Summary
I geni morfogenici delle piante possono essere utilizzati per migliorare la trasformazione genetica dei genotipi recalcitranti. Descritto qui è un protocollo di trasformazione genetica mediata agrobatterica(QuickCorn) per tre importanti linee pubbliche di mais.
Abstract
Dimostrata qui è un protocollo dettagliato per la trasformazione genetica mediata di lineeinbred di mais con geni morfogenici Baby boom (Bbm) e Wuschel2 (Wus2). Bbm è regolato dal promotore del gene del puritacolo di mais (Pltp) e Wus2 è sotto il controllo di un promotore indotto da auxina di mais (Axig1). Un ceppo di Agrobacterium che trasporta questi geni morfogeni sul DNA di trasferimento (T-DNA) e copie extra di virulenza di Agrobacterium (vir) sono utilizzati per infettare espiante embrionali immature di mais. Gli embrioni somatici si formano sulla scutella degli embrioni infetti e possono essere selezionati dalla resistenza agli erbicidi e germinati in piante. Un sistema di ricombinazione cre/loxP attivato a caldo integrato nel costrutto del DNA consente di rimuovere i geni morfogeni dal genoma del mais durante una fase iniziale del processo di trasformazione. Le frequenze di trasformazione di circa il 14%, 4% e 4% (numero di eventi transgenici indipendenti ogni 100 embrioni infetti) possono essere raggiunte rispettivamente per W22, B73 e Mo17 utilizzando questo protocollo.
Introduction
La trasformazione è uno strumento di base per valutare l'espressione genica estranea nel mais e produrre linee di mais geneticamente modificate sia per scopi di ricerca che commerciali. L'accesso alla trasformazione ad alta produttività può facilitare la maggiore necessità di studi di biologia molecolare e cellulare di mais1. La capacità di trasformare geneticamente le specie di colture è vitale sia per i laboratori pubblici che per quelli privati. Ciò consente sia una comprensione fondamentale dei meccanismi di regolazione genica sia un miglioramento delle colture su scala globale per sostenere una popolazione in continua crescita.
La scoperta che gli embrioni immaturi dal mais potrebbero essere utilizzati per la produzione di callo rigenerabile originata nel 19752. Da questa rivelazione, i protocolli di trasformazione del mais più scalabili hanno richiesto la formazione e la selezione del callo prima della rigenerazione3. Durante il processo di trasformazione genetica, gli embrioni immaturi infettati o bombardati biolistici vengono coltivati su supporti per l'induzione del callo embrionale. I calli indotti vengono poi coltivati su supporti selettivi (ad esempio, contenenti un erbicida) in modo che solo i pezzi di callo trasformati siano in grado di sopravvivere. Questi calli transgenici putgenici resistenti agli erbicidi vengono gonfiati e rigenerati in piante. Mentre questo metodo è efficace, il processo è lungo e laborioso, e può richiedere fino a 3 mesi per completare4. Ancora più importante, i protocolli convenzionali di trasformazione del mais possiedono una limitazione molto più ampia, cioè solo un numero limitato di genotipi di mais può essere trasformato5,6.
Lowe et al.7,8 hanno riferito in precedenza un metodo di trasformazione "QuickCorn" che non solo ha ridotto notevolmente la durata del processo di trasformazione, ma ha anche ampliato l'elenco dei genotipi trasformabili. Il metodo QuickCorn utilizza ortolologi di mais (sm-Bbm e zm-Wus2) dei fattori di trascrizione dell'Arabidopsis BABY BOOM (BBM)9 e WUSCHEL (WUS)10. Quando vengono incorporati nel sistema vettoriale di trasformazione, questi geni lavorano sinergicamente per stimolare la crescita embriogenica7.
Il protocollo QuickCorn descritto in questo lavoro si basava sul protocollo in Jones et al11, che è stato un ulteriore miglioramento del metodo riportato da Lowe et al7,8. Nel presente studio, un ceppo di Agrobacterium LBA4404(Thy-) che ospita un costrutto vettoriale binario PHP81430 (Figura 1) e plasmide accessorio PHP7153912 vengono utilizzati per la trasformazione. Il DNA T di PHP81430 contiene i seguenti componenti molecolari. (1) Il gene del marcatore selettivo di trasformazione Hra expression cassette. Il gene di mais Hra èun gene di sinteassi dell'acetolactassi modificato (ALS) che è tollerante agli erbicidi inibitori della SLA come il sulfonylureas e imidazolinones13,14. Il gene sèm-Hra è regolato dal promotore di Sorhum ALS8 e dall'inibitore della proteina di patate II(pinII) terminatore15. Il DNA T contiene anche (2) una cassetta di espressione che possiede il gene marcatore schermato di trasformazione . Questo gene di proteine fluorescenti verdi , sGreen di zoanthus sp. corallo barriera16 è regolato da un sorgomo promotore/intron e riso ubiquitin terminatore.
Inoltre, il DNA T contiene (3) la cassetta di espressione Bbm del gene morfogenico. Bbm è un fattore di trascrizione associato allo sviluppo embrionale9,17. Bbm è regolato dalla proteina trasferiresate di fosfolipidi di mais (Pltp) promotore8 e riso T28 terminator18. Lo zm-Pltp è un gene con una forte espressione nell'epitelio di scutellare embrione, peli di seta e cellule sussidiariche delle foglie (che fiancheggiano le cellule di guardia), bassa espressione negli organi riproduttivi e nessuna espressione nelle radici8. Contiene anche (4) la cassetta dell'espressione Wus2 del gene morfogenico. Wus2 è un altro fattore di trascrizione associato alla manutenzione del meristemapicale 19. Il promotore di mais auxine-inducible di mais (sm-Axig1)20 e il mais In2-1 terminator21. Infine, il T-DNA contiene (5) il sistema di ricombinazione cre-loxP. Il gene22 della crema ricombinase è sotto il controllo della proteina shock termico di mais 17.7 (Hsp17.7)23 promotore e schiacciante dipatate perno II terminatore. Due siti loxP (nello stesso orientamento)24 fiancheggiano quattro cassette di espressione genica, tra cui sGreen, cre, Bbm e Wus2.
