
| Eriksson's Vitamins | Phytotech | E330 | 1000x in liquid |
| Ethanol (70%) | Sterilizing tools and surfaces | ||
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | F8263 | |
| Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 | ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) | A903206 | Fertilizer |
| Flask (2 L) | Pyrex | 10-090E | To autoclave media and tools |
| Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) | Hummert International (Earth City, Mo) | 11300000 | Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome |
| Forceps (fine-tipped and large) | Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders | ||
| Gentamicin | Gold Biotechnologies | G-400 | |
| Glass bottle (1 L) | Pyrex | 06-414-1D | To autoclave medium |
| Graduated cylinder | To adjust volume of media | ||
| Imazapyr | Millipore Sigma | 37877 | |
| Incubator, 20 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection |
| Incubator, 27 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow co-cultivation plate and maize embryo culture |
| Incubator, 45 °C | Heat shock treatment | ||
| Insert TO Standard, pots | Hummert International (Earth City, Mo) | 11030000 | For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome |
| Laminar flow hood | Maintains sterile conditions | ||
| L-proline | Phytotech | P698 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | M1880 | |
| Maize inbred seed B73 | U.S National Plant Germplasm | id=47638 | |
| Maize inbred seed Mo17 | U.S National Plant Germplasm | id=15785 | |
| Maize inbred seed W22 | U.S National Plant Germplasm | id=61755 | |
| Manganese Sulfate Monohydrate | Millipore Sigma | M7899 | |
| Milli-Q Water purification systems | Millipore sigma | MILLIQ | For tissue culture grade water |
| MS Basal Medium | Millipore Sigma | M5519 | |
| MS Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | M5524 | |
| N6 Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | C1416 | |
| Paperclips, non-skid | Holding on tassel bags | ||
| Peptone | BD bioscience | 211677 | |
| Petri dish (100x15 mm) | Fisher scientific | FB0875713 | For bacteria culture medium |
| Petri dish (100x25 mm) | Fisher scientific | FB0875711 | For the plant tissue culture medium |
| pH meter | Fisher scientific | AB150 | To adjust pH of media |
| Pipette (1 mL) | ThermoFischer Scientific | 4641100N | |
| Plastic Boxes | The Container Store | 10048430 | For tissue culture storage and incubation |
| Plastic humidy dome (Humi-Dome) | Hummert International (Earth City, Mo) | 14385100 | Plastic cover for soil flat |
| Potassium Iodide | Millipore Sigma | 793582 | |
| Potassium Nitrate | Millipore Sigma | P8291 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Millipore Sigma | P5655 | |
| Scale | To weigh chemicals for media | ||
| Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) | Thermo Scientific | 3120030 | remove the top of the kernel crowns for embryo dissection |
| Scalpel handle | Holding scalpel blades | ||
| Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) | Phytotech | S826 | 100x powder |
| Scissors | Cutting ear shoots | ||
| Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) | Seedburo (Des Plaines, IL) | S26 | Semi-transparent bag to cover ear shoots |
| Silver Nitrate | Millipore Sigma | S7276 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate | Millipore Sigma | M1651 | |
| Soiless substrate LC1 | SunGro Horticulture (Agawam, Ma) | #521 | For growing maize plants |
| Spatula (Double Ended Micro-Tapered) | Fischer Scientific | 2140110 | Dissecting embryos from kernels |
| Spatula (with spoon) | Fisher scientific | 14-375-10 | To measure chemicals for media |
| Spectinomycin | Millipore Sigma | S4014 | |
| Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) | Thermo Scientific | 840-300000 | Measure OD of Agro suspension |
| Stirring bar | Fisher scientific | 14-513-67 | To mix media |
| Stirring hotplates | To mix media | ||
| Syringe (without needle, 60 mL) | Fisher scientific | 14-823-43 | For filter sterilization |
| Syringe filter (0.22 µm) | Fisher scientific | 09-720-004 | For filter sterilization |
| Tassel bag (Canvasback- brown) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514 | Bag to cover tassels of non-transgenic plants |
| Tassel bag (Canvasback-green stripe) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514G | Bag to cover tassels of transgenic plants |
| Thiamine HCl | Phytotech | T390 | |
| Thidiazuron | Phytotech | T888 | |
| Thymidine | Millipore Sigma | T1895 | |
| Timentin | Phytotech | T869 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | Cas #9005-64-5 | surfactant |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI0236 | Homogenizes liquids (Agro suspension) |
| Water bath (large - Precision model 186) | Fisher scientific | any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C | Keeps autoclaved media at optimal temperature |
| Weigh dish | Fisher scientific | 08-732-112 | To measure chemicals for media |
| Weighing paper | Fisher scientific | 09-898-12A | To measure chemicals for media |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP14222 | |
| Zeatin | Millipore Sigma | Z0164 |
References
- Zhao, Z. Y., et al. High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize. Molecular Breeding. 8 (4), 323-333 (2002).