Poiché la presenza dei geni morfogenici non è desiderata per la maturità delle piante e la successiva progenie, il sistema di ricombinazione cre-loxP indotto dal calore è stato integrato nel DNA T per rimuovere i geni morfogenici dal genoma del mais per consentire la normale rigenerazione del callo e lo sviluppo delle piante. Durante il trattamento termico, l'espressione della proteina CRE rimuove tutti i transgeni ad eccezione del gene di selezione Hra. I trasformazioni di successo dovrebbero essere resistenti agli erbicidi, ma -negativi per ilverde. Per migliorare ulteriormente la frequenza di trasformazione, il ceppo Agrobacterium ospita anche un plasmide accessorio aggiuntivo (PHP71539) che ha copie extra di geni agrobacterium virulence (vir)12.
Il metodo QuickCorn è diverso dai protocolli convenzionali di trasformazione del mais, in quanto non comporta una fase di induzione del callus durante la trasformazione. Durante la prima settimana dopo l'infezione da Agrobacterium, embrioni somatici si sviluppano sull'epitelio scuereo degli embrioni immaturi infetti. Gli embrioni vengono poi trasferiti su un mezzo con ormoni che incoraggiano la maturazione dell'embrione e la formazione dei germogli. Trasferire rapidamente gli embrioni somatici sul mezzo di maturazione/formazione dei germogli salta lo stadio tradizionale del callo precedentemente utilizzato per la trasformazione del mais e consente la generazione diretta di piante T08. Rispetto ai metodi di trasformazione del mais pubblicati in precedenza6, il metodo QuickCorn è più veloce, più efficiente e meno dipendente dal genotipo. Utilizzando questo metodo, le piante radicate sono in genere pronte per essere trasferite sul suolo in appena 5-7 settimane, piuttosto che i tre o più mesi richiesti dai protocolli tradizionali. Lo scopo di questo articolo è fornire una descrizione approfondita e una dimostrazione del metodo, consentendo una replica più semplice in un ambiente di laboratorio che si trova in genere nella maggior parte delle istituzioni accademiche.
Protocol
1. Preparazione dei media di crescita
- Per le ricette medie di crescita esatte per questo protocollo, si prega di fare riferimento alla Tabella 1.
- Per preparare 1 L di supporti, mettere un becher da 2 L su un piatto di mescolare e mettere una barra di mescolare all'interno.
- Riempire il becher con 900 mL di acqua distillata e accendere la piastra di mescolare. La barra di agitazione dovrebbe girare a velocità media.
- Pesare tutti gli ingredienti in polvere e sciogliere in un bicchiere.
- Misurare tutti gli ingredienti liquidi, se presenti, e aggiungere al becher.
- Portare il volume finale a 1 L con acqua distillata.
- Misurare il pH e adattarsi alle specifiche della ricetta.
- Se si formula un mezzo di crescita liquido, non viene aggiunto alcun agar. Attaccare uno sterilizzatore filtrante a una pompa a vuoto e versare il mezzo di crescita liquida attraverso il filtro. Accendere la pompa e attendere che tutto il liquido venga estratto. Posizionare un tappo sul contenitore e allegare un'etichetta.
- Se si formula un mezzo di crescita solido, dopo aver regolato il pH, aggiungere l'agar direttamente in una bottiglia o in una fiaschetta.
- Versare il mezzo di crescita liquido da 1 L in un flaasso erlenmeyer da 2 L, o dividerlo in due bottiglie autoclabili da 1 L (500 mL ciascuna). Se si utilizzano due bottiglie, dividere l'agar e aggiungerlo direttamente alle bottiglie.
- Coprire il flacone con una copertura traspirante, come due strati di foglio di alluminio, per consentire al vapore di fuoriuscire. Se si utilizza una bottiglia, tappare liberamente il coperchio della vite sulla parte superiore.
- Autoclave a 121 gradi centigradi per 25 min.
- Dopo l'autoclaving, rimuovere il mezzo di crescita dall'autoclave e raffreddare a 55-60 gradi centigradi (un bagno d'acqua impostato a 55 gradi centigradi può rendere questo più facile). Mantenere il mezzo di crescita in uno stato liquido per alcune ore fino a quando non è conveniente versare piastre.
- Una volta raffreddato, aggiungere tutti gli additivi post-sterilizzazione (vedi Tabella 1) e mescolare accuratamente.
- Dopo aver aggiunto tutti gli ingredienti, versare il volume designato nel contenitore di scelta in un cappuccio a flusso laminare.
- Il mezzo di crescita può essere versato nei piatti Petri desiderati manualmente o utilizzando un apparato di erogazione liquida. Quando si versa manualmente, si consiglia di trasferire un grande volume di mezzo autoclaved in un becher sterile più piccolo (500 mL) per facilità di manipolazione.
- Lasciare raffreddare e solidificare il mezzo di crescita.
- Il mezzo di crescita sarà disponibile per l'uso una volta diventando solido ed è meglio utilizzato il giorno successivo dopo l'essiccazione leggermente durante la notte in una cappa di flusso sterile come pile di piastre lepille. Dopo l'essiccazione notturna, trasferire le piastre in maniche di plastica, piegare l'estremità libera, e tenerlo in posizione con un po 'di nastro adesivo. Ciò impedisce un'eccessiva essiccazione. Il supporto può essere conservato in un ambiente fresco, buio e pulito (4-16 gradi centigradi) per un massimo di 1 mese.
2. Coltivare piante da donatore e raccogliere orecchie immature
- Coltivare qualsiasi mais pubblicamente disponibile inbred (cioè B73, Mo17 o W22) in una serra in vasi da 1,5 galloni (5,9 L) contenenti un substrato senza terreno. Utilizzare un periodo fotografico di 16/8 (giorno/notte), con temperature medie di 25,5 gradi centigradi durante il giorno e 20 gradi centigradi di notte.
- Le piante vengono innaffiate in base alle esigenze e fecondate con un fertilizzante a rilascio controllato (N-P-K del 15-9-12), che può essere incorporato nella miscela del terreno o aggiunto alla superficie dopo la semina.
- Di solito ci vogliono circa 70-90 giorni dopo la germinazione del seme per le orecchie di emergere. Man mano che emergono i germogli per le orecchie, coprili con un sacchetto di tiro per evitare che si verifichi l'impollinazione incontrollata.
- Circa 2-3 giorni dopo l'emersio delle sete e se il polline sarà disponibile il giorno successivo, tagliare le sete utilizzando le forbici che sono state sterilizzate nel 70% di etanolo. Tagliare le sete e sbucciare circa 2,5 cm sotto l'estremità delle foglie di buccia, dove emergono le sete. L'impollinazione può essere eseguita il giorno successivo. Assicurarsi di risterilizzare le forbici tra ogni orecchio.
- Una volta che le antere emergono da una nappa, coprire la nappa con un sacchetto di nappa e una graffetta non skid alla base del sacchetto intorno al gambo.
- La mattina dopo, piegare delicatamente la pianta e toccare la borsa per incoraggiare il polline da rilasciare.
- Rimuovere il sacchetto di nappa e piegare la parte superiore del sacchetto per evitare che il polline scappi. Generalmente è meglio insaccare la nappa 1 giorno prima che venga utilizzata (per evitare l'accumulo di polline morto e versare ante). Polline fresco può essere raccolto da nappe per circa 3-5 giorni. Quando le antiresse emergono dai fiori interni alla base della nappa, quella nappa probabilmente non produrrà polline vitale il giorno successivo.
- Utilizzare il polline della stessa pianta (selfing) o di un'altra pianta dello stesso inbred (sibbing).
- Rimuovere il sacchetto dell'orecchio o tagliare l'estremità del sacchetto per esporre le sete, quindi versare rapidamente il polline dal sacchetto di nappa sulle sete.
- Coprire immediatamente l'orecchio con la sacca di nappa e pinzare la base della borsa intorno al gambo per fissarlo. Può essere utile isolare fisicamente la pianta da piante da fiore di diversi genotipi durante l'impollinazione per aiutare a prevenire l'impollinazione incrociata. Lasciare il sacchetto di nappa sull'orecchio fino a quando l'orecchio immaturo è pronto per la raccolta.
- 9-12 giorni dopo l'impollinazione, le orecchie dello schermo per le dimensioni dell'embrione. Far scorrere il sacchetto di impollinazione sul gambo per esporre l'orecchio. Tirare delicatamente la buccia verso il basso per esporre i chicchi su circa un terzo a un quarto della circonferenza dell'orecchio e circa un terzo della distanza verso il basso l'orecchio. I chicchi vicini alla punta non saranno rappresentativi della dimensione media dell'embrione.
- Utilizzando un bisturi, tagliare il tappo di un singolo kernel che appare simile alla maggior parte degli altri kernel in termini di dimensioni e colore.
- Utilizzare una spatola (con un righello) per rimuovere l'embrione come descritto al punto 4.6. Misurare la lunghezza dell'embrione utilizzando un righello incorporato sulla spatola o una pinza digitale. Se l'embrione è compreso tra 1,5-2,0 mm, raccogliere l'orecchio. Se è di 1,3 mm, l'orecchio può essere pronto per la raccolta più tardi nel corso della giornata e può essere ricontrollato in circa 7-8 h.
3. Preparazione della coltura delle sospensioni dell'agrobacterium per l'infezione
NOTA: il ceppo Agrobacterium LBA4404(Thy-) contenente PHP81430 (Figura 1) e PHP7153912 viene memorizzato come stock di glicerolo a -80 gradi centigradi. Questi materiali possono essere ottenuti da Corteva Agriscience attraverso un accordo di trasferimento di materiale. LBA4404(Thy-) è un ceppo auxotrofico che ha bisogno di timofina fornita nei media di crescita. L'utilità principale del ceppo agro-agroè è per scopi di biocontenimento. Ha l'ulteriore vantaggio di ridurre la crescita eccessiva dell'agro. Il ceppo agro-agro auxotrofico non cresce senza la timinea supplementare. Tuttavia, la timina può (presumibilmente) essere fornita dalla morte del tessuto vegetale nella coltura. Pertanto, c'è ancora la necessità di fornire un antibiotico nel mezzo per controllare completamente l'Agro auxotrofico. Tuttavia, sarà più facile da controllare a causa della crescita compromessa del ceppo auxotrofico in assenza di timidina.
- Quattro giorni prima della data dell'infezione, avviare una piastra "madre" dal brodo di glicerolo striando i batteri su una piastra YP con 50 mg/L di tiofina, 50 mg/L gentamicina e 50 mg/L spettronomina(tabella 1). Incubare la piastra "madre" in un'incubatrice di 20 gradi centigradi per 3 giorni.
- Un giorno prima dell'esperimento di infezione, preparare una piastra "di lavoro" selezionando una o cinque colonie dalla piastra "madre" e striando i batteri dalla piastra "madre" a una nuova piastra YP (con timina, gentnemica e spettronomina; Tabella 1).
- Streak la piastra quotidiana "di lavoro" in quadranti sequenziali ed eseguire il loop 1x attraverso l'area appena striata nel quadrante successivo, ripetendo per formare quadranti che sono stati diluiti serialmente. Incubare la piastra "di lavoro" durante la notte in un'incubatrice a 27 gradi centigradi.
- Dopo aver completato la dissezione dell'embrione (passaggio 4.8), utilizzare un ciclo o uno strumento simile per raccogliere l'Agrobacterium da una regione della piastra "di lavoro" in cui la crescita batterica è visibile come sottili striature di colonie.
NOTA: Evitare le aree della piastra con un prato denso di crescita batterica. La crescita dell'Agrobatterio ha probabilmente già iniziato a diminuire in aree dense, mentre nelle aree con colonie visibili i batteri sono nella fase di crescita corretta per l'infezione. - Sospendere i batteri raccolti in un tubo da 50 mL contenente 10 mL di 700A mezzo liquido (Tabella 1). Vortex per sospendere completamente la coltura batterica.