- Green, C. E., Phillips, R. L. Plant regeneration from tissue cultures of maize. Crop Science. 15 (3), 417-421 (1975).
- Ji, Q., Xu, X., Wang, K. Genetic transformation of major cereal crops. International Journal of Developmental Biology. 57, 495-508 (2013).
- Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang, K. Maize (Zea mays, L). Agrobacterium Protocols. Wang, K. , 3rd edition, Springer, USA. 101-117 (2015).
- Frame, B., et al. Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts. Plant Cell Reports. 25 (1), 1024-1034 (2006).
- Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Frontiers in Plant Science. 5 (379), (2014).
- Lowe, K. S., et al. Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation. The Plant Cell. 28 (9), 1998-2015 (2016).
- Lowe, K. S., et al. Rapid genotypes independent maize transformation via direct somatic embryogenesis. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 54 (3), 240-252 (2018).
- Boutilier, K., et al. Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth. The Plant Cell. 14 (8), 1737-1749 (2002).
- Zuo, J., Niu, Q. W., Frugis, G., Chua, N. H. The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. The Plant Journal. 30 (3), 349-359 (2002).
- Jones, T. J., et al. Maize transformation using the morphogenic genes Baby Boom and Wuschel2. Transgenic Plants. Kumar, S., Barone, P., Smith, M. , 81-93 (2019).
- Anand, A., et al. An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation. Plant Molecular Biology. 97 (1-2), 187-200 (2018).
- Ray, K., et al. Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (Oilseed Mustard). Journal of Plant Physiology. 161 (9), 1079-1083 (2004).
- Green, J. M., Hale, T., Pagano, M. A., Andreassi, J. L. II, Gutteridge, S. A. Response of 98140 corn with gat4621 and hra transgenes to glyphosate and ALS-inhibiting herbicides. Weed Science. 57 (2), 142-148 (2009).
- An, G., et al. Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene. The Plant Cell. 1 (1), 115-122 (1989).
- Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Biotechnology. 17 (10), 969-973 (1999).
- Passarinho, P., et al. Target Genes Provide Diverse Entry Points into Cell Proliferation and Cell Growth Pathways. Plant Molecular Biology. 68 (3), 225-237 (2008).
- Bhyri, P., Khrishnamurthy, N., Narayanan, E., Nott, A., Sarangi, R. R. Novel plant terminator sequences. Patent Number US2014/0130205. , (2014).
- Laux, T., Mayer, K. F., Berger, J., Jürgens, G. The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis. Development. 122 (1), 87-96 (1996).
- Garnaat, C., Lowe, K., Roth, B. Zm-AXIG1-specific polynucleotides and methods of use. Patent Number WO2002006499. , (2002).
- Hershey, H. P., Stoner, T. D. Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn. Plant Molecular Biology. 17 (4), 679-690 (1991).
- Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. Journal of Biological Chemistry. 259 (3), 1509-1514 (1984).
- Sun, A. Q., et al. Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7 from Maize. ACTA Agronomica Sinica. 41 (3), 414 (2015).
- Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (14), 5166-5170 (1988).
- Hershfield, V., Boyer, H. W., Yanofsky, C., Lovett, M. A., Helinski, D. R. Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3455-3459 (1974).
- Liebert, C. A., Hall, R. M., Summers, A. O. Transposon Tn21, flagship of the floating genome. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (3), 507-522 (1999).
- Nishiguchi, R., Takanami, M., Oka, A. Characterization and sequence determination of the replicator region in the hairy-root-inducing plasmid pRiA 4b. Molecular and General Genetics. 206 (1), 1-8 (1987).