- Misurare la densità ottica ad una lunghezza d'onda di 550 nm. Regolare il volume fino a quando l'OD è compreso tra 0,35-0,45, con 0,4 come valore ottimale.
NOTA: se l'OD è superiore a 0,45, aggiungere più di 700A mezzo liquido. Se l'OD è inferiore a 0,35, inoculare più colonie agronella coltura delle sospensioni.
4. Dissezione, infezione e co-coltivazione dell'embrione
- Selezionare le orecchie adatte per gli esperimenti di trasformazione; questi dovrebbero avere un buon set di semi e avere embrioni di dimensioni variabili da 1,5-2,0 mm. Essi sono in genere raccolti tra 9-12 giorni dopo l'impollinazione. Le orecchie raccolte possono essere utilizzate fresche o conservate per 1-4 giorni a 4 gradi centigradi, anche se la qualità della risposta probabilmente si degrada progressivamente con uno stoccaggio prolungato oltre il primo giorno.
- Togliere le bucce e le sete. Inserire una maniglia nella base o nella parte superiore dell'orecchio. La maniglia può essere una coppia di pinze, cacciavite, ecc.
- Mettere le orecchie in un grande contenitore (ad esempio, becher 2 L con la maniglia verso l'alto, riempire il contenitore con soluzione di disinfezione. La soluzione di disinfezione è 1,8 L di 20% candeggina commerciale (1.65% ipoclorico di sodio) e un paio di gocce di surfactant Tween 20.
- Sterilizzare le orecchie all'interno di una panca a flusso laminare. Dopo 20 min, svuotare la soluzione di candeggina e sciacquare le orecchie 3x (5 min ciascuna) utilizzando una generosa quantità di acqua distillata sterile. Rimuovere l'acqua e lasciare asciugare le orecchie per alcuni minuti.
NOTA: È importante che le orecchie siano completamente sommerse nella soluzione di candeggina per 20 min. Spostare le orecchie con attenzione nella soluzione di candeggina di tanto in tanto per spostare le bolle d'aria. - Preparare un tubo di microcentrifuga da 2 mL riempito con un mezzo liquido 700A. Questo tubo sarà utilizzato per raccogliere gli embrioni immaturi.
- Prendere l'orecchio e con un bisturi sterile, rimuovere i primi 1-2 mm delle corone del kernel per esporre l'endosperma. Utilizzare una micro spatola per rimuovere l'embrione zigotico immaturo (EI). L'IE sarà situato all'interno del kernel, sul lato rivolto verso la punta dell'orecchio e vicino all'attaccamento alla pannocchia. Utilizzando la spatola, inserirla nell'endosperma nel pericarp più lontano dall'embrione, quindi ruotare delicatamente verso l'alto per spostare l'endosperma e consentire la rimozione dell'embrione (Figura 2).
- Utilizzando la spatola, trasferire l'embrione nel tubo contenente il mezzo liquido 700A. Continuare a fare questo fino a quando non sono stati raccolti fino a 100 embrioni. Più tubi possono essere riempiti (embrioni/tubi) di 100 dollari prima di procedere alla fase successiva. A questo punto, la sospensione Agrobacterium deve essere preparata (vedi passo 3.5).
- Rimuovere il mezzo liquido 700A dal tubo embrionale con una pipetta da 1 mL. Aggiungere nuovo 700A mezzo per lavare gli embrioni, quindi rimuovere anche quel supporto.
- Aggiungere 1 mL della sospensione Agrobacterium e del vortice su un'impostazione bassa (3/10) per 30 s o invertire il tubo 12x-15x per mescolare. Lasciare riposare questo tubo orizzontalmente sulla panchina per 5 min.
- Dopo 5 min, trasferire l'intero tubo di embrioni e sospensione Agrobacterium su una piastra di 562V centro di co-coltivazione (tabella 1). Questo può essere ottenuto posizionando la piastra sulla panca e versando rapidamente il contenuto del tubo sulla piastra. Ruotare delicatamente la piastra per distribuire gli embrioni e rimuovere la sospensione Agrobacterium utilizzando una pipetta da 1 mL.
- Assicurarsi che gli embrioni siano posizionati con il lato scutellum (rotondo) rivolto verso l'alto. Se necessario, utilizzare una lente di ingrandimento o un mirino di dissezione. Mettere le piastre in scatole di plastica (19 cm x 28 cm x 5,1 cm) e incubare le piastre durante la notte 16-18 h a 21 gradi centigradi al buio. Non è necessario avvolgere la piastra con pellicola di paraffina o nastro adesivo.
- Dopo la co-coltivazione notturna, spostare gli embrioni infetti, il lato del scutellum verso l'alto, sul mezzo a riposo 605T (Tabella 1). Mettere circa 30 embrioni per piastra. Incubare le piastre a 26-28 gradi centigradi al buio.
- Incubare per 4-10 giorni (7 giorni è preferito). In questo momento, lo sviluppo di embrioni somatici può essere osservato sulla superficie dello scutellum zigotico (Figura 3).
5. Selezione, trattamento termico e rigenerazione
- Dopo il periodo di riposo, il calore scuote gli embrioni. Posizionare la scatola contenente le lastre di embrioni in un'incubatrice di 45 gradi centigradi con umidità relativa del 70% per 2 h. Quindi, togliere la scatola dall'incubatrice a 45 gradi centigradi e collocarla nell'incubatrice scura 26-28 gradi per 1-2 h.
NOTA: Se non è possibile raggiungere il 70% di umidità in un'incubatrice, aggiungere un doppio strato di asciugamani di carta autoclavi sul fondo della scatola della piastra e immergere con acqua autoclaved per mantenere l'umidità all'interno della scatola. Riportare i piatti sulla parte superiore degli asciugamani di carta e sigillare il coperchio prima di posizionarlo a 45 gradi centigradi. Utilizzare un piccolo igrometro/termometro digitale per monitorare la temperatura e l'umidità. - Trasferire le IE trattate termicamente dal mezzo di riposo al mezzo di formazione del tiro (13329A) contenente 0,05 mg/L imazapyr come agente selettivo (tabella 1). Durante il trasferimento, rimuovere i coleoptiles, se presenti, usando pinze a punta fine o forbici chirurgiche.
- Mettere 10-15 embrioni per piastra per evitare il sovraffollamento. Conservare gli embrioni in questo mezzo per 2 settimane nell'incubatrice scura a 26 gradi centigradi.
- Trasferire gli embrioni al mezzo di radicamento (13158; Tabella 1) per 1-2 settimane. Collocare circa otto pezzi per piatto e incubare in una stanza luminosa o camera luminosa (16 giorno/8 notte, 20-150 mol/m2/s) a 27 gradi centigradi.
- Man mano che si sviluppano le piantagioni, posiziona le piantine più forti contenenti sia germogli che radici vigorose su nuove piastre di radicamento medie, posiziona una pianta per piastra. Ciò consentirà una maggiore crescita delle plantiche. Posizionare le piastre nella stanza luminosa o nella camera luminosa per altri 7-14 giorni.
NOTA: rimuovere con attenzione tutti i pezzi callus associati alla pianta per assicurarsi che sia in buon contatto con il mezzo. - Come la pianta diventa più vigorosa, rimuovere la pianta dal mezzo di radicamento e sciacquare le radici con acqua del rubinetto per rimuovere l'agar.
- Trapiantare singole piante in 3 penti in2 (19 cm2)contenenti un substrato soilless pre-bagnato. Mettere le pentole in un vassoio (27 cm x 54 cm) con fori di scarico e coprire l'appartamento con una cupola di umidità di plastica. Questa fase di acclimatamento può essere raggiunta sia nella camera di crescita che in serra con condizioni di crescita descritte nella sezione 2 (passaggio 2.1) sopra.
6. Trapianto alla serra e produzione di semi di T1
- Controllare le piante 2 volte al giorno. Acqua in base alle esigenze. Assicurarsi che le piante non siano né essiccate né sovranviate. Mantenere un substrato leggermente asciutto favorisce la crescita della radice.
NOTA: La cupola di umidità può essere rimossa 4-7 giorni dopo il trapianto. Le piante devono essere coltivate in questi piccoli vasi fino a quando non hanno visibilmente recuperato dallo stress del trapianto al suolo. Questo dovrebbe richiedere circa 9-14 giorni. - Trapiantare l'intero tappo e piantalet senza terreno in un vaso da 1,5 gal (5,9 L). Mantenere in serra e acqua quando il terreno si sente asciutto al tatto.
- Aggiungere un fertilizzante a rilascio controllato con N-P-K di 15-9-12 al piatto, che può essere incorporato nella miscela di substrato o applicato alla superficie.
- Quando i germogli auricolari iniziano ad emergere dalla pianta, utilizzare una borsa di tiro per coprire i germogli dell'orecchio. Assicurarsi di utilizzare un sacchetto semi-trasparente in modo che le sete emergenti possano essere osservate senza rimozione della borsa. Il sacco di tiro consente l'impollinazione controllata. È importante bagare sempre le nappe transgeniche.
- Dopo che le sete emergono (1-2 giorni), tagliare le sete emerse ad una lunghezza uniforme. Questo sarà circa 2,5 cm sotto la parte superiore delle foglie di buccia. Utilizzare un paio di forbici pulite che sono state sterilizzate nel 70% di etanolo. Tagliando le sete, un ciuffo uniforme si sviluppa il giorno seguente per l'impollinazione.
- Per la maggior parte dei genotipi di mais, il tempo ottimale per l'impollinazione è 2-3 giorni dopo l'emergere di nappa o seta.
- Raccogliere il polline dalla stessa pianta (se auto-impollinato) o da un tipo selvaggio dello stesso inbred (se in corso di attraversamento o inviccolo).
- Raccogliere il polline in un sacchetto di nappe e applicarlo sul ciuffo di seta della pianta T0. Se il polline proviene da una pianta di tipo selvatico (non transgenica), posizionare il polline in un sacchetto di nappa marrone pianura. Se il polline proviene da una pianta transgenica, posiziona il polline in un sacchetto a strisce verdi per indicare che il polline è transgenico.
- Seguire i passaggi 2.5-2.10 per i dettagli sull'impollinazione.
- Circa 2 settimane dopo l'impollinazione, rimuovere i sacchetti di nappa dalle orecchie e lasciare asciugare per iniziare. Per asciugare, smettere di annaffiare la pianta 21-25 giorni dopo l'impollinazione. Puoi anche tirare indietro le foglie di buccia per esporre il seme. Questa pratica aiuta anche a prevenire la muffa.
- Circa 45 giorni dopo l'impollinazione, raccogliere i semi e conservarli in celle frigorifere a 4-12 gradi centigradi.
Representative Results
Divenuto qui è un protocollo passo-passo per la trasformazione genetica mediata da Agrobacterium- di tre linee pubbliche di mais (B73, Mo17 e W22) che sono state significative nel campo della genetica del mais. La trasformazione delle tre linee inbred non è stato possibile ottenere utilizzando protocolli convenzionali di trasformazione del mais5. Figura 1 e Figura 2 Mostra il costrutto e materiali di partenza, rispettivamente, utilizzato qui. Le orecchie sono generalmente raccolte 9-12 giorni dopo l'impollinazione. Le IE con lunghezze comprese tra 1,5-2,0 mm sono i migliori espianti per la trasformazione per questo protocollo (Figura 2).
Otto giorni dopo l'infezione, gli embrioni somatici che esprimono il green sono stati visualizzati sotto il canale GFP di un microscopio fluorescente (Figura 3). Le IE infette sono state sottoposte a trattamento termico 8 giorni dopo l'infezione (passaggi 5.1 e 5.2). Questo trattamento ha indotto l'espressione di RIcombinante CRE che ha esitato le cassette di espressione Bbm, Wus2, cree sGreen affiancate tra i due siti loxP (Figura 1). I tessuti trattati termicamente sono stati poi coltivati su un mezzo di formazione di germogli contenente l'erbicida imazapyr per la selezione del tessuto trasformato dopo la rimozione del gene morfogenico.
Tessuti che proliferano con embrioni in maturazione o germogli di tiro resistenti all'imazapyr sono stati osservati circa 3-4 settimane dopo l'infezione (Figura 4). Alcuni tessuti imazapyr-resistente erano negativi per sGreen, suggerendo chel'escissione mediata cremata probabilmente si è verificato in questi tessuti (Figura 4). Dopo che i tessuti sono stati spostati nel mezzo di radicamento e nell'incubazione leggera, i germogli hanno iniziato a svilupparsi (Figura 5). Sono stati raccolti germogli di crescita sani e vigorosi con radici ben sviluppate (Figura 5). Alcuni tessuti sembravano avere più germogli (Figura 5E,F,G). Questo tipo di rigenerazione "erba" può essere dovuto alle piante clonali che hanno modelli identici di integrazione transgenica. Per genotili queste piante è necessaria un'analisi biologica molecolare.
Tutte e tre le linee pubbliche inbred hanno risposto bene utilizzando questo protocollo così come il costrutto utilizzato in questo lavoro. W22 ha prodotto la più alta frequenza di germogli resistenti agli imazapyr, con una frequenza di circa il 14% (circa 14 germogli transgenici per 100 embrioni immaturi infetti). Sia B73 che Mo17 hanno prodotto circa il 4% di germogli transgenici. Queste frequenze indicano tutti i germogli transgenici, comprese entrambe le piante che trasportano i geni morfogenici e le piante con il gene morfogenico rimosso dall'escissione mediata dal CRE.
Figura 1: Rappresentazione schematica della regione T-DNA del plasmide binario PHP81430. RB - bordo destra T-DNA; loxP - sito di destinazione ricombinano CRE; Axig1pro:Wus2 - promotore auxina inducibile di mais (.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pltppro:Proteina promotrice di trasferimentodi fosforesi di mais ( , ) promotrice di mais ()- sm-Bbm , riso T28 terminatore (Os-T28); Hsppro: cre -promotrice di shock termico di mais 17,7 (sm-Hsp17.7) , gene ricombinante della crema , inibitore della proteina di patate II (pinI)terminatore; Ubipro:sGreen , sorghum ubiquitin promotore/intron (Sb-Ubi) , proteina fluorescente verde , gene verde , terminatore di ubiquitina di riso (Os-Ubi); Hra cassetta - sorghum acetolactase synthase (Sb-Als) promotore di mais Hra (sm-Hra) - terminatore pinII; LB - bordo T-DNA sinistro; colE1, origine replicare del plasmide ColE125; SpecR - Gene resistente alla spettronomina aadA1 da Tn21 per la selezione del batterio26; Rep A,B,C - origine della replica da pRiA4 di Agrobacterium rhizogenes27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Materiali di partenza. Orecchie B73 raccolte 12 giorni dopo l'impollinazione (A). Embrioni immaturi di B73 (B), Mo17 (C) e W22 (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Sviluppo dei tessuti su media a riposo 1 settimana dopo l'infezione. Embrioni (8 giorni dopo l'infezione) al microscopio a florescenza (filtro GFP) che mostra GFP che esprime embrioni somatici di Mo17 (A) e W22 (B). Tessuto in via di sviluppo (B73) sotto il campo luminoso (C) e il filtro GFP (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Sviluppo dei tessuti sul mezzo di maturazione con selezione. Piastra di maturazione W22 (A). Tessuto in via di sviluppo (Mo17, 15 giorni dopo l'infezione) sotto il filtro a campo luminoso (B) e GFP (C). Tessuto in via di sviluppo (Mo17, 28 giorni dopo l'infezione) sotto il filtro a campo luminoso (D) e GFP (E). Le frecce indicano la rigenerazione dei tessuti che mancano di espressione GFP, suggerendo l'escissione del gene verde tra i siti loxP dopo l'attività proteica CRE indotta dal calore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Sviluppo di tessuti su supporti radicanti. Spara di W22 (A), B73 (B) e Mo17 (C,D). Evento con più germogli (rigeneranti erbosi) di B73 (E) e W22 (F,G). Spara con radici di B73 (H) e W22 (I). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Composizioni multimediali per la trasformazione del mais. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Discussion
I protocolli tradizionali per la trasformazione del mais seguono il paradigma di isolare gli embrioni zigiti immaturi per produrre tessuto callo sogengenico transgenico, che viene rigenerato in piante fertili4,6. Mentre questo è efficace, protocolli callus-based possono richiedere molto tempo, e spesso ci vogliono fino a 3 mesi per il processo di coltura dei tessuti per produrre piante. Ciò che rende significativo il metodo qui presentato è che è senza callus, efficiente, veloce e consente la rigenerazione delle piante T0 in circa la metà dei tempi. Sembra anche essere meno dipendente dal genotipo e può quindi essere efficace per la maggior parte degli inbred disponibili pubblicamente8,11.
Mentre tutti i passaggi devono essere seguiti in modo efficace, una corretta preparazione dei media di crescita è imperativa. I componenti dei mezzi di crescita devono essere aggiunti nelle fasi corrette, sia pre che post-autoclave, per garantire che il materiale vegetale riceva la corretta concentrazione di sostanze chimiche. Questo garantirà che composti sensibili come antibiotici non si rompono. È inoltre importante che il materiale vegetale sia collocato sul mezzo di crescita corretto in ogni fase, come indicato nel protocollo. Non mettere materiale sul mezzo di crescita corretto può causare la morte materiale. Inoltre, si dovrebbe evitare di mettere troppi embrioni o di sviluppare tessuti su lastre. Mentre il posizionamento di pezzi di tessuto il doppio può risparmiare il costo di sostanze chimiche e piatti Petri (e anche lo spazio di incubatrice), la crescita del tessuto in piastre sovraffollate può essere seriamente inibita. Durante l'esecuzione dell'infezione, dovrebbe essere assicurato che la densità ottica della sospensione Agrobacterium sia appropriata. Se la densità delle sospensioni batteriche è troppo bassa, potrebbe non verificarsi un'infezione corretta.
La qualità dei materiali di partenza è essenziale per il successo nei protocolli di trasformazione. Le orecchie utilizzate per la dissezione dell'embrione devono essere sane, il che significa che la pianta che le produce è sana. Devono anche possedere un set di semi adeguato ed essere privi di parassiti e malattie. Inoltre, il vecchio Agrobacterium non deve essere utilizzato. Il piatto "madre" non dovrebbe essere più di 2 settimane. Dopo questo punto, una nuova piastra "madre" dovrebbe essere striata per iniziare nuovi esperimenti.
Sebbene questo metodo sia meno dipendente dal genotipo, non si può presumere che tutte le righe avranno lo stesso successo. Ci possono ancora essere variazioni tra le linee e differenze di successo in base al costrutto utilizzato. La variabilità da orecchio a orecchio è inevitabile anche quando si lavora con embrioni immaturi, quindi idealmente gli esperimenti dovrebbero usare più orecchie per spiegare questo. In questo lavoro, W22 inbred ha ottenuto il meglio, con una frequenza di trasformazione di oltre il 14%, seguita da B73 e Mo17 (4% ciascuno). Lowe et al.8 ha riferito utilizzando il protocollo QuickCorn per la trasformazione B73 e Mo17. In questo lavoro, le frequenze di trasformazione variavano dal 9%-50% per B73 e dal 15%-35% per Mo17.
Una possibilità per le frequenze di trasformazione più basse per B73 e Mo17 osservate in questo lavoro può essere attribuita alla fluttuazione stagionale della qualità dell'orecchio. Un'altra differenza tra questo lavoro e quello di Lowe et al.8 è che qui sono stati utilizzati diversi costrutti vettoriali. Nel lavoro di Lowe, i geni morfogenici non sono stati rimossi dalle piante trasformate, ma piuttosto silenziati in modo equisì nelle fasi successive. In questo lavoro, i geni morfogenici sono stati rimossi 8 giorni dopo l'infezione. È possibile che B73 e Mo17 possano aver bisogno di una presenza più lunga di Bbm/Wus2 per lo sviluppo di embrioni somatici.
Utilizzando questo metodo, c'è la possibilità di ottenere piante di fuga non transgeniche, inserimenti multimeerici e transgeni non espatriati. Queste piante non avranno un fenotipo notevolmente diverso, quindi è necessario il rilevamento da parte della PCR per determinare se una pianta è transgenica. Per raggiungere questo obiettivo, possono essere impiegati primer PCR all'interno della regione eccitata e primer che fiancheggiano la regione eccitata. Molteplici trasformazioni indipendenti possono anche produrre piante dallo stesso embrione immaturo, rendendo difficile la determinazione del tasso totale di recupero dei trasformativi indipendenti. Il nostro standard è stato quello di calcolare un tasso di trasformazione basato sul campionamento di una pianta da ogni embrione immaturo che produceva piante e dividendolo per il numero di embrioni infetti. Questo metodo sottovaluta quasi certamente il numero effettivo di eventi indipendenti recuperati come piantine. La discriminazione tra eventi indipendenti dello stesso embrione richiede il sequenziamento delle regioni di confine intorno ai transgeni, e questo sarà proibitivo e dispendioso in termini di tempo per la maggior parte delle applicazioni; però, ci possono essere casi in cui questi dati sono utili.
Questo metodo di trasformazione della coltura tissutale si è dimostrato molto efficace, ma i problemi possono ancora verificarsi. Se il materiale vegetale non risponde, è possibile che ci sia un problema con la particolare linea inbred, suggerendo che variabili come la composizione dei media di crescita e i tempi di subcultura richiedano regolazioni. Un'altra variabile è la progettazione corretta del vettore e la costruzione accurata del vettore, se il vettore originale viene modificato. Ci possono essere anche problemi con la sensibilità imazapyr, come alcune linee sono più sensibili di altri, e la concentrazione di imazapyr potrebbe essere necessario essere regolato per raggiungere le piante trasformate con successo.
Negli ultimi 30 anni, la cultura dei tessuti di mais e i protocolli di trasformazione sono cambiati e progrediti; e si ritiene che questo protocollo abbreviato favorirà questa progressione. Questo metodo è efficace per le impostazioni accademiche perché richiede meno tempo rispetto ai metodi tradizionali. Inoltre, non richiede operatori altamente qualificati, il che lo rende più suscettibile alla distribuzione diffusa rispetto ai metodi tradizionali. In futuro, questo metodo può essere combinato con nuove tecnologie come l'ingegneria genomica.
Disclosures
Alicia Masters, William Gordon-Kamm e Todd Jones sono dipendenti di Corteva Agriscience che ha fornito il protocollo e le orecchie di mais di B73, Mo17 e W22 utilizzate in questo articolo. Gli autori Minjeong Kang, Morgan McCaw, Jacob e Kan Wang non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il team della serra Di Corteva per aver fornito orecchie immature di mais, il laboratorio di preparazione dei media Corteva per aver fornito assistenza nella realizzazione dei media, Ning Wang di Corteva per l'aiuto del costrutto Agrobacterium e Keunsub Lee dell'Iowa State University per assistenza. Questo progetto è stato parzialmente sostenuto dal National Science Foundation Plant Genome Research Program Grant 1725122 e 1917138 a K.W., dal programma di ricerca sulle piante predittive Fenomics Research (National Science Foundation Grant DGE-1545453) a J. . . . . #IOW04341 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4-D | Millipore Sigma | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (BAP) | Millipore Sigma | B3408 | |
| Acetosyringone | Millipore Sigma | D134406 | |
| Agar | Millipore Sigma | A7921 | |
| Aluminum foil | To cover the flask | ||
| Ammonium Sulfate | Millipore Sigma | A4418 | |
| Analytical balance | To weigh small quantities of chemicals | ||
| Autocalve | Primus (Omaha, NE) | PSS5-K | To autoclave media and tools |
| Bacterial culture loop (10 µl) | Fisher scientific | 22-363-597 | Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid |
| Bactoagar | BD bioscience | 214030 | |
| Beakers (1 L, 2 L, 4 L) | To mix the chemicals for media | ||
| Benomyl | Millipore Sigma | #45339 | |
| Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) | Clorox | For seed sterilization | |
| Boric Acid | Millipore Sigma | B6768 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | |
| Carbenicillin | Millipore Sigma | C3416 | |
| Casein Hydrolysate | Phytotech | C184 | |
| Cefotaxime | Phytotech | C380 | |
| Conical tube (50 mL) | Fisher scientific | 06-443-19 | Contain liquid medium and Agro suspension |
| Cuvette (Semi-micro) | Fisher scientific | 14955127 | To hold liquid for measuring OD |
| Dicamba | Phytotech | D159 | |
| Digital hygrometer | Checking temperature and humidity for heat treatment | ||
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Millipore Sigma | 324503 | |
| Eppendorf tube (2.0 mL) | ThermoFischer Scientific | AM12475 | |
| Eriksson's Vitamins | Phytotech | E330 | 1000x in liquid |
| Ethanol (70%) | Sterilizing tools and surfaces | ||
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | F8263 | |
| Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 | ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) | A903206 | Fertilizer |
| Flask (2 L) | Pyrex | 10-090E | To autoclave media and tools |
| Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) | Hummert International (Earth City, Mo) | 11300000 | Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome |
| Forceps (fine-tipped and large) | Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders | ||
| Gentamicin | Gold Biotechnologies | G-400 | |
| Glass bottle (1 L) | Pyrex | 06-414-1D | To autoclave medium |
| Graduated cylinder | To adjust volume of media | ||
| Imazapyr | Millipore Sigma | 37877 | |
| Incubator, 20 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection |
| Incubator, 27 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow co-cultivation plate and maize embryo culture |
| Incubator, 45 °C | Heat shock treatment | ||
| Insert TO Standard, pots | Hummert International (Earth City, Mo) | 11030000 | For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome |
| Laminar flow hood | Maintains sterile conditions | ||
| L-proline | Phytotech | P698 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | M1880 | |
| Maize inbred seed B73 | U.S National Plant Germplasm | id=47638 | |
| Maize inbred seed Mo17 | U.S National Plant Germplasm | id=15785 | |
| Maize inbred seed W22 | U.S National Plant Germplasm | id=61755 | |
| Manganese Sulfate Monohydrate | Millipore Sigma | M7899 | |
| Milli-Q Water purification systems | Millipore sigma | MILLIQ | For tissue culture grade water |
| MS Basal Medium | Millipore Sigma | M5519 | |
| MS Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | M5524 | |
| N6 Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | C1416 | |
| Paperclips, non-skid | Holding on tassel bags | ||
| Peptone | BD bioscience | 211677 | |
| Petri dish (100x15 mm) | Fisher scientific | FB0875713 | For bacteria culture medium |
| Petri dish (100x25 mm) | Fisher scientific | FB0875711 | For the plant tissue culture medium |
| pH meter | Fisher scientific | AB150 | To adjust pH of media |
| Pipette (1 mL) | ThermoFischer Scientific | 4641100N | |
| Plastic Boxes | The Container Store | 10048430 | For tissue culture storage and incubation |
| Plastic humidy dome (Humi-Dome) | Hummert International (Earth City, Mo) | 14385100 | Plastic cover for soil flat |
| Potassium Iodide | Millipore Sigma | 793582 | |
| Potassium Nitrate | Millipore Sigma | P8291 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Millipore Sigma | P5655 | |
| Scale | To weigh chemicals for media | ||
| Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) | Thermo Scientific | 3120030 | remove the top of the kernel crowns for embryo dissection |
| Scalpel handle | Holding scalpel blades | ||
| Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) | Phytotech | S826 | 100x powder |
| Scissors | Cutting ear shoots | ||
| Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) | Seedburo (Des Plaines, IL) | S26 | Semi-transparent bag to cover ear shoots |
| Silver Nitrate | Millipore Sigma | S7276 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate | Millipore Sigma | M1651 | |
| Soiless substrate LC1 | SunGro Horticulture (Agawam, Ma) | #521 | For growing maize plants |
| Spatula (Double Ended Micro-Tapered) | Fischer Scientific | 2140110 | Dissecting embryos from kernels |
| Spatula (with spoon) | Fisher scientific | 14-375-10 | To measure chemicals for media |
| Spectinomycin | Millipore Sigma | S4014 | |
| Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) | Thermo Scientific | 840-300000 | Measure OD of Agro suspension |
| Stirring bar | Fisher scientific | 14-513-67 | To mix media |
| Stirring hotplates | To mix media | ||
| Syringe (without needle, 60 mL) | Fisher scientific | 14-823-43 | For filter sterilization |
| Syringe filter (0.22 µm) | Fisher scientific | 09-720-004 | For filter sterilization |
| Tassel bag (Canvasback- brown) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514 | Bag to cover tassels of non-transgenic plants |
| Tassel bag (Canvasback-green stripe) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514G | Bag to cover tassels of transgenic plants |
| Thiamine HCl | Phytotech | T390 | |
| Thidiazuron | Phytotech | T888 | |
| Thymidine | Millipore Sigma | T1895 | |
| Timentin | Phytotech | T869 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | Cas #9005-64-5 | surfactant |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI0236 | Homogenizes liquids (Agro suspension) |
| Water bath (large - Precision model 186) | Fisher scientific | any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C | Keeps autoclaved media at optimal temperature |
| Weigh dish | Fisher scientific | 08-732-112 | To measure chemicals for media |
| Weighing paper | Fisher scientific | 09-898-12A | To measure chemicals for media |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP14222 | |
| Zeatin | Millipore Sigma | Z0164 |
References
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